一種優(yōu)化的獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因生物的雙t-dna表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種優(yōu)化的獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因生物的雙T-DNA表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的雙T-DNA載體A，為將雙T-DNA區(qū)域插入表達(dá)載體中上得到的載體；所述雙T-DNA區(qū)域包括兩個獨(dú)立T-DNA區(qū)域：T-DNA區(qū)域A和T-DNA區(qū)域B；所述T-DNA區(qū)域A的右邊界A和所述T-DNA區(qū)域B的右邊界相鄰，且所述T-DNA區(qū)域A的左邊界A和所述T-DNA區(qū)域B的左邊界相離。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建的雙T-DNA質(zhì)粒兩個T-DNA區(qū)的右邊界在質(zhì)粒環(huán)中相互靠近，形成頭對頭的結(jié)構(gòu)（LB-RB-RB-LR型），以期避免在轉(zhuǎn)錄的時候形成通讀，降低轉(zhuǎn)化基因與選擇標(biāo)記基因的連鎖比例，從而提高T1代分離出無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因株系幾率，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種優(yōu)化的獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因生物的雙T-DNA表達(dá)載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種優(yōu)化的獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因生物的雙T-DNA表達(dá)載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)自1983年問世以來，得到了長足的發(fā)展，它可以打破不同物種之間生物隔離，使物種之間的基因交流成為可能，讓轉(zhuǎn)基因作物向需要的方向發(fā)展。目前研究人員已發(fā)現(xiàn)多種不同的轉(zhuǎn)基因方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG法、電激法、顯微注射法、脂質(zhì)體法等(Sawahel W A, et al.1992.Biotech Advances.10:393-412)。利用這些轉(zhuǎn)化方法將外源目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞時，通常只有部分細(xì)胞可以成為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，選擇標(biāo)記基因的應(yīng)用使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在相應(yīng)的選擇壓力下仍可繼續(xù)存活并分化成植株，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞將死亡(Dale E C，et al.1991.Proc Natl Acad Sci USA.88:10558-10562)。然而，選擇標(biāo)記基因及其蛋白產(chǎn)物畢竟不是基因工程的目的產(chǎn)品，從而引發(fā)有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物安全的許多問題。主要有以下幾點(diǎn):一是抗生素類基因編碼產(chǎn)物可能對人類或動物有潛在的毒性或致敏性；二是標(biāo)記基因有可能會通過不同的途徑在物種間傳播，威脅生態(tài)環(huán)境，包括轉(zhuǎn)基因作物導(dǎo)致雜草問題、產(chǎn)生病毒或加重病害對非目標(biāo)生物的影響。此外，選擇標(biāo)記基因的存在還限制了轉(zhuǎn)基因作物的進(jìn)一步改良，當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物中已存在某一選擇標(biāo)記基因時，該基因在隨后的再次轉(zhuǎn)化中就不能再作為選擇標(biāo)記，這樣便給植物再次導(dǎo)入外源基因帶來一定的限制。而由于目前可供利用的選擇標(biāo)記基因?yàn)閿?shù)甚少，不可能每次轉(zhuǎn)化都更換新的選擇標(biāo)記基因，重復(fù)轉(zhuǎn)化將難以實(shí)現(xiàn)。因此，建立無選擇標(biāo)記植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，培育無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物將從根本上解決這個問題(Dekeyser R, et al.1989.PlantPhysiol.90:217-223)，且無論是從安全性考慮，還是從轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身考慮均具有著重要的意義。
[0003]無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的研究和培育已成為國際上植物基因工程領(lǐng)域的一個趨勢。迄今，已有一些方法可獲得不帶選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化植物，主要的有轉(zhuǎn)座子成份介導(dǎo)法，位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)介導(dǎo)法及共轉(zhuǎn)化方法等(Yoder J I, et al.1994.Bio/Technology, 12:263-267)。目前有人對傳統(tǒng)的T-DNA共轉(zhuǎn)化方法做了功能改進(jìn)，發(fā)明了一種獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的專用載體，Chen等(Songbiao Chen, et al.2004.PlantCell Rep, 23:625-631)利用上述載體構(gòu)建了含有⑶S基因的植物表達(dá)載體p⑶TGNGUS，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草。Ttl代共轉(zhuǎn)化頻率為53.6%，對共轉(zhuǎn)化T1代轉(zhuǎn)基因株系的遺傳分析表明，41.4%的株系發(fā)生基因分離，產(chǎn)生無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株，但T1代18個株系中有6株系(33.3%)均成雙TDNA插入連鎖，影響了后代分離比。分析原因?yàn)樵撦d體由于兩個T-DNA區(qū)相靠近，兩個T-DNA區(qū)的雙邊界為順勢(邊界型為LB-RB-LB-RB型)，可能在轉(zhuǎn)錄的時候形成通讀，導(dǎo)致兩個T-DNA連鎖插入同一位點(diǎn)，嚴(yán)重降低了后代分離標(biāo)記基因。因此建立一種高效的獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基 因植物培育體系具有重要的實(shí)際意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一種雙T-DNA載體A。
[0005]本發(fā)明提供的雙T-DNA載體A，包括雙T-DNA區(qū)域，所述雙T-DNA區(qū)域依次包括TDNA區(qū)域A和T-DNA區(qū)域B ;所述T-DNA區(qū)域A依次包括左邊界A、選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒和右邊界A ;所述T-DNA區(qū)域B依次包括右邊界B、第二個MAR、用于插入目的DNA的多克隆位點(diǎn)、第一個MAR和左邊界B ;所述T-DNA區(qū)域A的右邊界A和所述T-DNA區(qū)域B的右邊界B相鄰。
[0006]上述雙T-DNA載體A中，所述選擇標(biāo)記基因和所述目的DNA的轉(zhuǎn)錄方向相反。
[0007]上述T-DNA區(qū)域A的左邊界A和所述T-DNA區(qū)域B的左邊界B相背離。
[0008]上述選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒包括啟動子、選擇標(biāo)記基因和終止子。[0009]上述MAR(matrix attachment region, MAR)序列是一段核基質(zhì)結(jié)合序列，置于外源表達(dá)結(jié)構(gòu)的兩側(cè)可提高外源基因表達(dá)的水平，或明顯減少了外源基因在轉(zhuǎn)基因植株間的表達(dá)差異。利用MARs來穩(wěn)定、提高外源基因的表達(dá)是克服外源基因失活的一種有效方法。
[0010]上述雙T-DNA載體A中，所述選擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、二氫葉酸還原酶基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因；所述選擇標(biāo)記基因具體為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因或新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；
[0011]所述用于插入目的DNA的多克隆位點(diǎn)依次包括HindII1、Sph1、Pst1、Xba1、BamH1、Sma1、Sac1、EcoR10
[0012]上述雙T-DNA載體A為如下I)或2):
[0013]I)所述的雙T-DNA載體A (pDTmar-hyg)中的雙T-DNA區(qū)域依次包括所述左邊界A、終止子CaMV35S polyA、所述潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因和啟動子35S、所述右邊界A、所述右邊界B、所述第二個MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位點(diǎn)、所述第一個MAR和所述左邊界B ;1)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區(qū)域的核苷酸序列具體為序列表中的序列I ;
[0014]上述終止子CaMV35S polyA、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因和啟動子35S構(gòu)成選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒；
[0015]2)所述的雙T-DNA載體A (pDTmar-npt)中的雙T-DNA區(qū)域依次包括所述左邊界A、nos終止子、所述新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和nos啟動子、所述右邊界A、所述右邊界B、所述第二個MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位點(diǎn)、所述第一個MAR和所述左邊界B。2)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區(qū)域的核苷酸序列具體為序列表中的序列2。
[0016]上述nos終止子、所述新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和nos啟動子構(gòu)成選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒。
[0017]上述I)所述的雙T-DNA載體A按照如下方法制備:將含有所述T-DNA區(qū)域B的片段插入含有所述T-DNA區(qū)域A的表達(dá)載體中，且使所述T-DNA區(qū)域A的右邊界A和所述T-DNA區(qū)域B的右邊界相鄰；所述含有所述T-DNA區(qū)域B片段的核苷酸序列具體為序列表中序列I自5’末端第2744-5527位核苷酸；所述含有所述T-DNA區(qū)域A的表達(dá)載體具體為pC1300LaCZ_ ;具體為將序列表中序列I自5’末端第2744-5527位核苷酸插入pC1300LacZ_載體的SphI酶切位點(diǎn)間得到的載體pDTmar-hyg ；
[0018]2)所述的雙T-DNA載體A按照如下方法制備:將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)表達(dá)盒替換掉I)所述的雙T-DNA載體A中潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因表達(dá)盒得到的載體；所述潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因表達(dá)盒包括終止子CaMV35S polyA、所述潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因和啟動子35S。具體為將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)表達(dá)盒取代I)所述的雙TDNA載體A的Xhol/Pmel酶切識別位點(diǎn)間的小片段(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因表達(dá)盒)得到的重組載體pDTmar-npt。
[0019]上述新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)表達(dá)盒按照如下方法獲得=EcoRI和ClaI (NEB)雙酶切質(zhì)粒pCASmGFPt，收集2298bp的酶切產(chǎn)物，即得到新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)表達(dá)盒。
[0020]本發(fā)明的另一個目的是提供一種DNA片段。
[0021]本發(fā)明提供的DNA片段，為上述雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區(qū)域。
[0022]本發(fā)明的第三個目的是提供一種雙T-DNA載體B。
[0023]本發(fā)明提供的雙T-DNA載體B，為將目的DNA插入上述的雙T-DNA載體A的用于插入目的DNA的多克隆位點(diǎn)得到的載體。
[0024]上述目的DNA以目的基因表達(dá)盒的形式插入；
[0025]所述目的基因表達(dá)盒具體為綠色熒光蛋白基因表達(dá)盒或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表達(dá)盒；
[0026]所述綠色熒光蛋白基因表達(dá)盒進(jìn)一步具體包括CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白基因mgfp5和nos終止子組成；所述綠色熒光蛋白基因表達(dá)盒的核苷酸序列進(jìn)一步具體為序列表中的序列3 ；
[0027]所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表達(dá)盒進(jìn)一步具體包括P-Ubi啟動子、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因和nos終止子；所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表達(dá)盒的核昔酸序列進(jìn)一步具體為序列表中的序列4。
[0028]上述雙T-DNA 載體 B 具體為 pDTgfp-npt 和 pDTepsps-hyg ；
[0029]載體pDTgfp-npt為將序列表中序列3所示的綠色突光蛋白基因(mgfp5)表達(dá)盒插入pDTmar-npt載體的SmaI酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0030]載體PDT印sps-hyg為將序列表中序列4所示的5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合酶基因表達(dá)盒插入pDTmar-hyg的SmaI和SbfI酶切位點(diǎn)間得到。
[0031 ] 上述的雙T-DNA載體A或上述的DNA片段或上述的雙T-DNA載體B在抑制雙T-DNA插入植物基因組發(fā)生連鎖中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；上述應(yīng)用中，所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進(jìn)一步具體煙草，所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。
[0032]上述的雙T-DNA載體A或上述的DNA片段或上述的雙T-DNA載體B在培育無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；上述應(yīng)用中，所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進(jìn)一步具體煙草，所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。
[0033] 選擇標(biāo)記基因可以包括任何適用于遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因，例如新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶(neomycin phosphotransf erase-1 I, Npt-1I)基因、氣霉素乙酸轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicol acetyl transferase, Cat)基因、二氫葉酸還原酶(Dihydrofolatereductase, DHFR)基因、潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin phosphotransferase, Hpt)基因、勝絲菌素乙酸轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin-N-acetyltransferase, Bar)基因和5_烯醇丙酮莽草酸 _3_ 憐酸合酶(5-enolpyruvylshikimate_3-phosphatesynthase,EPSPs)基因等；目的基因可以包括任何在生產(chǎn)上有應(yīng)用價值的基因，如抗蟲基因、抗病基因、抗除草劑基因、抗衰老基因、抗逆基因、品質(zhì)改良等基因以及由上述基因組成的融合或多價基因。所述目的基因的啟動子可以包括組成型啟動子、器官特異性啟動子、組織特異性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或者由啟動子和調(diào)控元件組成的復(fù)合啟動子。
[0034]上述植物包括雙子葉植物和單子葉植物，如煙草、棉花、大豆、花生、番茄、辣椒、油菜或白菜，以及水稻、小麥、玉米、高梁、大麥、燕麥或黑麥等。當(dāng)所述植物為煙草時，所述優(yōu)化的雙T-DNA植物表達(dá)載體為pDTmar-npt。當(dāng)所述植物為水稻時，所述優(yōu)化的雙T-DNA植物表達(dá)載體為pDTmar-hyg。
[0035]定義
[0036]“植物表達(dá)載體”是指能驅(qū)動目的基因在植物體內(nèi)表達(dá)的載體。
[0037]“Ti質(zhì)?！笔歉┺r(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中的一種雙鏈環(huán)狀DNA 分子，一般具有 T-DNA 區(qū)(transferred-DNA regions)、毒性區(qū)(virulence region)、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(origin of replication)和質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)(regions encodingconjugation)。在農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時，T-DNA區(qū)在毒性區(qū)的激活下能從Ti質(zhì)粒上轉(zhuǎn)移并整合到植物染色體中。Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)目前被廣泛應(yīng)用于植物基因工程領(lǐng)域。
[0038]“T-DNA”是根癌農(nóng)桿菌內(nèi)Ti質(zhì)粒上的一段能從質(zhì)粒上轉(zhuǎn)移并整合到寄主植物基因組中的DNA,即transferred DNA。T-DNA兩端各有一段長約25bp的邊界序列(bordersequence),分別稱為左邊界(LB)和右邊界(RB)。邊界序列的存在是T-DNA保留轉(zhuǎn)移特性的必需元件。當(dāng)保留T-DNA的邊界序列時，以目的基因取代野生型T-DNA的部分基因組后，改造后的T-DNA仍能進(jìn)入植物細(xì)胞并整合到植物染色體組中。T-DNA在受體植物染色體上的整合位點(diǎn)是隨機(jī)的。目前，在植物基因工程應(yīng)用中，野生型根癌農(nóng)桿菌T-DNA中的致瘤基因被外源目的基因和選擇標(biāo)記基因替換，僅保留邊界序列。
[0039]“基因”是指編碼一種特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括該編碼區(qū)前面(5’非編碼區(qū))和后面(3’非編碼區(qū))的調(diào)控序列。
[0040]“外源基因”是指正常情況下宿主生物中沒有的、通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入的基因；也可指正常存在于宿主生物中的，但又被重新導(dǎo)入其基因組中其天然基因座之外的另一基因座的基因，這種變化會導(dǎo)致一種內(nèi)源基因的編碼序列的一個或幾個額外拷貝的出現(xiàn)。
[0041 ] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明在前期工作的基礎(chǔ)上，創(chuàng)造性的改變了雙T-DNA在表達(dá)載體中的排列方向，使構(gòu)建的雙T-DNA質(zhì)粒兩個T-DNA區(qū)的右邊界在質(zhì)粒環(huán)中相互靠近，形成頭對頭的結(jié)構(gòu)(LB-RB-RB-LR型)，以期避免在轉(zhuǎn)錄的時候形成通讀，降低轉(zhuǎn)化基因與選擇標(biāo)記基因的連鎖比例，從而提高T1代分離出無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因株系幾率，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為中間載 體pC1300LacZ-的物理圖譜
[0043]圖2為中間載體pCDMAR-hyg的物理圖譜[0044]圖3為優(yōu)化后的雙T-DNA植物載體pDTmar_hyg的物理圖譜
[0045]圖4為優(yōu)化后的雙T-DNA植物載體pDTmar_hyg的雙T-DNA區(qū)域的線性結(jié)構(gòu)
[0046]圖5為中間載體pCASmGFPt的物理圖譜
[0047]圖6為優(yōu)化后的雙T-DNA植物載體pDTmar_npt的物理圖譜
[0048]圖7為優(yōu)化后的雙T-DNA植物載體pDTmar_npt的雙T-DNA區(qū)域的線性結(jié)構(gòu)
[0049]圖8為中間載體pSPmGFP5的物理圖譜
[0050]圖9為整合目的基因gfp的優(yōu)化后的雙T-DNA表達(dá)載體pDTgfp-npt的物理圖譜 [0051]圖10為整合基因epsps的未優(yōu)化載體pQ)epsps_hyg的物理圖譜
[0052]圖11為整合基因epsps的優(yōu)化后載體pDTepsps_hyg的物理圖譜
[0053]圖12為整合目的基因gfp的未優(yōu)化的雙T-DNA表達(dá)載體pCDgfp-npt的物理圖譜
[0054]圖13為轉(zhuǎn)整合gfp基因的優(yōu)化及未優(yōu)化載體Ttl代煙草植株P(guān)CR分析的電泳圖譜
[0055]圖14為轉(zhuǎn)整合gfp基因的優(yōu)化及未優(yōu)化載體T1代煙草植株P(guān)CR分析的電泳圖譜
[0056]圖15為轉(zhuǎn)整合印sps基因的優(yōu)化及未優(yōu)化載體Ttl代水稻植株P(guān)CR分析的電泳譜
[0057]圖16為轉(zhuǎn)整合印sps基因的優(yōu)化及未優(yōu)化載體T1代水稻植株P(guān)CR分析的電泳圖譜
[0058]圖17為載體pCDmar-npt的物理圖譜【具體實(shí)施方式】
[0059]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0060]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0061]下述實(shí)施例構(gòu)建過程中質(zhì)粒提取、酶切、DNA的回收、純化均按分子克隆中的方法進(jìn)行(分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊，Sambrook et al, New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)。
[0062]實(shí)施例1、雙T-DNA植物載體pDTmar-hyg和pDTmar-npt的構(gòu)建
[0063]一、雙T-DNA植物載體pDTmar-hyg的構(gòu)建
[0064]1、中間載體pC1300LacZ-的獲得
[0065]EcoRI 和 HindIII(NEB)雙酶切 pCAMBIA1300(Roberts C，et al.1994.Plant Mol.Biol.25(6):989-994 ;公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)，收集8907bp的載體骨架，然后用Klenow(NEB)補(bǔ)平載體骨架的酶切位點(diǎn)，自連，獲得無多克隆位點(diǎn)的中間載體pC1300LacZ-(載體示意圖如圖1)。
[0066]2、雙 T-DNA 植物載體 pDTmar-hyg 獲得
[0067]以載體pCDMAR-hyg (載體示意圖如圖2，DREB基因雙T-DNA植物表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證，分子植物育種，2004，2(1)，7-12 ;公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)為模板，以 primer-1:5-tgcaggatatcactgaacgtcagaagccgactgc-3, primer-2:5-tgcaggatatcatccaacccctccgctgctata-3 (下劃線為EcoRV酶切位點(diǎn))為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到2774bp的PCR產(chǎn)物(序列表中序列I自5’末端第2744-5527位核苷酸)，其含有雙MAR序列(LiX G, et al.2001.Science in China (series C) 44:400-408)、多克隆位點(diǎn)、選擇標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)盒的T-DNA片段結(jié)構(gòu)域。
[0068]用EcoRV酶切上述PCR產(chǎn)物，回收2753bp酶切片段；用SphI (NEB)酶切pC1300LacZ-載體，回收8907bp載體骨架；用T4DNA聚合酶(NEB)削平載體骨架的SphI酶切位點(diǎn)，得到平末端載體骨架；將2753bp酶切片段與平末端載體骨架連接，得到重組載體；
[0069]將 多個PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序分析，獲得插入方向正確的重組載體，命名為pDTmar-hyg (載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示)。經(jīng)過測序,載體pDTmar-hyg為將序列表中序列I自5’末端第2744-5527位核苷酸插入pC1300LacZ-載體的SphI酶切位點(diǎn)間得到的載體，該載體包括雙T-DNA區(qū)域I,該區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列I所示,結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示。
[0070]雙T-DNA區(qū)域I依次包括兩個獨(dú)立T-DNA區(qū)域:T_DNA區(qū)域A-1和T-DNA區(qū)域B ；TDNA區(qū)域A-1依次包括左邊界A、終止子CaMV35S polyA、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因Hpt和啟動子35S ；T-DNA區(qū)域B依次包括右邊界B、第二個MAR、用于插入目的基因的多克隆位點(diǎn)、第一個MAR和左邊界B ；T-DNA區(qū)域A-1的右邊界A和T-DNA區(qū)域B的右邊界相鄰，且T-DNA區(qū)域A-1的左邊界A和T-DNA區(qū)域B的左邊界相離(即右臂相鄰)。
[0071]選擇標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因(hygromycin phosphotransferase,Hpt)表達(dá)盒包括啟動子35S、基因Hpt和終止子CaMV35S polyA ；
[0072]上述用于插入目的基因的多克隆位點(diǎn)依次包括HindII1、Sph1、Pst1、Xba1、BamH1、Sma1、Sac1、EcoRI ；
[0073]雙T-DNA區(qū)域I各部分的核苷酸序列如下所示:序列I自5’末端第1_26位核苷酸為左邊界A ;自5’末端第76-292位核苷酸為選擇標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因表達(dá)盒的終止子T-nos ；自5’末端第320-1342位核苷酸為選擇標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因；自5’末端第1378-2147位核苷酸為選擇標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因表達(dá)盒的啟動子35S ;自5’末端第2653-2678位核苷酸為右邊界A ;自5’末端第2893-2919位核苷酸為右邊界B ;自5’末端第2965-3712位核苷酸為第二 MAR ;自5’末端第3928-3985位核苷酸為用于插入目的基因的多克隆位點(diǎn)；自5’末端第4248-5110位核苷酸為第一MAR ;自5’末端第5385-5410位核苷酸為左邊界B。
[0074]二、雙 T-DNA 植物載體 pDTmar-npt
[0075]EcoRI和ClaI (NEB)雙酶切質(zhì)粒pCASmGFPt (載體結(jié)果示意圖如圖5，中國科學(xué)院博士研究生學(xué)位論文“一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制的研究”，劉翔，2004年，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)，收集2298bp的酶切產(chǎn)物，該酶切產(chǎn)物包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)表達(dá)盒；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)表達(dá)盒包括nos啟動子、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)和nos終止子。
[0076]將2298bp的酶切產(chǎn)物用Klenow酶(NEB)補(bǔ)平EcoR1、ClaI酶切位點(diǎn)，得到平末端酶切產(chǎn)物；再將pDTmar-hyg用Xhol/Pmel酶切，收集9327bp的載體骨架，用Klenow酶(NEB)補(bǔ)平載體骨架的XhoI酶切位點(diǎn)，得到平末端載體骨架；將平末端酶切產(chǎn)物和平末端載體骨架鏈接，得到雙T-DNA載體pDTmar-npt (為將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)表達(dá)盒取代pDTmar-hyg的Xhol/Pmel酶切識別位點(diǎn)間的小片段(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因表達(dá)盒)得到的重組載體pDTmar-npt)。
[0077]將多個PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序分析，獲得插入方向正確的重組載體，命名為pDTmar-npt(載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖6所示)。經(jīng)過測序，載體pDTmar-npt包括雙T-DNA區(qū)域2，該區(qū)域的核苷酸序列為列表中序列2所示，結(jié)構(gòu)示意圖如圖7所示。[0078]雙T-DNA區(qū)域2依次包括兩個獨(dú)立T-DNA區(qū)域:T_DNA區(qū)域A-2和T-DNA區(qū)域B ；T-DNA區(qū)域A-2包括左邊界A、nos終止子、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和nos啟動子、右邊界A ；T-DNA區(qū)域B依次包括右邊界B、第二個MAR、用于插入目的基因的多克隆位點(diǎn)、第一個MAR和左邊界B ；T-DNA區(qū)域A-2的右邊界A和T-DNA區(qū)域B的右邊界相鄰，且T-DNA區(qū)域A-2的左邊界A和T-DNA區(qū)域B的左邊界相離(即右臂相鄰)。
[0079]選擇標(biāo)記基因nptll表達(dá)盒包括nos啟動子、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)和nos終止子；
[0080]上述用于插入目的基因的多克隆位點(diǎn)依次包括HindII1、Sph1、Pst1、Xba1、BamH1、Sma1、Sac1、EcoRI ；
[0081]雙T-DNA區(qū)域2各部分的核苷酸序列如下所示:序列表中序列2自5’末端第1_26位核苷酸為左邊界A ;自5’末端第545-800位核苷酸為選擇標(biāo)記基因nptll表達(dá)盒的終止子nos、自5’末端第1013-1996位核苷酸為選擇標(biāo)記基因nptll、自5’末端第1997-2303位核苷酸為選擇標(biāo)記基因nptll表達(dá)盒的nos啟動子、自5’末端第2618-2643位核苷酸為右邊界A、自5’末端第2858-2883位核苷酸為右邊界B、自5’末端第2930-3676位核苷酸為第二 MAR、自5’末端第3893-3950位核苷酸為用于插入目的基因的多克隆位點(diǎn)、自5’末端第4213-5074位核苷酸為第一 MAR、自5’末端第5349-5374位核苷酸為左邊界B。
[0082]實(shí)施例2、雙T-DNA植物表達(dá)載體pDTgfp-npt和pDTepsps-hyg的構(gòu)建
[0083]一、雙T-DNA植物表達(dá)載體pDTgfp-npt的構(gòu)建
[0084]XhoI和BglII (NEB)雙酶切中間載體pSPmGFP5 (中國科學(xué)院博士研究生學(xué)位論文“一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制的研究”，劉翔，2004年，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；載體構(gòu)建示意圖如圖8)，得到1989bp的酶切產(chǎn)物，該酶切產(chǎn)物包括綠色熒光蛋白基因(mgfp5)表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白基因(mgfp5)和nos終止子組成的表達(dá)盒(該表達(dá)盒的核苷酸序列為序列3)。
[0085]將該酶切產(chǎn)物用Klenow酶(NEB)補(bǔ)平XhoI和BglII酶切位點(diǎn)，得到平末端酶切產(chǎn)物；再將由實(shí)施例1得到的載體pDTmar-npt用SmaI (NEB)酶切，回收11624bp的載體骨架；再將平末端酶切產(chǎn)物和載體骨架鏈接，得到雙T-DNA表達(dá)載體pDTgfp-npt，該表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖9所示。
[0086]經(jīng)過測序鑒定方向，且該表達(dá)載體pDTgfp-npt為將序列表中序列3所示的綠色熒光蛋白基因(mgfp5)表達(dá)盒插入pDTmar-npt載體的SmaI酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0087]序列3自5’末端第30-878位核苷酸為CaMV35S啟動子、自5’末端第884-1701位核苷酸為綠色熒光蛋白基因(mgfp5)、自5’末端第1702-1967位核苷酸為nos終止子。
[0088]從圖9的結(jié)構(gòu)示意圖可以看出，雙T-DNA表達(dá)載體pDTgfp-npt含有兩個方向相反且獨(dú)立的T-DNA區(qū)，其中一個T-DNA包含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)表達(dá)盒作為選擇標(biāo)記基因，另一個T-DNA包含綠色熒光蛋白基因(mgfp5)表達(dá)結(jié)構(gòu)盒作為報告基因，代表目的基因。在報告基因的兩側(cè)同時還含有兩段同向來源于豌豆的MAR序列，該序列可以提高和穩(wěn)定外源基因在受體植物中的表達(dá)(Li X G, et al.2001.Science in China (seriesC)44:400-408)。
[0089]二、雙T-DNA植物表達(dá)載體pDTepsps-hyg的構(gòu)建
[0090] XmnI和SbfI (NEB)雙酶切質(zhì)粒pQ)epsps_hyg(載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖10,該載體的核苷酸序列為序列表中的序列5，雙T-DNA順勢連接，LB-RB-LB-RB)含有兩個同向且獨(dú)立的T-DNA區(qū))，得到4222bp的酶切產(chǎn)物；該酶切產(chǎn)物包括5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合酶表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括P-Ubi啟動子、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase, EPSPs)基因和nos終止子(該表達(dá)盒的核苷酸序列為序列表中的序列4)。
[0091]將由實(shí)施例1得到的載體pDTmar-hyg用SmaI和SbfI (NEB)酶切，回收11637bp的載體骨架，將4222bp的酶切產(chǎn)物與11637bp的載體骨架連接，得到雙T-DNA植物表達(dá)載體pDTepsps-hyg (載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖11)。
[0092]載體PDT印sps-hyg為將序列表中序列4所示的5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合酶基因表達(dá)盒插入pDTmar-hyg的SmaI和SbfI酶切位點(diǎn)間得到。
[0093]序列4自5’末端第2198-4108位核苷酸為Ρ-Ubi啟動子、自5’末端第554-2197位核苷酸為EPSPs、自5’末端第285-574位核苷酸為nos終止子。
[0094]實(shí)施例3、對照雙T-DNA植物表達(dá)載體pCDgfp-npt的構(gòu)建[0095]XhoI和BglII (NEB)雙酶切中間載體pSPmGFP5，得到1989bp的酶切產(chǎn)物，該酶切產(chǎn)物包括綠色熒光蛋白基因(mgfp5)表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白基因(mgfp5)和nos終止子組成的表達(dá)盒(序列3)。
[0096]將該酶切產(chǎn)物用Klenow酶(NEB)補(bǔ)平XhoI和BglII酶切位點(diǎn)，得到平末端酶切產(chǎn)物；再將載體pCDmar-npt (載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖17，該載體的核苷酸序列為序列表中的序列6，雙T-DNA順勢連接，為LB-RB-LB-RB ；)用SmaI (NEB)酶切，回收11643bp的載體骨架；再將平末端酶切產(chǎn)物和載體骨架鏈接，得到雙T-DNA表達(dá)載體P⑶gfp-npt，該表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖12所示。
[0097]經(jīng)過測序驗(yàn)證插入方向正確,且該表達(dá)載體pCTgfp-npt為將序列表中序列3的綠色突光蛋白基因(mgfp5)表達(dá)盒插入pCDmar-npt載體的SmaI酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0098]從圖12的結(jié)構(gòu)示意如可以看出，雙T-DNA表達(dá)載體P⑶gfp-npt含有兩個同向且獨(dú)立的T-DNA區(qū)，其中一個T-DNA包含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)表達(dá)盒作為選擇標(biāo)記基因，另一個T-DNA包含綠色熒光蛋白基因(mgfp5)表達(dá)結(jié)構(gòu)盒作為報告基因，代表目的基因。在報告基因的兩側(cè)同時還含有兩段同向來源于豌豆的MAR序列，該序列可以提高和穩(wěn)定外源基因在受體植物中的表達(dá)(Li X G, et al.2001.Science in China (seriesC)44:400-408)。
[0099]實(shí)施例4、雙T-DNA植物表達(dá)載體pDTgfp-npt和pDTepsps-hyg在培育無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物或抑制雙T-DNA連鎖中的應(yīng)用
[0100]一、雙T-DNA植物表達(dá)載體pDTgfp-npt在培養(yǎng)無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因煙草或抑制雙T-DNA連鎖中的應(yīng)用
[0101]1、煙草轉(zhuǎn)化植株的獲得
[0102]I)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草
[0103]利用改良葉盤法，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草。
[0104]參照BIO-DAD公司電激儀的說明書，將優(yōu)化后的植物表達(dá)載體pDTgfp-npt及其未優(yōu)化的對照載體pO)gfp-npt通過電激法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404 (Luo, et al.2006.Plant Cell R印25:403 - 409，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)中，得到農(nóng)桿菌LBA4404/pDTgfp-npt (提取質(zhì)粒，用SalI和KpnI酶切，得到2013bp的為陽性)和LBA4404/pCDgfp-npt (提取質(zhì)粒，用SalI和KpnI酶切，得到1955bp的為陽性)。
[0105]將農(nóng)桿菌LBA4404/pDTgfp_npt 和 LBA4404/pCDgfp_npt 在含有 kanamycin50mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C避光培養(yǎng)至長出直徑約Imm大小的單菌落(約2_3天)，單菌落再度轉(zhuǎn)接于同樣的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生長旺盛期(約2-3天)。取少許農(nóng)桿菌LBA4404/pDTgfp-npt 和 LBA4404/pCDgfp_npt 轉(zhuǎn)接于 20ml 的 YEB 液體培養(yǎng)基中(kanamycin50mg/L)于28°C，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜(約16小時)。次日以2% _4%的接種量轉(zhuǎn)接于20ml不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，并補(bǔ)加乙酰丁香酮(AS)至終濃度為100 μ M。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3-4小時，到達(dá)對數(shù)生長中期時，用3.5倍體積的YEB液體培養(yǎng)基稀釋至肉眼稍見渾池即可(OD6tltl=0.1)作轉(zhuǎn)化用，得到農(nóng)桿菌 LBA4404/pDTgfp_npt 和 LBA4404/pQ)gfp-npt菌液。
[0106]取完全展開的野生本氏煙草(Nicotiana benthamiana)(以下簡稱為野生型煙草；Baulcombe et al., The Plant Journall995.67:1045-1053 ;公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)無菌苗葉片，用打孔器(直徑0.9cm)制成葉盤，在農(nóng)桿菌LBA4404/pDTgfp-npt和LBA4404/pCDgfp-npt菌液中浸泡8分鐘。取出葉盤,用無菌濾紙吸干后，轉(zhuǎn)入覆蓋有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L + 6BA1.0mg/L +IAA0.lmg/L)中于25°C暗培養(yǎng)3天后，再將葉盤轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基++蔗糖30g/L + 6-BA1.0mg/L + IAA0.lmg/L +頭孢噻肟鈉500mg/L)中，在繼代培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)(光/暗周期為16/8小時)3天后，再將葉盤轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+蔗糖 30g/L + 6-BA1.0mg/L + IAA0.lmg/L + 頭抱噻月虧鈉 500mg/L + kanamycin80mg/L),繼續(xù)培養(yǎng)10天后，將葉盤轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L + 6-BA1.0mg/L +頭孢噻廂鈉500mg/L + kanamycin80mg/L)。一個月左右葉片邊緣長出再生芽至l_2cm,轉(zhuǎn)入新的再生培養(yǎng)基中(MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L + 6-BA1.0mg/L +頭孢噻肟鈉500mg/L + kanamycin80mg/L)。再生芽長到3_4cm時,用解剖刀將再生芽切下,并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+蔗糖20g/L + kanamycin50mg/L)中，待再生芽在培養(yǎng)基中生根，并長成獨(dú)立植株時，移栽至蛭石并在溫室中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，得到Ttl代轉(zhuǎn)pDTgfp-npt煙草和Ttl代轉(zhuǎn)pO)gfp-npt 煙草(對照)。
[0107]2) T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株的分子檢測驗(yàn)證雙-DNA連鎖
[0108](1)、煙草DNA的提取
[0109]CTAB法提取Ttl代轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA，具體如下:分別取Ttl代轉(zhuǎn)pDTgfp-npt煙草和Ttl代轉(zhuǎn)pCDgfp-npt煙草(對照)的新鮮葉片0.3mg置于研缽中，加液氮研成粉末，再加入0.6ml60°C預(yù)熱的CTAB緩沖液(30g/L CTAB, 1.4mol/L NaCl，0.2%的巰基乙醇，20mmol/L EDTA，IOOmmoI/L Tris-HCl，pH8.0)。60°C保溫 30 分鐘，其間輕搖數(shù)次。然后加等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中加入2/3倍體積異丙醇，形成的沉淀即是DNA，加入少許洗液(體積分?jǐn)?shù)為76%的乙醇，lOmmol/L NH4AC)洗滌沉淀一次,干燥后用 500 μ I TE 緩沖液(10mmol/L Tris-HCl (pH8.0), lmmol/L EDTA)溶解DNA。隨后加入RNase A(終濃度10mg/L)，37°C保溫30分鐘，依次用等體積的苯酚、苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)、氯仿:異戊醇(24:1)各抽提一次，水相加入2.5倍體積無水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶解于60 μ I無菌水中，得到基因組DNA。[0110](2)、Ttl代轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測
[0111]對轉(zhuǎn)化優(yōu)化后的載體pDTgfp-npt獲得的192個Ttl代轉(zhuǎn)pDTgfp-npt煙草植株及其轉(zhuǎn)化對照載體P⑶gfp-npt獲得的99個Ttl代轉(zhuǎn)p⑶gfp-npt煙草(對照)的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，具體如下:
[0112]取I μ I基因組DNA做模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0113]nptll 基因的引物為:引物 1:N1，5’ -GAA, CAA, GAT, GGA, TTG, CAC, GCA, GG-3’ ；引物2:N2, 5’ -AAG, AAG, GCG, ΑΤΑ, GAA, GGC, GAT, GC-3’，擴(kuò)增片段為 774bpnptII 基因；
[0114]mgfp5 基因的引物為:引物 1:M1，5’ -ACC, CAG, ATC, ΑΤΑ, TGA, AGC, GG-3’ ;引物 2:M2, 5’ -TTG, GGA, TCT, TTC, GAA, AGG, GC-3’，擴(kuò)增片段為 415bpmgfp5 基因；
[0115]鑒定轉(zhuǎn)化優(yōu)化后載體pDTgfp-npt的雙T-DNA插入連鎖的引物:引物1:W1，5’ CCA,GGC, TTT, ACA, CTT, TAT, GCT, TC-3，；引物 2:W2，5，-CTT, CTC, CTC, TAG, TAT, CTC, CCG, ATG-3，，擴(kuò)增片段為472bp ；
[0116]鑒定轉(zhuǎn)化對照載體pCDgfp-npt的雙T-DNA插入連鎖的引物:引物1:W3，5’ TGA, CTC, CCT, TAA, TTC, TCC, GCT, CAT-3';引物 2:W4, 5’ -CGA, TAC, CGT, CGA, GTT, TCT, CCA, TA-3’，擴(kuò)增片段為1145bp ；
[0117]上述每個PCR反應(yīng)體系均包括:2μ 110XPCR反應(yīng)緩沖液、0.5 μ IlOmM引物1、0.5 μ IlOmM引物2、1μ IDNA模板、2.5 μ 12.5mM dNTPs，補(bǔ)加無菌水至總體積20 μ I。每個PCR反應(yīng)條件均為:94°C預(yù)變性5分鐘，94 °C變性30秒、54 °C復(fù)性30秒、72 °C延伸I分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72°C延伸5分鐘。
[0118]T0代轉(zhuǎn)pDTgfp-npt煙草植株P(guān)CR產(chǎn)物全部進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，部分電泳結(jié)果如圖13A,為檢測轉(zhuǎn)化優(yōu)化后載體pDTgfp-npt的部分電泳結(jié)果,其中M為IOObp DNA marker ；P為陽性質(zhì)粒pDTgfp-npt ;N為野生型煙草，1-9為Ttl代轉(zhuǎn)pDTgfp-npt煙草植株,可以看出，
1-9均擴(kuò)增出774bpnptII基因和415bpmgfp5基因，其中僅有5和6擴(kuò)增出472bp，為Ttl代雙T連鎖檢測呈陽性植株，其余均為非雙T連鎖Ttl代轉(zhuǎn)pDTgfp-npt煙草植株。
[0119]T0代轉(zhuǎn)P⑶gfp-npt煙草(對照)PCR產(chǎn)物全部進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，部分電泳結(jié)果如圖13B，為檢測對照載體pCDgfp-npt的部分電泳結(jié)果，其中M為IOObp DNA marker ;P為陽性質(zhì)粒pCDgfp-npt ；N為野生型煙草，1-10為Ttl代轉(zhuǎn)pCDgfp-npt煙草(對照)，可以看出，
2-10均擴(kuò)增出774bpnptll基因和2-6，8_10均擴(kuò)增出415bp mgfp5基因，其中2-4, 6，8，10均擴(kuò)增出1145bp，為Ttl代轉(zhuǎn)P⑶gfp-npt煙草(對照)雙T連鎖檢測呈陽性植株。
[0120]192個Ttl代轉(zhuǎn)pDTgfp-npt煙草PCR檢測結(jié)果顯示，nptll基因檢測呈陽性的Ttl代轉(zhuǎn)基因煙草共184株；nptll基因與mgfp5基因發(fā)生共轉(zhuǎn)化Ttl代轉(zhuǎn)pDTgfp-npt煙草有160個，二者共轉(zhuǎn)化率為86.96%，其中二者共轉(zhuǎn)化160個中經(jīng)檢測雙T連鎖整合到煙草基因組的Ttl代轉(zhuǎn)pDTgfp-npt煙草共41株、連鎖頻率為25.63% (表1)，非雙T連鎖的整合到煙草基因組的Ttl代轉(zhuǎn)pDTgfp-npt煙草共119株、非連鎖頻率為74.37%。
[0121]99個Ttl代轉(zhuǎn)pCDgfp-npt煙草(對照)PCR檢測結(jié)果顯示，nptll基因檢測呈陽性的T0代轉(zhuǎn)基因煙草共95株；nptll基因與mgfp5基因發(fā)生共轉(zhuǎn)化Ttl代轉(zhuǎn)基因煙草有86個，二者共轉(zhuǎn)化率為90.53%，其中二者共轉(zhuǎn)化86個中經(jīng)檢測雙T連鎖整合到煙草基因組的Ttl代轉(zhuǎn)P⑶gfp-npt煙草(對照)共38株、連鎖頻率為44.19% (表1)，非雙T連鎖的整合到煙草基因組的Ttl代轉(zhuǎn)pCDgfp-npt煙草(對照)共48株、非連鎖頻率為55.81%。[0122]表1為Ttl代轉(zhuǎn)基因煙草共轉(zhuǎn)化頻率及連鎖頻率
[0123]
【權(quán)利要求】
1.一種雙T-DNA載體A，包括雙T-DNA區(qū)域，所述雙T-DNA區(qū)域包括T-DNA區(qū)域A和T-DNA區(qū)域B ;所述T-DNA區(qū)域A依次包括左邊界A、選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒和右邊界A ;所述T-DNA區(qū)域B依次包括右邊界B、第二個MAR、用于插入目的DNA的多克隆位點(diǎn)、第一個MAR和左邊界B ;所述T-DNA區(qū)域A的右邊界A和所述T-DNA區(qū)域B的右邊界相鄰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙T-DNA載體A，其特征在于:所述選擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、二氫葉酸還原酶基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因；所述選擇標(biāo)記基因具體為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因或新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因； 所述用于插入目的DNA的多克隆位點(diǎn)依次包括Hindlll、SphI, Pst、IXbaI, BamHI,Sma1、Sac1、EcoRI。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙T-DNA載體A，其特征在于: 所述雙T-DNA載體A為如下I)或2): 1)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區(qū)域依次包括所述左邊界A、終止子CaMV35SpolyA、所述潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因和啟動子35S、所述右邊界A、所述右邊界B、所述第二個MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位點(diǎn)、所述第一個MAR和所述左邊界B; 2)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區(qū)域依次包括所述左邊界A、nos終止子、所述新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和nos啟動子、所述右邊界A、所述右邊界B、所述第二個MAR、所述用于插入目的DNA的多克隆位點(diǎn)、所述第一個MAR和所述左邊界B。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙T-DNA載體A，其特征在于: 1)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中的序列I; 2)所述的雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中的序列2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的雙T-DNA載體A，其特征在于: 1)所述的雙T-DNA載體A按照如下方法制備:將含有所述T-DNA區(qū)域B片段插入含有所述T-DNA區(qū)域A的表達(dá)載體中，且使所述T-DNA區(qū)域A的右邊界A和所述T-DNA區(qū)域B的右邊界相鄰；所述含有所述T-DNA區(qū)域B片段的核苷酸序列具體為序列表中序列I自5’末端第2744-5527位核苷酸；所述含有所述T-DNA區(qū)域A的表達(dá)載體具體為pC1300LacZ-； 2)所述的雙T-DNA載體A按照如下方法制備:將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)盒替換掉I)所述的雙T-DNA載體A中潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因表達(dá)盒得到的載體；所述潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因表達(dá)盒包括終止子CaMV35S polyA、所述潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因和啟動子35S。
6.一種DNA片段，為權(quán)利要求1-5中任一所述雙T-DNA載體A中的雙T-DNA區(qū)域。
7.一種雙T-DNA載體B，為將目的DNA插入權(quán)利要求1_5中任一所述的雙TDNA載體A的用于插入目的DNA的多克隆位點(diǎn)得到的載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙T-DNA載體B，其特征在于:所述目的DNA以目的基因表達(dá)盒的形式插入； 所述目的基因表達(dá)盒具體為綠色熒光蛋白基因表達(dá)盒或5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合酶基因表達(dá)盒； 所述綠色熒光蛋白基因表達(dá)盒進(jìn)一步具體包括CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白基因mgfp5和nos終止子組成；所述綠色熒光蛋白基因表達(dá)盒的核苷酸序列進(jìn)一步具體為序列表中的序列3 ； 所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表達(dá)盒進(jìn)一步具體包括P-Ubi啟動子、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因和nos終止子；所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因表達(dá)盒的核苷酸序列進(jìn)一步具體為序列表中的序列4。
9.權(quán)利要求1-5中任一所述的雙T-DNA載體A或權(quán)利要求6所述的DNA片段或權(quán)利要求7或8所述的雙T-DNA載體B在抑制雙T-DNA插入植物基因組發(fā)生連鎖中的應(yīng)用；所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進(jìn)一步具體煙草，所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。
10.權(quán)利要求1-5中任一所述的雙T-DNA載體A或權(quán)利要求6所述的DNA片段或權(quán)利要求7或8所述的雙T-DNA載體B在培育無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；所述植物具體為雙子葉植物 或單子葉植物；所述雙子葉植物進(jìn)一步具體煙草，所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。
【文檔編號】C12N15/11GK103898135SQ201210576396
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月26日
【發(fā)明者】朱禎, 孫兵, 戴艷, 冷春旭 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所