專利名稱：改進(jìn)生面團(tuán)和面包質(zhì)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制造生面團(tuán)和基于生面團(tuán)的產(chǎn)品的領(lǐng)域，特別是涉及改進(jìn)生面團(tuán)的強(qiáng)度和切削性及面包和其它烘烤產(chǎn)品的屑結(jié)構(gòu)。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種用可以水解生面團(tuán)中的非極性和極性脂的酶制作生面團(tuán)和面包，從而改進(jìn)生面團(tuán)和烘烤成品質(zhì)量的方法。
背景技術(shù)：
和先有技術(shù)
在烘烤行業(yè)中已知可以使用酶，如淀粉酶、木聚糖酶、氧化酶和蛋白酶而改進(jìn)生面團(tuán)和生面團(tuán)的加工特性和/或改進(jìn)烘烤產(chǎn)品而獲得體積增加、延緩陳腐和提高柔軟度。
將脂酶作為烘烤添加劑也是已知地?？梢远x為催化?；视退獾聂人狨ッ?EC3.1.1.3)是生理上十分重要的酶，與淀粉酶和蛋白酶一起成為三種主要的消化酶。它們水解?；视王楦视椭椭舅?，但也可在酯化或酯交換反應(yīng)中起作用。
因此，美國(guó)專利3,368,903公開了當(dāng)添加從植物種子中分離的純化脂酶制劑到面包生面團(tuán)混合物中時(shí)，對(duì)面包陳腐具有顯著延緩作用。
JP-62-285749-A描述了一種制作面包的方法，其中將脂酶與有活力的谷蛋白和卵磷脂混合添加到生面團(tuán)中。然而，據(jù)報(bào)道該脂酶使面包體積和面包屑彈性等質(zhì)量特征變壞。
Mohsen等(Egypt.J.Food Sci.，1986，14175-182)描述了由德列馬根霉產(chǎn)生的酯酶可以改善面包的柔軟度。
EP468731A1公開了一種包含葡萄糖氧化酶與各種氧化酶或水解酶如脂酶的結(jié)合的改進(jìn)面包的組合物。獲得了足夠體積的面包。然而，根據(jù)此先有技術(shù)文獻(xiàn)，單獨(dú)使用脂酶不產(chǎn)生具有滿意質(zhì)量的面包。
WO-94/04035公開了一種通過(guò)添加微生物來(lái)源的脂酶(EC3.1.1.3)到生面團(tuán)而改進(jìn)生面團(tuán)(添加或不添加脂肪)和/或由生面團(tuán)制作的烘烤產(chǎn)品特性的方法。使用微生物脂酶導(dǎo)致體積增加并改進(jìn)烘烤產(chǎn)品的柔軟度。另外，也發(fā)現(xiàn)了抗陳腐作用。
EP585988A1公開了一種包含至少一種脂酶、至少一種半纖維素酶和至少一種淀粉酶的面包改進(jìn)劑組合物。烘烤實(shí)驗(yàn)表明，在生面團(tuán)中單獨(dú)使用脂酶，不添加脂肪，使烘烤產(chǎn)品的體積減小，而當(dāng)在含添加脂肪的生面團(tuán)中使用脂酶時(shí)沒(méi)有觀察到對(duì)體積的作用。
WO98/45453公開了從黑色曲霉得到的脂酶在改進(jìn)面包屑結(jié)構(gòu)中的用途。然而，這種酶對(duì)面包體積和柔軟度沒(méi)有顯著改進(jìn)作用。
因此從先有技術(shù)可以得出脂酶的作用，當(dāng)作為生面團(tuán)添加劑時(shí)對(duì)于抗陳腐或延緩屑變硬及改善面包體積是高度可變的。
WO98/45453公開的脂酶的一個(gè)重要作用是，除了甘油三酯水解作用，它可以水解面粉中的極性糖脂，如雙半乳糖甘油二酯(DGDG)。假定面包屑結(jié)構(gòu)改進(jìn)作用可能與后一種作用相關(guān)。已經(jīng)表明黑色曲霉脂酶沒(méi)有磷脂水解作用。
已知使用磷脂酶可以改進(jìn)面包質(zhì)量。因此，JP-82-66213公開了磷脂酶C和溶血磷脂酶在改進(jìn)冷凍生面團(tuán)中的用途，EP575133A公開了磷脂酶A1在改進(jìn)生面團(tuán)加工特性中的用途，JP-60-078529描述了磷脂酶A在改進(jìn)小麥面生面團(tuán)和面條的機(jī)械特性中的用途，EP109244A公開了磷脂酶A可以用于改進(jìn)生面團(tuán)的特性。
由于本領(lǐng)域中已知添加脂酶或磷脂酶到生面團(tuán)可以改進(jìn)生面團(tuán)的機(jī)械特性和/或烘烤成品的質(zhì)量，因此一個(gè)重要的問(wèn)題是存在于面粉中的各個(gè)酶的脂底物量是有限的。小麥面粉生面團(tuán)中的脂酶底物是內(nèi)源性脂，其中約50％為非極性脂，50％為極性糖脂和磷脂。
目前用于烘烤行業(yè)中的一些脂酶，包括公開于EP585998和WO94/04035的脂酶僅僅對(duì)非極性脂部分是有活性的，因此形成游離脂肪酸和甘油以及較少的甘油單酯和甘油二酯。然而對(duì)生面團(tuán)或面包質(zhì)量的有益作用是有限的，因?yàn)橛坞x脂肪酸可能對(duì)面包質(zhì)量有不利的作用。除了對(duì)酰基甘油的作用外，公開于WO98/45453的真菌脂酶對(duì)極性糖脂有一定的水解作用。
另外，如上所述，建議將磷脂酶A和C作為改進(jìn)生面團(tuán)和/或面包的添加劑。這種磷脂酶的酶促作用是將存在于生面團(tuán)中的磷脂轉(zhuǎn)化為已知是有效乳化劑的對(duì)應(yīng)溶血磷脂酶。然而，面包生面團(tuán)中的內(nèi)源性磷脂量相對(duì)較少，因此選擇性對(duì)磷脂有活性的添加酶改進(jìn)生面團(tuán)和面包的作用是有限的。
因此需要一種可以水解生面團(tuán)中基本所有磷脂類型，即非極性?；视秃蜆O性磷脂以及糖脂的生面團(tuán)和/或面包改進(jìn)酶。本發(fā)明是基于對(duì)可以同時(shí)利用所有這些脂作為底物的脂解活性酶的發(fā)現(xiàn)，以及發(fā)現(xiàn)添加這種酶到生面團(tuán)導(dǎo)致生面團(tuán)穩(wěn)定性和強(qiáng)度以及加工特性顯著改進(jìn)，并導(dǎo)致以面包體積、面包屑結(jié)構(gòu)、面包屑外形和顏色、以及面包柔軟度的顯著改進(jìn)而體現(xiàn)的烘烤面包產(chǎn)品的質(zhì)量改進(jìn)。這些新型酶的一個(gè)特別使人感興趣和重要的方面是它們可以優(yōu)選作用于極性脂，這提示在?；视退怩ッ钢杏^察到的不良反應(yīng)可以通過(guò)優(yōu)選水解極性脂的選擇性酶而得到控制。這些新型酶的另一使人感興趣和重要的方面是，與短鏈脂肪酸如C4到C10脂肪酸相比，它們優(yōu)選作用于長(zhǎng)鏈脂肪酸，如C12到C20脂肪酸。
先有技術(shù)已經(jīng)表明在從德列馬根霉得到的脂酶中，鏈長(zhǎng)度選擇性受氨基酸取代的影響。R.D.Joerger等(Lipids，29(6)377-384(1994))表明突變體F95D，F(xiàn)112W和V209W對(duì)C4和C8酸的優(yōu)選性改變。R.R.Klein等(JAOCS，74(11)1401-1407(1997))公開了突變體V206T+F95D對(duì)C8脂肪酸具有更高的選擇性。R.R.Klein等(Lipids32(2)123-130(1997))表明突變體V209W+F112W，V94W和F95D+F214R對(duì)C4到C8脂肪酸具有更高的水解活性，并提示中鏈長(zhǎng)度特異性的結(jié)構(gòu)決定簇可能存在于?；Y(jié)合溝的遠(yuǎn)端。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的酶改進(jìn)生面團(tuán)和面包的作用可以通過(guò)添加如燕麥油等谷物脂形式的糖脂和/或磷脂到生面團(tuán)中而進(jìn)一步增強(qiáng)。
發(fā)明概述
因此，本發(fā)明第一方面涉及一種制備生面團(tuán)的方法，所述方法包含在生面團(tuán)成分中添加一種酶，這種酶在生面團(tuán)的條件下可以水解非極性脂、糖脂和磷脂，或添加含該酶的組合物，并混合生面團(tuán)成分而獲得生面團(tuán)。這種酶的任何脂底物可以是天然存在于面粉中的脂，或可以被添加到生面團(tuán)中。
另一方面，提供了一種改進(jìn)生面團(tuán)的組合物，包含一種酶，這種酶在生面團(tuán)的條件下可以水解非極性脂、糖脂和磷脂，并可選擇性水解至少另一種生面團(tuán)成分。另一種生面團(tuán)成分可以是，例如對(duì)生面團(tuán)特性和/或由生面團(tuán)制成的烘烤產(chǎn)品的質(zhì)量有改進(jìn)作用的其它酶。
另一方面，本發(fā)明涉及一種通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的生面團(tuán)和通過(guò)烘烤這種生面團(tuán)而獲得的烘烤產(chǎn)品，以及根據(jù)本發(fā)明制備的面條和意大利面食產(chǎn)品。
發(fā)明詳述
本發(fā)明有利地提供了一種改進(jìn)基于面粉的生面團(tuán)和由這種生面團(tuán)制成的產(chǎn)品的特性的方法。對(duì)于烘烤產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，這是通過(guò)提供一種制備烘烤產(chǎn)品的方法而達(dá)到的，這種烘烤產(chǎn)品具有高度需要的關(guān)于面包體積、屑結(jié)構(gòu)和外形的特征，并額外具有由柔軟度的增加而反映的延長(zhǎng)的儲(chǔ)存期，即相對(duì)于未使用本發(fā)明的酶而制作的烘烤產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，延遲了這種烘烤產(chǎn)品的陳腐。盡管目前優(yōu)選將此方法用于制作酵母發(fā)酵的面包產(chǎn)品如面包條、卷或烤面包，也考慮了將此方法用于任何其它類型的生面團(tuán)和基于生面團(tuán)的產(chǎn)品，如面條和意大利面食產(chǎn)品及蛋糕，其質(zhì)量可以通過(guò)添加本發(fā)明的酶而得到改善。
本方法包含一個(gè)實(shí)質(zhì)步驟，即將有效量的，在生面團(tuán)條件下可以水解非極性脂、糖脂和磷脂的酶，或含該酶的組合物直接加入已經(jīng)混合的生面團(tuán)或作為一種或更多生面團(tuán)成分而加入生面團(tuán)。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，一般用表達(dá)式“有效量”描述在生面團(tuán)條件下足夠使生面團(tuán)中的甘油三酯、磷脂和糖脂產(chǎn)生可檢測(cè)的水解的量。下面的實(shí)施例中給出了檢測(cè)這些水解活性的分析方法的例子。更具體地說(shuō)，這一表達(dá)式可以涉及不僅產(chǎn)生上述脂底物的可檢測(cè)的水解，還導(dǎo)致形成一定水平酶催化終產(chǎn)物的量，該終產(chǎn)物的水平可以改進(jìn)生面團(tuán)的特性，如顯著改進(jìn)粘度評(píng)分和/或延展性評(píng)分，這些改進(jìn)歸因于酶的添加，或者，如果烘烤生面團(tuán)，該終產(chǎn)物水平可以改進(jìn)烘烤產(chǎn)品的質(zhì)量，如面包體積增加，柔軟度增加或改進(jìn)屑結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的酶可以具有一些甘油三酯水解作用。除了甘油三酯水解活性，該酶也可以具有對(duì)磷脂和糖脂的水解活性。
另外，本發(fā)明的酶對(duì)磷脂和糖脂可以具有顯著水解活性，但具有較不顯著的甘油三酯水解作用。
可以將本發(fā)明的酶描述為可以同時(shí)水解?；视?甘油酯)(即，它具有通常與稱作脂酶(EC3.1.1.3)的一類酶相關(guān)的酯酶活性)、磷脂和糖脂如半乳糖脂的多功能酶。因此，此酶具有與許多通常稱作磷脂酶的酶相關(guān)的水解活性。磷脂通過(guò)兩組不同的酶以兩種不同的方式切斷，其中一種包含在一組脂酶中，包括磷脂酶A1和磷脂酶A2和磷酸二酯酶(磷脂酶C和D)。本發(fā)明的酶可以具有任何這些磷脂酶活性。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有本發(fā)明的酶的水解特征的酶可能對(duì)脂底物中的脂肪酸成分具有不同的親和性，這表示本發(fā)明的酶可能優(yōu)選水解含短鏈脂肪酸如C4到C10脂肪酸的脂，或者它可能優(yōu)選水解含長(zhǎng)鏈脂肪基團(tuán)如C12到C20脂肪酸的脂。對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸基團(tuán)具有優(yōu)選性的酶可以在如黃油脂肪或其它脂質(zhì)含有丁酸基團(tuán)的生面團(tuán)中特別有用，因?yàn)橐阎囊粋€(gè)問(wèn)題是游離丁酸可能引起不好的口感和味道。
在一個(gè)更優(yōu)選的方面，與短鏈脂肪酸如C4到C10脂肪酸相比，本發(fā)明的酶優(yōu)選水解含長(zhǎng)鏈脂肪酸，如C12到C20脂肪酸的脂。這就是說(shuō)，該酶優(yōu)選對(duì)短鏈脂肪酸具有相對(duì)低的活性，但對(duì)具有長(zhǎng)鏈脂肪酸的甘油酯特別有活性。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的酶對(duì)短鏈脂肪酸無(wú)活性。
使用對(duì)短鏈脂肪酸活性相對(duì)低的酶可以避免或抑制產(chǎn)生不好的味道，不好的味道可以由短鏈脂肪酸的釋放而導(dǎo)致。
從這種選擇性底物分布得到的一種提示是，可以根據(jù)配方和其脂含量選擇在給定生面團(tuán)中特別有活性的酶。
具有這里所描述的性質(zhì)的酶可以來(lái)自于各種來(lái)源，包括植物、動(dòng)物和微生物如細(xì)菌和真菌物種，包括酵母菌物種。本發(fā)明的酶可以來(lái)源于天然產(chǎn)生該酶的生物體或可以通過(guò)用編碼該酶的基因轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞而重組產(chǎn)生。該酶可以自身包含其所有酶活性的活性位點(diǎn)，也可以通過(guò)合成或使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建具有這里所描述的酶活性的雜交酶。
另外，起初不具有這里所定義的特定性質(zhì)的酶可以通過(guò)例如改變其氨基酸序列而進(jìn)行修飾，從而提供具有這里所定義的性質(zhì)，并具有所需底物特異性的酶。通過(guò)隨機(jī)誘變(US4,814,331，WO93/01285和WO 95/22615)而修飾酶以及通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變(WO97/04079)修飾脂解酶而獲得其改進(jìn)性能是本領(lǐng)域中公知的。通用的概念是在所討論的脂解酶的氨基酸鏈的結(jié)構(gòu)部分中插入、去除或取代氨基酸。適于進(jìn)行修飾的酶是可以水解酯鍵的酶。這種酶包括，例如，酯酶，如三酰甘油脂酶(EC3.1.1.3)、脂蛋白脂酶(EC3.1.1.34)、甘油單酯脂酶(EC3.1.1.23)、溶血磷脂酶、阿魏酸酯酶和酯酶(EC3.1.1.1，EC3.1.1.2)。
適于修飾的酶可以來(lái)自于各種來(lái)源，包括植物、動(dòng)物和微生物如細(xì)菌和真菌物種，包括酵母菌物種。適于修飾的酶的例子為假單孢菌脂酶，例如從蔥頭假單孢菌(US5,290,694)、P.glumae(Frenken N等(1992)Appl.Envir.Microbiol.583787-3791)，類產(chǎn)堿假單孢菌(EP 0 334 462)或假單孢菌SD705株(WO95/06720，EP 0 721981，WO96/27002，EP 0 812 910)得到的脂酶。另外，可以選擇的適于修飾的酶可以是例如真菌脂解酶，如腐質(zhì)霉族和結(jié)合菌族的脂解酶和真菌角質(zhì)酶(cutinases)。脂解酶腐質(zhì)霉族由從H.lanuginosaDSM4109株得到的脂酶和與此脂酶有大于50％同源性的脂酶組成。從H.lanuginosa(與Thermomyces lanuginosus同義)得到的脂酶描述于EP 0 258 068和EP 0 305 216，并具有表示于US5,869,438的SEQ ID NO.2的1-269位置的氨基酸序列。
目前優(yōu)選用于本發(fā)明的酶為脂酶SP972和脂酶SP979，其作用詳細(xì)描述于下面的實(shí)施例。
大多數(shù)谷物面粉含有可以作為本發(fā)明酶的底物的甘油三酯等非極性脂和磷脂和糖脂等極性脂。因此，在本發(fā)明方法的一種實(shí)施方案中，非極性脂、包括雙半乳糖甘油二酯(DGDG)的半乳糖脂等糖脂、以及磷脂酰膽堿(PC)等磷脂中的至少一種是存在于用于生面團(tuán)的面粉中的天然存在(或內(nèi)源性)脂成分。
然而，生面團(tuán)可能不含有足量本發(fā)明酶的所有脂底物。因此本發(fā)明包括給生面團(tuán)補(bǔ)充至少一種非極性脂、糖脂和磷脂，從而為酶提供足夠的底物。應(yīng)該理解“足夠的底物”表示為獲得上述生面團(tuán)改進(jìn)或烘烤產(chǎn)品改進(jìn)作用，三種主要類型的脂底物都是足夠的。
本發(fā)明酶的補(bǔ)充脂底物可以是非極性脂，如?；视?。根據(jù)本發(fā)明，可以使用各種這樣的脂，如植物油、植物脂肪、動(dòng)物油、動(dòng)物脂肪，如黃油脂肪和起酥。在這一點(diǎn)上，特別有用的脂是從谷物中得到的油或脂肪，如燕麥油。除甘油三酯外，燕麥油一般包含5-25％磷脂和5-12％糖脂?？梢苑逐s燕麥油，產(chǎn)生具有高極性脂含量的部分。
因此本發(fā)明的方法的一方面是可以將一種或更多磷脂加入生面團(tuán)。在這一點(diǎn)上，有用的磷脂包括磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰膽堿(PC)、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺(PE)。
根據(jù)本發(fā)明，加入的酶量為10-100,000LUT/千克面粉或10-100,000PLU/千克面粉，單位的名稱是下面實(shí)施例中所定義的，如50-50,000LUT或PLU/千克面粉，包括100-10,000LUT/千克面粉或100-10,000PLU/干克面粉。
本發(fā)明可以進(jìn)一步有利地提供一種獲得具有前面所定義的改進(jìn)質(zhì)量的烘烤產(chǎn)品。因此，在一種實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明的方法制備的生面團(tuán)是面包生面團(tuán)，此方法包含另一步，即烘烤生面團(tuán)而獲得烘烤產(chǎn)品。烘烤面包產(chǎn)品的一個(gè)特別需要的特征是如實(shí)施例中定義的高比容。因此，加入本發(fā)明的酶優(yōu)選使烘烤產(chǎn)品的比容相對(duì)于在除沒(méi)有加入酶外，其它都相同的條件下制作的烘烤產(chǎn)品增加至少10％。更優(yōu)選地，比容的增加至少為20％，如至少30％，如至少40％。
本發(fā)明可以進(jìn)一步提供意大利面食生面團(tuán)、面條生面團(tuán)和蛋糕生面團(tuán)或面糊和由這種生面團(tuán)或面糊制作的成品。
本領(lǐng)域中已知脂酶以外的其它酶可以對(duì)改進(jìn)生面團(tuán)性質(zhì)和烘烤產(chǎn)品質(zhì)量起作用。除了本發(fā)明的酶，將至少另一種酶加入生面團(tuán)也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另一種酶包括淀粉降解酶如內(nèi)或外淀粉酶、支鏈淀粉酶、脫支酶，木聚糖酶等半纖維素酶，纖維素酶和氧化還原酶，如葡萄糖氧化酶、脂酶、磷脂酶和己糖氧化酶。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的酶可以對(duì)某些糖脂如包括轉(zhuǎn)化為一種有效表面活性劑即雙半乳糖甘油單酯(DGMG)的雙半乳糖甘油二酯(DGDG)的半乳糖脂特別具有活性。因此在有用的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶可以水解至少25％的起初存在于生面團(tuán)中的DGDG，優(yōu)選水解至少50％DGDG，如至少60％或至少75％。
此酶的另一種有用的脂底物是磷脂、磷脂酰膽堿(PC)。因此，在有用的實(shí)施方案中，此酶可以降解至少25％，優(yōu)選至少50％包括至少60％如至少75％的起初存在于生面團(tuán)中的PC。
這些酶的一個(gè)有利的方面是它們對(duì)前面定義的某些脂底物類型比對(duì)其它類型具有更強(qiáng)的水解活性。因此相對(duì)于非極性甘油三酯，這些酶對(duì)極性脂相對(duì)更有活性。這可以通過(guò)分析任何被水解的脂底物類型的量，然后構(gòu)建描述任何脂底物對(duì)，如甘油三酯與糖脂或甘油三酯與磷脂的水解間的關(guān)系的曲線而說(shuō)明。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶的特征在于酶水解甘油三酯的能力和水解糖脂的能力之間的關(guān)系可以描述為斜率為至少1.0，如至少1.5或至少2.0的曲線，或其特征在于酶水解甘油三酯的能力和水解磷脂的能力之間的關(guān)系可以描述為斜率為至少0.1，如至少0.2，包括至少0.5或至少1.0的曲線。
另一方面，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)生面團(tuán)的組合物，包含一種在生面團(tuán)條件下可以水解非極性脂、糖脂和磷脂，并選擇性水解至少另一種生面團(tuán)成分的酶。另一種生面團(tuán)成分可以是，如另一種前面所定義的酶，包括不具有本發(fā)明酶的底物分布的脂酶或磷脂酶。其它可以加入組合物的適當(dāng)生面團(tuán)成分包括小麥面粉、米粉和玉米粉等谷物面粉、酵母、化學(xué)發(fā)酵劑、生面團(tuán)加強(qiáng)劑如氧化還原酶和抗壞血酸、乳化劑、糖、上述類型的?；视?、磷脂如大豆卵磷脂和蛋卵磷脂、糖脂和鹽。
本發(fā)明的另一方面提供了一種制備上述生面團(tuán)的方法，其中如上所述將酶加入組合物并根據(jù)本發(fā)明的方法獲得生面團(tuán)。這種生面團(tuán)可以是新鮮生面團(tuán)，可選擇在控制的保護(hù)氣氛下包裝使其保持新鮮，或可以是冷凍生面團(tuán)。
盡管一些具有這里定義的特定性質(zhì)的酶可以由本領(lǐng)域中的技術(shù)人員輕易鑒定，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種方法，用于鑒定可以水解非極性脂、糖脂和磷脂或鑒定另一些酶，這些酶適合開發(fā)為可以水解非極性脂、糖脂和磷脂的酶。這些適合開發(fā)為本發(fā)明酶的酶是從黑色曲霉得到的脂酶，公開于WO98/45453(在此引入作為參考)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種開發(fā)可以水解非極性脂、糖脂和磷脂的酶的方法。
克隆編碼酶的核苷酸序列
編碼具有此處定義的特定性質(zhì)的酶或適于修飾的酶的核苷酸序列可以從任何產(chǎn)生該酶的細(xì)胞或生物體分離。許多分離核苷酸序列的方法是本領(lǐng)域公知的。
例如，可以使用產(chǎn)生酶的生物體中的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。如果已知該酶的氨基酸序列，可以合成標(biāo)記的寡核苷酸探針，并用其從生物體制備的基因組文庫(kù)中識(shí)別編碼酶的克隆。另外，含有與另一種已知酶基因同源的序列的標(biāo)記寡核苷酸探針可以用于識(shí)別編碼酶的克隆。在后一種情況下，使用低嚴(yán)格性的雜交和洗滌條件。
此外，可以通過(guò)以下方法鑒別編碼酶的克隆，將基因組DNA片段插入質(zhì)粒等表達(dá)載體，用得到的基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化酶陰性細(xì)菌，然后將被轉(zhuǎn)化細(xì)菌平鋪于含酶底物(即麥芽糖)的瓊脂糖上，從而允許識(shí)別表達(dá)該酶的克隆。
在另一種替代方案中，可以通過(guò)已確立的標(biāo)準(zhǔn)方法，如BeucageS.L.等(1981)在Tetrahedron Letters22，p1859-1869中描述的phosphoroamidite法，或Matthes等(1984)在EMBO J.3，p801-805中描述的方法而合成制備編碼酶的核苷酸序列。在phosphoroamidite法中，如在自動(dòng)DNA合成器中合成寡核苷酸，純化、退火、連接和在適當(dāng)載體中克隆。
核苷酸序列可以是混合的基因組和合成來(lái)源，混合的合成和cDNA來(lái)源，或混合的基因組和cDNA來(lái)源，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)連接(適當(dāng)?shù)?合成、基因組或cDNA來(lái)源的片段而制備。每一個(gè)被連接片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)核苷酸序列的各種部分。也可以通過(guò)使用特異性引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)而制備DNA序列，例如美國(guó)專利4,683,202或Saiki R K等(Science(1998)239，pp487-491)的描述。
核苷酸序列
本發(fā)明也包括編碼具有這里定義的特定性質(zhì)的酶的核苷酸序列。這里用到的“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其變異體、同源物、片段和衍生物(如其部分)。核酸序列可以是基因組或合成或重組來(lái)源，可以是雙鏈或單鏈，代表有意義鏈或反義鏈。
與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列“包括基因組DNA、cDNA、合成DNA和RNA。它優(yōu)選表示DNA，更優(yōu)選表示本發(fā)明的編碼序列的cDNA。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列本身不包含當(dāng)與處于天然環(huán)境中的與其天然相關(guān)的序列連接時(shí)，存在于其天然環(huán)境中的本發(fā)明的天然核苷酸序列。為了更容易參考，我們將稱此優(yōu)選實(shí)施方案為“非天然核苷酸序列”。在這一點(diǎn)上，“天然核苷酸序列”表示處于其天然環(huán)境，并且與一個(gè)與其天然相關(guān)的完整啟動(dòng)子可操作性連接時(shí)的完整核苷酸序列，該啟動(dòng)子也處于其天然環(huán)境中。因此，本發(fā)明的酶可以由在其天然生物體中的核苷酸序列表達(dá)，但其中該核苷酸序列不處于在該生物體中與其天然相關(guān)的啟動(dòng)子的控制下。
本發(fā)明的酶可以與其它酶結(jié)合使用。因此本發(fā)明也包含了酶的組合，其中該組合包含了本發(fā)明的酶和另一種酶，它可以是本發(fā)明的另一種酶。
該酶優(yōu)選不是天然酶。在這一點(diǎn)上，“天然酶”表示處于其天然環(huán)境中并由其天然核苷酸序列表達(dá)時(shí)的完整酶。
一般地，本發(fā)明的核苷酸序列是用重組DNA技術(shù)(即重組的DNA)制備。然而，在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，整個(gè)或部分核苷酸序列可以是用本領(lǐng)域中公知的化學(xué)方法合成的(見Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23和Horn T等(1980)Nuc Acids ResSymp Ser225-232)。
氨基酸序列
本發(fā)明也包括具有這里所定義的特定性質(zhì)的酶的氨基酸序列。
這里使用的“氨基酸序列”是“肽”和/或“蛋白”的同義詞。在一些情況下，“氨基酸序列”與“肽”同義。在一些情況下，“氨基酸序列”與“酶”同義。
可以從適當(dāng)?shù)膩?lái)源制備/分離氨基酸序列，或可以合成或可以使用重組DNA技術(shù)制備。
變異體/同源物/衍生物
本發(fā)明也包含本發(fā)明的酶的任何氨基酸或任何編碼這種酶的核苷酸序列的變異體、同源物和衍生物的用途。這里，名詞“同源物”表示與主題氨基酸和主題核苷酸序列具有一定同源性的實(shí)體。這里“同源性”可以等同于“同一性”。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，同源序列包括至少75，85或90％等同于，優(yōu)選至少95或98％等同于主題序列的氨基酸序列。一般地，同源物將包含與主題氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等。盡管也可以根據(jù)相似性(即具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)考慮同源性，在本發(fā)明的內(nèi)容中，優(yōu)選根據(jù)序列同一性表達(dá)同源性。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，同源序列包括至少75，85或90％等同于，優(yōu)選至少95或98％等同于編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列(主題序列)的核苷酸序列。一般地，同源物將包含與主題氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)。盡管也可以根據(jù)相似性(即具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)考慮同源性，在本發(fā)明的內(nèi)容中，優(yōu)選根據(jù)序列同一性表達(dá)同源性。
同源性比較可以通過(guò)肉眼進(jìn)行，或通常利用容易獲得的序列比較程序的幫助。這些商業(yè)上可獲得的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個(gè)或更多序列之間的同源百分比。
可以對(duì)鄰接序列進(jìn)行同源百分比計(jì)算，即將一個(gè)序列與另一個(gè)序列進(jìn)行對(duì)比，并將一個(gè)序列中的每個(gè)氨基酸與另一個(gè)序列中的對(duì)應(yīng)氨基酸進(jìn)行直接比較，一次一個(gè)殘基。這稱作“無(wú)空位”對(duì)比。一般地，這種無(wú)空位對(duì)比只在相對(duì)少的殘基中進(jìn)行。
盡管這是一個(gè)非常簡(jiǎn)單和穩(wěn)定的方法，它不能考慮例如，在本來(lái)為等同的序列對(duì)中，一個(gè)插入或缺失將使后面的氨基酸對(duì)比失效，這樣會(huì)導(dǎo)致在進(jìn)行總體對(duì)比時(shí)同源百分比很大程度減低。因此，將大多數(shù)序列對(duì)比方法設(shè)計(jì)為產(chǎn)生考慮了可能的插入和缺失而不對(duì)總體同源性得分進(jìn)行過(guò)度罰分的最優(yōu)對(duì)比。這是通過(guò)在序列對(duì)比中插入“空位”而試圖使局部同源性最大化而達(dá)到的。
然而，這些更復(fù)雜的方法給出現(xiàn)在對(duì)比中的每個(gè)空位指定了“空位罰分”，因此，對(duì)于同樣數(shù)目的等同氨基酸，一個(gè)具有盡可能少的空位的序列對(duì)比反映了兩個(gè)對(duì)比序列之間的更高的相關(guān)性，它將比有許多空位的序列得到更高分。一般使用的“親族空位值”對(duì)空位的存在罰掉相對(duì)高的值，對(duì)于空位中的每個(gè)后續(xù)的殘基罰掉更少的分。這是最常用的空位評(píng)分系統(tǒng)。高空位罰分當(dāng)然將產(chǎn)生具有更少空位的最優(yōu)對(duì)比。大多數(shù)對(duì)比程序允許修改空位罰分。然而，當(dāng)使用這種序列對(duì)比軟件時(shí)優(yōu)選使用默認(rèn)值。例如當(dāng)使用GCG Wisconsin Bestfit軟件包時(shí)，氨基酸序列的默認(rèn)空位罰分為每個(gè)缺口-12，每個(gè)延伸-4。
因此計(jì)算最大同源百分比首先要求產(chǎn)生最優(yōu)對(duì)比，考慮空位罰分。執(zhí)行這種對(duì)比的適當(dāng)計(jì)算機(jī)程序?yàn)镚CG Wisconsin Bestfit軟件包(Devereux et al 1984 Nuc.Acids Research 12 p387)。其它可以進(jìn)行序列對(duì)比的軟件的例子包括，但不限于BLAST軟件包(見Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology，4thEd-Chapter18)，F(xiàn)ASTA(Altschul et al 1990 J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORK對(duì)比工具序列。BLAST和GENEWORK都可進(jìn)行離線和在線搜索(見Ausubel et al 1999，7-58到7-60頁(yè))。然而，對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一種稱作BLAST2序列的新工具也可以用于比較蛋白和核苷酸序列(見FEMS Microbiol Lett1999 174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
盡管最終同源性百分比可以根據(jù)同一性而測(cè)量，對(duì)比過(guò)程自身一般不以全或無(wú)配對(duì)比較為基礎(chǔ)。相反，通常使用標(biāo)準(zhǔn)的相似性評(píng)分矩陣將得分分配到每個(gè)以化學(xué)相似性或進(jìn)化距離為基礎(chǔ)而進(jìn)行的配對(duì)比較。這種常用矩陣的一個(gè)例子是BLOSUM62矩陣，即BLAST程序系列的默認(rèn)矩陣。GCG Wisconsin程序一般用公共默認(rèn)值或如果已提供，則使用客戶符號(hào)比較表(更詳細(xì)內(nèi)容見使用者手冊(cè))。對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選將公共默認(rèn)值用于GCG軟件包，或在使用其它軟件的情況下，使用默認(rèn)矩陣如BLOSUM62。
一旦軟件產(chǎn)生最優(yōu)對(duì)比，就可以計(jì)算同源百分比，優(yōu)選序列等同百分比。軟件一般作為序列對(duì)比的一部分進(jìn)行此計(jì)算并產(chǎn)生數(shù)字結(jié)果。
序列也可以有產(chǎn)生沉默改變并導(dǎo)致產(chǎn)生功能等同物質(zhì)的氨基酸殘基缺失、插入或取代。只要保持了物質(zhì)的二級(jí)結(jié)合活性，可以根據(jù)殘基極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、和/或雙親性的相似而進(jìn)行有意的氨基酸取代。例如，帶負(fù)電的氨基酸包括天門冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；以及具有相似親水性值的有不帶電極性首基的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以進(jìn)行保守的取代，例如根據(jù)下表。在第二列的同一格中的氨基酸，優(yōu)選第三列的同一行中的氨基酸可以互相取代
本發(fā)明也包含可以發(fā)生相似物取代相似物，如堿性取代堿性、酸性取代酸性、極性取代極性等的同源取代(這里用到的取代和替代都表示用可選擇的氨基酸殘基交換存在的氨基酸殘基)。也可以發(fā)生非同源取代，即從一類殘基取代為另一類，或引入非天然氨基酸如鳥氨酸(此后稱作Z)，二氨基丁酸鳥氨酸(此后稱作B)、正亮氨酸烏氨酸(此后稱作O)、pyriylalanine、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
也可用非天然氨基酸替代，包括α*和α雙取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的鹵化衍生物如三氟酪氨酸*、對(duì)-氯苯丙氨酸*、對(duì)-溴苯丙氨酸*、對(duì)-碘苯丙氨酸*、L-烯丙基甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基異丁酸*、L-ε-氨基己酸*、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正纈氨酸*、對(duì)-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羥基脯氨酸#、L-硫脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物，如4-甲基苯丙氨酸*、五甲基苯丙氨酸*、L-苯丙氨酸(4-氨基)#、L-酪氨酸(甲基)*、L-苯丙氨酸(4-異丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四羥基異喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸*和L-苯丙氨酸(4-芐基)*。符號(hào)*是為上述討論(關(guān)于同源或非同源取代)的目的而使用的，表示衍生物的疏水性，而#是用于表示衍生物的親水性，#*表示雙親性特征。
變異氨基酸序列可以包括可以插入序列的任意兩個(gè)氨基酸殘基之間的適當(dāng)間隔基，如甲基、乙基等烷基或丙基以及氨基酸間隔基如甘氨酸或β丙氨酸殘基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解，變異的其它形式包括以peptoid形式存在的一種或更多氨基酸殘基。為了避免疑問(wèn)，“peptoid形式”是指變異氨基酸殘基，其中α碳取代基是在殘基的氮原子上，而不是在α碳上。制備peptoid形式的肽的方法是本領(lǐng)域中公知的，如Simon RJ et al.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
用于本發(fā)明中的核苷酸序列可以包括合成或修飾核苷酸。許多不同類型的寡核苷酸修飾是本領(lǐng)域中公知的。這些修飾包括磷酸甲酯和硫代磷酸酯主鏈和/或在分子的3’和/或5’端加入吖啶或聚賴氨酸鏈。對(duì)本發(fā)明而言，應(yīng)該理解這里描述的核苷酸序列可以用本領(lǐng)域中的任意可行方法進(jìn)行修飾。這些修飾的進(jìn)行可以是為了增強(qiáng)本發(fā)明的核苷酸序列的體內(nèi)活性或壽命。
本發(fā)明也包含與這里提出的序列，或其任意衍生物、片段或衍生物互補(bǔ)的核苷酸序列。如果序列與其片段互補(bǔ)，那么此序列可以用作探針，從而識(shí)別其它生物中的相似編碼序列。
可以通過(guò)許多途徑獲得不與本發(fā)明的序列100％同源，但處于本發(fā)明范圍中的多核苷酸。這里描述的序列的其它變異體可以通過(guò)探測(cè)從一定范圍的個(gè)體，如不同人群中的個(gè)體制作的DNA文庫(kù)等方法獲得。此外，可以獲得其它病毒/細(xì)菌、或細(xì)胞同源物特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如大鼠、小鼠、牛和靈長(zhǎng)目動(dòng)物細(xì)胞)中的細(xì)胞同源物，并且這些同源物及其片段總體上將可以與這里列出的序列選擇性雜交。這些序列的獲得可以通過(guò)在中度至高度嚴(yán)格條件下探測(cè)由其它動(dòng)物物種基因組DNA文庫(kù)制作的cDNA文庫(kù)，以及用包含所附序列表中的任意序列的全部或部分的探針探測(cè)這些文庫(kù)?？梢詰?yīng)用相似的考慮，以獲得物種同源物和本發(fā)明的多肽或核苷酸序列的等位基因變異體。
變異體和株/種同源物也可以用簡(jiǎn)并PCR獲得，它將使用的引物被設(shè)計(jì)為定向于本發(fā)明序列內(nèi)編碼變異體和同源物的保守氨基酸序列內(nèi)的序列?？梢酝ㄟ^(guò)例如，對(duì)比來(lái)源于一些突變體/同源物的氨基酸序列而預(yù)測(cè)保守序列?？梢杂帽绢I(lǐng)域中已知的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行序列對(duì)比。例如GCG Wisconsin PileUp程序已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。
應(yīng)用于簡(jiǎn)并PCR的引物將包含一個(gè)或更多簡(jiǎn)并位置，并將在相對(duì)于用已知序列的單序列引物克隆序列時(shí)所用條件嚴(yán)格性更低的條件下使用。
此外，這些多肽可以通過(guò)特征序列的定點(diǎn)誘變獲得。這在例如要求用沉默密碼子序列改變來(lái)優(yōu)化表達(dá)多核苷酸序列的特定宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子的位置可能是有用的。為引入限制酶識(shí)別位點(diǎn)，或改變由多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)或功能，可能需要其它序列改變。
本發(fā)明的多核苷酸(核苷酸序列)可以用于產(chǎn)生引物，如PCR引物、用于其它擴(kuò)增反應(yīng)的引物，探針，如通過(guò)使用放射性或非放射性標(biāo)記的常規(guī)方法用顯示性標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的探針，或可以克隆到載體的多核苷酸。這些引物、探針和其它片段長(zhǎng)度可以為至少15個(gè)，優(yōu)選至少20個(gè)，例如至少25、30或40個(gè)核苷酸，并且包含在本發(fā)明所用名詞多核苷酸的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探針可以重組、合成或通過(guò)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可行的方法產(chǎn)生。也可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆。
通常，引物是用合成方法產(chǎn)生，包括逐步制造需要的核酸序列，每次一個(gè)核苷酸。實(shí)現(xiàn)這種自動(dòng)技術(shù)的方法是本領(lǐng)域中已有的。
一般可以用重組方法，如使用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))克隆技術(shù)產(chǎn)生更長(zhǎng)的多肽。這包括制造在需要克隆的定位于脂的序列區(qū)域側(cè)翼的引物對(duì)(如約15到30個(gè)核苷酸)，使引物與從動(dòng)物或人細(xì)胞獲得的mRNA或cDNA接觸，在允許所需區(qū)域擴(kuò)增的條件下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分離擴(kuò)增片段(如通過(guò)在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合物)并回收擴(kuò)增DNA?？梢詫⒁镌O(shè)計(jì)為包含適當(dāng)?shù)南拗泼缸R(shí)別位點(diǎn)，使擴(kuò)增的DNA被克隆到適當(dāng)?shù)目寺≥d體。
雜交
本發(fā)明也包括與本發(fā)明的序列互補(bǔ)的序列或可以與本發(fā)明的序列或其互補(bǔ)序列雜交的序列。
這里用到的名詞“雜交”應(yīng)包括“一種使核酸鏈通過(guò)堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的過(guò)程”，以及在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中進(jìn)行的擴(kuò)增過(guò)程。
本發(fā)明也包含可以與這里所述序列，或其任意衍生物、片段或其衍生物互補(bǔ)的序列雜交的核苷酸序列的用途。
名詞“變異體”也包括可以與這里所述核苷酸序列雜交的序列的互補(bǔ)序列。
名詞“突變體”優(yōu)選包括可以在嚴(yán)格條件下(如50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0})與這里所述核苷酸序列雜交的序列的互補(bǔ)序列。
名詞“突變體”更優(yōu)選包括可以在高嚴(yán)格條件下(如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH7.0})與這里所述核苷酸序列雜交的序列的互補(bǔ)序列。
本發(fā)明也涉及可以與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括這里所述序列的互補(bǔ)序列)。
本發(fā)明也涉及可以與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括這里所述序列的互補(bǔ)序列)的互補(bǔ)序列。
可以在中度到最大嚴(yán)格條件下與這里所述核苷酸序列雜交的多核苷酸序列也包括在本發(fā)明的范圍中。
在一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明包含可以在嚴(yán)格條件下(如50℃和0.2×SSC)與本發(fā)明的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。
在一個(gè)更優(yōu)選的方面，本發(fā)明包含可以在高嚴(yán)格條件下(如65℃和0.1×SSC)與本發(fā)明的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。
定點(diǎn)誘變
一旦分離出編碼酶的核苷酸序列，可能需要使序列突變，從而制備本發(fā)明的酶。
可以用合成寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有所需突變位點(diǎn)的側(cè)翼核苷酸序列。
適合的方法公開于Morinaga et al(Biotechnology(1984)2，p646-649)，其中在攜帶酶基因的載體中建立單鏈DNA空位，酶編碼序列。然后將攜帶所需突變的合成核苷酸退火于單鏈DNA的同源部分。然后將DNA聚合酶I填入剩余的空位(克列諾片段)并用T4連接酶連接構(gòu)建體。
美國(guó)專利4,760,025公開了通過(guò)進(jìn)行基因盒的微小改變而引入編碼多個(gè)突變的寡核苷酸。然而，通過(guò)上述Morinaga法甚至可以在任意一個(gè)時(shí)間引入更多的突變，因?yàn)榭梢砸敫鞣N長(zhǎng)度的多個(gè)寡核苷酸。
另一種將突變引入編碼酶的核苷酸序列的方法描述于Nelson andLong(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)。這種方法包括含需要突變的PCR片段的三步產(chǎn)生法，該突變是通過(guò)在PCR反應(yīng)中使用化學(xué)合成的DNA鏈作為引物之一而引入的。可以通過(guò)用限制性內(nèi)切酶切除DNA片段并將其重新插入表達(dá)質(zhì)粒，從PCR產(chǎn)生的片段分離攜帶突變的DNA片段。
另外，Sierks et al(Protein Eng(1989)2，621-625andProtein Eng(1990)3，193-198)描述了曲霉屬葡糖淀粉酶的定點(diǎn)誘變。
酶的表達(dá)
本發(fā)明中使用的核苷酸序列可以被插入重組可復(fù)制載體。載體可以用于在相容的宿主中和/或由容的宿主復(fù)制和以酶的形式表達(dá)該核苷酸序列?？梢杂冒▎?dòng)子/增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)的控制序列控制表達(dá)?？梢允褂迷藛?dòng)子和在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子?？梢允褂媒M織特異性或刺激特異性啟動(dòng)子。也可以使用包含從兩種或更多不同的上述啟動(dòng)子得到的序列元件的嵌合啟動(dòng)子。
通過(guò)核苷酸序列表達(dá)而由宿主重組細(xì)胞產(chǎn)生的酶可以被分泌或包含在細(xì)胞內(nèi)，這取決于使用的序列和/或載體?？梢詫⒕幋a序列設(shè)計(jì)為具有信號(hào)序列，該信號(hào)序列指導(dǎo)物質(zhì)編碼序列通過(guò)特定原核或真核細(xì)胞膜而分泌。
表達(dá)載體
名詞“表達(dá)載體”表示可以體內(nèi)或體外表達(dá)的構(gòu)建體。
表達(dá)載體優(yōu)選摻入生物體基因組。“摻入”優(yōu)選包括穩(wěn)定摻入基因組。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含本發(fā)明的構(gòu)建體。選擇性表達(dá)的，優(yōu)選本發(fā)明的核苷酸序列存在于載體中，核苷酸序列在其中被可操作性連接到調(diào)節(jié)序列，使得調(diào)節(jié)序列可以通過(guò)適當(dāng)宿主生物體提供核苷酸序列的表達(dá)，即載體為表達(dá)載體。
本發(fā)明的載體可以被轉(zhuǎn)化到下面敘述的適當(dāng)宿主細(xì)胞中，從而提供本發(fā)明多肽的表達(dá)。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種制備用于本發(fā)明后續(xù)用途的多肽的方法，包含在提供由載體表達(dá)編碼多肽的編碼序列的條件下培養(yǎng)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，并回收所表達(dá)的肽。
載體可以是例如，具有提供的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒、病毒或噬菌體，可以選擇用于所述多肽表達(dá)的啟動(dòng)子，也可選擇啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)因子。載體的選擇通常將依賴于所引入的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的載體可以包含一種或更多可選擇的標(biāo)記基因。用于工業(yè)微生物的最適當(dāng)?shù)倪x擇系統(tǒng)是由一組選擇標(biāo)記形成的、不要求宿主生物體中突變的系統(tǒng)。適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記可以是從枯草芽孢桿菌或地衣形芽孢桿菌得到的dal基因，或賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。其它的選擇標(biāo)記可以是曲霉選擇標(biāo)記，如amdS，argB，niaD和sC，或產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記。其它真菌選擇標(biāo)記的例子為ATP合成酶的基因、亞單位9(oliC)、乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶(pvrA)、腐草霉素和苯菌靈抗性基因(benA)。非真菌選擇標(biāo)記的例子為細(xì)菌G418抗性基因(也可以用于酵母，但不能用于絲狀真菌)、氨芐青霉素抗性基因(大腸桿菌)、新霉素抗性基因(芽孢桿菌屬)以及編碼β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的大腸桿菌uidA基因。其它適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記包括從枯草芽孢桿菌或地衣形芽孢桿菌得到的dal基因。另外，可以通過(guò)共轉(zhuǎn)化完成選擇(如WO91/17243中所描述)。
載體可以體外使用，如用于產(chǎn)生RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
因此，可以將用于本發(fā)明用途的核苷酸序列摻入載體(一般是可復(fù)制載體)，例如克隆或表達(dá)載體。載體可以用于在相容宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因此在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過(guò)將本發(fā)明的核苷酸序列引入可復(fù)制載體，將載體引入相容的宿主細(xì)胞，并且在產(chǎn)生載體復(fù)制的條件下使宿主細(xì)胞生長(zhǎng)而制造本發(fā)明的核苷酸序列的方法。可以從宿主細(xì)胞回收載體。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞在下文中聯(lián)系表達(dá)載體而描述。
用于連接編碼具有這里定義的特定性質(zhì)的酶的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體和調(diào)節(jié)序列、以及將它們插入適當(dāng)含有復(fù)制所必需的信息的載體的過(guò)程是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(例如見Sambrook et al MolecularCloningA laboratory Manual，2nd Ed.(1989))。
載體可以進(jìn)一步包含使載體在討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核苷酸序列。這種序列的例子是質(zhì)粒pUC19，pACYC177 pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
調(diào)節(jié)序列
在一些應(yīng)用中，本發(fā)明中使用的核苷酸序列被可操作性連接到可以通過(guò)所選的宿主細(xì)胞等提供核苷酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。通過(guò)實(shí)施例的方式，本發(fā)明涵蓋了包含與這種調(diào)節(jié)序列可操作性連接的本發(fā)明的核苷酸序列的載體，即載體為表達(dá)載體。
名詞“可操作性連接的”是指一種并列位置，其中所描述的成分處于允許它們以試圖達(dá)到的方式起作用。與編碼序列“可操作性連接”的調(diào)節(jié)序列的連接方式允許在與控制序列相容的條件下完成編碼序列的表達(dá)。
名詞“調(diào)節(jié)序列”包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子及其它表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)。
名詞“啟動(dòng)子”是在本領(lǐng)域的常規(guī)含義范圍內(nèi)使用的，如RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。
編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列的增強(qiáng)表達(dá)也可以通過(guò)選擇異源調(diào)節(jié)區(qū)，如啟動(dòng)子、分泌前導(dǎo)序列和終止子區(qū)而完成，這可以增加表達(dá)，并且如果需要，可以增加感興趣蛋白從所選表達(dá)宿主的分泌水平和/或提供對(duì)本發(fā)明酶的表達(dá)的誘導(dǎo)型控制。在真核生物中，聚腺苷酸化序列可以與編碼酶的核苷酸序列可操作性連接。
本發(fā)明的核苷酸序列優(yōu)選可以與至少一個(gè)啟動(dòng)子可操作性連接。
除了編碼本發(fā)明核苷酸序列的基因的天然啟動(dòng)子，也可使用其它啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)本發(fā)明多肽的表達(dá)。可以根據(jù)啟動(dòng)子指導(dǎo)本發(fā)明的核苷酸序列在所需表達(dá)宿主中的表達(dá)的效率而選擇啟動(dòng)子。
在另一種實(shí)施方案中，可以選擇組成型啟動(dòng)子用于指導(dǎo)本發(fā)明所需核苷酸的表達(dá)。這種表達(dá)構(gòu)建體可以提供額外的益處，因?yàn)樗恍枰诤T導(dǎo)底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)宿主。
優(yōu)選用于真菌表達(dá)宿主中的強(qiáng)組成型和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子為可以從木聚糖酶(xlnA)、肌醇六磷酸酶、ATP合成酶、亞單位9(olic)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)、醇脫氫酶(AdhA)、α淀粉酶(amy)、淀粉葡糖苷酶(AG-從glaA基因得到)、乙酰胺酶(amdS)、和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動(dòng)子的真菌基因獲得的啟動(dòng)子。對(duì)真菌宿主中的轉(zhuǎn)錄有用的啟動(dòng)子的其它例子是來(lái)自于編碼米曲霉TAKA淀粉酶、啤酒糖酵母的TPI(丙糖磷酸異構(gòu)酶)啟動(dòng)子(Alber et al(1982)J.Mol.Appl.Genet.1，p419-434)、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑色曲霉中性α淀粉酶、黑色曲霉酸穩(wěn)定α淀粉酶、黑色曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶的基因的啟動(dòng)子。
強(qiáng)酵母啟動(dòng)子的例子是可以從醇脫氫酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因獲得的啟動(dòng)子。
強(qiáng)細(xì)菌啟動(dòng)子的例子是α淀粉酶和SP02啟動(dòng)子，以及從細(xì)胞外蛋白酶基因得到的啟動(dòng)子。用于指導(dǎo)核苷酸轉(zhuǎn)錄特別是在細(xì)菌宿主中轉(zhuǎn)錄的其它適當(dāng)啟動(dòng)子的例子是大腸桿菌lac操縱子啟動(dòng)子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因dagA啟動(dòng)子、地衣形芽孢桿菌α淀粉酶基因(amyL)啟動(dòng)子、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)啟動(dòng)子、解淀粉芽孢桿菌α淀粉酶基因(amyQ)啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌xy1A和xy1B基因啟動(dòng)子。
雜交啟動(dòng)子也可以用于改善表達(dá)構(gòu)建體的誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)。
啟動(dòng)子也可以另外包含確?；蛟黾釉谶m當(dāng)宿主中的表達(dá)的特征。例如，這些特征可以存在于保守區(qū)如普里布諾框或TATA框。啟動(dòng)子甚至可以包含其它影響(如維持、增強(qiáng)、減弱)本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)水平的序列。例如，其它適當(dāng)?shù)男蛄邪⊿h1內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。其它序列包括誘導(dǎo)型元件—如溫度、化學(xué)、光或應(yīng)激誘導(dǎo)型元件。也可以存在增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄或翻譯的適當(dāng)元件。后一種元件的一個(gè)例子是TMV5’信號(hào)序列(見Sleat 1987 Gene217，217-225和Dawson 1993 PlantMol.Biol.2397)。
構(gòu)建體
名詞“構(gòu)建體”與“接合體”、“盒”和“雜交體”是同義的一包括直接或間接附著于啟動(dòng)子的用于本發(fā)明用途的核苷酸序列。間接附著的例子是在啟動(dòng)子和本發(fā)明的核苷酸序列間提供適當(dāng)?shù)拈g隔基如內(nèi)含子序列，如Sh-1內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。與本發(fā)明有關(guān)的名詞“融合的”也是如此，它包括直接或間接附著。在一些情況下，此名詞不涵蓋一般與野生型基因啟動(dòng)子相關(guān)的蛋白的編碼核苷酸序列的天然組合，也不涵蓋它們都處于天然環(huán)境的情況。
構(gòu)建體甚至可以包含或表達(dá)一種標(biāo)記，該標(biāo)記允許在例如細(xì)菌，優(yōu)選芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌、或該標(biāo)記轉(zhuǎn)移到的植物中選擇遺傳構(gòu)建體?？梢允褂么嬖诘母鞣N標(biāo)記，如編碼麥芽糖-6-磷酸異構(gòu)酶(特別是對(duì)于植物)的標(biāo)記或提供抗生素抗性，如G418、潮霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素和慶大霉素抗性的標(biāo)記。
對(duì)于一些應(yīng)用，本發(fā)明的構(gòu)建體優(yōu)選包含至少一個(gè)與啟動(dòng)子可操作性連接的核苷酸序列。
宿主細(xì)胞
與本發(fā)明相關(guān)的名詞“宿主細(xì)胞”包括任何包含上述核苷酸序列或表達(dá)載體的細(xì)胞，它被用于重組產(chǎn)生具有這里所述特定性質(zhì)的酶。
因此，本發(fā)明的另一種實(shí)施方案提供了用表達(dá)本發(fā)明的酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。所述核苷酸序列優(yōu)選由復(fù)制或表達(dá)該核苷酸序列的載體攜帶。將選擇與該載體相容的細(xì)胞，可以是例如原核(例如細(xì)菌)細(xì)胞、真菌、酵母或植物細(xì)胞。
革蘭氏陰性菌大腸桿菌被廣泛用作異源基因表達(dá)的宿主。然而，大量異源蛋白容易在細(xì)胞內(nèi)聚集。從大量大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白中后續(xù)純化所需蛋白有時(shí)會(huì)很困難。
相對(duì)于大腸桿菌，芽孢桿菌屬的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、B.alkalophilus、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、變青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，可能非常適于用作異源宿主，因?yàn)樗鼈兛梢苑置诘鞍字僚囵B(yǎng)基。其它可能適于用作宿主的細(xì)菌是鏈霉菌屬和假單孢菌屬的細(xì)菌。
根據(jù)編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的性質(zhì)，和/或是否需要進(jìn)一步加工被表達(dá)蛋白，可以優(yōu)選真核宿主如酵母或其它真菌?？偟恼f(shuō)來(lái)，酵母細(xì)胞比真菌細(xì)胞更優(yōu)選，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀撞僮鳌Ｈ欢?，一些蛋白從酵母?xì)胞中分泌不良，或在一些情況下加工不當(dāng)(如在酵母中糖基化過(guò)多)。在這些情況下，應(yīng)選擇不同的真菌宿主生物。
合適的酵母生物可以選自克魯維氏酵母屬、糖酵母屬或裂殖糖酵母屬，如啤酒糖酵母、或漢遜氏酵母屬的物種(公開于英國(guó)專利申請(qǐng)9927801.2)。
合適的絲狀真菌可以是例如屬于曲霉屬物種的株，如米曲霉或黑色曲霉，或尖孢鐮孢、禾谷鐮孢(在完全階段稱作玉蜀黍赤霉，以前稱作Sphaeria zeae，與Gibberella roseum和Gibberella roseumf.sp.Cerealis同義)或硫色鐮孢(在完全階段稱作Gibberellapuricaris，與Fusarium trichothercioides，F(xiàn)usariumbactridioides，F(xiàn)usarium sambucium，F(xiàn)usarium roseum和Fusarium roseum var.Graminearum同義)、Fusarium cerealis(與Fusarium crokkwellnse同義)或Fusarium venenatum。
典型的表達(dá)宿主可以選自例如黑色曲霉、Aspergillus nigar var.tubigenis、Aspergillus niger var.awamori、棘孢曲霉、構(gòu)巢曲霉、米曲霉、Trichoderma reesei、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、乳克魯維氏酵母和啤酒糖酵母。
適當(dāng)宿主細(xì)胞-如酵母、真菌和植物宿主細(xì)胞的使用可以提供翻譯后修飾(如豆蔻酰化、糖基化、截短、酯化和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，可能需要通過(guò)翻譯后修飾而賦予本發(fā)明的重組表達(dá)產(chǎn)物最優(yōu)的生物學(xué)活性。
宿主可以是蛋白酶缺陷或無(wú)蛋白酶株。例如具有堿性蛋白酶基因“alp”缺失的米曲霉JaL125蛋白酶缺陷株。此株描述于WO97/35956。
生物體
與本發(fā)明有關(guān)的名詞“生物體”包括任何可以包含編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列和/或由它們得到的產(chǎn)物的生物體，和/或在其中的啟動(dòng)子可以允許本發(fā)明的核苷酸序列在生物體中表達(dá)的生物體。
合適的生物體可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
與本發(fā)明相關(guān)的名詞“轉(zhuǎn)基因生物”包括任何包含編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列和/或由它們得到的產(chǎn)物的生物體，和/或在其中的啟動(dòng)子可以允許本發(fā)明的核苷酸在生物體中表達(dá)的生物體。核苷酸序列優(yōu)選摻入生物體的基因組。
名詞“轉(zhuǎn)基因生物”并不包含在天然環(huán)境中，處于天然環(huán)境中的天然啟動(dòng)子控制之下的天然核苷酸編碼序列。
因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包括含有編碼本發(fā)明的酶、本發(fā)明的構(gòu)建體、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的質(zhì)粒、本發(fā)明的細(xì)胞、本發(fā)明的組織的核苷酸序列中的任意一種或其任意組合，或其產(chǎn)物的生物體。例如，轉(zhuǎn)基因生物體也可以包含由異源啟動(dòng)子控制的編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列。
宿主細(xì)胞/生物體的轉(zhuǎn)化
如前面所提到的，宿主生物體可以是原核或真核生物。合適的原核宿主的例子包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。關(guān)于原核宿主的轉(zhuǎn)化的教義在本領(lǐng)域中已有詳細(xì)記載，如見Sambrook et al(MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press)和Ausubel et al.，Current Protocolsin Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc。
如果使用原核宿主，那么在轉(zhuǎn)化前需要適當(dāng)修飾核苷酸序列—如去除內(nèi)含子。
在另一種實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因生物可以是酵母。在這一點(diǎn)上，酵母也被廣泛用作異源基因表達(dá)的載體。啤酒糖酵母具有長(zhǎng)期工業(yè)使用的歷史，包括將其用于異源基因表達(dá)。異源基因在啤酒糖酵母中的表達(dá)綜述于Goodey et al(1987，Yeast Biotechnology，D R Berryet al，eds，pp401-429，Allen and Unwin，London)和king et al(1989，Molecular and Cell Biology ot Yeasts，E F Walton andG T Yarronton，eds，pp107-133，Blackie，Glasgow)。
出于一些原因，啤酒糖酵母非常適于異源基因表達(dá)。首先，它對(duì)人類是非致病的，不會(huì)產(chǎn)生某些內(nèi)毒素。其次，在多個(gè)世紀(jì)不同目的的商業(yè)開發(fā)后它具有長(zhǎng)期安全史。這導(dǎo)致了廣泛的公共可接受性。第三，對(duì)于該生物的廣泛商業(yè)使用和研究產(chǎn)生了對(duì)其遺傳學(xué)和生理學(xué)以及大規(guī)模發(fā)酵特征的明確認(rèn)識(shí)。
啤酒糖酵母中異源基因表達(dá)和基因產(chǎn)物的分泌綜述于EHinchcliffe E Kenny(1993，＂Yeast as a vehicle for theexpression of heterologous genes＂，Yeasts，Vol5，Anthony HRose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic PressLtd.)。
可以使用一些類型的酵母載體，包括整合載體，為了維持并且自動(dòng)復(fù)制質(zhì)粒載體，它們要求與宿主基因組的重組。
為制備轉(zhuǎn)基因糖酵母，通過(guò)將本發(fā)明的核苷酸序列插入設(shè)計(jì)用于在酵母中表達(dá)的構(gòu)建體而制備表達(dá)構(gòu)建體。已經(jīng)開發(fā)了一些類型的用于異源表達(dá)的構(gòu)建體。這些構(gòu)建體包含在酵母中有活性的、與本發(fā)明的核苷酸融合的啟動(dòng)子，通常使用酵母來(lái)源的啟動(dòng)子，如GAL1啟動(dòng)子。通常使用酵母來(lái)源的信號(hào)序列，如編碼SUC2信號(hào)肽的序列。在酵母中有活性的終止子終止表達(dá)系統(tǒng)。
為轉(zhuǎn)化酵母，開發(fā)了一些轉(zhuǎn)化方案。例如，可以通過(guò)Hinnen等(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUSA75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)等的教導(dǎo)制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因糖酵母。
可以用各種選擇性標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)記包括許多營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，如LEU2、HIS4和TRP1，及顯性抗生素抗性標(biāo)記，如氨基糖苷抗生素標(biāo)記，如G418。
絲狀真菌細(xì)胞可以由包括原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的過(guò)程轉(zhuǎn)化，然后用已知方式再生細(xì)胞壁。曲霉屬作為宿主微生物的用途描述于EP 0 238 023。
另一種宿主生物是植物。構(gòu)建遺傳修飾植物的基本原則是在植物基因組中插入遺傳信息，以便獲得插入遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定保持。插入遺傳信息存在一些技術(shù)，兩個(gè)主要原理是直接引入遺傳信息和通過(guò)使用載體系統(tǒng)引入遺傳信息。常用技術(shù)的綜述可以見Potrykus(Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol[1991]42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。其它對(duì)植物轉(zhuǎn)化的教導(dǎo)見EP-A-0449375。
用核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在誘導(dǎo)產(chǎn)生被編碼酶和促進(jìn)從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基回收酶的條件下培養(yǎng)。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于使所討論的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)并獲得酶表達(dá)的常規(guī)培養(yǎng)基?？梢詮墓?yīng)商獲得適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基或根據(jù)公開的配方制備(如描述于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中的配方)。
由重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白可以出現(xiàn)在細(xì)胞表面。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，如果需要，可以給含有編碼序列的表達(dá)載體設(shè)計(jì)指導(dǎo)編碼序列通過(guò)特定原核或真核細(xì)胞膜分泌的信號(hào)序列。其它重組構(gòu)建體可以連接編碼序列與促進(jìn)可溶蛋白純化的多肽結(jié)構(gòu)域的編碼核苷酸序列(Kroll DJ et al(1993)DNA Cell Biol 12441-53)。
酶可以從宿主細(xì)胞分泌并可以通過(guò)熟知的程序方便地從培養(yǎng)基回收，包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基分離細(xì)胞，以及通過(guò)硫酸銨等鹽從沉淀培養(yǎng)基的蛋白成分，然后使用層析法如離子交換層析、親和層析等。
分泌
通常，需要將酶從表達(dá)宿主分泌到培養(yǎng)基中，然后可以從培養(yǎng)基更容易地回收酶。根據(jù)本發(fā)明，可以根據(jù)所需表達(dá)宿主選擇分泌先導(dǎo)序列。也可以在本發(fā)明的內(nèi)容中使用雜交信號(hào)序列。
異源分泌先導(dǎo)序列的典型例子是來(lái)源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-如從曲霉屬得到的18氨基酸和24氨基酸譯本)、a因子基因(酵母如糖酵母屬、克魯維氏酵母屬和漢遜氏酵母屬)和α淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)。
融合蛋白
為了有助于提取和純化等，本發(fā)明的氨基酸序列可以作為融合蛋白產(chǎn)生。融合在一起的蛋白的例子包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄激活域)和β半乳糖苷酶。在相互融合的蛋白和感興趣的蛋白序列間包括蛋白水解切割位點(diǎn)，以便允許去除融合蛋白序列可能是方便的。融合蛋白優(yōu)選不防礙蛋白序列的活性。
融合蛋白可以包含抗原或與本發(fā)明的物質(zhì)融合的抗原決定簇。在此實(shí)施方案中，融合蛋白可以是非天然存在的融合蛋白，包含一種可以作為對(duì)免疫系統(tǒng)提供泛化刺激的佐劑的物質(zhì)?？乖蚩乖瓫Q定簇可以附著于物質(zhì)的氨基或羧基端。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，氨基酸序列可以與異源序列連接而編碼融合蛋白。例如，為了篩選可以影響物質(zhì)活性的試劑的肽文庫(kù)，編碼由商購(gòu)抗體識(shí)別的表達(dá)異源表位的嵌合物質(zhì)可能是有用的。
在下面的非限制性實(shí)施例和附圖中進(jìn)一步舉例說(shuō)明了本發(fā)明，其中


圖1說(shuō)明了商購(gòu)脂酶GRINDAMYLTM EXEL16(200ppm)(左側(cè)的面包卷)、脂酶SP972(分別為1000，2500和5000LUT/千克面粉)(面包卷2-4)與沒(méi)有添加脂酶的對(duì)照(右側(cè)面包卷)相比對(duì)面包屑結(jié)構(gòu)的作用；
圖2表示添加單獨(dú)的燕麥脂(左側(cè)的面包)、燕麥脂+1010ppm SP979(中間的面包)和燕麥脂+200ppm GRINDAMYLTM EXEL16(右側(cè)面包卷)對(duì)面包體積和面包屑結(jié)構(gòu)的作用，
圖3說(shuō)明了脂酶SP972和脂酶SP979水解甘油三酯的能力和它們水解糖脂的能力之間的關(guān)系，和
圖4說(shuō)明了脂酶SP972和脂酶SP979水解甘油三酯的能力和它們水解磷脂的能力之間的關(guān)系。
實(shí)施例
材料和方法
1.使用的酶
指定為SP972和SP979的酶制劑是從Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark獲得，這些酶是可以水解非極性脂、糖脂和磷脂的修飾脂解酶。酶的名稱是Novo Nordisk所使用的。
此外，一種商業(yè)上可獲得的酶制劑是從Fluka Chemie AG，Switzerland(指定分類號(hào)為62299)獲得的。該酶來(lái)源于Candidaantarctica。
下列酶用作參考GRINDAMYLTM EXEL16(Danisco Ingredients，Brabrand，Denmark)和StalingaseTM(Gist-brocadesl Delfts，theNetherlands)。
2.用三丁酸甘油酯作為底物測(cè)量的脂酶活性(LUT和LIPU)
用Food Chemical Codex，4th edition，National AcademyPress，1996，p.803所描述的方法測(cè)量基于用三丁酸甘油酯作為底物的脂酶活性，進(jìn)行的修改為將樣品溶解在去離子水中，而不是甘氨酸緩沖液，pH計(jì)穩(wěn)定點(diǎn)為5.5而不是7。
1LUT定義為在測(cè)定條件下每分鐘可以釋放2μmol丁酸的酶量。1LIPU定義為在測(cè)定條件下每分鐘可以釋放1μmol丁酸的酶量。
3.基于將向日葵油作為底物而進(jìn)行的脂酶測(cè)定(LUSol，pH6.5)
反應(yīng)物將8.4g阿拉伯樹膠溶解于100ml去離子水中，并加入100ml 30mM的CaCl2。緩慢加入36ml向日葵油，同時(shí)用Ultra TurraxTM攪拌器以20,000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，得到乳狀液。
測(cè)定在燒杯中將20ml向日葵油乳狀液在30℃下平衡5分鐘，用pH計(jì)將pH值調(diào)節(jié)為6.3-6.5。加入2ml酶制劑，然后連續(xù)加入0.05NNaOH，而將pH6.5保持10分鐘。計(jì)算加入0.05N NaOH作為時(shí)間的函數(shù)所作曲線的斜率。
1LUSol定義為在測(cè)定條件下每分鐘可以釋放1μmol脂肪酸的酶量。
4.磷脂酶測(cè)定(PLU，pH8.0)
底物在加熱到40-50℃下將8g卵磷脂酶粉末(MetarinP，074793)溶解于150ml水。加入40ml 50mM的CaCl2，將水加至200ml。用Ultra TurraxTM攪拌器以20,000rpm的轉(zhuǎn)速將底物混合物混勻1分鐘。
測(cè)定將20.0ml底物轉(zhuǎn)移到燒杯中，在30℃下平衡5分鐘，將pH值調(diào)至8.0。加入2ml酶制劑，然后連續(xù)10分鐘加入0.05N NaOH，將pH保持在8.0。
計(jì)算加入0.05N NaOH作為時(shí)間的函數(shù)所作曲線的斜率。1PLU定義為在測(cè)定條件下每分鐘可以釋放1μmol脂肪酸的酶量。
5.烘烤實(shí)驗(yàn)(烤面包)
用帶鉤的HobartTM攪拌器將2000g丹麥改良面粉、30g干酵母、30g糖、30g鹽和400布雷本登單位(BU)+3％的水以低速捏和2分鐘并用高速捏和10分鐘?；旌虾蟮纳鎴F(tuán)溫度為25℃。在30℃下放置10分鐘。將生面團(tuán)分為每個(gè)生面團(tuán)750g，在33℃下再放置5分鐘，用GlimikTM造型器進(jìn)行85％RH.造型。在33℃下將生面團(tuán)在罐中發(fā)酵50分鐘，在WachtelTM烤箱中220℃下烘烤40分鐘，蒸汽注射16秒。冷卻后，稱量面包，用油菜籽置換法(rape seed displacementmethod)測(cè)量面包體積。
主觀評(píng)價(jià)面包屑，分級(jí)為1到10，其中1＝粗糙結(jié)構(gòu)，10＝均質(zhì)結(jié)構(gòu)。
將在有蓋的罐中烘烤的三條面包儲(chǔ)存于20℃，用于進(jìn)行硬度測(cè)量。
6.硬度測(cè)量
用連接于計(jì)算機(jī)的InstronTM UTM模型4301測(cè)量面包硬度。測(cè)量條件如下
測(cè)壓盒 Max100N
活塞直徑50mm
十字頭速度 200mm/min
壓縮25％
面包片厚度 11mm
將力轉(zhuǎn)化為N/dm2。結(jié)果計(jì)算為每條面包10個(gè)面包片的平均值。
7.烘烤實(shí)驗(yàn)(硬皮面包卷)
用帶鉤的HobartTM攪拌器將1500g丹麥改良面粉、90g壓縮酵母、24g糖、24g鹽和400布雷本登單位+2％的水以低速捏和2分鐘并以高速捏和6分鐘。生面團(tuán)溫度為26℃。將生面團(tuán)定量為1350g，在30℃下放置10分鐘，用FortunaTM造型器進(jìn)行造型。在34℃下將已造型的生面團(tuán)發(fā)酵45分鐘，在BagoTM烤箱中220℃下烘烤18分鐘，用蒸汽烘烤12秒。冷卻后，稱量面包卷，用油菜籽置換法測(cè)量面包卷體積。
按如下公式計(jì)算面包卷的比容
8.微量烘烤實(shí)驗(yàn)
在30℃下用50g BrabrenderTM攪拌碗將50g丹麥改良面粉、10g干酵母、0.8g糖、0.8g鹽、70ppm抗壞血酸和400布雷本登單位的水捏和5分鐘。在34℃下放置10分鐘。將生面團(tuán)分為每個(gè)生面團(tuán)15g，用一種設(shè)備造型，生面團(tuán)在其中的木板和有機(jī)玻璃框之間滾動(dòng)。在34℃下將生面團(tuán)發(fā)酵45分鐘，在VossTM家用烤箱中225℃下烘烤8分鐘。烘烤后，將微型面包條冷卻至周圍環(huán)境溫度，20分鐘后稱量面包條，用油菜籽置換法測(cè)量面包卷體積。切開面包，評(píng)價(jià)面包屑和皮。
9.脂提取和脂肪酸分析
立即冷凍20g完全發(fā)酵的生面團(tuán)并凍干。用咖啡豆磨將凍干的生面團(tuán)磨碎，使其通過(guò)800μm的篩。用帶螺旋蓋的15ml離心管分裝2g凍干的生面團(tuán)。加入10ml水飽和的丁醇(WSB)。將離心管置于沸水浴中10分鐘。在環(huán)境溫度下將離心管置于RotamixTM儀器中以45rpm旋轉(zhuǎn)20分鐘，然后置于沸水浴中10分鐘，在環(huán)境溫度下置于RotamixTM儀器中旋轉(zhuǎn)30分鐘。將離心管在3,500g下離心5分鐘。將5ml上清液轉(zhuǎn)移到管瓶中。在氮流動(dòng)下將WSB蒸發(fā)干。
將提取物中的游離脂肪酸作為異辛烷中的銅鹽分析，在715nm下測(cè)量，根據(jù)基于油酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量(Kwon D.Y.and J.S.Rhee(1986)，A Simple and Rapid Colourimetric Method forDetermination of Free Fatty Acids for Lipase Assay JAOCS6389)。
10.HPLC分析
柱具有水衣的LiChrospherTM100 DIOL 5μm(Merck art.16152)250×4.0id，50℃。
移動(dòng)相
A庚烷/異丙醇/丁醇/四氫呋喃/異辛烷/H2O*，64.5/17.5/7/5/5/1
B異丙烷/丁醇/四氫呋喃/異辛烷/H2O*，730/7/5/5/10
*每升移動(dòng)相1mmol三氟乙酸
(pH＝6.6，用NH3調(diào)節(jié))
泵WatersTM510+梯度控制器
梯度
檢測(cè)器CUNOWTM DDL21(蒸發(fā)光散射)(溫度100℃，電壓600V，氣流6.01/min)
注射器Hewlett PackardTM1050，注射體積50μl
樣品制備將小麥脂溶于5ml CHCl3/CH3OH(7525)中，超聲波處理10分鐘，濾過(guò)孔大小為0.45μm的過(guò)濾器。
計(jì)算PC的標(biāo)準(zhǔn)曲線(International Lecithin andPhospholipid Society的卵磷脂標(biāo)準(zhǔn))
參考文獻(xiàn)Arnoldsson，KC and P.Kaufmann(1996)，Chromatographia38317
11.氣相層析法
使用裝備了WCOT融合硅柱的Perkin ElmerTM8420毛細(xì)管氣相層析，12.5×0.25mmID和0.1μm5％苯基甲基聚硅氧烷(CP Sil8 CB，從Chrompack得到)，用氦氣作為載體，在如下條件下進(jìn)行
檢測(cè)器FID，385℃
烤爐方案
樣品制備將50mg小麥脂溶于含有2mg/ml十七烷作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的12ml庚烷∶吡啶為2∶1的溶液。將500μl轉(zhuǎn)移到crimp管瓶中，加入100μl MSTFA(N-甲基-N-三甲代甲硅烷基-三氟乙酰胺)并且在90℃下反應(yīng)15分鐘。
計(jì)算甘油一、二和三酯和游離脂肪酸的反應(yīng)因子是通過(guò)參考這些成分的混合物而判斷的。根據(jù)這些反應(yīng)因子，可以計(jì)算小麥脂中的甘油一、二和三酯和游離脂肪酸含量。
12.用于下列實(shí)施例中的酶的酶促活性
實(shí)施例1
SP972和GRINDAMYLTM EXEL16在硬皮面包卷中的作用
按前面所述程序烘烤和檢驗(yàn)面包卷。結(jié)果總結(jié)于表1.1。
表1.1. 比容知面包屑評(píng)分(1-10)
從此烘烤實(shí)驗(yàn)中取出完全發(fā)酵的生面團(tuán)，測(cè)量游離脂肪酸的含量。結(jié)果總結(jié)于表1.2
表1.2.發(fā)酵生面團(tuán)中的游離脂肪酸含量
這些結(jié)果表示脂酶SP972對(duì)生面團(tuán)中脂肪酸形成的明確作用。
此外，通過(guò)添加脂酶972，面包體積顯著改善，此酶賦予了更白和更均質(zhì)的面包屑結(jié)構(gòu)，如
圖1所示。
實(shí)施例2
補(bǔ)充脂酶的發(fā)酵生面團(tuán)中的脂肪酸和極性脂含量
用50g BrabenderTM淀粉測(cè)定記錄儀在30℃下將5個(gè)實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)(1-5)攪拌5分鐘，在34℃下發(fā)酵5分鐘。然后立即冷凍和凍干。
實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)的組成總結(jié)于表2.1
表2.1.實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)的組成
用GC分析脂肪酸含量。這些分析的結(jié)果總結(jié)于表2.2
表2.2.實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)1-5中的脂肪酸含量
此外，用上述HPLC分析對(duì)照生面團(tuán)(實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)1)和實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)5的極性脂含量。結(jié)果總結(jié)于表2.3
表2.3.含0和8943LUT脂酶的實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)中各自的極性脂含量
以上結(jié)果顯示了脂酶SP972對(duì)脂肪酸形成的明確作用。甚至在最低的894LUT/kg面粉的劑量下，也觀察到了實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)中脂肪酸含量的顯著增加。HPLC分析表明關(guān)于水解磷脂和糖脂的顯著作用。
因此，這些實(shí)驗(yàn)表明SP972脂酶可以利用甘油酯、磷脂和糖脂作為底物。
實(shí)施例3
單獨(dú)的和與大豆卵磷脂結(jié)合的脂酶SP972對(duì)硬皮面包卷生面團(tuán)中脂肪酸和極性脂含量及烘烤成的面包卷質(zhì)量的作用
檢驗(yàn)單獨(dú)的和與大豆卵磷脂結(jié)合的脂酶SP972對(duì)硬皮面包卷質(zhì)量的活性。用商購(gòu)的脂酶產(chǎn)品GRINDAMYLTM EXEL16(EXEL16)和商購(gòu)的DATEM乳化劑，PanodanTM A2020作為對(duì)比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
使用的酶量和乳化劑添加劑及分別烘烤的面包卷質(zhì)量總結(jié)于表3.1
表3.1.酶與乳化劑添加和面包質(zhì)量
用脂酶SP972與GRINDAMYLTM EXEL16或Panodan A 2020乳化劑對(duì)比的烤烘實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出單獨(dú)使用SP972或與大豆卵磷脂結(jié)合都具有極佳的烘烤性能。結(jié)果比商購(gòu)的脂酶GRINDAMYLTM EXEL16顯著更佳。
按前面描述的方法分析從生面團(tuán)中提取的脂的游離脂肪酸和極性脂。這些分析的結(jié)果總結(jié)于表3.2和3.3
表3.2.含有乳化劑、單獨(dú)的或與卵磷脂結(jié)合的脂酶SP972、或單獨(dú)的或與卵磷脂結(jié)合的GRINDAMYLTM EXEL16的生面團(tuán)中的脂肪酸含量
表3.3.在補(bǔ)充了單獨(dú)的或與卵磷脂結(jié)合的脂酶SP972或單獨(dú)的或與卵磷脂結(jié)合的GRINDAMYLTM EXEL16的生面團(tuán)中的極性脂含量(wt％)
以上結(jié)果表明GRINDAMYTM EXEL16對(duì)DGDG和PC水解無(wú)作用。因此可以得出結(jié)論，與商購(gòu)的脂酶GRINDAMYLTM EXEL16相比，由脂酶SP972影響的生面團(tuán)中磷脂和糖脂的修飾對(duì)脂酶972的面包改進(jìn)作用很重要。
實(shí)施例4
脂酶SP972在補(bǔ)充了燕麥脂的生面團(tuán)中的酶促活性
在補(bǔ)充了燕麥脂部分，2133-18-1的模型生面團(tuán)中檢驗(yàn)脂酶SP972。生面團(tuán)的配方如下
表4.1.補(bǔ)充燕麥脂的生面團(tuán)的組成
用50g Brabender淀粉測(cè)定記錄儀在30℃下攪拌生面團(tuán)。60分鐘后，發(fā)酵，冷凍和凍干生面團(tuán)，然后從凍干的生面團(tuán)中提取脂，并用HPLC分析極性脂。結(jié)果總結(jié)于表4.2
表4.2.補(bǔ)充燕麥脂的生面團(tuán)中極性脂的含量。數(shù)值為凍干生面團(tuán)的重量百分比
以上結(jié)果表明，加入燕麥脂使磷脂和糖脂的水平均增加，SP972脂酶很大程度利用了DGDG和PC作為底物。因此，添加酶對(duì)生面團(tuán)中更多極性脂成分的形成具有顯著作用。
實(shí)施例5
評(píng)估將生面團(tuán)中加入谷脂和脂酶SP979的可能協(xié)同作用的烘烤實(shí)驗(yàn)
進(jìn)行烘烤實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中研究了單獨(dú)使用分餾的燕麥脂制劑(2133-100-1)和與脂酶SP979或GRINDAMYLTM EXEL16結(jié)合使用時(shí)對(duì)面包質(zhì)量的影響，從而評(píng)估是否可以證明燕麥脂和脂酶的協(xié)同作用。制作生面團(tuán)和烘烤生面團(tuán)的程序描述于上述“微量烘烤實(shí)驗(yàn)”。使用的添加劑含量和關(guān)于面包質(zhì)量的結(jié)果總結(jié)于表5.1
表5.1.燕麥脂和脂酶對(duì)面包質(zhì)量的作用
這些烘烤實(shí)驗(yàn)表明燕麥脂和脂酶SP979的結(jié)合對(duì)體積影響很大。單獨(dú)使用燕麥脂部分對(duì)面包體積沒(méi)有任何改進(jìn)作用。也非常明確，盡管商購(gòu)的脂酶GRINDAMYLTM EXEL16表現(xiàn)出輕微的體積改進(jìn)作用，但與SP979脂酶相比，體積改進(jìn)作用明顯較低，SP979脂酶與不含添加劑的對(duì)照相比，比容改進(jìn)了43％，相對(duì)于商購(gòu)的脂酶，比容改進(jìn)了約22％。
除了改進(jìn)面包體積，添加脂酶SP979使面包屑結(jié)構(gòu)和面包外觀改進(jìn)。這一結(jié)果表示于圖2，從中可以看出，用SP979烘烤的面包具有更好和更柔軟的面包屑結(jié)構(gòu)和顯著彈性。
實(shí)施例6
單獨(dú)的和與?；视徒Y(jié)合的脂酶SP972對(duì)生面團(tuán)質(zhì)量和烤面包質(zhì)量的作用
按前面的描述在烘烤實(shí)驗(yàn)中用烤面包檢驗(yàn)單獨(dú)的和與大豆油結(jié)合的SP972，比較使用GRINDAMYLTM EXEL16和DIMODANTM SDM-T對(duì)生面團(tuán)特征和面包質(zhì)量的作用。這些實(shí)驗(yàn)中的生面團(tuán)質(zhì)量參數(shù)和面包質(zhì)量的結(jié)果總結(jié)于下表
表6.1.單獨(dú)或結(jié)合的脂酶SP972、大豆油、起酥、GRINDAMYLTMEXEL16和乳化劑DIMODANTM SDM-T對(duì)生面團(tuán)延展性和粘度的作用
表6.2.單獨(dú)或結(jié)合的脂酶SP972、大豆油、起酥、GRINDAMYLTMEXEL16和乳化劑DIMODANTM SDM-T對(duì)比容、面包屑質(zhì)量和柔軟度的作用
這些烘烤實(shí)驗(yàn)證實(shí)添加單獨(dú)的和與?；视椭Y(jié)合的脂酶SP972使面包體積和柔軟度顯著改進(jìn)，而且這一作用明顯優(yōu)于商購(gòu)的脂酶GRINDAMYLTM EXEL16。此外，從上表中可以看出，添加脂酶SP972可以改進(jìn)生面團(tuán)延展性和面包屑評(píng)分。從以上結(jié)果也可以明顯看出SP972與大豆油和起酥結(jié)合時(shí)產(chǎn)生非常良好的作用。
相對(duì)于脂酶SP972，添加GRINDAMYLTM EXEL16不改進(jìn)面包柔軟度。
實(shí)施例7
脂酶SP979對(duì)生面團(tuán)特征和面包質(zhì)量的作用
在烤面包烘烤實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)對(duì)短鏈甘油三酯活性相對(duì)較低，但對(duì)具有長(zhǎng)鏈脂肪酸的甘油酯和磷脂特別有活性的脂酶SP979。制作烤面包的程序如前面所述，但加入表7.1中所示的添加劑，表7.1概括了關(guān)于生面團(tuán)和面包質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表7.1.單獨(dú)的或與卵磷脂或大豆油結(jié)合的脂酶SP979對(duì)生面團(tuán)和面包質(zhì)量的作用
這些烘烤實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出非常令人感興趣的脂酶SP979對(duì)面包體積和面包屑結(jié)構(gòu)的改進(jìn)作用。此作用明顯優(yōu)于商購(gòu)的乳化劑D IMODANTMSDM-T。
甚至更有趣的是，該酶對(duì)面包柔軟度的作用明確表示單獨(dú)的或與?；视秃土字Y(jié)合的脂酶SP979具有顯著的柔軟度改進(jìn)作用。已經(jīng)觀察到在本實(shí)驗(yàn)中制作的添加了SP979的面包的面包屑是濕潤(rùn)的，并且這種面包的面包屑結(jié)構(gòu)非常均勻，與不含添加劑的對(duì)照面包相比，咬下的一口更短。
實(shí)施例8
單獨(dú)的或與燕麥脂結(jié)合的脂酶SP979對(duì)面包質(zhì)量的作用
根據(jù)前面描述的程序進(jìn)行面包烘烤實(shí)驗(yàn)，但添加了表8.1中指出的添加劑，表中概括了對(duì)生面團(tuán)中比容和游離脂肪酸形成的作用(比色分析)
表8.1.脂酶979對(duì)面包體積和游離脂肪酸形成的作用
以上結(jié)果證明了脂酶SP979的顯著生面團(tuán)加強(qiáng)作用，反映于比容的增加和面包屑結(jié)構(gòu)和外觀。當(dāng)與燕麥油結(jié)合時(shí)，SP979的作用甚至更顯著。
將此烘烤實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵的生面團(tuán)凍干并提取其中的脂，然后進(jìn)行HPLC分析。分析結(jié)果見表8.2
表8.2.脂酶SP979對(duì)生面團(tuán)中糖脂和磷脂水解的作用(數(shù)值用重量百分比表示)
從這些結(jié)果可以看出，脂酶SP979可以水解糖脂(DGDG)和磷脂(PC)。實(shí)際上，50％以上存在的DGDG和PC是通過(guò)添加SP979而被水解的。
實(shí)施例9
脂酶SP972和脂酶SP979與商購(gòu)的脂酶GRINDAMYLTM EXEL16和StalingaseTM對(duì)生面團(tuán)和面包質(zhì)量的改進(jìn)作用
在模型生面團(tuán)系統(tǒng)中比較脂酶SP972和脂酶SP979和兩種商購(gòu)的脂酶GRINDAMYLTM EXEL16和StalingaseTM(Gistbrocades)(后一種酶也稱作#1867)的脂水解作用。在32℃下將生面團(tuán)放置1小時(shí)并凍干，用HPLC分析極性脂，用GLC分析極性脂。
模型生面團(tuán)具有以下組成
表9.1.模型生面團(tuán)的組成
生面團(tuán)中的游離脂肪酸和甘油三酯(GLC分析)和極性脂，DGDG和PC(HPLC)的含量總結(jié)于表9.2
表9.2.模型生面團(tuán)中游離脂肪酸、甘油三酯和極性脂的含量(值用重量百分比表示)
根據(jù)這些值，可以計(jì)算在生面團(tuán)中形成的游離脂肪酸(FFA)的含量和分別在生面團(tuán)中水解的甘油三酯、DGDG和PC的量。這些數(shù)據(jù)見表9.3
表9.3.模型生面團(tuán)中游離脂肪酸的形成和甘油三酯、DGDG和PC的水解(wt％)
當(dāng)用上表中所示生面團(tuán)中形成的FFA的量表示生面團(tuán)中的脂酶活性時(shí)，明確證明脂酶SP972和脂酶SP979與所檢驗(yàn)的兩種商購(gòu)的脂酶相比，在水解糖脂(DGDG)和磷脂(PC)方面非常有活性，而兩種商購(gòu)的脂酶對(duì)這些底物無(wú)作用。
關(guān)于對(duì)甘油三酯的作用，脂酶972和脂酶SP979都是有活性的，然而程度低于所檢驗(yàn)的兩種商購(gòu)的脂酶。
因此，這些結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的兩種脂酶水解廣泛的脂底物，包括非極性脂，如甘油三酯和極性脂，如糖脂、DGDG和磷脂、PC。
表9.3中總結(jié)的數(shù)據(jù)也可以用圖表示，表現(xiàn)酶水解甘油三酯和水解糖脂的能力之間的關(guān)系(圖3)，以及酶水解甘油三酯的能力和水解磷脂的能力之間的關(guān)系(圖4)。從這些圖中可以看出，脂酶SP972和脂酶SP979分別關(guān)于DGDG之間的這種關(guān)系可以分別描繪為斜率為1.3965和2.6405的曲線，關(guān)于PC的對(duì)應(yīng)值分別為0.1648和0.7248。
這些數(shù)據(jù)明確說(shuō)明了相對(duì)于對(duì)甘油三酯的作用，脂酶SP972和脂酶SP979對(duì)糖脂和磷脂具有相對(duì)高的活性。
實(shí)施例10
脂酶SP979和SP972對(duì)不同脂肪酸的作用
通過(guò)制作含黃油脂肪的實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)評(píng)估SP979和SP972脂酶對(duì)不同脂肪酸的活性。檢驗(yàn)商購(gòu)脂酶產(chǎn)品GRINDAMYLTM EXEL16作為對(duì)比。
根據(jù)表10.1中列出的配方制作實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)
表10.1.含黃油脂肪的實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)組成
用50g BrabenderTM攪拌碗攪拌四種實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)(1-4)并發(fā)酵(如標(biāo)題為“8.微量烘烤實(shí)驗(yàn)”的部分所詳細(xì)描述)。發(fā)酵后將生面團(tuán)冷凍并凍干。用水飽和的丁醇提取生面團(tuán)中的所有脂。在BondElut-NH2柱上分離生面團(tuán)脂中的游離脂肪酸，用GLC分析脂肪酸甲酯形式的游離脂肪酸組成(見表10.2)。通過(guò)分光光度法分析作為銅鹽形式的生面團(tuán)脂中游離脂肪酸的總量(％，以生面團(tuán)干重計(jì)算)(也見表10.2)。表10.2.生面團(tuán)中的游離脂肪酸，以及游離脂肪酸的脂肪酸組成
根據(jù)游離脂肪酸的量和脂肪酸組成，可以計(jì)算相對(duì)于沒(méi)有添加脂酶的對(duì)照生面團(tuán)，含脂酶的生面團(tuán)所產(chǎn)生的游離脂肪酸量。
例如，與沒(méi)有添加脂酶的生面團(tuán)1相比，含脂酶GRINDAMYL EXEL16的生面團(tuán)2中產(chǎn)生的C16脂肪酸(棕櫚酸)量計(jì)算如下0.05497％＝549.7ppm
每千克干生面團(tuán)
根據(jù)此數(shù)據(jù)，可以計(jì)算相對(duì)于長(zhǎng)鏈脂肪酸(碳原子數(shù)≥10)量，生面團(tuán)中產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(碳原子數(shù)≤10)量(見表10.3)。
表10.3每千克生面團(tuán)中的脂肪酸微摩爾數(shù)和短鏈脂肪酸的相對(duì)活性
表10.3中的結(jié)果表明，不同的脂酶對(duì)同樣底物中的不同脂肪酸具有不同的活性，它表明脂酶SP 972和SP 979與GRINDAMYL EXEL 16相比，對(duì)短鏈脂肪酸的活性較低。
實(shí)施例11
商購(gòu)脂酶對(duì)極性脂的活性
評(píng)價(jià)了從瑞士Fluka Chemie AG購(gòu)得的商品分類號(hào)為62299的脂酶活性。在模型生面團(tuán)系統(tǒng)中檢驗(yàn)此脂酶，并與沒(méi)有添加脂酶的對(duì)照生面團(tuán)進(jìn)行比較。
根據(jù)表11.1的配方用10g面粉制作生面團(tuán)
表11.1實(shí)驗(yàn)生面團(tuán)的組成
在30℃下用50g BrabenderTM攪拌碗將生面團(tuán)(1-2)捏和5分鐘，在34℃下發(fā)酵45分鐘。發(fā)酵后將生面團(tuán)冷凍并凍干。用水飽和的丁醇提取凍干的生面團(tuán)。用比色法分析作為銅鹽的分離的生面團(tuán)脂中的游離脂肪酸，生面團(tuán)脂也用HPLC分析(見表11.2)。
表11.2生面團(tuán)脂的HPLC分析
表11.2的結(jié)果表明62299號(hào)Fluka脂酶在形成游離脂肪酸的過(guò)程中在生面團(tuán)系統(tǒng)中是有活性的，62299號(hào)Fluka脂酶對(duì)糖脂(DGDG)和磷脂(PC)都是有活性的。
總結(jié)
現(xiàn)在用編號(hào)的段落總結(jié)本發(fā)明
1.一種制備生面團(tuán)的方法，該方法包含在生面團(tuán)成分中加入在生面團(tuán)條件下可以水解非極性脂、糖脂和磷脂的酶，或加入含所述酶的組合物，并混合生面團(tuán)成分而獲得生面團(tuán)。
2.第1段的方法，其中至少一種非極性脂、糖脂和磷脂是存在于用于生面團(tuán)的面粉中的天然存在的脂成分。
3.第2段的方法，其中天然存在的脂為磷脂。
4.第3段的方法，其中磷脂為磷脂酰膽堿(PC)。
5.第2段的方法，其中天然存在的脂為糖脂。
6.第5段的方法，其中糖脂為雙半乳糖甘油二酯(DGDG)。
7.第1段的方法，其中將至少一種非極性脂、糖脂和磷脂加入生面團(tuán)。
8.第7段的方法，其中加入的非極性脂為?；视?。
9.第8段的方法，其中加入的?；视瓦x自植物油、植物脂肪、動(dòng)物油、動(dòng)物脂肪、起酥和黃油。
10.第9段的方法，其中植物油為天然存在的谷物油，包括燕麥油。
11.第7段的方法，其中加入的極性脂為選自磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的磷脂。
12.第1段的方法，其中生面團(tuán)為酵母發(fā)酵的生面團(tuán)。
13.第1段的方法，其中加入的酶量為10-100,000LUT/千克面粉或10-100,000PLU/千克面粉。
14.第13段的方法，其中酶量為100-10,000LUT/千克面粉或100-10,000PLU/千克面粉。
15.第1段的方法，其中生面團(tuán)為面包生面團(tuán)，該方法包含另一步，即烘烤生面團(tuán)而獲得烘烤產(chǎn)品。
16.第1段的方法，其中生面團(tuán)選自意大利面食生面團(tuán)、面條生面團(tuán)和蛋糕生面團(tuán)或面糊。
17.第1段的方法，其中加入的酶量使烘烤產(chǎn)品的比容相對(duì)于在除未添加酶外，其它都相同的條件下制作的烘烤產(chǎn)品增加至少10％。
18.第1段的方法，其中將另一種酶加入生面團(tuán)。
19.第18段的方法，其中另一種酶選自脂酶、淀粉降解酶、半纖維素酶、纖維素酶和氧化還原酶。
20.第1段的方法，其中最初存在于生面團(tuán)中的DGDG的至少25％被水解。
21.第1或第20段的方法，其中最初存在于生面團(tuán)中的PC的至少25％被水解。
22.第1段的方法，其中酶的特征在于該酶水解甘油三酯的能力和水解糖脂的能力之間的關(guān)系可以描繪為斜率至少為1.0的曲線。
23.第1段的方法，其中酶的特征在于該酶水解甘油三酯的能力和水解磷脂的能力之間的關(guān)系可以描繪為斜率至少為0.1的曲線。
24.前面任何一段中的方法，其中所述非極性脂為包含C4到C10脂肪酸的甘油三酯和包含C12到C20的脂肪酸的甘油三酯，其中與包含C4到C10脂肪酸的甘油三酯相比，該酶優(yōu)先水解所述包含C12到C20的脂肪酸的甘油三酯。
25.一種制備生面團(tuán)的方法，所述方法包含在生面團(tuán)成分中加入在生面團(tuán)條件下可以水解包含C4到C10脂肪酸的甘油三酯、包含C12到C20的脂肪酸的甘油三酯、糖脂和磷脂的酶，與包含C4到C10脂肪酸的甘油三酯相比，該酶優(yōu)先水解所述包含C12到C20的脂肪酸的甘油三酯，以及混合生面團(tuán)成分而獲得生面團(tuán)。
26.第25段的方法，其中所述糖脂為雙半乳糖甘油二酯。
27.一種制備生面團(tuán)或由生面團(tuán)制備的烘烤產(chǎn)品的方法，包含
a)檢驗(yàn)至少一種酶對(duì)甘油三酯中的C4到C10脂肪酸、甘油三酯中的C12到C20脂肪酸、雙半乳糖甘油二酯和磷脂的水解活性，
b)選擇對(duì)雙半乳糖甘油二酯和磷脂具有水解活性，并且相對(duì)于C4到C10脂肪酸，對(duì)C12到C20脂肪酸具有更強(qiáng)活性的酶，和
c)將所選的酶加入生面團(tuán)。
28.一種改進(jìn)生面團(tuán)的組合物，包含在生面團(tuán)條件下能夠水解非極性脂、糖脂和磷脂，并且可選擇水解至少另外一種生面團(tuán)成分的酶。
29.第28段的組合物，包含另一種酶，該酶選自脂酶、淀粉降解酶、半纖維素酶、纖維素酶和氧化還原酶。
30.第28段的組合物，其中另外一種生面團(tuán)成分選自谷物面粉、酵母、化學(xué)發(fā)酵劑、生面團(tuán)加強(qiáng)劑、乳化劑、糖、酰基甘油、磷脂、糖脂和鹽。
31.第1段的方法，其中將酶加入28-30段的任意一段的組合物。
32.通過(guò)1-27和31段的任意一段的方法獲得的生面團(tuán)。
33.第32段的生面團(tuán)，該生面團(tuán)被冷凍或在控制的氣氛下被包裝。
34.通過(guò)烘烤32段的生面團(tuán)而獲得的烘烤產(chǎn)品。
35.由32段的生面團(tuán)制作的面條產(chǎn)品。
36.由32段的生面團(tuán)制作的意大利面食產(chǎn)品。
在此引入前面的說(shuō)明書中提到的所有公開文獻(xiàn)作為參考。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明確，對(duì)所描述本發(fā)明的方法和系統(tǒng)所做的各種修飾和改變不離開本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明是聯(lián)系特定優(yōu)選實(shí)施方案而描述的，應(yīng)該理解本發(fā)明要求保護(hù)的范圍不應(yīng)該過(guò)分限制于這些特定實(shí)施方案。實(shí)際上，所描述的執(zhí)行本發(fā)明的方式的各種修飾對(duì)分子生物學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該是很明顯的，意欲包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備生面團(tuán)的方法，該方法包含在生面團(tuán)成分中加入在生面團(tuán)條件下可以水解非極性脂、糖脂和磷脂的酶，或加入含所述酶的組合物，并混合生面團(tuán)成分而獲得生面團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種非極性脂、糖脂和磷脂是存在于用于生面團(tuán)的面粉中的天然存在的脂成分。
3.權(quán)利要求2的方法，其中天然存在的脂為磷脂。
4.權(quán)利要求3的方法，其中磷脂為磷脂酰膽堿(PC)。
5.權(quán)利要求2的方法，其中天然存在的脂為糖脂。
6.權(quán)利要求5的方法，其中糖脂為雙半乳糖甘油二酯(DGDG)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中將至少一種非極性脂、糖脂和磷脂加入生面團(tuán)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中加入的非極性脂為酰基甘油。
9.權(quán)利要求8的方法，其中加入的?；视瓦x自植物油、植物脂肪、動(dòng)物油、動(dòng)物脂肪、起酥和黃油。
10.權(quán)利要求9的方法，其中植物油為天然存在的谷物油，包括燕麥油。
11.權(quán)利要求7的方法，其中加入的極性脂為選自磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的磷脂。
12.權(quán)利要求1的方法，其中生面團(tuán)為酵母發(fā)酵的生面團(tuán)。
13.權(quán)利要求1的方法，其中加入的酶量為10-100,000LUT/千克面粉或10-100,000PLU/千克面粉。
14.權(quán)利要求13的方法，其中酶量為100-10,000LUT/千克面粉或100-10,000PLU/千克面粉。
15.權(quán)利要求1的方法，其中生面團(tuán)為面包生面團(tuán)，該方法包含另一步，即烘烤生面團(tuán)而獲得烘烤產(chǎn)品。
16.權(quán)利要求1的方法，其中生面團(tuán)選自意大利面食生面團(tuán)、面條生面團(tuán)和蛋糕生面團(tuán)或面糊。
17.權(quán)利要求1的方法，其中加入的酶量使烘烤產(chǎn)品的比容相對(duì)于在除未添加酶外，其它都相同的條件下制作的烘烤產(chǎn)品增加至少10％。
18.權(quán)利要求1的方法，其中將另一種酶加入生面團(tuán)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中另一種酶選自脂酶、淀粉降解酶、半纖維素酶、纖維素酶和氧化還原酶。
20.權(quán)利要求1的方法，其中最初存在于生面團(tuán)中的DGDG的至少25％被水解。
21.權(quán)利要求1或20的方法，其中最初存在于生面團(tuán)中的PC的至少25％被水解。
22.權(quán)利要求1的方法，其中酶的特征在于該酶水解甘油三酯的能力和水解糖脂的能力之間的關(guān)系可以描繪為斜率至少為1.0的曲線。
23.權(quán)利要求1的方法，其中酶的特征在于該酶水解甘油三酯的能力和水解磷脂的能力之間的關(guān)系可以描繪為斜率至少為0.1的曲線。
24.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述非極性脂為包含C4到C10脂肪酸的甘油三酯和包含C12到C20的脂肪酸的甘油三酯，其中與包含C4到C10脂肪酸的甘油三酯相比，該酶優(yōu)先水解所述包含C12到C20的脂肪酸的甘油三酯。
25.一種制備生面團(tuán)的方法，所述方法包含在生面團(tuán)成分中加入在生面團(tuán)條件下可以水解包含C4到C10脂肪酸的甘油三酯、包含C12到C20的脂肪酸的甘油三酯、糖脂和磷脂的酶，與包含C4到C10脂肪酸的甘油三酯相比，該酶優(yōu)先水解所述包含C12到C20的脂肪酸的甘油三酯，以及混合生面團(tuán)成分而獲得生面團(tuán)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述糖脂為雙半乳糖甘油二酯。
27.一種制備生面團(tuán)或由生面團(tuán)制備的烘烤產(chǎn)品的方法，包含
a)檢驗(yàn)至少一種酶對(duì)甘油三酯中的C4到C10脂肪酸、甘油三酯中的C12到C20脂肪酸、雙半乳糖甘油二酯和磷脂的水解活性，
b)選擇對(duì)雙半乳糖甘油二酯和磷脂具有水解活性，并且相對(duì)于C4到C10脂肪酸，對(duì)C12到C20脂肪酸具有更強(qiáng)活性的酶，和
c)將所選的酶加入生面團(tuán)。
28.一種改進(jìn)生面團(tuán)的組合物，包含在生面團(tuán)條件下能夠水解非極性脂、糖脂和磷脂，并且可選擇水解至少另外一種生面團(tuán)成分的酶。
29.權(quán)利要求28的組合物，包含另一種酶，該酶選自脂酶、淀粉降解酶、半纖維素酶、纖維素酶和氧化還原酶。
30.權(quán)利要求28的組合物，其中另外一種生面團(tuán)成分選自谷物面粉、酵母、化學(xué)發(fā)酵劑、生面團(tuán)加強(qiáng)劑、乳化劑、糖、酰基甘油、磷脂、糖脂和鹽。
31.權(quán)利要求1的方法，其中將酶加入權(quán)利要求28-30的任意一項(xiàng)的組合物。
32.通過(guò)權(quán)利要求1-27和31的任意一項(xiàng)的方法獲得的生面團(tuán)。
33.權(quán)利要求32的生面團(tuán)，該生面團(tuán)被冷凍或在控制的氣氛下被包裝。
34.通過(guò)烘烤權(quán)利要求32的生面團(tuán)而獲得的烘烤產(chǎn)品。
35.由權(quán)利要求32的生面團(tuán)制作的面條產(chǎn)品。
36.由權(quán)利要求32的生面團(tuán)制作的意大利面食產(chǎn)品。
全文摘要
制備生面團(tuán)的方法，此方法包含將可以同時(shí)水解非極性脂、糖脂和磷脂的酶加入生面團(tuán)?？梢约尤朐撁傅囊环N或更多底物，如雙半乳糖甘油二酯(DGDG)等半乳糖脂或磷脂酰膽堿(PC)等磷脂?？梢詫⒅孜镆怨任镏缪帑溣偷男问郊尤肷鎴F(tuán)中。該方法提供了延展性改進(jìn)和粘度減低的生面團(tuán)，和具有高比容、改進(jìn)的柔軟度和極佳的屑結(jié)構(gòu)的烘烤面包產(chǎn)品。
文檔編號(hào)A21D2/00GK1407856SQ0081666
公開日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2000年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月3日
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