專利名稱：檢測及鑒別腸病毒的方法及其所用之引物及探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明揭示了核苷酸引物對在檢測檢體中腸病毒之存在與否中的應(yīng)用。本發(fā)明亦揭示能夠與腸病毒核酸之有義鏈或相關(guān)于該有義鏈之核酸進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)之合成性核苷酸序列。本發(fā)明提供了檢測腸病毒核酸在檢體中存在與否的方法以及在檢體中檢測腸病毒之試劑盒。本發(fā)明特別提供檢測及鑒別檢體中腸病毒71型及/或柯薩奇病毒A16型的方法及試劑盒。
腸病毒屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)。該病毒科在成員數(shù)量上代表非常大的RNA病毒家族，但在病毒顆粒尺寸及復(fù)雜程度上俱為最小之一。腸病毒之病毒體包括由60個(gè)次單元所組成，每個(gè)次單元由四種蛋白質(zhì)(VP1-VP4)以正二十面體對稱方式圍繞由單鏈正義RNA形成之基因體。腸病毒短暫棲于人類消化道，也可以從腸道后段或喉嚨分離。人類來源之腸病毒包括小兒麻痹病毒(血清型1至3)，柯薩奇病毒A群(CAV，血清型1至22及24)及柯薩奇病毒B群(CBV，血清型1至6)，腸道細(xì)胞病變孤獨(dú)病毒(血清型1至9，11至27及29至33)及腸病毒(血清型68-71)。人類腸病毒感染可導(dǎo)致大范圍涉及神經(jīng)，皮膚及粘膜，心臟及肌肉，眼，呼吸道及胃腸道疾病的急性癥狀，以及無明顯特征之熱病，廣泛之嬰兒疾病及糖尿病。在非小兒麻痹之腸病毒中，一些未分類之血清型所造成的感染特別在夏季及初秋盛行于一些國家及地區(qū)，例如腸病毒70型及71型。腸病毒71型曾由罹患腦膜炎、腦炎及類似小兒麻痹脊髓炎之麻痹患者身上分離，仍為世界上時(shí)而致命之中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之主要原因。再者，此型病毒在一些地區(qū)引起人類手足口疾病之爆發(fā)，例如在日本，瑞典及臺灣。
腸病毒的一般診斷通常包括病毒收獲及血清學(xué)試驗(yàn)。病毒的分離可包含自漱喉水、喉嚨棉拭、糞便、直腸棉拭中分離病毒，有時(shí)可從腦脊髓液(在無菌性腦膜炎的情形)中分離病毒。將經(jīng)分離之病毒樣品接種至組織培養(yǎng)物或乳鼠(后者專門為柯薩奇病毒)中繁殖及鑒定。此種病毒收獲程序每次耗費(fèi)一至二星期才能完成。另外，亦需合格技術(shù)人員參與才得以完成。
血清學(xué)試驗(yàn)方面通常進(jìn)行中和試驗(yàn)以檢測對感染病毒具特異性之中和性抗體。對于一些腸道細(xì)胞病變孤獨(dú)病毒而言，血球凝集抑制試驗(yàn)可指出血清型特異性感染。血清抗體亦能經(jīng)由免疫熒光技術(shù)在蓋玻片上使用被感染細(xì)胞培養(yǎng)物作為抗原來進(jìn)行檢測及滴定。然而，血清學(xué)試驗(yàn)難以用于評估，因?yàn)檠逍偷姆N類很多，除非所用的抗原是由特定個(gè)人分離或在典型臨床疾病流行性爆發(fā)時(shí)分離。在所有的血清學(xué)試驗(yàn)中，熟習(xí)本技術(shù)之人員必須從結(jié)果讀數(shù)去判斷何者為決定值(cut-off values)。同時(shí)，在這些試驗(yàn)中所使用的抗原通常需要特別的技術(shù)及一段時(shí)間來制備以降低異質(zhì)型反應(yīng)或交叉反應(yīng)的發(fā)生率。
病毒收獲及血清學(xué)試驗(yàn)俱不能提供一個(gè)快速的診斷工具。然而，與腸病毒相關(guān)的急性癥狀可發(fā)展甚速，在有些案例中可能在數(shù)天內(nèi)發(fā)展成為致命性。因此對于在實(shí)際上能快速且簡易檢測腸病毒的方法有殷切需求。
本發(fā)明涉及新的寡核苷酸對以用于檢測腸病毒在檢體中存在與否。本發(fā)明之具體引物對包括第一引物及第二引物，其可用于經(jīng)由核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(如聚合酶鏈反應(yīng))快速診斷出與腸病毒相關(guān)之疾病或癥狀。
本發(fā)明令人驚異地發(fā)現(xiàn)一些核苷酸序列系相關(guān)于腸病毒核酸中的保守性區(qū)域。因此，本發(fā)明進(jìn)而提供合成性核苷酸序列，其能夠特異性與腸病毒核酸之有義鏈或相關(guān)于該有義鏈之核酸進(jìn)行雜交。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種檢測腸病毒核酸在檢體中存在與否的方法。本發(fā)明之方法包含(a)在一擴(kuò)增方法中將該檢體與本發(fā)明之一寡核苷酸引物對接觸；及(b)經(jīng)由檢測擴(kuò)增產(chǎn)物之存在與否以決定腸病毒之存在與否。
優(yōu)選地，在本發(fā)明之方法中，該檢體于擴(kuò)增方法中可同時(shí)接觸除了第一對引物以外之第二對本發(fā)明之寡核苷酸引物。在第二對中的引物與第一對中的引物不同。在第二對中的引物可具有與第一對中相對應(yīng)引物不同之第一引物或第二引物。優(yōu)選的是，第二對中的兩個(gè)引物皆與第一對的引物不同。進(jìn)而，該檢體于擴(kuò)增方法中可同時(shí)接觸除了第一對及第二對引物以外之第三對本發(fā)明之寡核苷酸引物。同樣的，在第三對中的引物與第一對或第二對中的引物皆不同。
在另一方面，本發(fā)明之方法可進(jìn)而包含在一擴(kuò)增方法中將該步驟(a)之產(chǎn)物與本發(fā)明之第二寡核苷酸引物對接觸。第二對引物經(jīng)選擇而能在一擴(kuò)增方法中用于擴(kuò)增一序列，該序列相同于或被包含于使用第一對引物之?dāng)U增方法中可得到之序列。
在本發(fā)明方法之另一方面，可將在步驟(b)檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明之至少一個(gè)合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
在另一方面，本發(fā)明相關(guān)于一種在檢體中檢測及鑒別腸病毒71型的方法。該方法包含(a)在一擴(kuò)增方法中將該檢體與本發(fā)明之至少一對寡核苷酸引物接觸；(b)經(jīng)由檢測擴(kuò)增產(chǎn)物之存在與否以決定腸病毒71型之存在與否；及(c)將在步驟(b)檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明之含有序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。優(yōu)選的是，所檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物系與本發(fā)明之含有序列SEQ ID NO12及SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種在檢體中檢測及鑒別柯薩奇病毒A16型的方法。該方法包含(a)在一擴(kuò)增方法中將該檢體與本發(fā)明之至少一對寡核苷酸引物接觸；(b)經(jīng)由檢測擴(kuò)增產(chǎn)物之存在與否以決定柯薩奇病毒A16型之存在與否；及(c)將在步驟(b)檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明之含有序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。優(yōu)選的是，所檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物系與本發(fā)明之含有序列SEQ ID NO14及SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種在檢體中檢測及鑒別腸病毒71型及/或柯薩奇病毒A16型的方法。該方法包含(a)在一擴(kuò)增方法中將該檢體與本發(fā)明之至少一對寡核苷酸引物接觸；(b)經(jīng)由檢測擴(kuò)增產(chǎn)物之存在與否以決定腸病毒71型及/或柯薩奇病毒A16型之存在與否；及(c)將在步驟(b)檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明之至少一個(gè)含有序列SEQ IDNO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列及至少一個(gè)含有序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。優(yōu)選的是，所檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物系與本發(fā)明之含有序列SEQID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14及SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
在另一方面，本發(fā)明提供在檢體中檢測腸病毒之試劑盒，其包含至少一對本發(fā)明寡核苷酸引物。優(yōu)選的是，本發(fā)明之試劑盒包含超過一對之本發(fā)明寡核苷酸引物。在本發(fā)明另一方面，該試劑盒可進(jìn)而包含至少一個(gè)本發(fā)明合成性核苷酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供在檢體中檢測及鑒別腸病毒71型之試劑盒，其包含至少一對本發(fā)明寡核苷酸引物及至少一個(gè)含有序列SEQID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列。優(yōu)選的是，本發(fā)明之試劑盒包含超過一對之本發(fā)明寡核苷酸引物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，該試劑盒系包含含有序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供在檢體中檢測及鑒別柯薩奇病毒A16型之試劑盒，其包含至少一對本發(fā)明寡核苷酸引物及至少一個(gè)含有序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列。優(yōu)選的是，本發(fā)明之試劑盒包含超過一對之本發(fā)明寡核苷酸引物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，該試劑盒系包含含有序列SEQ ID NO14或SEQ IDNO15之合成性核苷酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供在檢體中檢測及鑒別腸病毒71型及/或柯薩奇病毒A16型之試劑盒，其包含至少一對本發(fā)明寡核苷酸引物，及至少一個(gè)含有序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13以及至少一個(gè)含有序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列。優(yōu)選的是，本發(fā)明之試劑盒包含超過一對之本發(fā)明寡核苷酸引物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，該試劑盒系包含含有序列SEQ ID NO12-15之合成性核苷酸序列。


圖1之示意圖顯示相關(guān)于腸病毒71型之一部分cDNA序列，其中具有編號U22521之cDNA序列系得自GenBank資料庫。在框中的序列相關(guān)于本發(fā)明之引物及探針，其分別以發(fā)明人所使用的命名予以標(biāo)示。
圖2為以不同引物之組合，利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增腸病毒71型核酸之電泳分析圖。a至h行各使用之引物對為af1/r1，bf2/r1，cf3/r1，df5/r1，ef1/r2，ff2/r2，gf3/r1，hf5/r2。m為核酸大小標(biāo)記，1至5分別為1∶600bp，2∶500bp，3∶400bp，4∶300bp，5∶200bp。
圖3為腸病毒71型及柯薩奇病毒A16型之核酸經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后與腸病毒共通型探針(p1，p2，p3)雜交之結(jié)果。聚合酶鏈反應(yīng)使用之引物配對為f5/r1，固定在尼龍膜探針之分部位置如下左邊第一排之第2至4點(diǎn)p1，中間排之第2至4點(diǎn)p2，右邊第一排之第2至4點(diǎn)p3；1和2腸病毒71型與柯薩奇病毒A16型核酸；3為不含核酸之對照組。
圖4為腸病毒71型，柯薩奇病毒A16型及腸道細(xì)胞病變孤獨(dú)病毒第3型之核酸分別經(jīng)多重聚合酶鏈反應(yīng)(multiplex PCR)擴(kuò)增后，與腸病毒共通型探針(p1，p2，p3)及腸病毒71型，柯薩奇病毒A16型特異性探針(71-2，71-3，16-1，16-2)雜交之結(jié)果。聚合酶鏈反應(yīng)使用之引物配對為fS/r1及f7/r4，固定在尼龍膜探針之分布位置如下將此6×6點(diǎn)陣十字等分為4個(gè)3×3的等分，其中左上方區(qū)塊屬腸病毒共通型探針區(qū)塊，每一排各為3個(gè)探針之3重復(fù)，右上區(qū)塊為腸病毒71型區(qū)，由兩個(gè)特異性探針交錯(cuò)排列，左下區(qū)塊為柯薩奇病毒A16型區(qū)，由兩個(gè)特異性探針交錯(cuò)排列。
術(shù)語″特異性雜交″或″特異性雜交反應(yīng)″意指寡核苷酸與目標(biāo)序列之間的互補(bǔ)性雜交。術(shù)語″特異性″或″特異性地″意指該互補(bǔ)性雜交所顯示之特異性，其允許在該寡核苷酸與該目標(biāo)序列之間有少許錯(cuò)配但不會負(fù)面影響檢測雜交信號之退火。
術(shù)語″檢體″意指包括任何含有核酸之生物性物質(zhì)之檢體。優(yōu)選地，術(shù)語″檢體″意指包括全血，血清，尿液，唾液，腦脊髓液，精液，淚水，喉嚨棉拭，直腸棉拭，排泄物等之生物性檢體。
術(shù)語″擴(kuò)增方法″意指擴(kuò)增核酸序列之試驗(yàn)或方法。例如，該″擴(kuò)增方法″包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試驗(yàn)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)試驗(yàn)，Qβ-復(fù)制酶擴(kuò)增法，活體外轉(zhuǎn)錄法，活體外反轉(zhuǎn)錄法及自持性序列復(fù)制。
術(shù)語″高度嚴(yán)格條件″意指所選擇之雜交條件就特定序列及既定的離子強(qiáng)度與pH值下約較熱融點(diǎn)(Tm)低5℃。熱融點(diǎn)溫度時(shí)(在既定的離子強(qiáng)度與pH值下)50％之目標(biāo)序列可與完全相配對之探針雜交。典型地，高度嚴(yán)格條件下，鹽濃度在pH 7約為0.2M且溫度至少高于60℃。
在此所用的堿基代號包括代表在天然DNA分子中可發(fā)現(xiàn)之天然來源嘌呤及嘧啶的代號(即，A，G，T及C)，以及熟習(xí)該項(xiàng)技術(shù)者在合成寡核苷酸所習(xí)知之代表混合堿基的代號(如R，Y，S，H)。關(guān)于本案說明書所使用的代號，A(或a)表示腺嘌呤，G(或g)表示鳥糞嘌呤，T(或t)表示胸腺嘧啶，C(或c)表示胞嘧啶，R(或r)表示腺嘌呤或鳥糞嘌呤，Y(或y)表示胸腺嘧啶或胞嘧啶，S(或s)表示鳥糞嘌呤或胞嘧啶，且H(或h)表示腺嘌呤，胸腺嘧啶或胞嘧啶。
本發(fā)明可用于檢測衍生自腸病毒之核酸。本發(fā)明提供快速及靈敏的方法以檢測衍生自腸病毒之核酸之存在與否。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明之方法為基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)之試驗(yàn)。在另一方面，本發(fā)明提供非常特異之PCR引物對，其可用于檢測及/或確認(rèn)特定腸病毒血清型，如腸病毒71型及柯薩奇病毒A16型。在另一方面，本發(fā)明提供特異性核苷酸序列，其能夠與自使用本發(fā)明引物對之?dāng)U增方法可得到的核酸片段進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
有一些擴(kuò)增方法皆可使用，但基于PCR的方法為優(yōu)選的。PCR方法在相關(guān)技藝中所知甚詳，因此在此僅作簡述。對于PCR方法及步驟程序的綜覽，可參考例如，U.S.專利Nos.4,683,195及4,683,202；4,965,188；及Innis等人所編著之PCR步驟程序″A Guide toMethods and Application″(Academic Press，Inc.，San Diego，CA.1990)。PCR反應(yīng)劑及方法程序亦為商業(yè)化可得者。
因?yàn)槟c病毒為RNA病毒，擴(kuò)增方法的第一步為針對欲復(fù)制的區(qū)域制造DNA拷貝(cDNA)。反轉(zhuǎn)錄方法可以分開的方式進(jìn)行，或以均質(zhì)性反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方式進(jìn)行，后者為用于擴(kuò)增RNA之聚合酶鏈反應(yīng)改良方法。適合將腸病毒核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法見述于Romero及Rotbart之″Diagnostic Molecular BiologyPrinciples and Applications″pp.401-406，Persing等人編著(MayoFoundation，Rochester，MN 1993)；Rotbart等人U.S.專利No.5,075,212及Egger等人，J.Clin.Microbiol.331442-1447(1995)。
本發(fā)明提供新的寡核苷酸引物對以用于在檢體中檢測腸病毒存在與否。本發(fā)明之具體引物對包括第一引物及第二引物，其可用于經(jīng)由核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(例如聚合酶鏈反應(yīng))快速診斷與腸病毒相關(guān)之疾病或癥狀。本發(fā)明之引物尋標(biāo)至編碼特定保守性區(qū)域之有義鏈或反義鏈。單一引物對或復(fù)數(shù)引物對之特定組合得到陣列式擴(kuò)增產(chǎn)物，其可用于檢測在檢體中存在之腸病毒。在本發(fā)明優(yōu)選的組合中，第一引物包含選自包括下列之群組之序列f1TTGTRCGCCTGTTTTA(SEQ ID NO1)，f2CAAGCACTTCTGTHHCCCCGG(SEQ ID NO2)，f3TACTTCGAGAARCCYAGTA(SEQ ID NO3)，f5AAGAGYCTATTGAGCTA(SEQ ID NO4)及f7GGI TGG TRS TGG AAR TTI CC(SEQ ID NO5)。
第二引物包含選自包括下列之群組之序列R1CACYGGATGGCCAATCCAA(SEQ ID NO6)，R2ATTGTCACCATAAGCAGCCA(SEQ ID NO7)，及R4AR RTT IAT CCA YTG RTG IGG(SEQ ID NO8)。
本發(fā)明引物之序列相關(guān)于如
圖1所示在框中之習(xí)知腸病毒cDNA序列。設(shè)計(jì)這些引物時(shí)，對相關(guān)病毒cDNA序列進(jìn)行堿基修正以增進(jìn)引物退火之效率并擴(kuò)大使用這些引物可檢測之序列歧異范圍。
包含本發(fā)明序列SEQ ID NOs5及8之引物相關(guān)于腸病毒基因體之編碼區(qū)域。相關(guān)于腸病毒基因體之編碼區(qū)域之引物系意欲涵蓋包含與序列SEQ ID NOs5及8有關(guān)之簡并性序列之引物。上列序列SEQ IDNOs5及8系根據(jù)該等序列所相關(guān)的密碼子而以適當(dāng)?shù)娜?lián)體(triplet)方式示意性描繪。
在本發(fā)明中，更優(yōu)選之組合包含一對或多對下列引物F1(SEQ ID NO1)/r1(SEQ ID NO6)；f2(SEQ ID NO2)/r1(SEQ ID NO6)；F3(SEQ ID NO3)/r1(SEQ ID NO6)；f5(SEQ ID NO4)/r1(SEQ ID NO6)；F1(SEQ ID NO1)/r2(SEQ ID NO7)；f2(SEQ ID NO2)/r2(SEQ ID NO7)；F3(SEQ ID NO3)/r2(SEQ ID NO7)；f5(SEQ ID NO4)/r2(SEQ ID NO7)；及F7(SEQ ID NO5)/r2(SEQ ID NO7)。
在本發(fā)明優(yōu)選的方面，引物對f7(SEQ ID NO5)/r4(SEQ ID NO8)特別適用于擴(kuò)增方法中偵側(cè)腸病毒71型(EV71)及柯薩奇病毒A16型(Cox A16)。
根據(jù)
圖1，熟習(xí)該項(xiàng)技術(shù)者可了解如何選擇適合檢測及/或擴(kuò)增腸病毒基因體中所欲片段之至少一對本發(fā)明引物，并因此容易決定欲使用之本發(fā)明引物對。如
圖1所示，當(dāng)?shù)谝灰锇蛄蠸EQ ID NO5或其簡并性序列則第二引物應(yīng)包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列。
為了經(jīng)由PCR去擴(kuò)增在檢體中之目標(biāo)核酸序列，該序列必須能夠與擴(kuò)增系統(tǒng)中元件接觸(accessible)。通常，此接觸性經(jīng)由將核酸自該檢體中分離而予以確認(rèn)。在相關(guān)技藝中已知相異之自生物性檢體中抽取核酸之技術(shù)，特別是核糖核酸。或者，若該檢體系相當(dāng)易于破壞，則核酸經(jīng)由PCR技術(shù)擴(kuò)增前毋需純化。亦即若該檢體包括細(xì)胞(特別是外周血淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞)，細(xì)胞內(nèi)成份之溶解及分散可經(jīng)由將細(xì)胞懸浮于低張性溶液中而輕易達(dá)成。
每個(gè)PCR循環(huán)的第一步系有關(guān)將引物延長作用所得之核酸雙鏈加以分離。當(dāng)雙鏈分離后，PCR中下一步系有關(guān)將已分離之核酸鏈與目標(biāo)序列兩側(cè)之引物進(jìn)行雜交(即退火)。該引物隨后被延長而形成目標(biāo)序列之互補(bǔ)性拷貝。為了成功的PCR擴(kuò)增，考慮每個(gè)引物沿著雙鏈序列進(jìn)行雜交的位置來設(shè)計(jì)該引物，使得從一引物合成所得的延伸產(chǎn)物自模板分離后，作為另一引物之延伸作用的模板。變性，雜交，及延長之循環(huán)依需要重覆多次以獲得擴(kuò)增核酸之需要份量。
在PCR方法之優(yōu)選實(shí)施方案中，鏈分離之達(dá)成系經(jīng)由將反應(yīng)物加熱至充分高的溫度達(dá)充分時(shí)間，造成雙鏈之變性但不會造成聚合酶不可逆之變性。在PCR中引物對之模板依賴性延長作用系經(jīng)由聚合性物質(zhì)在適量之四種脫氧核糖核苷三磷酸(典型上為dATP，dGTP，dCTP及dTTP)存在下于包含合適鹽類，金屬離子及pH緩沖系統(tǒng)之培育液體內(nèi)進(jìn)行催化而成。合適的聚合性物質(zhì)為已知可催化模板依賴性DNA合成之酶。在本發(fā)明中，引物延長作用之最初模板典型上為RNA。適于自RNA模板合成cDNA之反轉(zhuǎn)錄酶(RTs)為習(xí)知的。
PCR最通常以自動化方法使用熱穩(wěn)定酶進(jìn)行。在此方法中，反應(yīng)混合物的溫度自動經(jīng)由變性范圍、引物退火范圍及延長反應(yīng)范圍進(jìn)行循環(huán)。
如上所述，本發(fā)明之優(yōu)選實(shí)施方案并含RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。然而，熟習(xí)該項(xiàng)技術(shù)者將認(rèn)知到目標(biāo)序列在檢體中的擴(kuò)增可用任何習(xí)知方法完成，如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，Qβ-復(fù)制酶擴(kuò)增，活體外轉(zhuǎn)錄，及子持性序列復(fù)制，以上皆可提供充份的擴(kuò)增。
本發(fā)明方法所生產(chǎn)之被擴(kuò)增片段(″擴(kuò)增產(chǎn)物″)之大小典型上足以決定腸病毒之存在與否。因此，在本發(fā)明之一些實(shí)施方案中，在檢體中所產(chǎn)出之被擴(kuò)增片段之大小區(qū)分(例如凝膠電泳分析)可用于決定在檢體中腸病毒之存在與否。此典型上經(jīng)由將含有已知核酸之對照組以和用于擴(kuò)增目標(biāo)檢體所用者相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)習(xí)知方法將被擴(kuò)增的序列在瓊脂糖凝膠上電泳并以溴化乙錠標(biāo)示后，將檢體及對照組之條帶型態(tài)進(jìn)行比較。檢體結(jié)果與對照組比較出現(xiàn)之相異或額外的條帶指出腸病毒之存在。
為了確定PCR擴(kuò)增結(jié)果之正確性，可以在一擴(kuò)增方法中使用一對以上的引物。在本發(fā)明之方法中，彼此不同的引物對可以同時(shí)或先后使用。在一個(gè)擴(kuò)增方法中同時(shí)使用本發(fā)明一對以上引物之情形下，一對引物與另一對引物的不同可為第一個(gè)引物或第二個(gè)引物，或第一個(gè)引物或第二個(gè)引物皆有不同。在另一種情形，若在一擴(kuò)增方法中連續(xù)使用本發(fā)明之兩對引物，第二對引物能用于擴(kuò)增之序列，相等于使用第一對引物在擴(kuò)增方法中推想可獲得之序列或在該可獲得序列范圍之內(nèi)。根據(jù)
圖1，實(shí)施者可以經(jīng)由輕易決定同時(shí)使用或先后使用之一對以上的引物來進(jìn)行本發(fā)明方法。
或者，本發(fā)明之?dāng)U增產(chǎn)物可使用對目標(biāo)核酸具特異性之寡核苷酸探針進(jìn)行檢測。探針通常選自對單一目標(biāo)序列具有特異性之腸病毒基因體區(qū)域。
序列特異性探針雜交反應(yīng)為一種習(xí)知甚詳之在檢體中檢測所欲核酸之方法。在充分嚴(yán)格之雜交反應(yīng)條件下，探針僅與實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)性序列發(fā)生特異性雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)條件的嚴(yán)格性可以放寬以容忍不同程度之序列錯(cuò)配。被擴(kuò)增產(chǎn)物之檢測使用此序列特異性雜交反應(yīng)以確定檢測到正確之被擴(kuò)增目標(biāo)，藉此減少因來自其他生物或其他污染序列之相似性序列存在之故造成偽陽性的機(jī)會。
本發(fā)明令人驚異地發(fā)現(xiàn)一些核苷酸序列相關(guān)于腸病毒核酸之保守性區(qū)域。因此，本發(fā)明進(jìn)而提供該等合成性核苷酸序列，其能夠與腸病毒核酸之有義鏈或相關(guān)于該有義鏈之核酸(如使用該有義鏈作為模板之?dāng)U增反應(yīng)之產(chǎn)物)進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。這些合成性核苷酸序列有利于在腸病毒雜交反應(yīng)試驗(yàn)中作為探針。優(yōu)選的是，該等合成性核苷酸序列系選自包括下列之群組p1TCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATC(SEQ ID NO9)，p2TGTCGTAACGSGCAASTCYGYRGCGGAACCGAC(SEQ ID NO10)，p3TACTTTGGGTGTCCGTGTTTCHTTTTAT(SEQ ID NO11)，71-2C TTA TAA GCA GAC TCA ACC CGG TGC TGA TG(SEQ ID NO12)，71-3TGG CAT TCC AAT ATC ACA ATT AAC AGT G(SEQ ID NO13)，16-1CTC GGC ACT ATC GCA GGA GGG ACC GGG AAT(SEQ ID NO14)及16-2C CTA CGC CAC TAC ACA GCC TGG TCA GGT TG
(SEQ ID NO15)。
本發(fā)明之合成性核苷酸序列相關(guān)于如
圖1所示框中的習(xí)知腸病毒cDNA序列。本發(fā)明包含序列SEQ ID NOs12-15之核苷酸序列相關(guān)于腸病毒基因體之編碼區(qū)域。相關(guān)于腸病毒基因體之編碼區(qū)域之核苷酸序列系意欲涵蓋包含與序列SEQ ID NOs12-15有關(guān)之簡并性序列之核苷酸序列。上列序列SEQ ID NOs12-15系根據(jù)該等序列所相關(guān)的密碼子而以適當(dāng)?shù)娜?lián)體方式示意性描繪。
根據(jù)
圖1，熟習(xí)該項(xiàng)技術(shù)者可了解如何選擇至少一本發(fā)明核苷酸序列，其在使用本發(fā)明引物之雜交反應(yīng)試驗(yàn)中作為探針，并因此容易決定欲使用之本發(fā)明探針。如
圖1所示，當(dāng)包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列之第二引物不用于擴(kuò)增時(shí)，則該核苷酸序列應(yīng)不包含任何序列SEQ ID Nos12-15或其簡并性序列。進(jìn)而，當(dāng)包含序列SEQID NO5或其簡并性序列之第一引物不用于擴(kuò)增時(shí)，則該核苷酸序列應(yīng)不包含任何序列SEQ ID Nos9-11或其簡并性序列。
相關(guān)技藝中已對一些雜交反應(yīng)模式習(xí)知甚詳，這些雜交反應(yīng)模式包括但不限于溶液相，固體相，混合相或原位雜交反應(yīng)試驗(yàn)。在溶液(或液體)相雜交反應(yīng)中，目標(biāo)核酸與探針或引物之間自由在反應(yīng)混合物中進(jìn)行交互反應(yīng)。在固體相雜交反應(yīng)試驗(yàn)中，將目標(biāo)或探針連接于固體支持物上，而處于能夠在溶液中與互補(bǔ)性核酸進(jìn)行。示范性固體相模式包含Southern雜交反應(yīng)，斑點(diǎn)法及類似方法。雜交反應(yīng)之檢測可于固體支持物上進(jìn)行，如微滴板，濾膜(如硝基纖維)或微球體(小珠)或一晶片及任何可行的雜交反應(yīng)緩沖液系統(tǒng)。
雜交反應(yīng)復(fù)合物之檢測系根據(jù)習(xí)知甚詳之技術(shù)進(jìn)行檢測，且此習(xí)知檢測并非本發(fā)明之重要部份。能夠特異性與一目標(biāo)進(jìn)行雜交之核酸探針之標(biāo)記(labeling)可用任何一種典型上用于檢測被雜交之核酸存在之方法進(jìn)行。
常見檢測的方法系使用放射自顯影，其使用以3H，125I，35S，14C，32P或類似物進(jìn)行標(biāo)記之探針。放射活性同位素之選擇依研究的偏好而定，而這種偏好又視合成的容易程度而定。雜交反應(yīng)之檢測可于固體支持物上進(jìn)行，如微滴板，濾膜(如硝基纖維)或微球體(小珠)或一晶片及任何可行的雜交反應(yīng)緩沖液系統(tǒng)。
其他的標(biāo)記包含配體(ligand)，其系與以熒光團(tuán)(fluorophore)，化學(xué)發(fā)光劑或酶標(biāo)記之抗配體(antiligand)或抗體結(jié)合?；蛘?，探針可直接與如熒光團(tuán)，化學(xué)發(fā)光劑或酶之標(biāo)記進(jìn)行綴合結(jié)合。標(biāo)記方式的選擇取決于所需之靈敏度，與探針綴合結(jié)合之容易性，安定性需求及可用的儀器而定。
本發(fā)明探針及引物可使用傳統(tǒng)習(xí)知方法進(jìn)行合成及標(biāo)記。作為探針及引物之寡核苷酸可根據(jù)Beaucage，S.L.及Caruthers，M.H.(1981，Tetrahedron Letts.，22(20)1859-1862)首先描述之固體相亞胺基磷酸酯三酯方法使用自動化合成儀進(jìn)行化學(xué)合成，如Needham-VanDevanter，D.R.等人在1984，Nucleic Acid Res.，126159-6168中所述。寡核苷酸之純化或可經(jīng)由天然丙烯酰胺凝膠電泳法或經(jīng)由陰離子-交換樹脂HPLC進(jìn)行，如Pearson，J.D.及Regnier，F(xiàn).E.在1983，J.Chrom.，255137-149中所述者。
上述引物及試驗(yàn)系用于檢測檢體中的腸病毒，診斷腸病毒相關(guān)疾病及癥狀及確定特定癥狀或癥狀組合與特定腸病毒存在之間的關(guān)聯(lián)性(或切斷此種關(guān)聯(lián))。診斷上的應(yīng)用可用病史及受試個(gè)體的特征加以補(bǔ)充及確認(rèn)。經(jīng)由本發(fā)明方法診斷之腸病毒疾病，癥候群及癥狀包含所有在本文及科學(xué)文獻(xiàn)中已報(bào)告與腸病毒相關(guān)之疾病，癥候群及癥狀，特別包含無菌性腦膜炎，腸病毒糖尿病，腸病毒結(jié)膜炎，急性軟弱性麻庳，急性良性心包炎，發(fā)疹，內(nèi)皮疹，擴(kuò)張性心肌病變，口足病，慢性疲憊癥狀，熱病及上呼吸道感染。腸病毒感染及其與癥候群的關(guān)聯(lián)性之檢測使得發(fā)展疫苗及治療方法成為可能。
本發(fā)明亦提供試劑盒，其為多容器單位而包括用于實(shí)施本發(fā)明方法之成份。有利的試劑盒可包括用于檢測意欲目標(biāo)核酸之探針。在一些情況下，該探針可固著于合適的支持膜上。該試劑盒將亦可包含本發(fā)明所提供之引物。該試劑盒中其他選擇性成份包含，例如，反轉(zhuǎn)錄酶或聚合酶，基質(zhì)核苷三磷酸，用于標(biāo)記的物質(zhì)(例如，當(dāng)標(biāo)記物為生物素時(shí)，含抗生物素蛋白(avidin)-酶綴合物及酶底物及發(fā)色原)及用于反轉(zhuǎn)錄，PCR，或雜交反應(yīng)之合適緩沖液。除了上述成份以外，該試劑盒亦可包含進(jìn)行本發(fā)明方法之指示。
在本發(fā)明說明中所引述之文獻(xiàn)均以參考資料的方式并入本案。
本發(fā)明其他的特征及優(yōu)點(diǎn)將可明顯見于下列優(yōu)選實(shí)施方案及權(quán)利要求書。
下列實(shí)施例用于示范說明本發(fā)明。這些實(shí)施例不以任何方式意欲限制本發(fā)明之范圍，但用于指示如何實(shí)施本發(fā)明的材料及方法。
實(shí)施例1腸病毒之檢測1.1.病毒所使用的59個(gè)腸病毒樣本(見表1)或自臨床收集之檢體中分離或得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。腸病毒經(jīng)由中和試驗(yàn)使用匯合之免疫血清加以鑒定，接著以單型中和性多克隆抗體確認(rèn)其血清型。如結(jié)果所示，59個(gè)樣本包括不同的腸病毒血清型(見表1)。病毒于MRC5單層細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖。
1.2.抽取RNA病毒RNA系經(jīng)由將總核酸自經(jīng)感染單層細(xì)胞培養(yǎng)物之離心沉淀物分離而得。約4-6×106個(gè)細(xì)胞(每毫升)于溶解緩沖液(50mMNaCl，20mM Tris HCl(pH 7.5)，50 mM EDTA，1％十二烷基硫酸鈉)中溶解，以酚-氯仿萃取三次并以氯仿萃取一次，且隨后自2.5M含乙醇之乙酸銨中沉淀。將核酸離心沉淀物以75％乙醇清洗，進(jìn)行乾燥并懸浮于100微升之無菌蒸餾水中。RNA制備物被貯于-80℃。
1.3.PCR擴(kuò)增試驗(yàn)擴(kuò)增試驗(yàn)之第一步為合成將被擴(kuò)增之腸病毒RNA基因體部分之DNA拷貝(cDNA)(即反轉(zhuǎn)錄步驟)。經(jīng)由聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行之反轉(zhuǎn)錄作用于20μl之反應(yīng)混合物(1μl之總RNA，20 mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，5mM MgCl2，10mM DTT，各為0.5mM之dATP，dCTP，dGTP及dTTP，以及50納克之隨意六元體)中進(jìn)行。將檢體培育于65℃5分鐘，隨后置于冰上1分鐘。加入50單位之反轉(zhuǎn)錄酶并將該混合物于42℃培育50分鐘。該反應(yīng)藉由在70℃培育15分鐘而終止。所得的cDNA產(chǎn)物被貯于-20℃。
經(jīng)由PCR之DNA擴(kuò)增作用于25μl反應(yīng)混合物[12μl之cDNA，20mM Tris-HCl(pH8.0)，0.1mM EDTA，1mM DTT，1.0％triton X-100，50％甘油，1.5mM MgCl2，各150μM之dATP，dCTP，dGTP及dTTP，各10pmol之各具體引物及2.5 U之Taq DNA聚合酶]中進(jìn)行。在擴(kuò)增反應(yīng)中所使用的引物對為包含下列序列之引物f1(SEQ ID NO1)/r1(SEQ ID NO6)，f2(SEQ ID NO2)/r1(SEQ ID NO6)，f3(SEQ ID NO3)/r1(SEQ ID NO6)；f5(SEQ ID NO4)/r1(SEQ ID NO6)，f1(SEQ ID NO1)/r2(SEQ ID NO7)，f2(SEQ ID NO2)/r2(SEQ ID NO7)，f3(SEQ ID NO3)/r2(SEQ ID NO7)及f5(SEQ ID NO4)/r2(SEQ ID NO7)。
引物r1及r2以生物素在5′端標(biāo)記供后續(xù)檢測步驟使用。每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)溫度循環(huán)(于94℃變性4分鐘，于55℃進(jìn)行引物對退火1分鐘，及于72℃延長1分鐘)。
1.4.DNA產(chǎn)物之分離將PCR產(chǎn)物之少量(每個(gè)10μl)于1.5％瓊脂糖凝膠于0.5×TBE緩沖液(0.045M Tris-硼酸鹽，0.001M EDTA)中于100伏特下進(jìn)行電泳30分鐘。電泳后，將凝膠染以溴化乙錠并于UV光源下觀察。所有病毒樣本使用本發(fā)明引物之?dāng)U增反應(yīng)于UV光源下觀察皆顯示陽性結(jié)果。使用引物對f5/r1針對59個(gè)病毒樣本進(jìn)行之PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)示于表1。表1
以不同引物之組合，利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增腸病毒71型核酸之電泳分析圖示于圖2。a至h行各使用之引物對為af1/r1，bf2/r1，cf3/r1，df5/r1，ef1/r2，f:f2/r2，gf3/r1，hf5/r2。m為核酸大小標(biāo)記，1至5分別為1∶600bp，2∶500bp，3∶400bp，4∶300bp，5∶200bp。
上述結(jié)果證明本發(fā)明引物，可廣泛用于檢測腸病毒之核酸存在與否，藉此診斷腸病毒之存在與否。
1.5.雜交反應(yīng)分析將三個(gè)腸病毒特異性探針(p1，p2及p3)用于檢測經(jīng)擴(kuò)增之DNA片段，其分別包含序列SEQ ID NO9，SEQ ID NO10及SEQ IDNO11。
將探針進(jìn)行加熱以變性(95℃，5分鐘)并快速于冰上驟冷2分鐘，接著將這些探針(每個(gè)10μM)固著于尼龍膜(來自BoehringerManngeim)上。三個(gè)探針(每個(gè)1μl)被施用及曝露于紫外線幅射(254nm，0.15J/cm2)之下。
將生物素標(biāo)記之PCR產(chǎn)物(每個(gè)8μl)在95℃加熱5分鐘進(jìn)行變性并于冰上驟冷2分鐘，并加入雜交反應(yīng)溶液[5x標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽(SSC)，0.1％(w/v)N-月桂?；舛罐⑺幔?.1％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)，1x封閉緩沖液(來自Boehringer Manngeim，20ml/100cm2)]中。含有PCR產(chǎn)物之雜交反應(yīng)溶液隨后與尼龍膜及經(jīng)標(biāo)記之探針共同培育。于50℃培育1小時(shí)以后，將該等膜于室溫使用清洗緩沖液(2×SSC及0.1％SDS)清洗五次，隨后加入鏈親和素堿性磷酸(2μl/20ml 1×封閉緩沖液)。將膜置于室溫下30分鐘并于室溫下以順丁烯二酸緩沖液(0.1M順丁烯二酸，0.15M NaCl，pH7.5)清洗五次。將膜于檢測緩沖液(0.1M Tris-HCl；0.1M NaCl；50mM MgCl2，pH9.5)中平衡5分鐘并與新鮮制備之顏色-基質(zhì)溶液(45μl NBT溶液混合35μl X-磷酸溶液)，并用檢測緩沖液加到10毫升)在黑暗中培育10分鐘。最后將膜以1×TE緩沖液清洗以終止反應(yīng)并于室溫下晾干。將雜交反應(yīng)信號進(jìn)行檢測及記錄。結(jié)果示于表2。表2
腸病毒71型及柯薩奇病毒A16型之核酸經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后與腸病毒共通型探針(p1，p2，p3)雜交之結(jié)果示于圖3。聚合酶鏈反應(yīng)使用之引物配對為f5／r1，固定在尼龍膜探針之分部位置如下最上面一列及最下面一列為雜交對照組，使用之探針為豬流產(chǎn)及呼吸綜合癥病毒(Dorcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)ORF 7的一段核酸序列，由于雜交液中含有與此探針互補(bǔ)之核酸序列，故雜交反應(yīng)順利完成時(shí)，此兩列會有信號產(chǎn)生。左邊第一排之第2至4點(diǎn)探針p1，中間排之第2至4點(diǎn)探針p2，右邊第一排之第2至4點(diǎn)探針p3。1及2腸病毒71型與柯薩奇病毒A16型于雜交對照點(diǎn)及腸病毒共通型探針位置均有信號。3為不含核酸之對照組，僅于雜交對照探針有信號。
實(shí)施例2檢測及鑒別腸病毒71型(EV71)與柯薩奇病毒A16型(CoxA16)2.1.PCR擴(kuò)增試驗(yàn)RNA抽取及反轉(zhuǎn)錄步驟在實(shí)例1中所述之相同條件下進(jìn)行。在此試驗(yàn)中所使用的PCR引物為包含序列f7(SEQ ID NO5)/r4(SEQ IDNO8)之引物對。
PCR反應(yīng)混合物及溫度循環(huán)條件如實(shí)例1中所述加以調(diào)整。
2.2.雜交反應(yīng)試驗(yàn)用于檢測EV71之探針為含有序列SEQ ID NO12(71-2)及SEQ IDNO13(71-3)之探針。用于檢測Cox A16之探針為含有序列SEQ IDNO14(16-1)及SEQ ID NO15(16-2)之探針。雜交反應(yīng)試驗(yàn)如實(shí)例1中所述條件進(jìn)行。
結(jié)果顯示使用引物對f7/r4及探針71-2與71-3之本發(fā)明方法能特異性檢測及鑒別EV71及非-EV71腸病毒。結(jié)果顯示使用引物對f7/r4及探針16-1與16-2之本發(fā)明方法能特異性檢測及鑒別Cox A16及非-Cox A16腸病毒。
實(shí)施例3檢測及鑒別EV71，Cox A16，非-EV71腸病毒及非-CoxA16腸病毒之試劑盒使用本發(fā)明之試劑盒同時(shí)對EV71及Cox A16進(jìn)行檢測。該試劑盒提供材料及步驟程序使得實(shí)施者能夠進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)。病毒RNA抽取及反轉(zhuǎn)錄步驟在實(shí)施例1中所述之相同條件下進(jìn)行。多重PCR于25μl反應(yīng)混合物(每單位含有12μl之cDNA，50mM Tris-HCl(pH8.3)，70mM KCl，2.5mM MgCl2，各為200μM之dATP，dCTP，dGTP及dTTP，10pmol之引物f5/r1，20pmol之引物f7/r4及3U之Taq DNA聚合酶)中進(jìn)行。每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)溫度循環(huán)(于94℃變性4分鐘，于55℃進(jìn)行引物對退火1分鐘，及于72℃延長1分鐘)。經(jīng)該多重PCR擴(kuò)增后，所得之PCR產(chǎn)物與固著探針之膜(p1，p2及p3針對腸病毒，71-2及71-3專一針對EV71，且16-1及16-2專一針對Cox A16)共同培育。雜交反應(yīng)試驗(yàn)的所有條件均與實(shí)例1中所述者相同。結(jié)果顯示該試劑盒(提供包括多重PCR及多重雜交反應(yīng)檢測之系統(tǒng))可檢測及鑒別EV71，Cox A16，非-EV71腸病毒及非-Cox A16腸病毒。使用本發(fā)明不同探針之雜交反應(yīng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)示于表3。表3
腸病毒71型，柯薩奇病毒A16型及ECHO病毒第3型之核酸分別經(jīng)多重聚合酶鏈反應(yīng)(multiplex PCR)擴(kuò)增后，與腸病毒共通型探針(p1，p2，p3)及腸病毒71型，柯薩奇病毒A16型特異性探針(71-2，71-3，16-1及16-2)雜交之結(jié)果示于圖4。聚合酶鏈反應(yīng)使用之引物配對為f5/r1及f7/r4，固定在尼龍膜探針之分部位置如下此為6×6點(diǎn)分部的探針點(diǎn)陣，以十字將此6×6點(diǎn)陣等分為4個(gè)3×3的等分，其中左上方區(qū)塊屬腸病毒共通型探針區(qū)塊，每一排各為3個(gè)探針之3重復(fù)，右上區(qū)塊為腸病毒71型區(qū)，由兩個(gè)特異性探針交錯(cuò)排列，左下區(qū)塊為柯薩奇病毒A16型區(qū)，由兩個(gè)特異性探針交錯(cuò)排列。1共通型與腸病毒71型探針位置均有信號；2共通型與柯薩奇病毒A16型探針位置均有信號；3只有共通型區(qū)域探針有信號。
根據(jù)本發(fā)明可作之不同修正及變化對于熟習(xí)該項(xiàng)技術(shù)者而言均顯然不會偏離本發(fā)明的范圍與精神。雖然本發(fā)明已敘述特定的偏好實(shí)施方案，必須了解的是本發(fā)明不應(yīng)被不當(dāng)?shù)叵拗朴谠摰忍囟▽?shí)施方案上。事實(shí)上，在實(shí)施本發(fā)明之已述模式方面，對于熟習(xí)該項(xiàng)技術(shù)者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋于下列申請專利范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一用于在檢體中檢測腸病毒存在與否之寡核苷酸引物對，其中該對引物中第一引物包含下列任一序列SEQ ID NO1TTGTRCGCCTGTTTTA，SEQ ID NO2CAAGCACTTCTGTHHCCCCGG，SEQ ID NO3TACTTCGAGAARCCYAGTA，SEQ ID NO4AAGAGYCTATTGAGCTA，或SEQ ID NO5GGITGGTRSTGGAARTTICC，或SEQ ID No5之簡并性序列；且該對引物中第二引物包含下列任一序列SEQ ID NO6CACYGGATGGCCAATCCAA，SEQ ID NO7ATTGTCACCATAAGCAGCCA，或SEQ ID NO8ARRTTIATCCAYTGRTGIGG，或SEQ ID No8之簡并性序列，其條件為，當(dāng)?shù)谝灰锇蛄蠸EQ ID NO5或其簡并性序列，則第二引物包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1之引物對，其包含選自包括下列之群組之序列SEQ ID NO1/SEQ ID NO6；SEQ ID NO2/SEQ ID NO6；SEQ IDNO3/SEQ ID NO6；SEQ ID NO4/SEQ ID NO6；SEQ ID NO1/SEQ IDNO7；SEQ ID NO2/SEQ ID NO7；SEQ ID NO3/SEQ ID NO7；SEQ IDNO4/SEQ ID NO7；及SEQ ID NO5/SEQ ID NO8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1之引物對，其為SEQ ID NO5/SEQ ID NO8。
4.根據(jù)權(quán)利要求3之引物對，其用于檢測腸病毒71型(EV71)或柯薩奇病毒A16(Cox A16)。
5.一合成性核苷酸序列，其包含任一選自下列群組之序列SEQ ID NO9TCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATC，SEQ ID NO10TGTCGTAACGSGCAASTCYGYRGCGGAACCGAC，SEQ ID NO11TACTTTGGGTGTCCGTGTTTCHTTTTAT，SEQ ID NO12CTTATAAGCAGACTCAACCCGGTGCTGATG，SEQ ID NO13TGGCATTCCAATATCACAATTAACAGTG，SEQ ID NO14CTCGGCACTATCGCAGGAGGGACCGGGAAT及SEQ ID NO15CCTACGCCACTACACAGCCTGGTCAGGTTG，及SEQ ID NO12-15中任一之簡并性序列，其能夠與腸病毒核酸之有義鏈或相關(guān)于該有義鏈之核酸進(jìn)行特異性雜交。
6.一種檢測腸病毒核酸在檢體中存在與否的方法，其包含下列步驟(a)在一擴(kuò)增方法中將該檢體與根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物對接觸；及(b)經(jīng)由檢測擴(kuò)增產(chǎn)物之存在與否而決定腸病毒之存在與否。
7.根據(jù)權(quán)利要求6之方法，其中在步驟(a)，該檢體于一擴(kuò)增方法中同時(shí)與第二對根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物接觸，且該第二對引物相異于第一對引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7之方法，其中在第二對引物中的第一引物相異于第一對引物中的第一引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7之方法，其中在第二對引物中的第二引物相異于第一對引物中的第二引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7之方法，其中第二對引物中的兩個(gè)引物相異于第一對引物中的兩個(gè)引物。
11.根據(jù)權(quán)利要求7之方法，其中在步驟(a)，該檢體于一擴(kuò)增方法中同時(shí)與第三對根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物接觸，且該第三對引物相異于第一對及第二對引物。
12.根據(jù)權(quán)利要求6之方法，其進(jìn)而包含將步驟(a)之產(chǎn)物于一擴(kuò)增方法中同時(shí)與第二對根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物接觸，其中第二對引物能用于擴(kuò)增之序列，相等于使用第一對引物在擴(kuò)增方法中可獲得之序列或在該可獲得序列范圍之內(nèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求6之方法，其中將被檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步與至少一根據(jù)權(quán)利要求5之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)，其條件為，當(dāng)包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列之第二引物不用于擴(kuò)增時(shí)，則該核苷酸序列應(yīng)不包含任何序列SEQ ID NO12-15或其簡并性序列；當(dāng)包含序列SEQ ID NO5或其簡并性序列之第一引物不用于擴(kuò)增時(shí)，則該核苷酸序列應(yīng)不包含任何序列SEQ IDNO9-11或其簡并性序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13之方法，其中雜交反應(yīng)系于高度嚴(yán)格條件下進(jìn)行。
15.一種檢測及鑒別檢體中腸病毒71型的方法，其包含(a)在一擴(kuò)增方法中將該檢體與根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物對接觸，條件為第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列；(b)經(jīng)由檢測擴(kuò)增產(chǎn)物之存在與否而決定腸病毒71型之存在與否；及(c)將所檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物與至少一個(gè)包含序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15之方法，其中，在步驟(c)中，擴(kuò)增產(chǎn)物系與分別包含序列SEQ ID NO12及SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
17.一種檢測及鑒別檢體中柯薩奇病毒A16型的方法，其包含(a)在一擴(kuò)增方法中將該檢體與根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物對接觸，條件為第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列；(b)經(jīng)由檢測擴(kuò)增產(chǎn)物之存在與否而決定柯薩奇病毒A16型之存在與否；及(c)將所檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物與至少一個(gè)包含序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17之方法，其中，在步驟(c)中，擴(kuò)增產(chǎn)物系與分別包含序列SEQ ID NO14及SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
19.一種檢測及鑒別檢體中腸病毒71型及/或柯薩奇病毒A16型的方法，其包含(a)在一擴(kuò)增方法中將該檢體與根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物對接觸，條件為第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列；(b)經(jīng)由檢測擴(kuò)增產(chǎn)物之存在與否而決定腸病毒71型及/或柯薩奇病毒A16型之存在與否；及(c)將所檢測到的擴(kuò)增產(chǎn)物與至少一個(gè)包含序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列以及至少一個(gè)包含序列SEQ IDNO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19之方法，其中，在步驟(c)中，擴(kuò)增產(chǎn)物系與分別包含序列SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14及SEQID NO15之合成性核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)。
21.一種在檢體中檢測腸病毒之試劑盒，其包含至少一對根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物，其條件為，當(dāng)?shù)谝灰锇蛄蠸EQ IDNO5或其簡并性序列時(shí)，則第二引物包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21之試劑盒，其包含多于一對根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物。
23.根據(jù)權(quán)利要求21之試劑盒，其包含至少一根據(jù)權(quán)利要求5之合成性核苷酸序列，其條件為，當(dāng)包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列之第二引物不用于擴(kuò)增時(shí)，則該核苷酸序列應(yīng)不包含任何序列SEQ ID NO12-15或其簡并性序列；當(dāng)包含序列SEQ ID NO5或其簡并性序列之第一引物不用于擴(kuò)增時(shí)，則該核苷酸序列應(yīng)不包含任何序列SEQ IDNO9-11或其簡并性序列。
24.一種檢測及鑒別檢體中腸病毒71型的試劑盒，其包含至少一對根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物，條件為第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列；及至少一個(gè)包含序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列。
25.一種檢測及鑒別檢體中柯薩奇病毒A16型的試劑盒，其包含至少一對根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物，條件為第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列；及至少一個(gè)包含序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列。
26.一種檢測及鑒別檢體中腸病毒71型及/或柯薩奇病毒A16型的方法，其包含至少一對根據(jù)權(quán)利要求1之寡核苷酸引物，條件為第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其簡并性序列；至少一個(gè)包含序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列以及至少一個(gè)包含序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明揭示了核苷酸引物對在檢測檢體中腸病毒之存在與否中的應(yīng)用。本發(fā)明亦揭示能夠與腸病毒核酸之有義鏈或相關(guān)于該有義鏈之核酸進(jìn)行特異性雜交反應(yīng)之合成性核苷酸序列。本發(fā)明提供了檢測腸病毒核酸在檢體中存在與否的方法以及在檢體中檢測腸病毒之試劑盒。本發(fā)明特別提供檢測及鑒別檢體中腸病毒71型及/或柯薩奇病毒A16型的方法及試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1366066SQ0110062
公開日2002年8月28日 申請日期2001年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月15日
發(fā)明者李泔泓, 白啟宏, 曾楊源, 王意雯, 王獻(xiàn)煌 申請人:晶宇生物科技實(shí)業(yè)股份有限公司