專(zhuān)利名稱(chēng)：在體外用病毒感染真核細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在體外用病毒感染真核細(xì)胞系或原代細(xì)胞的方法，以及得到的感染細(xì)胞培養(yǎng)物。為了達(dá)到這個(gè)目的，將得自病毒(優(yōu)選嗜肝DNA病毒科和黃病毒科)感染個(gè)體的血漿或血清作為接種體用于感染已建立的真核細(xì)胞系或原代細(xì)胞(優(yōu)選肝細(xì)胞)，繼而生成病毒顆粒。這種方法、得到的感染細(xì)胞、和細(xì)胞培養(yǎng)物上清液可用于許多情況，特別是篩選藥物候選、檢測(cè)抗體、產(chǎn)生診斷試劑盒、和生產(chǎn)疫苗。
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肝炎病毒感染是世界上最普遍的病毒性疾病。全世界有3.5億和1乙個(gè)體分別受到乙肝病毒(HBV-嗜肝DNA病毒科的成員)和丙肝病毒(HCV-黃病毒科的成員)的單獨(dú)侵襲(WHO 1996年度報(bào)告)。已知這些病毒引起急性和慢性肝臟紊亂。另外，流行病學(xué)研究已經(jīng)將HBV和HCV感染與肝細(xì)胞癌(HCC)的形成聯(lián)系起來(lái)(Parkin，1999，第5-11頁(yè)；Wild和Hall，1999，第35-54頁(yè)；Ferri，1997；Boyer和Reuben，1993，第611頁(yè)；Hayashi，1999，第205-210頁(yè))。當(dāng)前對(duì)HBV和HCV感染個(gè)體的治療包括干擾素和抗病毒藥物。然而，它們的功效并非完全令人信服，而且它們并非毫無(wú)顯著副作用。
為了研究肝炎病毒相關(guān)疾病和開(kāi)發(fā)新型治療，需要用于培養(yǎng)肝炎病毒的可靠手段。迄今為止，只有黑猩猩、小鼠、大鼠、樹(shù)鼯、旱獺、和鴨可作為模型用于研究乙肝和丙肝感染(Schinazi，1999)。這些動(dòng)物模型有許多缺點(diǎn)，諸如花費(fèi)高、觀察的復(fù)雜性、不適用于新型治療劑的高通量篩選、和顯著的動(dòng)物受苦。
最近幾年，進(jìn)行了幾次嘗試，試圖在體外在真核細(xì)胞中生成HBV或HCV。為了本發(fā)明的目的，“體外病毒增殖”和等同措詞指細(xì)胞培養(yǎng)物中完全完整的感染性病毒(如人肝炎病毒)的復(fù)制生成。
體外增殖可以使用兩種主要流程(1)用病毒接種體感染細(xì)胞?！案腥尽钡亩x是傳達(dá)或傳播傳染病的介質(zhì)、物質(zhì)、微生物、或原理；感染的作用或過(guò)程。(2)用核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)染”的定義是將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞。
當(dāng)前用于在組織培養(yǎng)物中復(fù)制HBV和HCV的“現(xiàn)有技術(shù)”模型主要基于用來(lái)自HBV或HCV的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染(而非感染)已建立的肝細(xì)胞細(xì)胞系，諸如HepG2(ATCC HB8065)和Huh-7(得自Helmut Jacobsen博士，Hoffmann-La-Roche，Pharma Division，Preclinical Central NervousSvstem Research，巴塞爾，瑞士)(位于說(shuō)明書(shū)末尾的表1和表2)。
在現(xiàn)有技術(shù)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用包含HBV基因組的兩個(gè)串聯(lián)拷貝的DNA克隆轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系。得到的細(xì)胞系(“2.2.15細(xì)胞”)生成HBV表面抗原、核殼、和病毒體。然而，2.2.15細(xì)胞系有幾個(gè)缺點(diǎn)1)2.2.15細(xì)胞系生成感染性顆粒(丹氏粒)的速率很低。2)該細(xì)胞系持續(xù)生成大量的復(fù)制中間物，而在抗病毒化合物實(shí)驗(yàn)中測(cè)試病毒滴度前必須首先由有關(guān)細(xì)胞將它們清洗掉。
由于這些原因，最初的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系諸如HepG2和Huh-7(后者具有相似特征)不適合于大規(guī)?；蚋咄亢Y選。
現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于感染過(guò)程中乙肝和丙肝病毒顆粒如何進(jìn)入細(xì)胞的研究中已經(jīng)提到了許多不同受體。對(duì)于HBV，清蛋白受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、IgA受體、低密度脂蛋白(LDL)受體、去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)、白介素-6受體、內(nèi)聯(lián)蛋白-2受體、GAPD受體、和31kDa和50kDa推定受體，正如Treichel所回顧的(Treichel，1997及其參考文獻(xiàn))，在文獻(xiàn)中都有提及。然而，對(duì)于這些受體中的哪一種直接負(fù)責(zé)HBV顆粒進(jìn)入細(xì)胞還沒(méi)有確定的回答。
對(duì)于HCV，CD81受體(Pileri，1998；Flint，1999)、LDL受體(Agnello，1999)、甘露糖受體、和去唾液酸糖蛋白受體(Houghton等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,968,775)作為進(jìn)入的可能機(jī)制在文獻(xiàn)中都有提及。然而，對(duì)于這些受體中的哪一種直接負(fù)責(zé)HCV顆粒進(jìn)入細(xì)胞還沒(méi)有確定的回答。
值得注意的是，Cribier等人(1998)最近的工作指出，對(duì)將要用HCV感染的細(xì)胞進(jìn)行硫酸葡聚糖預(yù)處理可抑制HCV附著于細(xì)胞表面并預(yù)防細(xì)胞的任何感染。這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明通過(guò)除去脂蛋白或脂質(zhì)，硫酸葡聚糖抑制了病毒顆粒與細(xì)胞之間的相互作用。因此，現(xiàn)有技術(shù)明確講授在體外感染系統(tǒng)中不可使用硫酸葡聚糖或相似化合物，尤其是對(duì)肝炎病毒而言。
概括而言，盡管有許多嘗試，但現(xiàn)有技術(shù)尚未描述關(guān)于HBV和HCV的有效且可靠的體外感染系統(tǒng)(Robinson，1996，第1149、1155、1161頁(yè)；Koff，1993，第498-499頁(yè)；Hollinger，1996，第2742頁(yè)；Ganem，1996，第2709頁(yè)；RobinSon，1996，第1189頁(yè)；Lohmann等人，1999，它的參考文獻(xiàn)6；Schinazi，1999)。
關(guān)于乙肝病毒培養(yǎng)已經(jīng)描述了可靠且有效的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)所需要的特征(Sureau，1993)。這些特征(同樣適用于丙肝病毒)是1)細(xì)胞應(yīng)當(dāng)起源于人。2)細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是永生化的，以確保無(wú)限供應(yīng)。3)細(xì)胞應(yīng)當(dāng)保持分化后肝細(xì)胞的特征和功能。4)細(xì)胞對(duì)HBV或HCV應(yīng)當(dāng)是易感且允許的。5)細(xì)胞所維持的復(fù)制數(shù)量應(yīng)當(dāng)足夠用于大多數(shù)生化和分子分析流程。
因此，非常需要滿足這些特征的HBV和HCV感染系統(tǒng)。
發(fā)明簡(jiǎn)述通過(guò)提供權(quán)利要求書(shū)中表征的實(shí)施方案解決了上述技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明為滿足上文為HBV、HCV、和其它病毒所描述的特征的真核細(xì)胞提供了可靠且有效的感染系統(tǒng)。
用一種或多種病毒物種感染真核細(xì)胞的目標(biāo)是通過(guò)在用預(yù)期病毒感染前使細(xì)胞表面的脂蛋白和/或脂質(zhì)受體不含基本上所有的脂蛋白和/或脂質(zhì)來(lái)達(dá)到的。應(yīng)當(dāng)理解，這些受體上脂蛋白和/或脂質(zhì)的缺乏允許病毒顆粒(它們自身覆蓋有脂蛋白)與靶細(xì)胞之間的適當(dāng)相互作用。
本發(fā)明可用于任何病毒物種的感染，優(yōu)選引起肝炎的介質(zhì)，諸如嗜肝DNA病毒科(HBV及其它)、黃病毒科(HCV、登革病毒、黃熱病毒、及其它)、或病毒物種的任意組合(諸如丁肝病毒與乙肝病毒)。
可依照本發(fā)明感染的細(xì)胞可以是任何真核細(xì)胞，它們可以是原代細(xì)胞或來(lái)自已建立的細(xì)胞系。優(yōu)選的是，細(xì)胞來(lái)自已建立的肝細(xì)胞細(xì)胞系諸如HepG2和Huh-7、肝細(xì)胞原代細(xì)胞、靈長(zhǎng)類(lèi)起源的任何真核細(xì)胞、以及表達(dá)脂蛋白和/或脂質(zhì)受體的任何真核細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，所述表達(dá)可以是天然發(fā)生的，或是在真核細(xì)胞中克隆了合適基因之后發(fā)生的。
用于在用預(yù)期病毒感染前使細(xì)胞表面的脂蛋白和/或脂質(zhì)受體不含基本上所有的脂蛋白和/或脂質(zhì)的試劑可以是硫酸多糖諸如硫酸葡聚糖或肝素化合物，或者是鈣螯合劑諸如乙二醇-雙(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA；亞乙基-雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸；EGTAzic acid)、或乙二胺四乙酸(EDTA；亞乙基雙次氮基四乙酸)、或能夠由表面受體除去細(xì)胞結(jié)合的脂蛋白和/或脂質(zhì)的任何其它試劑。
本發(fā)明還涉及通過(guò)進(jìn)行所要求保護(hù)的方法而得到的感染細(xì)胞培養(yǎng)物。在與現(xiàn)有技術(shù)中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(諸如HepG2和Huh-7)進(jìn)行比較時(shí)，本發(fā)明的感染細(xì)胞培養(yǎng)物所實(shí)現(xiàn)的感染性顆粒的生成速率要高得多，而且復(fù)制中間物的生成量不顯著。
因此，與現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)物不同，本發(fā)明的感染細(xì)胞培養(yǎng)物適用于針對(duì)感染性病毒的抗病毒劑的大規(guī)?；蚋咄康捏w外篩選。用于篩選抗病毒化合物的流程包括至少一種對(duì)照樣品和至少一種測(cè)試樣品；每種樣品包含基本上相似或相當(dāng)數(shù)量的來(lái)自原代細(xì)胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)細(xì)胞系的細(xì)胞，在這點(diǎn)上，是在基本上相似或相當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)物流體中。另外，在本發(fā)明感染過(guò)程之前、之中、或之后，將測(cè)試樣品在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基或任何合適流體中暴露于潛在有效的抗HCV或抗HBV試劑，并將來(lái)自對(duì)照樣品的細(xì)胞和來(lái)自測(cè)試樣品的細(xì)胞在合適的細(xì)胞培養(yǎng)基中保溫合適的時(shí)間。然后采用常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)對(duì)照樣品和測(cè)試樣品二者測(cè)定產(chǎn)物，包括表達(dá)的核糖核酸(在HBV和HCV兩種情況中)、表達(dá)的脫氧核糖核酸(在HBV的情況中)、或生成的多肽?？梢愿鶕?jù)產(chǎn)物的生成量評(píng)估測(cè)試化合物的抗病毒特性。很少或沒(méi)有產(chǎn)物說(shuō)明測(cè)試化合物具有抗病毒特性，否則則是沒(méi)有這種特性。
另外本發(fā)明的受感染細(xì)胞培養(yǎng)物還提供了生成含抗原培養(yǎng)基的手段。由此通過(guò)上述病毒抗原提供了新且重要的臨床診斷和預(yù)后工具，它們可用于檢測(cè)患者血清中針對(duì)HBV、HCV、和其它病毒的抗體。即將患者血清與由上述細(xì)胞生成的病毒抗原混合，然后使用常規(guī)方法篩選抗原-抗體相互作用。
最后，由本發(fā)明受感染細(xì)胞培養(yǎng)物生成的病毒抗原可用于生產(chǎn)疫苗。針對(duì)HBV的現(xiàn)有疫苗制劑(Recombivax HB和Engerix-B；參閱Seef，1996，第1119頁(yè)；Hollinger，1996，第2787頁(yè))具有易變的免疫學(xué)性能，原因是通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)的抗原是不完整的，而且可能缺乏免疫學(xué)重要表位。這些表位在本發(fā)明的體外感染系統(tǒng)中能夠得到保持。在所述系統(tǒng)中生成的病毒顆粒的感染性可以通過(guò)常規(guī)方法得到減毒或滅活，諸如用尿素、胃蛋白酶、甲醛進(jìn)行處理或暴露于紫外線進(jìn)行處理。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)包括獲得感染培養(yǎng)物所需花費(fèi)低，而且不再需要活的動(dòng)物(諸如黑猩猩)作為感染模型。
下文實(shí)施例列出了特別有利的實(shí)施方案，從而進(jìn)一步描述了本發(fā)明。這些實(shí)施方案確實(shí)意欲作為例示和例證而非限制，即它們不以任何方式限制本發(fā)明。
圖的圖例


圖1在細(xì)胞表面表達(dá)HBsAg的HBV感染細(xì)胞的百分比。
圖2A-2D受HBV感染的HepG2細(xì)胞(單層)。(A)和(C)感染后18天的受HBV感染的HepG2細(xì)胞；(A)在完全培養(yǎng)基中保溫，(C)在無(wú)血清的已知成份培養(yǎng)基中。(B)和(D)模擬感染后18天的受模擬物感染的HepG2細(xì)胞；(B)在完全培養(yǎng)基中，(D)在無(wú)血清的已知成份培養(yǎng)基中。放大倍率2000x。
圖3A和3B受HBV感染的HepG2細(xì)胞(在軟瓊脂中的懸浮液)。用HBV感染HepG2細(xì)胞10天，胰蛋白酶消化，清洗，然后接種含軟瓊脂的完全培養(yǎng)基。保溫3周后大塊細(xì)胞在軟瓊脂中生長(zhǎng)。估計(jì)懸浮細(xì)胞每2-3天分裂1次。暗色細(xì)胞可能是壞死的細(xì)胞。放大倍率(A)500x和(B)2000x。未感染細(xì)胞和模擬感染細(xì)胞在軟瓊脂中不生長(zhǎng)(未顯示)。
圖4A和4B受HBV感染的HepG2細(xì)胞的免疫熒光研究。(A)在該實(shí)驗(yàn)中，感染后12天，68％左右的細(xì)胞被FITC標(biāo)記的針對(duì)HBsAg的抗體染上色。(B)相同視野的相差顯微鏡檢查。放大倍率(A)和(B)2000x。
圖5A-5E受HBV感染的HepG2細(xì)胞在添加激素的完全培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)胰島素加地塞米松的影響。將受感染細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，胰蛋白酶消化，清洗，然后在添加胰島素和地塞米松的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在保溫期間每3-4天更換含胰島素和地塞米松的完全培養(yǎng)基，確實(shí)顯現(xiàn)下列一般特征(A)和(B)貼壁的HBV感染細(xì)胞的異常形態(tài)，和細(xì)胞培養(yǎng)瓶基底上出現(xiàn)的圓形細(xì)胞；(C)細(xì)胞培養(yǎng)瓶基底上出現(xiàn)的圓形細(xì)胞確實(shí)每2-3天分裂1次，開(kāi)始成塊；(D)4周左右后，形成了含數(shù)千細(xì)胞的大塊；(E)與(D)一樣，但放大倍率更高。放大倍率(A)、(B)、和(E)2000x；(C)500x；(D)800x。
發(fā)明詳述l.培養(yǎng)基通常每種原代細(xì)胞或細(xì)胞系在某種特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得較好，但是其它細(xì)胞培養(yǎng)基配方可用于所考慮細(xì)胞的支持生長(zhǎng)。為了描繪所關(guān)注細(xì)胞培養(yǎng)方案和培養(yǎng)基配方的領(lǐng)域，技術(shù)人員可以考慮相關(guān)文獻(xiàn)，諸如Freshney RI，《Culture of aninal cellsa manual of basictechniques》(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊(cè))，Wiley-Liss公司，1994；《Mammalian Cell Cultureessential techniques》(哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù))，Doyle和Griffiths JB編，John Wiley & sons，1997)。既然考慮肝細(xì)胞，也可以在Reid(Reid，1988)描述的存在于無(wú)血清、含激素的已知成份培養(yǎng)基的改良配方中培養(yǎng)細(xì)胞。2.細(xì)胞在添加10％胎牛血清(FCS；PAA，林茨，奧地利)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco-Life technologies，Paysley，蘇格蘭)、和Earle氏BSS(Gibco)并調(diào)至含1％非必需氨基酸(Amimed Bioconcept，Allschwil，瑞士)、1mM丙酮酸鈉(Gibco)、25mM HEPES(Gibco)、1.5g/L碳酸氫鈉(Amimed)、和抗生素(100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素；Gibco)的Eagle氏極限必需培養(yǎng)基(EMEM；Biochrom AG，柏林，德國(guó))(完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞(ATCC HB8065)。在用磷酸鹽緩沖液(PBS；每升含NaCl8g/L、KCl 0.2g/L、KH2PO40.2g/L、Na2HPO42H20 1.44g/L)清洗和胰蛋白酶(胰蛋白酶-EDTA；Gibco)消化之后，以25-50％匯合度將細(xì)胞直接接種新的培養(yǎng)瓶；或者在接種新的培養(yǎng)瓶之前，如上所述胰蛋白酶消化細(xì)胞單層，然后用完全培養(yǎng)基清洗1次。依照為HepG2細(xì)胞的胰蛋白酶消化而推薦的方案，胰蛋白酶消化后添加的這次清洗是任選的，但是在將細(xì)胞接種新的培養(yǎng)瓶之后顯示它們生長(zhǎng)成真正的單層。使用相差顯微鏡觀察培養(yǎng)物。發(fā)現(xiàn)在所采用的條件下倍增時(shí)間是8-10天左右。每2-3天更換全部細(xì)胞培養(yǎng)基。
在添加10％胎牛血清、1％丙酮酸鈉、2mM L-谷氨酰胺、和抗生素(100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)的Iscove氏修改Eagle氏培養(yǎng)基(IMEM；Gibco)(完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)Huh-7細(xì)胞。
若采用優(yōu)選懸浮培養(yǎng)的其它相關(guān)細(xì)胞系或原代細(xì)胞，則這些細(xì)胞可以省略上文所述胰蛋白酶消化步驟。3.細(xì)胞培養(yǎng)物的感染如上所述在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)于感染，采用如下流程。1)首先任選用PBS或任何其它方便流體清洗細(xì)胞。2)在任選的清洗之后，用硫酸葡聚糖例如每毫升方便流體含10毫克硫酸葡聚糖處理細(xì)胞，保溫時(shí)間例如5-10分鐘?；蛘?，可以采用肝素、乙二醇-雙(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸(即EGTA；亞乙基一雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸即EGTAzic acid)、乙二胺四乙酸(即EDTA；亞乙基雙次氮基四乙酸即乙二胺四乙酸)來(lái)代替硫酸葡聚糖。與硫酸葡聚糖或所述其它試劑一起保溫能夠在感染前使脂蛋白和/或脂質(zhì)的表面受體不含基本上所有的脂蛋白和/或脂質(zhì)。3)將細(xì)胞與硫酸葡聚糖或所述其它試劑一起保溫之后，用PBS或任何其它方便流體徹底清洗細(xì)胞，以除去痕量的硫酸葡聚糖。4)然后向細(xì)胞中加入病毒接種體并保溫30-90分鐘。該病毒接種體可存在于i)未稀釋血漿或血清，所述血漿或血清包含病毒的相關(guān)滴度或相關(guān)基因組等同物，所述病毒屬于嗜肝DNA病毒科或黃病毒科(分別諸如乙肝病毒或丙肝病毒)或任何其它病毒物種；或ii)用方便流體稀釋的血清或血漿，所述流體具有多種生理學(xué)相關(guān)配方?；蛘?，病毒接種體可起源于血液以外的其它來(lái)源，諸如其它體外細(xì)胞培養(yǎng)物，其中細(xì)胞在先前的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中受到了感染或轉(zhuǎn)染，所述細(xì)胞是已建立的原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系，或來(lái)自超速離心或免疫沉淀后病毒的重懸液，或來(lái)自由受感染黑猩猩獲得的血液。5)感染后，由細(xì)胞除去病毒接種體，并用PBS徹底清洗細(xì)胞。然后將細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中保溫。任選地，保溫過(guò)夜后更換完全培養(yǎng)基以除去未結(jié)合的輸入病毒，然后將細(xì)胞置于新的完全培養(yǎng)基中。
或者，在較低溫度(例如4℃或在冰上)進(jìn)行上文所述感染過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)步驟可以提高感染率。在這點(diǎn)上，首先可以將完全培養(yǎng)基中的細(xì)胞置于冰上大約10分鐘。然后任選用冰冷的PBS清洗細(xì)胞。再然后如上所述在冰上用硫酸葡聚糖處理細(xì)胞。除去硫酸葡聚糖之后，用冰冷的PBS徹底清洗細(xì)胞，并如上所述向細(xì)胞中加入冰冷的病毒接種體。然后通過(guò)如上所述直接置于37℃達(dá)1小時(shí)而將細(xì)胞與病毒接種體一起保溫，或者在置于37℃之前可以將細(xì)胞在冰上靜置一會(huì)兒，例如10分鐘。將細(xì)胞與病毒接種體一起保溫之后，除去病毒接種體，如上所述清洗細(xì)胞，并如上所述將細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中保溫。如上所述，任選地，保溫過(guò)夜后更換完全培養(yǎng)基。4.被感染細(xì)胞培養(yǎng)物的維持如上所述，通常每2-3天更換未感染細(xì)胞培養(yǎng)物的完全培養(yǎng)基。然而，在持續(xù)長(zhǎng)達(dá)1周的感染實(shí)驗(yàn)中，在整個(gè)感染過(guò)程中維持相同培養(yǎng)基。在持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的長(zhǎng)期感染中，用完全培養(yǎng)基定期(例如每7-10天)更換培養(yǎng)物上清液，以避免上清液的顯著蒸發(fā)。
實(shí)施例為了測(cè)定結(jié)合HBsAg的細(xì)胞的百分比，使用如下方案。將受感染HepG2細(xì)胞(大約106個(gè))進(jìn)行胰蛋白酶消化和完全培養(yǎng)基清洗。然后將細(xì)胞重懸于80微升含0.2％胎牛血清(FCS)和1/50效價(jià)的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗乙肝病毒表面抗原(Anawa Trading，Wangen Zürich，瑞士；產(chǎn)品目錄編號(hào)4940-1464)的磷酸鹽緩沖液(PBS)。將細(xì)胞在冰上保溫1小時(shí)，隨后用冰冷的PBS清洗2或3次。然后將細(xì)胞在500微升含1-2％低聚甲醛或丙酮的PBS中固定。將未感染細(xì)胞用作陰性對(duì)照。上文所述FITC標(biāo)記的抗HBsAg抗體的原始供應(yīng)商采用組成性表達(dá)HBsAg的肝細(xì)胞細(xì)胞系建立了陽(yáng)性對(duì)照。用配備表面熒光(Carl Zeiss，Axiophot 35，Oberkochen，德國(guó))的顯微鏡觀察細(xì)胞。使用FITC標(biāo)記的針對(duì)HBsAg的抗體對(duì)HBV感染細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光研究。圖4。(4)細(xì)胞表面表達(dá)HBsAg的HBV感染細(xì)胞的百分比(通過(guò)FACS測(cè)定)除了上述方案以外，還通過(guò)熒光相關(guān)細(xì)胞分揀術(shù)(FACS；FACSCalibur，Becton Dickinson)分析如上所述為免疫熒光而處理的細(xì)胞。參見(jiàn)
圖1。(5)HBV的轉(zhuǎn)化效果為了測(cè)定HBV的轉(zhuǎn)化效果，使用所謂的軟瓊脂測(cè)定法。早在30年前就已經(jīng)知道，瓊脂懸浮培養(yǎng)是用于病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一種選擇性測(cè)定法(Macpherson I和Montagnier L，1964)。該測(cè)定法稱(chēng)為“克隆原測(cè)定法”，而且相關(guān)方案已經(jīng)已建立的，例如《Mammalian Cell Cultureessential techniques》(哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù))(Doyle A和Griffiths JB編，John Wiley & sons，1997)中的方案17“用于貼壁依賴細(xì)胞的軟瓊脂克隆原測(cè)定法”(a soft agar clonogenic assay foranchorage-dependent cells)。通常，并且依照該領(lǐng)域文獻(xiàn)而非僅僅是這一推薦方案，瓊脂濃度的范圍可以是終濃度0.2-0.8％。HepG2細(xì)胞系在軟瓊脂中不生長(zhǎng)。因而，若這種細(xì)胞系受到能夠轉(zhuǎn)化該細(xì)胞的病毒的感染，則這些細(xì)胞可以在軟瓊脂中生長(zhǎng)。為了測(cè)定HBV是否是轉(zhuǎn)化性病毒，如上所述感染HepG2細(xì)胞，首先作為單層在完全培養(yǎng)基中保溫2-3周左右，胰蛋白酶消化，用完全培養(yǎng)基清洗，如上所述為軟瓊脂測(cè)定法而處理(然而，在完全培養(yǎng)基中存在0.8％軟瓊脂(Noble Agar，Difco；底特律，美國(guó)))時(shí)，最后保溫3周。
HBV感染細(xì)胞的軟瓊脂測(cè)定法。圖3。(6)添加胰島素和地塞米松的影響在完全培養(yǎng)基中添加胰島素和地塞米松對(duì)HBV感染細(xì)胞的影響。圖4。給出該實(shí)施例是為了提供關(guān)于HBV感染細(xì)胞命運(yùn)的其它特征。事實(shí)上，一些相關(guān)文獻(xiàn)早就提到胰島素和糖皮質(zhì)激素可能在HBV方面發(fā)揮重要作用(Tur-Caspa和Laub，1990；Choi，1998)。因而，將細(xì)胞在含大約10-6M胰島素和地塞米松的完全培養(yǎng)基中保溫。每3-4天更換全部含胰島素和地塞米松的完全培養(yǎng)基。(7)HBV感染細(xì)胞的長(zhǎng)期保溫(表4)依照本發(fā)明描述的方法，用低滴度的HBV感染HepG2細(xì)胞。然后可將細(xì)胞作為單層保持長(zhǎng)達(dá)35天或38天。在整個(gè)保溫期間，每5-7天只更換大約75-80％體積的完全培養(yǎng)基。
如上所述以規(guī)則間隔通過(guò)FACS分析細(xì)胞(2×104個(gè))。
注解和觀察在12孔板(Costar)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；在所考慮平板的10個(gè)周?chē)字械腍BsAg陽(yáng)性細(xì)胞百分比始終高于在兩個(gè)內(nèi)部孔中生長(zhǎng)的HBsAg陽(yáng)性細(xì)胞百分比，由此解釋了所測(cè)百分比的個(gè)體間差異。
依照本發(fā)明的方法，用低滴度的HBV感染Huh-7細(xì)胞。然后可將細(xì)胞作為單層保持長(zhǎng)達(dá)35天(表4a)。在整個(gè)保溫期間，每5-7天只更換大約75-80％體積的完全培養(yǎng)基。
如上所述以規(guī)則間隔通過(guò)FACS分析細(xì)胞(2×104個(gè))。
注解和觀察在12孔板(Costar)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；在所考慮平板的10個(gè)周?chē)字械腍BsAg陽(yáng)性細(xì)胞百分比始終高于在兩個(gè)內(nèi)部孔中生長(zhǎng)的HBsAg陽(yáng)性細(xì)胞百分比，由此解釋了所測(cè)百分比的個(gè)體間差異。
為了檢測(cè)HCV，常規(guī)采用Roche的COBAS Amplicor HCV Monitor測(cè)試。為了保持樣品中蛋白質(zhì)的方便濃度以得到精確結(jié)果，通?？紤]如下流程通常將來(lái)自模擬物感染培養(yǎng)物和HCV感染培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液與HCV陰性人血清混合，通常將要分析的樣品中達(dá)到終濃度50-90％血清。用HCV陰性血清進(jìn)行陰性對(duì)照；至于陽(yáng)性對(duì)照，以與來(lái)自模擬物感染細(xì)胞和HCV感染細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基的樣品相似的方式處理來(lái)自患有已知HCV病毒血癥的HCV感染患者的人血漿或血清。
結(jié)果以指數(shù)的形式給出指數(shù)值低于0.2，指示分析的樣品中不存在病毒RNA，分析中一起提供了內(nèi)部對(duì)照以確定獲得的結(jié)果是準(zhǔn)確的；指數(shù)值高于0.2，指示分析的樣品中存在病毒RNA，由HCV陽(yáng)性血清獲得的指數(shù)通?？蛇_(dá)到3.5-3.8左右，而且可以建立該分析，使樣品中病毒RNA飽和時(shí)提供“9.999”的指數(shù)。
有些平行對(duì)照分析指出，出于研究目的，在將要分析的樣品中不添加血清也能夠得到精確的結(jié)果，因?yàn)闇y(cè)試中所采用的提取方法包括在68％硫氰酸胍、3％二硫蘇糖醇中提取病毒核酸，這對(duì)于在全程生物學(xué)樣品中提取核酸是高度有效的(Chirgwin，1979)。
采用Amplicor HCV Moniter測(cè)試(Roche)對(duì)i)模擬物感染細(xì)胞、ii)用常規(guī)方法感染的細(xì)胞、和iii)用本發(fā)明所述流程感染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液分析HCV RNA。表6a(用代表HCV的幾種基因型(諸如基因型1a、1b、3、和4)的各種接種體進(jìn)行感染)。表6b(使用各種稀釋度的相同病毒接種體的典型感染的范例)。
接種體中含有各種血清(具有各種個(gè)別HCV基因型)，其中原始RNA滴度范圍是每毫升106-5.6×107個(gè)基因組。
接種體是用每毫升含有5.6×107個(gè)RNA基因組的原始血清(Roche)制備的。N.D.未測(cè)定到。
權(quán)利要求
1.用一種或多種病毒物種感染真核細(xì)胞的方法，其特征是在感染前使細(xì)胞表面的脂蛋白和/或脂質(zhì)受體不含基本上所有的脂蛋白和/或脂質(zhì)的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒物種是一種或幾種引起肝炎的因子。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒物種屬于嗜肝DNA病毒科。
4.權(quán)利要求3的方法其中所述病毒物種是乙肝病毒(HBV)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒物種屬于黃病毒科。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述病毒物種是丙肝病毒(HCV)。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述病毒物種是登革病毒。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述病毒物種是黃熱病毒。
9.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述病毒物種是丁肝病毒和乙肝病毒。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其特征是所述真核細(xì)胞是已建立的肝細(xì)胞細(xì)胞系。
11.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其特征是所述真核細(xì)胞是原代肝細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其特征是所述真核細(xì)胞是靈長(zhǎng)類(lèi)起源的。
13.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其特征是所述真核細(xì)胞是人HepG2細(xì)胞系。
14.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其特征是所述真核細(xì)胞是人Huh-7細(xì)胞系。
15.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其特征是所述真核細(xì)胞天然表達(dá)脂蛋白受體。
16.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其特征是所述真核細(xì)胞因先前編碼脂蛋白受體的基因的克隆而表達(dá)脂蛋白受體。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其特征是使細(xì)胞表面的脂蛋白和/或脂質(zhì)受體不含基本上所有的脂蛋白和/或脂質(zhì)是通過(guò)向培養(yǎng)基或向任何合適流體(優(yōu)選不含血清、和/或脂蛋白、和/或脂質(zhì)、和/或鈣)中單獨(dú)或聯(lián)合加入下組的一個(gè)或多個(gè)成員來(lái)進(jìn)行的硫酸葡聚糖、肝素、肝素樣多糖、乙二醇-雙(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA；亞乙基-雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸；EGTAzic acid)、乙二胺四乙酸(EDTA；亞乙基雙次氮基四乙酸)、或具有相似特性的任何其它試劑。
18.由權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法獲得的被感染細(xì)胞培養(yǎng)物。
19.權(quán)利要求18的被感染細(xì)胞培養(yǎng)物用于生產(chǎn)所述病毒物種的抗原的用途。
20.權(quán)利要求18的被感染細(xì)胞培養(yǎng)物用于生產(chǎn)針對(duì)所述病毒物種的疫苗的用途。
21.權(quán)利要求18的被感染細(xì)胞培養(yǎng)物用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的用途。
22.權(quán)利要求18的被感染細(xì)胞培養(yǎng)物用于產(chǎn)生基于細(xì)胞的診斷測(cè)定法的用途。
23.權(quán)利要求18的被感染細(xì)胞培養(yǎng)物用于篩選針對(duì)所述病毒物種的抗病毒劑的用途。
24.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其特征是使脂蛋白和/或脂質(zhì)受體不含基本上所有的脂蛋白和/或脂質(zhì)是通過(guò)將細(xì)胞與包含脂蛋白脂肪酶的合適流體一起預(yù)先保溫隨后徹底清洗細(xì)胞以除去脂蛋白脂肪酶來(lái)進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用一種或多種病毒物種(優(yōu)選乙肝病毒或丙肝病毒)感染真核細(xì)胞的方法，以及通過(guò)這種方法感染的細(xì)胞培養(yǎng)物。為了達(dá)到這個(gè)目的，將得自病毒(優(yōu)選嗜肝DNA病毒科和黃病毒科)感染個(gè)體的血漿或血清作為接種體用于感染已建立的真核細(xì)胞系或原代細(xì)胞(優(yōu)選肝細(xì)胞)，繼而生成病毒顆粒。這種方法、得到的感染細(xì)胞、和細(xì)胞培養(yǎng)物上清液可用于許多情況，特別是篩選藥物候選、檢測(cè)抗體、產(chǎn)生診斷試劑盒、和生產(chǎn)疫苗。
文檔編號(hào)C12N7/00GK1420923SQ00818199
公開(kāi)日2003年5月28日 申請(qǐng)日期2000年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月10日
發(fā)明者達(dá)尼埃爾·法夫爾 申請(qǐng)人:達(dá)尼埃爾·法夫爾