專利名稱：呼腸弧病毒家族病毒的疫苗病毒株的制造方法
呼腸弧病毒家族病毒的疫苗病毒株的制造方法本發(fā)明涉及產(chǎn)生病毒的改性病毒株的方法，該病毒為呼腸弧病毒家族成員，尤其 涉及尤其涉及環(huán)狀病毒屬的疫苗病毒株。呼腸弧病毒科(Reoviridae)病毒，其具有由雙股RNA (dsRNA)構(gòu)成的基因組，導(dǎo)致 多種疾病。環(huán)狀病毒為呼腸弧病毒家族病毒，也導(dǎo)致廣泛傳播的疾病。環(huán)狀病毒的實(shí)例為 非洲馬瘟病毒(AHSV)、流行性出血熱病毒(EHDV)及藍(lán)舌病毒(BTV)。
非洲馬瘟病毒(AHSV)、流行性出血熱病毒(EHDV)及藍(lán)舌病毒(BTV)為反芻動(dòng)物的 非接觸傳染的病毒性疾病，并通常經(jīng)昆蟲攜帶者傳播。AHSV通常地感染馬、騾、驢及斑馬； EHDV通常地感染鹿、家牛及綿羊；及BTV通常地感染家牛、綿羊、山羊、水牛、鹿、單峰駱駝及 羚羊。藍(lán)舌病毒(BTV)為昆蟲媒介的野生反芻動(dòng)物及家畜的新興病原體，其對(duì)歐洲農(nóng)業(yè) 已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響。BTV導(dǎo)致綿羊、山羊及家牛疾病，在一些種的綿羊中死亡率達(dá) 70%。BTV在哺乳動(dòng)物宿主間通過庫(kù)蠓屬的幾種蠓傳播，該蠓決定了該病毒的地理范圍。 BTV在多個(gè)熱帶及亞熱帶國(guó)家為地方性的，但自1998年BTV入侵歐洲大陸已經(jīng)成為常見的 事件，并于2007年向北直至聯(lián)合王國(guó)。分子流行病學(xué)研究顯示自1998年六種不同血清型 (BTV1、2、4、8、9及16)在至少八個(gè)獨(dú)立的場(chǎng)合，通過至少三種不同渠道已被引入歐洲大陸， 自1998年大多數(shù)年份都有新的引入。BTV的所述增加范圍的可能直接原因?yàn)槔ハx媒介種 群的大小和分布的增加，BTV通過新媒介種類的傳播，其在中歐及北歐大量存在。家畜或野 生反芻動(dòng)物未確診感染的存在與通過昆蟲媒介的遷徙而遠(yuǎn)距離迅速傳播一起導(dǎo)致阻止BTV 在歐洲開始地方性化的失敗。因此，當(dāng)前BTV對(duì)所有歐洲國(guó)家中的家畜表現(xiàn)出嚴(yán)重威脅。四 種BTV血清型現(xiàn)在歐洲普遍存在，并已導(dǎo)致180萬頭動(dòng)物的死亡。在歐洲已經(jīng)嘗試了通過接種進(jìn)行BTV控制，其對(duì)少數(shù)的血清型同時(shí)使用活的和滅 活的疫苗。兩種疫苗已為歐洲各地區(qū)提供了一些保護(hù)，但仍有已知的缺點(diǎn)。存活的減低毒 性的BTV疫苗具有多種缺點(diǎn)1)導(dǎo)致典型藍(lán)舌臨床癥狀的發(fā)生的under-attenuation ；2) 毒性恢復(fù)或與野生型病毒重組，之后通過昆蟲媒介傳播；3)不能區(qū)分接種疫苗的動(dòng)物與自 然地感染的動(dòng)物，這妨礙了鑒別感染與接種動(dòng)物策略(DIVA)的使用；以及4)制造新流行的 血清型的毒性降低株的時(shí)間延遲。在歐洲，滅活疫苗已被用于控制BTV2及BTV4。這些疫苗受與滅活、確認(rèn)每一批已 滅活以及低免疫原性相關(guān)的高制造成本影響。此前發(fā)明人已報(bào)道了 BTV ssRNA在不使用輔助病毒時(shí)仍然是有感染性的，同時(shí)有 感染性的BTV可從細(xì)胞中回收(BoyCe，M.和Roy，P. 2007)。此文獻(xiàn)以全文方式結(jié)合于本文。本發(fā)明旨在減少或消除與改良病毒的病毒株相關(guān)的，尤其是與產(chǎn)生活的減低毒性 的疫苗相關(guān)的部分或全部已知缺點(diǎn)，所述病毒為呼腸弧病毒家族的成員。本發(fā)明提供了制造作為呼腸弧病毒家族成員的病毒的疫苗病毒株的方法，該方法 包括在呼腸弧病毒科病毒中引入突變，從而摧毀必需基因的功能；使用來自病毒基因組并包含所述突變的病毒單股RNA (ssRNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；
在適宜的條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)疫苗病毒株的制造，其中所述細(xì)胞補(bǔ)充了必需病毒基因的功能，因此使得疫苗病毒株在細(xì)胞中復(fù)制。術(shù)語“ 疫苗病毒株”指適用于使通常受野生型病毒感染的特定宿主免疫的疫苗的 病毒株。疫苗病毒株為非致病性及不能導(dǎo)致感染的病毒株。因此，其不導(dǎo)致通常與野生型 病毒關(guān)聯(lián)的疾病。疫苗病毒株的概念是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，野生型病毒可以被 減低毒性或滅活從而其在接種了減低毒性的或滅活的病毒的宿主內(nèi)產(chǎn)生免疫響應(yīng)而不導(dǎo) 致完全感染。這允許宿主當(dāng)暴露于野生型病毒的時(shí)候發(fā)起有效的免疫響應(yīng)。在本發(fā)明中，所述病毒可為呼腸弧病毒家族成員的任意病毒。優(yōu)選地，所述病毒為 輪狀病毒、呼腸病毒或環(huán)狀病毒屬的成員。更優(yōu)選地，所述病毒為環(huán)狀病毒屬的成員。再更 優(yōu)選地，所述病毒為藍(lán)舌病毒(BTV)、非洲馬瘟病毒(AHSV)或流行性出血熱病毒(EHDV)。最 優(yōu)選地，所述病毒為藍(lán)舌病毒(BTV)。很多病毒具有多種不同的血清型。例如，BTV具有24種不同的血清型。不同血清 型可以具有略微不同的蛋白質(zhì)并甚至可以在不同基因組中含有的基因數(shù)量不同。進(jìn)一步 地，到現(xiàn)在為止未發(fā)現(xiàn)的血清型很可能未來會(huì)產(chǎn)生。因此，本發(fā)明旨在涵蓋病毒任何可能的 血清型，已知的或到現(xiàn)在為止未知的，其落入前述類別的定義內(nèi)，例如，BTV0術(shù)語“必需基因”指病毒為致病性所必需的基因。當(dāng)必需基因的功能被摧毀時(shí)，所 產(chǎn)生的疫苗病毒株為非致病性的。通過向該基因引入突變，破壞所述必需基因的功能。應(yīng) 破壞至少一個(gè)必需基因的功能。優(yōu)選地，破壞超過一種必需基因的功能。這幫助確保所述 病毒不恢復(fù)為致病性的顯型。優(yōu)選地，在必需基因或各個(gè)必需基因中的突變?yōu)橛绊懺摫匦?基因的大部分序列的廣泛突變。同樣地，這幫助確保所述病毒不恢復(fù)為致病性的顯型。此 突變可以為在任何必需基因中并使所述病毒轉(zhuǎn)化為非致病性的顯型。優(yōu)選地，所述突變引 入酶蛋白中，例如，在聚合酶、螺旋酶或加帽酶中?？蛇x地，非結(jié)構(gòu)蛋白也可以被滅活。這允 許DIVA策略的使用。這是鑒別感染與接種動(dòng)物策略。例如，如編碼NSl的基因在BTV中被 刪除，疫苗株在被接種的動(dòng)物中將不表達(dá)NS1。因此，在被接種的動(dòng)物中將不會(huì)產(chǎn)生對(duì)NSl 的抗體響應(yīng)。這與正常感染不同，在正常感染中NSl被表達(dá)，動(dòng)物中出現(xiàn)抗體響應(yīng)。在監(jiān)控 過程中，NSl抗體的檢測(cè)證明該動(dòng)物被野生型的BTV感染，而不是被疫苗株感染。此外，可 以在基因組中引入編碼標(biāo)記抗原(marker antigen)的基因。這將是明確的抗原標(biāo)記物，說 明動(dòng)物已經(jīng)被接種了。該突變可以以任何合適的方式引入基因或各個(gè)基因。例如，該突變可以被引入病 毒的基因組中。由此基因組產(chǎn)生的ssRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也將包含此突變。可選地，該突變可直 接引入ssRNA中。這可以通過例如使用人工產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)于被替換的部分但仍包含突變的 ssRNA替換ssRNA的一部分來完成。在一個(gè)實(shí)施例中，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的ssRNA可以是完全人 工制造的。此完全人工制造的ssRNA將對(duì)應(yīng)于在單個(gè)或多個(gè)必需基因中帶有突變的整個(gè)病 毒基因組。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，cDNA克隆可以由病毒基因組的一部分制得?？蛇x地，cDNA克隆可由整個(gè)病毒基因組制得。隨后突變可被引入到cDNA克隆中， 例如，以產(chǎn)生帶有各種不同突變的cDNA克隆的文庫(kù)。來自這些cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可隨 后用作用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的ssRNA。因此，該ssRNA的一部分可以由cDNA克隆創(chuàng)建。可選地，用 于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的整個(gè)ssRNA可從cDNA克隆創(chuàng)建。所述突變可以為破壞基因功能的任意突變。該突變可以為，例如，缺失或插入突變，以致該突變基因產(chǎn)生無功能的蛋白。優(yōu)選地，在病毒中引入大范圍缺失的突變。轉(zhuǎn)染ssRNA的細(xì)胞可以為適于ssRNA轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)病毒株的任意細(xì)胞。該細(xì)胞是病 毒許可的細(xì)胞。優(yōu)選地，該細(xì)胞為BHK 21細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞、293T細(xì)胞、BSR細(xì)胞(特定 BHK 21細(xì)胞的克隆)、HeLa細(xì)胞、C6/36細(xì)胞(來自白紋伊蚊的蚊細(xì)胞系)或KC細(xì)胞(來 自天然昆蟲媒介蠛蠓的蚊細(xì)胞系)。更優(yōu)選地，該細(xì)胞為BSR細(xì)胞。 用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的ssRNA為病毒基因組的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，也包含所述突變。此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 可由含有突變的病毒的dsRNA基因組直接獲得?？蛇x地，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可從病毒基因組中非 直接地獲得。例如，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可由病毒基因組的cDNA克隆中制得，該cDNA克隆包含突 變。在呼腸弧病毒科病毒中，例如BTV，病毒ssRNA在所感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中由病毒顆粒 合成，此處其用作病毒蛋白合成的mRNA及新基因組dsRNA合成的模板。本發(fā)明的ssRNA也 表現(xiàn)出這些功能，因此ssRNA中的突變?cè)赿sRNA基因組的合成過程中被并入疫苗病毒株。該ssRNA可以被修飾，以含有期待的病毒的免疫關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)。例如，當(dāng)病毒為BTV 時(shí)，所述ssRNA優(yōu)選地編碼來自感興趣的一種血清型的VP2及VP5。在一些實(shí)施例中，該 ssRNA可以編碼來自多種不同病毒血清型的大量免疫學(xué)上重要的蛋白質(zhì)。該ssRNA可隨后 被用于接種以抵抗多種不同病毒血清型。優(yōu)選地，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的該病毒ssRNA是經(jīng)分離的ssRNA。這意味著該ssRNA基本 不含其它病毒組分，例如病毒顆粒、病毒dsRNA及病毒蛋白質(zhì)。經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以在任何適合的條件下以任何適合的方式培養(yǎng)，以使其產(chǎn)生疫苗 病毒株。培養(yǎng)細(xì)胞的這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。轉(zhuǎn)染該細(xì)胞的步驟優(yōu)選地包含2個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)染步驟，其中(1)第一轉(zhuǎn)染步驟包括使用ssRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述ssRNA至少編碼組裝病毒衣殼內(nèi) 層所需的組分；以及(2)第二轉(zhuǎn)染步驟包括使用ssRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述ssRNA為病毒基因組的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 且包含突變，并因此編碼所有病毒組裝所需的組分。已發(fā)現(xiàn)通過執(zhí)行2次轉(zhuǎn)染，所產(chǎn)生的病毒的水平提高了 10倍。進(jìn)一步地，通過確 ?；蚪M包裝所需的至少一種病毒組分未被在第一轉(zhuǎn)染步驟中轉(zhuǎn)染的ssRNA編碼，產(chǎn)生的 病毒的水平相比當(dāng)只有單獨(dú)一步轉(zhuǎn)染步驟時(shí)達(dá)到的增加了 100倍。當(dāng)使用BTV操作時(shí)， 優(yōu)選為病毒組分VP2、VP5、VP7及NS3的至少一種不被第一轉(zhuǎn)染步驟中轉(zhuǎn)染的ssRNA編碼。 優(yōu)選地，病毒組分VP2、VP5、VP7及NS3的全部在第一轉(zhuǎn)染步驟中被省略(omit)。在第一及第二轉(zhuǎn)染步驟之間，優(yōu)選有一段時(shí)間間隔，以使有充足時(shí)間以組裝病毒 衣殼的內(nèi)層。優(yōu)選地，在第一和第二轉(zhuǎn)染步驟之間為至少6小時(shí)，更優(yōu)選地12小時(shí)以及最 優(yōu)選地18小時(shí)。所述細(xì)胞補(bǔ)充必需病毒基因的功能。這意味著細(xì)胞已經(jīng)被改性使得其含有滅活的 必需基因的備份。結(jié)果，必需基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)由細(xì)胞的mRNA表達(dá)，而不是由病毒的ssRNA 表達(dá)，因此該基因的功能由細(xì)胞補(bǔ)充。這保證了所有對(duì)病毒復(fù)制而言必要的關(guān)鍵的蛋白均 存在于細(xì)胞內(nèi)。因此，疫苗病毒株可以自由地在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。然而，若疫苗病毒株感染非該 補(bǔ)充細(xì)胞(complementing cell)的細(xì)胞，必需基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物將不出現(xiàn)，所以疫苗病毒 株將不能重復(fù)復(fù)制。所述疫苗病毒株將經(jīng)歷單復(fù)制周期，例如，在被接種的宿主中。當(dāng)多于 一個(gè)必需基因的功能被破壞時(shí)，細(xì)胞補(bǔ)充每個(gè)必需病毒基因的功能。
優(yōu)選地，制造疫苗病毒株的方法還包括將疫苗病毒株從細(xì)胞中分離。這可以通過 任意合適的方式完成。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。例如，疫苗病毒株可從病毒斑中 分離。本發(fā)明同時(shí)提供了分離的病毒ssRNA，該ssRNA源于作為呼腸弧病毒家族成員的 病毒的基因組，其中所述ssRNA包含破壞必需基因功能的突變，及其中所述病毒ssRNA適用 于前述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法中。本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述方法所制備的疫苗病毒株。本發(fā)明也提供了表達(dá)呼腸弧病毒科病毒的必需基因的細(xì)胞，其使得來自本發(fā)明 ssRNA的疫苗病毒株可以復(fù)制。
本發(fā)明提供由本發(fā)明的ssRNA感染的本發(fā)明的細(xì)胞。本發(fā)明還提供本發(fā)明的疫苗病毒株在治療中的用途。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的分離的病毒ssRNA在治療中的用途。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的疫苗病毒株在給動(dòng)物接種抵抗呼腸弧病毒科病毒中的 用途。本發(fā)明同時(shí)提供了本發(fā)明分離的病毒ssRNA在給動(dòng)物接種抵抗呼腸弧病毒科病 毒中的用途。本發(fā)明同時(shí)提供了給動(dòng)物接種抵抗呼腸弧病毒科病毒的方法，包括將有效量的本 發(fā)明的疫苗病毒株遞送給動(dòng)物。本發(fā)明同時(shí)提供了給動(dòng)物接種抵抗呼腸弧病毒科病毒的方法，包括將有效量的本 發(fā)明的分離的病毒ssRNA遞送給動(dòng)物。由于來自呼腸弧病毒科病毒的分離的病毒ssRNA是感染性的，可以使用分離的病 毒ssRNA自身用于給動(dòng)物接種。所述ssRNA可以任何合適的方式被引入動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè) 細(xì)胞，在細(xì)胞中該ssRNA會(huì)被該細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄。這將產(chǎn)生病毒蛋白，并可以導(dǎo)致病毒 顆粒的生成。然而，由于病毒中的ssRNA中必需基因的功能被破壞，病毒ssRNA將不能產(chǎn)生 完全功能的病毒顆粒。最多，該病毒將能夠完成一個(gè)復(fù)制周期，取決于所突變的必需基因的 功能。當(dāng)進(jìn)行接種時(shí)，要接種的動(dòng)物將依據(jù)呼腸弧病毒科病毒的特性及其所感染的特定 的動(dòng)物而變化。當(dāng)病毒為AHSV時(shí)，所述動(dòng)物選自馬、騾、驢或斑馬。當(dāng)病毒為EDHV時(shí)，所述 動(dòng)物選自鹿、家?；蚓d羊。當(dāng)病毒為BTV時(shí)，所述動(dòng)物選自家牛、綿羊、山羊、水牛、鹿、單峰 駱駝及羚羊。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的疫苗病毒株與藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或賦形劑的 藥物組合物。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的分離的病毒ssRNA與藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或 賦形劑的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或賦形劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，可使用的 藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或賦形劑包括但不限于離子交換劑，鋁土，硬脂酸鋁，卵磷脂，血 清蛋白例如人血清白蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸 的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，如精蛋白硫酸鹽，磷酸二氫鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅 鹽，膠體硅，三硅酸鎂，聚乙酰吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)，羥甲基化纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚丙烯嵌段聚合物，聚乙烯醇及羊毛脂。本發(fā)明的疫苗病毒株、分離的病毒ssRNA或藥物組合物可以經(jīng)口服、非腸道或吸 入給藥。優(yōu)選地，疫苗病毒株、分離的病毒ssRNA或藥物組合物通過注射給藥。本發(fā)明的 所述疫苗病毒株、分離的病毒ssRNA或藥物組合物可與任何常規(guī)無毒的藥學(xué)上可接受的載 體、佐劑或賦形劑共同制劑。此處使用的術(shù)語非腸道包括皮下、皮內(nèi)、經(jīng)靜脈、經(jīng)肌肉、關(guān)節(jié) 內(nèi)、滑液內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘膜內(nèi)、病灶內(nèi)及顱骨內(nèi)注射或注入技術(shù)。
疫苗病毒株、分離病毒ssRNA或藥物組合物可以為可注射制劑的形式，例如，為可 注射水質(zhì)或油質(zhì)的懸液劑。該懸液劑可根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)使用合適的分散劑或增濕劑 (例如，如吐溫80)以及懸浮劑而制劑。所述可注射制劑也可以為無毒的非腸道-可接受 稀釋劑或溶劑中的可注射溶液劑或懸液劑，例如在1，3_ 丁二醇中的溶液劑?？山邮艿目梢?采用的賦形劑和溶劑為甘露醇、水、林格液及等壓氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)性油通 常用作溶劑或懸浮媒介。為了這種目的，任何溫和的不揮發(fā)性油都可使用，包括合成的甘 油單酯或甘油二酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物在可注射制劑的制備中是有用的，同 樣的天然的藥學(xué)上可接受的油是有用的，例如橄欖油或蓖麻油，尤其以其聚氧乙烯化的形 式。這些油溶液劑或懸液劑還可以包含長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑，或瑞士藥典(Pharmacopoea Helvetica)中描述的類似的醇。所述疫苗病毒株、分離的病毒ssRNA或藥物組合物可以以任何口服可接受的劑型 口服給藥，包括而不限于膠囊、片劑、以及水懸液劑和溶液劑。在口服用片劑的情況中，通常 使用的載體包括乳糖及玉米淀粉。潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂，也典型地加入。對(duì)于以膠囊形式的 口服給藥而言，有用的稀釋劑包括乳糖及干燥的玉米淀粉。當(dāng)口服給藥水懸液劑時(shí)，所述活 性組分與乳化劑及懸浮劑組合。如果想要，某些甜味劑和/或調(diào)味劑和/或著色劑可以被 加入。遞送到動(dòng)物的疫苗病毒株的量可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定；然而，通常地，所遞送的量應(yīng) 在10，000到1，000, 000, 000感染單位/ml范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供試劑盒，其包含上述方法中的分離的ssRNA及補(bǔ)充ssRNA中被突變 的必需基因的細(xì)胞。本發(fā)明還提供確定作為呼腸弧病毒家族成員的病毒中必需基因的篩選方法，該方 法包括在呼腸弧病毒科病毒中引入突變，以破壞基因的功能；使用來自病毒基因組并含有突變的病毒ssRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞；和在合適的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中如果培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染細(xì)胞后產(chǎn)生的病毒為致病性的，所述病毒基因非必需基因。本發(fā)明還提供制造作為呼腸弧病毒家族成員的病毒的改良病毒株的制造方法，所 述方法包括向呼腸弧病毒科病毒中引入修飾；向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染來自所述病毒基因組并包含該修飾的病毒單鏈RNA(ssRNA)；以及在合適的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以導(dǎo)致改良病毒株的生成，其中所述細(xì)胞使得所述改良病毒株在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。就疫苗病毒株的制備方法而言，制備改良病毒株的方法如前定義。然而，所述病毒株可以任意方式修飾。例如，所述病毒株可通過向基因組中加入一個(gè)或多個(gè)基因、從基因組 中刪除一個(gè)或多個(gè)基因、改變基因組內(nèi)的控制序列等來修飾。進(jìn)一步地，只要必需基因的功 能未被破壞，任何合適的細(xì)胞都可用于此修飾的病毒的制備。如前文所指出的，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟含有兩個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)染步驟，其中(1)第一轉(zhuǎn)染步驟包含使用ssRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該ssRNA至少編碼組裝病毒衣殼內(nèi)層 所需的組分；以及(2)第二轉(zhuǎn)染步驟包含使用ssRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該ssRNA為病毒基因組的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物， 并也含有所述修飾，并因此編碼病毒組裝所需的全部組分。實(shí)施該2步轉(zhuǎn)染的優(yōu)選特征如前定義。優(yōu)選地，制備改良病毒株的方法進(jìn)一步包含從細(xì)胞 中分離所述病毒株。本發(fā)明還提供了來自病毒基因組的分離的病毒ssRBA，該病毒為呼腸弧病毒科家 族成員，其中所述ssRNA包含修飾，以及其中所述病毒ssRNA適用于前述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供由上述方法制備的改良病毒株。本發(fā)明也提供本發(fā)明的改良病毒株在治療中的用途。本發(fā)明也提供本發(fā)明的分離的修飾的病毒ssRNA在治療中的用途。本發(fā)明也提供包含本發(fā)明所述改良病毒株與藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或賦形劑 的藥物組合物。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的所述分離的修飾病毒ssRNA與藥學(xué)上可接受的載體、 佐劑或賦形劑的藥物組合物。在此詳細(xì)描述本發(fā)明，以實(shí)施例的形式，參考圖，其中

圖1表示自共轉(zhuǎn)染的BSR細(xì)胞回收的重配株(assortant)子代基因組，該BSR細(xì) 胞用來自BTV兩種血清型的源于核的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共轉(zhuǎn)染?；蚪MdsRNA跑9%非變性聚丙烯 酰胺凝膠。(A)來自被拯救的BTV的dsRNA，BTV得自用共轉(zhuǎn)錄的BTV-I及BTV-9轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 共轉(zhuǎn)染的BSR細(xì)胞。道1-3，為含有來自兩種親代轉(zhuǎn)錄制備品的基因組片段的病毒斑純化病 毒。箭頭指示來自提供了最少數(shù)量片段的親代的片段。指示了 BTV-I dsRNA及BTV-9dsRNA 標(biāo)準(zhǔn)帶。(B)來自拯救的BTV的dsRNA，BTV得自用制備后混合的BTV-I及BTV-9轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 共轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞。道1-2，為含有來自兩種親代轉(zhuǎn)錄制備品的基因組片段的病毒斑純化病 毒。箭頭指示來自提供了最少片段的親代的片段。指示了 BTV-I dsRNA及BTV-9 dsRNA標(biāo) 準(zhǔn)帶。圖2為T7 BTV質(zhì)?？寺〉氖疽鈭D。T7質(zhì)粒包含位于T7啟動(dòng)子和BsmBI、BSaI或 BpiI限制性酶位點(diǎn)中間的全長(zhǎng)BTV基因組片段，所述BTV基因組片段確定了轉(zhuǎn)錄時(shí)BTV3’ 的末端序列。指出了 BTV基因組片段的5’及3’末端的序列以及側(cè)翼的序列。T7啟動(dòng)子 (斜體)，保守的BTV基因組片段5’及3’末端序列(黑體)及BsmBI位點(diǎn)(下劃線)。圖3表示包含來自質(zhì)粒的BTV-10片段10的重配株子代基因組。㈧基因組dsRNA 跑9%非變性聚丙烯酰胺凝膠，其提取自BTV，該BTV回收自用BTV-10片段10 T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物和得自核的BTV-I轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共轉(zhuǎn)染的BSR細(xì)胞。道1-5，為回收的得自噬菌病毒斑的病 毒dsRNA。道1、2和5，為帶有箭頭指示移動(dòng)較快的BTV-10片段10基因組片段的重配株。 道3和4，為野生型BTV-I。指示了 BTV-I dsRNA及BTV-10 dsRNA標(biāo)準(zhǔn)道。(B-D)片段10RT-PCR產(chǎn)物的序列圖。來自全部病毒dsRNA的片段10靶序列通過RT-PCR，使用引物BTV10_ S10_259F 禾口 BTV10_S10_611F 擴(kuò)增。擴(kuò)增的靴序列采用 BTV10_S10_259F 測(cè)序 。(B)BTV_10。 (C)含有引入的 BTV-10 片段 10 的 BTV-1。(D)BTV_1。圖4表示含有得自質(zhì)粒的BTV-10片段10的重配株子代基因組，BTV-10片段10 帶有引入的標(biāo)記突變。(A)跑9%非變性聚丙烯酰胺凝膠的來自病毒斑的基因組dsRNA，其 含具有引入的HaeII位點(diǎn)的BTV-10片段10。道1_3，為來自三個(gè)病毒斑純化重配株的病毒 dsRNA,重配株含有遷移較快的BTV-10片段10。指示了 BTV-I dsRNA及BTV-10 dsRNA標(biāo)準(zhǔn) 道。(B)片段10的RT-PCR產(chǎn)物的HaeII消化。HaeII消化的RT-PCR產(chǎn)物，使用片段10引 物BTV10_S10_259F及BTV10_S10_611R，從基因組的dsRNA擴(kuò)增，在2%瓊脂糖凝膠上分離。 U =未消化的RT-PCR產(chǎn)物，D = HaeII消化的RT-PCR產(chǎn)物。道1，無模板，道2，BTV-10，道 3，引入BTV-10片段10的重配株，道4，引入帶有含HaeII位點(diǎn)的BTV-10片段10的重配株， 道5，BTV-I。M = StyI-消化的噬菌體λ DNA標(biāo)準(zhǔn)物，大小以bp指示。RT-PCR產(chǎn)物及消化 片段的大小在左側(cè)以bp標(biāo)示。(C與D)片段10RT-PCR產(chǎn)物的序列圖。來自全部病毒dsRNA 的片段10靶點(diǎn)序列使用引物BTV10_S10_238F及BTV10_S10_654R，通過RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增 的靶序列使用BTV10_S10_238F測(cè)序。(C)弓丨入BTV-10片段10的重配株。(D)引入了帶有 含HaeII位點(diǎn)的BTV-10片段10的重配株。箭頭指示引入的點(diǎn)突變。圖5表示含有得自質(zhì)粒的BTV-10片段2和5的雙重重配株子代基因組。(A)來自 BTV的基因組dsRNA，BTV回收自用BTV-10片段5T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、BTV-10片段2T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 以及得自核的BTV-I轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共轉(zhuǎn)染的BSR細(xì)胞。來自子代病毒斑的基因組dsRNA跑9% 非變性聚丙烯酰胺凝膠。道1-3，為來自三種病毒噬菌斑純化的重配株的病毒dsRNA。箭頭 指示遷移較慢的BTV-10片段2及片段5。BTV-I dsRNA及BTV-10 dsRNA標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物條帶 被指出。(B和C)片段2及片段5RT-PCR產(chǎn)物的限制性酶切分析。片段2及片段5的靶區(qū) 域使用RT-PCR從基因組dsRNA擴(kuò)增，用對(duì)BTV-10片段特異的限制性酶消化并用1. 5%瓊脂 糖凝膠分離。(B)片段2 RT-PCR產(chǎn)物的SacI消化。SacI對(duì)血清型10的片段2具有特異 性，在靶序列中有兩個(gè)位點(diǎn)。由從基因組dsRNA使用片段2引物BTV10_L2_727F及BTV10_ L2_1523R擴(kuò)增RT-PCR產(chǎn)物。U =未消化RT-PCR產(chǎn)物，D = SacI消化的RT-PCR產(chǎn)物。注意 引物對(duì)不擴(kuò)增BTV-I片段2，這是由于此片段在不同血清型之間的低同源性。道1為BTV-1， 道2，為BTV10，道3，為帶有BTV-10片段2及片段5導(dǎo)入的重配株。StyI-消化的噬菌體 λ DNA標(biāo)記物大小以bp標(biāo)于左側(cè)。RT-PCR產(chǎn)物及消化片段的大小以bp標(biāo)于右側(cè)。(C)片 段5RT-PCR產(chǎn)物的DraI消化。DraI具有對(duì)血清型10片段5的特異性，靶序列中存在兩個(gè) 位點(diǎn)。使用片段5引物BTV10_M5_724F及BTV10_M5_1590R自基因組dsRNA擴(kuò)增RT-PCR產(chǎn) 物。U =未消化的RT-PCR產(chǎn)物，D = DraI消化的RT-PCR產(chǎn)物。RT-PCR反應(yīng)中的模板為如 B圖所列出的。RT-PCR產(chǎn)物及消化片段的的大小以bp列于右側(cè)。圖6顯示BTV-I基因組片段的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。得自限制性內(nèi)切酶消化的克隆的 BTV-1 T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變性瓊脂糖凝膠電泳。M=Iyg ssRNA標(biāo)準(zhǔn)物(Promega)，其大 小以nt表示。㈧道1-片段1，道2-片段3，道3-片段5，道4-片段7，道5-片段9。(B) 道1-片段2，道2-片段4，道3-片段6，道4-片段8，道5-片段10。圖7顯示通過轉(zhuǎn)染以十個(gè)T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的感染性BTV的回收。(A)覆蓋以瓊脂糖的 轉(zhuǎn)染的BSR單層。孔1，為BSR轉(zhuǎn)染以4yg BTV-1 T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，孔2，為未轉(zhuǎn)染的BSR。轉(zhuǎn)染后5天，單層被固定并以結(jié)晶紫染色。(B)提取自BTV的基因組dsRNA跑9%非變性聚丙 烯酰胺凝膠，所述BTV回收自A圖所描述的BSR單層轉(zhuǎn)染。道1，為BTV-I儲(chǔ)備病毒，道2及 3，為來自得自轉(zhuǎn)染以T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不同病毒斑的BTV-1圖8顯示含有采用十種T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的標(biāo)記突變的感染性BTV的回收。(A)覆蓋 以瓊脂糖的轉(zhuǎn)染的BSR單層。孔1，為轉(zhuǎn)染以3yg BTV-1T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的BSR，所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 包括帶有導(dǎo)入的BglII位點(diǎn)的片段8轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，孔2，為未轉(zhuǎn)染的BSR。在轉(zhuǎn)染后5天，單層 被固定并以結(jié)晶紫染色。(B)基因組的dsRNA跑9%非變性聚丙烯酰胺凝膠，所述dsRNA提 取自BTV，所述BTV回收自如A圖所描述的BSR單層轉(zhuǎn)染。道1，為BTV-I儲(chǔ)存病毒，道2及 3，為來自得自轉(zhuǎn)染以T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不同病毒斑的BTV-1。圖9顯示BTV-I中引入的標(biāo)記突變的檢測(cè)，所述標(biāo)記突變產(chǎn)生自十種T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物。(A)片段8RT-PCR產(chǎn)物的BglII消化。BglII-消化的RT-PCR產(chǎn)物，使用片段8引物 NS2_Bam_T7_F及NS2_Bam_R擴(kuò)增自基因組dsRNA，于1 %瓊脂糖凝膠上分離。U =未消化的 RT-PCR產(chǎn)物，D = BglII消化的RT-PCR產(chǎn)物。道1，為野生型BTV-I，道2_6，為得自包括片 段SBglII突變轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染的五個(gè)單獨(dú)的病毒斑。道7，無模板。StyI-消化的噬菌體 λ DNA標(biāo)記物大小以bp標(biāo)于左側(cè)。RT-PCR產(chǎn)物及消化片段的大小以bp標(biāo)于右側(cè)。(B)片 段8 RT-PCR產(chǎn)物的序列圖，所述產(chǎn)物來自包括片段SBglII突變轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染。來自病 毒總dsRNA的片段8靶序列經(jīng)RT-PCR使用圖A中描述的引物擴(kuò)增。所擴(kuò)增的靶序列使用 BTV1_S8_627R測(cè)序。箭頭標(biāo)出引入的點(diǎn)突變。圖 10 顯示用于產(chǎn)生 BTVl delta VP6 的 pBTVl S9delta 克隆。(A)保留于 pBTVl S9delta克隆中的基因組片段9的互補(bǔ)核苷酸(nucleotide coordinate)。(B)pBTVl S9delta含有修飾的BTV基因組片段9，該片段位于T7啟動(dòng)子及BsmBI限制性酶位點(diǎn)之間， 其在轉(zhuǎn)錄時(shí)定義BTV 3’末端序列。(C)BTV基因組片段的5’及3’末端序列及側(cè)翼的序列 被標(biāo)出T7啟動(dòng)子(斜體)；保守的BTV基因組片段5’及3’末端序列(黑體)；及BsmBI 位點(diǎn)(下劃線的)。圖11顯示BTVl delta VP6在補(bǔ)充BSR VP6細(xì)胞系中產(chǎn)生CPE。單層在MOI為0.1 時(shí)被感染，并于感染后48小時(shí)使用相差顯微術(shù)記錄外觀。(A)感染BTVl delta VP6的BSR VP6細(xì)胞。(B)感染野生型BTV-I的野生型BSR細(xì)胞。(C)Mock感染的BSR細(xì)胞。圖12顯示BTVl delta VP6在補(bǔ)充BSR VP6細(xì)胞系中產(chǎn)生病毒斑。病毒儲(chǔ)藏液的 十倍稀釋液用于感染孔1到孔6中匯合的細(xì)胞單層。感染的單層覆蓋以固態(tài)介質(zhì)并于72 小時(shí)后以結(jié)晶紫染色。(A)被BTVl delta VP6感染的BSR VP6細(xì)胞。⑶被野生型BTV-I 感染的野生型BSR細(xì)胞。圖13顯示由更小的基因組片段取代基因組片段9的BTVl delta VP6。㈧基因 組dsRNA跑9%非變性聚丙烯酰胺凝膠。箭頭標(biāo)出存在于BTVldelta VP6中的新基因組片 段?；蚪M片段數(shù)量標(biāo)于右側(cè)。(B)產(chǎn)生自基因組dsRNA的RT-PCR產(chǎn)物，所述dsRNA使用 EcoT7_S9_F及Ec0BsmB_S9_R引物得自所標(biāo)出的來源，并在1 %瓊脂糖凝膠上分離。DNA標(biāo) 準(zhǔn)物的大小以堿基對(duì)標(biāo)出。圖14表示BTVl delta VP6在感染的BSR或C6/36細(xì)胞中不產(chǎn)生感染性病原體子 代。感染性子代的產(chǎn)生在72小時(shí)的間隔通過在補(bǔ)充BSR VP6細(xì)胞系上的病毒斑化驗(yàn)分析。 BTVl delta VP6及野生型BTV-I在BSR細(xì)胞(A)或者C6/36細(xì)胞(B)上的復(fù)制的圖。
圖15表示BTVl delta VP6在非補(bǔ)充BSR細(xì)胞中表達(dá)病毒蛋白質(zhì)。BSR細(xì)胞在MOI 為3時(shí)被感染，并于感染后標(biāo)出的小時(shí)數(shù)后收集。NS2表達(dá)由SDS PAGE檢測(cè)，隨后以NS-2特 異性的抗血清進(jìn)行免疫印跡。(A)使用BTVl delta VP6感染的BSR，(B)使用野生型BTV-I 感染的BSR。預(yù)染的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物的大小以kDa標(biāo)出。
圖16顯示BTVl SlO GFP具有更大的基因組片段以取代SlO片段。㈧基因組 dsRNA跑11%非變性聚丙烯酰胺凝膠。箭頭標(biāo)出在BTVl SlOGFP中的新的基因組片段?；?因組片段數(shù)量標(biāo)于右側(cè)。(B)產(chǎn)生自基因組dsRNA的RT-PCR產(chǎn)物，所述dsRNA得自所標(biāo)出 的來源，所述產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分離。DNA標(biāo)準(zhǔn)物的大小以堿基對(duì)標(biāo)出。圖17顯示來自BTV基因組的標(biāo)記抗原的表達(dá)。C6/36被BTVl SlOGFP感染(A及 B)，或模擬感染(C及D)。感染后5天，所述細(xì)胞使用4% w/v多聚甲醛固定，其外觀使用相 差記錄(A及C)或紫外燈(B及D)下記錄。圖18顯示兩次轉(zhuǎn)染增加病毒自核來源的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的回收。匯合的BSR細(xì)胞單層 以200ng病毒的ssRNA轉(zhuǎn)染一次(孔1)或兩次(孔2)，所述ssRNA自BTV核合成。各孔覆 蓋以于此所描述的瓊脂糖。圖19顯示兩次轉(zhuǎn)染增加病毒自質(zhì)粒來源的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的回收。匯合的BSR細(xì)胞單 層以2yg自質(zhì)粒得到的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)染一次(孔1)或兩次(孔2)。各孔覆蓋以于此所 描述的瓊脂糖。圖20顯示基因組片段2、5、7及10從第一次轉(zhuǎn)染的省略增加病毒自質(zhì)粒得到的轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物的回收。匯合的BSR細(xì)胞單層在第一次轉(zhuǎn)染中以十種T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的完整補(bǔ)充轉(zhuǎn)染 (孔1)或一組缺少片段2、5、7及10的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)染(孔2)。兩個(gè)孔在第二次轉(zhuǎn)染中 均轉(zhuǎn)染以十種T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的完整補(bǔ)充。兩次轉(zhuǎn)染中均使用IOOng的每種T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
實(shí)施例疫苗設(shè)計(jì)的新手段使用發(fā)明人開發(fā)的新型反向遺傳學(xué)方法。其建立在發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌 病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)染是感染性的[1]，該方法并允許靶片段被病毒基因的克隆版本替換。 該方法使用新的手段，所述手段為使用和BTV片段的噬菌體T7體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相混合的BTV 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)染病毒容許的細(xì)胞，所述BTV片段得自克隆的基因。含有取代基因組片段的病 毒通過篩選病毒斑分離。此反向遺傳學(xué)的新方法與現(xiàn)存的用于呼腸弧病毒家族的反向遺 傳學(xué)技術(shù)不同l)Roner等人的輔助病毒依賴的方法[3]成功地應(yīng)用于哺乳動(dòng)物正呼腸弧 病毒。病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及病毒dsRNA混合以T7體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并使用輔助病毒感染拯救；2) Komoto等人的輔助病毒依賴的方法[2]用于改變輪狀病毒的衣殼蛋白。T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用 痘苗T7RNA聚合酶系統(tǒng)在細(xì)胞中產(chǎn)生，并使用輔助病毒拯救；以及3) Kobayashi等人的基于 質(zhì)粒的方法[4]用于在哺乳動(dòng)物正呼腸弧病毒基因中產(chǎn)生突變。所有的病毒基因組片段都 使用疫苗T7 RNA聚合酶系統(tǒng)在細(xì)胞中產(chǎn)生。該新方法使用反向遺傳學(xué)來產(chǎn)生疫苗株，所述疫苗株含有免疫相關(guān)的來自感興趣 的血清型的藍(lán)舌蛋白(VP2及VP5)，對(duì)其他病毒蛋白具有廣泛背景。這一點(diǎn)與一種或多種必 需病毒基因的滅活結(jié)合，所述必需病毒基因通過反向遺傳學(xué)經(jīng)大規(guī)模突變，其由補(bǔ)充細(xì)胞 系提供。產(chǎn)生的病毒只能在補(bǔ)充細(xì)胞系中生長(zhǎng)，及在其他細(xì)胞中只能進(jìn)行一輪復(fù)制，其他細(xì) 胞例如所接種的動(dòng)物的細(xì)胞。用于通過反向遺傳學(xué)滅活的一種或多種BTV酶蛋白質(zhì)(聚合酶、螺旋酶及加帽蛋白)或可選地BTV非結(jié)構(gòu)病毒蛋白的靶向?qū)⒃试S使用DIVA策略用于監(jiān) 視的目的。所述新方法也消除了 under-atterumtion的難題，并減少了與減低毒性的新株 相關(guān)的從確定新的血清型到生產(chǎn)疫苗株的時(shí)間延遲。通過靶向的病毒基因中廣泛突變的使 用，毒性恢復(fù)的可能性被極大減少。通過疫苗株僅在接種的動(dòng)物里經(jīng)歷一個(gè)復(fù)制周期這一 事實(shí)，與野生型病毒重組產(chǎn)生傳染性病毒的可能性也被大大減少。該新方法也避免了確認(rèn) 與滅活疫苗關(guān)聯(lián)的各批次疫苗的滅活的需要。本技術(shù)已用于產(chǎn)生BTV的DISC(有缺陷的感染性單周期)疫苗，其中必需基因 (VP6)通過反向遺傳學(xué)系統(tǒng)控制，其功能通過大的刪除被破壞。所述VP6刪除突變體(BTV1 delta VP6)使用反向遺傳學(xué)技術(shù)以及補(bǔ)充細(xì)胞系回收，所述細(xì)胞系提供順式作用元件VP6 蛋白。BTVl delta VP6生長(zhǎng)性質(zhì)的表征顯示其具有BTV DISC疫苗的必要特征，即i)病毒 蛋白在非補(bǔ)充哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)；ii)在非補(bǔ)充哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞系中無可檢測(cè)的 感染性病毒產(chǎn)生；及iii)在補(bǔ)充VP6細(xì)胞系中健全復(fù)制。此外，產(chǎn)生病毒，表達(dá)外來蛋白/ 多肽的能力已經(jīng)使用NS3補(bǔ)充細(xì)胞系及BTV證實(shí)，所述BTV具有插入到NS3基因中心的增 強(qiáng)的綠色熒光蛋白(eGFP)。這使得含有免疫標(biāo)記物的疫苗株的產(chǎn)生，所述標(biāo)記物在接種的 動(dòng)物中可被檢測(cè)，以區(qū)分接種的動(dòng)物及感染的動(dòng)物，即DIVA概念(鑒別感染的和接種的動(dòng) 物)。材料與方法 細(xì)胞系及病毒。BSR細(xì)胞(BHK-21的克隆)在補(bǔ)充了 5% ν/ν胎牛血清(FBS)的 Dulbecco氏改性Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中，35°C下在5% CO2中培養(yǎng)。BTV儲(chǔ)藏液通過在感染倍率(MOI)為0. 1的時(shí)候，感染BSR細(xì)胞并在感染后3_4天 時(shí)收獲培養(yǎng)基產(chǎn)生。病毒儲(chǔ)藏液于4°C下儲(chǔ)存。藍(lán)舌病毒核的純化。BSR培養(yǎng)物在MOI為0. 02-0. 1時(shí)被BTV感染。具有轉(zhuǎn)錄活性 的BTV-I核如前所述純化并于4°C儲(chǔ)存[1]。藍(lán)舌病毒mRNA的體外合成與純化。BTV核在40 μ g/ml，30°C下在BTV核轉(zhuǎn)錄緩沖 液(IOOmM Tris HCl pH8. 0,4mM ATP,2mM GTP, 2mMCTP, 2mM UTP,500yM S-腺苷蛋氨酸，6mM DTT,9mM MgCl2,0. 5U/μ IRNasin (g) Plus [Promega])中溫育 5-6 小時(shí)。BTV核產(chǎn)生的mRNA以前述的方法純化并于_80°C儲(chǔ)存[1]。BTV-I基因組片段的RT-PCR擴(kuò)增。各個(gè)BTV-I基因組片段的cDNA拷貝以序列 獨(dú)立的方式使用FLAC方法從病毒dsRNA擴(kuò)增[18]。大體上，發(fā)夾錨狀引物如所述地連接 到病毒dsRNA上，隨后從凝膠純化的基因組片段進(jìn)行cDNA合成，所述合成使用IOU/μ 1 Superscript III (Invitrogen)，在 55°C下持續(xù) 1 小時(shí)。PCR 擴(kuò)增使用 5'磷酸化的 FLAC 2 引物(5 ‘ GAGTTAATTAAGCGGCCGCAGTTTAGAATCCTCAGAGGTC3 ‘)和 KOD 熱啟動(dòng) DNA 聚合酶 (Novagen)進(jìn)行。PacI及NotI位點(diǎn)為黑體。用于合成BTV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的T7質(zhì)?？寺?。為BTV-10基因組片段10(pNS3BsmBI)、片 段5 (pVP5BsmBI)及片段2 (pVP2BsmBI)，以及BTV-I基因組的所有10個(gè)片段構(gòu)建了 cDNA質(zhì) ?？寺?。也建立了含有引入的HaeII位點(diǎn)(pNS3Hae)的BTV-10片段10克隆的突變版本及 含有引入的BglII位點(diǎn)(pNS3Hae)的BTV-I片段8克隆的突變版本。各個(gè)質(zhì)?？寺〉墓δ?盒含有T7啟動(dòng)子及BsmBLBsaI或BpiH位點(diǎn)，BTV基因組片段位于這些元件之間。在各個(gè) 克隆中的BTV基因組片段與其他兩個(gè)序列元件相對(duì)定位，以使質(zhì)粒被BsmBI、BsaI或BpiH消化產(chǎn)生的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按預(yù)測(cè)具有與相應(yīng)BTV基因組片段的mRNA鏈精確相同的序列(圖 2)從cDNA質(zhì)?？寺『铣葿TV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。T7質(zhì)?？寺∫訠smBI、BsaI或BpiI消化，然 后以苯酚/氯仿萃取一次，以氯仿萃取一次。各個(gè)消化的質(zhì)粒使用異丙醇在0. 15M乙酸鈉 的存在下沉淀。DNA沉淀物以70% (ν/ν)乙醇洗滌兩次，并以IOmM Tris HCl pH8. 0溶至 1 μ g/ μ 1。使用 mMESSAGEmMACHINE Τ7 ULTRA 試劑盒(Ambion)，使用 4 1 比例的抗逆封 端類似物(anti-reverse cap analogue)比rGTP，由消化的T7質(zhì)?？寺‘a(chǎn)生帶有5’封端 類似物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。Τ7 BTV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以苯酚/氯仿萃取一次，隨后以氯仿萃取一次。未被 加入的rNTP通過尺寸分餾法，使用MicrOSpinTMG-25柱(GE Healthcare)，按照制造商說明 除去。所述T7 BTV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以等體積的異丙醇，在0.15M乙酸鈉的存在下沉淀。RNA沉淀 物以70% (ν/ν)乙醇洗滌兩次，并溶于無菌的焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水，并于-80°C 儲(chǔ)存。變性瓊脂糖凝膠電泳。純化的BTV SSRNA在MOPS (嗎啡啉丙磺酸)電泳緩沖液中 的瓊脂糖上，在甲醛存在下的以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行電泳分析[19]。
轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞以回收帶有一個(gè)或兩個(gè)得自cDNA的基因組片段的藍(lán)舌病 毒。得自轉(zhuǎn)錄核的BTV mRNA與一個(gè)或多個(gè)T7 BTV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在Opti-MEM I中，0. IU/ μ 1 RNasin Plus(Promega)存在下混合。該RNA混合物于20°C溫育30分鐘，隨后與 Lipofectamine 2000 試劑(Invitrogen)[見下文]混合。使用混合以 0. 75μ g 各個(gè) T7BTV 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的1. 5 μ g BTVmRNA,使用Lipofectamine 2000試劑，按照制造商說明轉(zhuǎn)染6孔 板中的匯合的BSR單層。轉(zhuǎn)染后四小時(shí)，培養(yǎng)基以由最小必須培養(yǎng)基(MEM)，2%FBS，1.5% w/v瓊脂糖類型VII (Sigma)組成的6mL覆蓋物替換。試樣于35°C ,5% CO2下溫育72-96小 時(shí)以允許病毒斑的出現(xiàn)。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞以從得自CDNA的基因組片段完全回收藍(lán)舌病毒。如前所述混合 300-400ng的各種T7BTV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以產(chǎn)生一套完整的T7BTV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因組。BSR單層的 轉(zhuǎn)染如前所述執(zhí)行。自得自轉(zhuǎn)染的BTV病毒斑制備dsRNA。取各個(gè)病毒斑，放入500 μ 1 5 % FBS的 Dulbecco氏修飾Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中，200 μ 1用于感染1. 5 X IO6 BSR0感染的細(xì)胞 于35°C，5% CO2中溫育72-96小時(shí)，以使得BTV擴(kuò)增。如前所述從感染的BSR細(xì)胞純化病 毒 dsRNA [1]。從得自轉(zhuǎn)染的BTV病毒斑篩選含有引入的基因組片段的重配株。在引入的基因 組片段以不同的速率在聚丙烯酰胺凝膠上遷移的情況下，篩選通過dsRNA在Tris/甘氨酸 (pH8. 3)中的9%聚丙烯酰胺凝膠上的電泳完成。凝膠使用溴化乙錠后染30分鐘。當(dāng)篩 選不可能基于遷移速率進(jìn)行時(shí)，RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，隨后限制性內(nèi)切酶消化 被用于區(qū)分重配株與野生型BTV。cDNA從IOOng熱變性的病毒dsRNA，使用Superscript III (Invitrogen)，側(cè)翼靶區(qū)域的正向及反向引物，55°C下合成1小時(shí)。所述靶區(qū)域使用Taq DNA聚合酶，及相同的正向及反向引物被PCR擴(kuò)增，并以限制性內(nèi)切酶消化。產(chǎn)物在Tris-硼 酸鹽-EDTA緩沖液中的含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上通過電泳分離。RT-PCR產(chǎn)物的序列 分析使用染料終止子，在ABI 3730 XL測(cè)序機(jī)上，使用MWG Biotech的數(shù)值顯示服務(wù)完成 [20]。
pNS3Hae及pBTVlS8Bgl的構(gòu)建。pNS3BsmBI被改變以含有一額外的HaeII位點(diǎn)，所 述改變通過使用Weiner等人的方法[17]，使用引物S10_mt_Hae_409F及S10_mt_Hae_409R 定點(diǎn)突變進(jìn)行。類似地，野生型BTV-I S8克隆被改變以引入BglII位點(diǎn)，所述改變通過使 用引物5' BTVl_S8_BglII及3' BTVl_S8_BglII進(jìn)行。通過HaeII或BglII消化，篩選克 隆中的引入位點(diǎn)的存在，以及使用MWG Biotech的數(shù)值顯示服務(wù)測(cè)序?qū)λ霰磉_(dá)盒進(jìn)行測(cè) 序以確定克隆不含有隨機(jī)突變。引物。用于從pNS3BsmBI產(chǎn)生pNS3Hae的誘導(dǎo)突變引物S10_mt_Hae_409F(5' CTACTAGTGGCTGCTGTGGTAGCGCTGCTGACATCAGTTTG3')及
S10_mt_Hae_409R(5' CAAACTGATGTCAGCAGCGCTACCACAGCAGCCACTAGTAG3')。用于從野生型BTV-I S8克隆產(chǎn)生pBTVlS8Bgl的誘導(dǎo)突變引物5' BTVl_S8_BglII(5' GATTTACCAGGTGTGATGAGATCTAACTACGATGTTCGTGAAC3')及3' BTVl_S8_BglII(5' CGAACATCGTAGTTAGATCTCATCACACCTGGTAAATCGGGC3')。誘導(dǎo)突變堿基被下 劃線，限制性位點(diǎn)為粗體。BTV-10片段10的RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序的引物BTV10_S10_238F (5' GGAGAAGGCTGCATTCGCATCG3‘)，BTV10_S10_654R(5' CTCATCCTCACTGCGTCATTATATGATTGTTTTTTCATCACTTC3')，BTV10_S10_259F (5' GGAGAAGGCTGCATTCGCATCG3‘)，BTV10_S10_611R(5'CTCATCCTCACTGCGTCATTATATGATTGTTTTTTCATCACTTC3')。從BTV-10片段5RT-PCR擴(kuò)增的引物BTV10_M5_724F(5‘ ATGACAGCAGACGTGCTAG AGGCGGCATC3‘)及 BTV10_M5_1590R(5' GCGTTCAAGCATTTCGTAAGAAGAG3‘)。從BTV-10 片段 2RT-PCR 擴(kuò)增的引物BTV10_L2_727F (5 ‘ CCGTACGAACGATTTATATC CAGC3‘)及 BTV10_L2_1523R(5' TACTAATTCAGAACGCGCGCC3‘)從BTV-I 片段 8RT-PCR 擴(kuò)增的引物NS2_Bam_T7_F (5 ‘ CGGGATCCTAATACGACTCACT ATAGTTAAAAAATCCTTGAGTCA3‘)及NS2_Bam_R(5' CATGGGATCCGGACCGTCTCCGTAAGTGTAAAATCCCC3‘)。BTV-I 片段 8 測(cè)序的引物BTV1_S8_627R(5' CAGCTTCTCCAATCTGCTGG3‘)。表達(dá)BTV VP6或NS3蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建。BTV-10 V6及BTV-1NS3的編碼區(qū) 域以PCR擴(kuò)增，并克隆入嘌呤霉素可選擇的質(zhì)粒pCAGGS/MCS-PMl [29]，以分別獲得pCAGG/ VP6 及 pCAGG/NS3。BSR細(xì)胞用 Lipofectamine 2000 試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染以 pCAGG/VP6 或PCAGG/NS3，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)胰蛋白酶化并以濃度為7. 5 μ g/ml的嘌呤霉素選擇。培養(yǎng)分 離的抗性克隆，VP6或NS3蛋白的表達(dá)使用適當(dāng)?shù)目贵w通過免疫印記檢驗(yàn)。所述VP6及NS3 表達(dá)系命名為BSR VP6及BSR NS3。
使用補(bǔ)充BSR VP6或BSR NS3細(xì)胞系回收BTV。構(gòu)建了 BTV-1片段9克隆，所述 克隆具有框架外核苷酸301-743的缺失(1049nt外)，即pBTVl S9delta(圖10)。在轉(zhuǎn)染 中使用BSR VP6細(xì)胞系取代野生型BSR細(xì)胞回收了相應(yīng)的突變病毒，BTVl delta VP6。類 似地，構(gòu)建了帶有增強(qiáng)綠色熒光蛋白(eGFP)插入于NS3基因中心的BTV-I片段10克隆，即 PBTV1S10GFP。在轉(zhuǎn)染期間使用BSR NS3細(xì)胞系回收了相應(yīng)的GFP表達(dá)病毒，BTVl S10GFP。BTVl delta VP6 及 BTVl SlOGFP 的傳代。BTVl delta VP6 在 BSRVP6 細(xì)胞系上傳 代，同時(shí)通過病毒斑化驗(yàn)測(cè)定的滴度也使用BSR VP6細(xì)胞系。BTVl SlOGFP在BSR NS3細(xì)胞 系上傳代，同時(shí)通過病毒斑化驗(yàn)測(cè)定的滴度也使用BSR NS3細(xì)胞系。BTVl delta VP6的多步生長(zhǎng)曲線。BSR或C6/36細(xì)胞在MOI為0. 5時(shí)在12孔板 上，分別地在250 μ 1 DMEM或L15培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染。孔在ImLPBS中洗滌三次，并于標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng) 條件下，ImL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中溫育。在不同時(shí)間間隔，孔被收獲，同時(shí)總病毒通過病毒斑化驗(yàn)滴 定，在BSR VP6補(bǔ)充細(xì)胞系上測(cè)定。引物。 EcoT7_S9_F(5' CTAGGAATTCTAATACGACTCACTATAGTTAAAAAATCGATAGGCTGC3')。EcoBsmB_S9_R(5' CAGTGAATTCGTCTCCGTAAGTGTAAAATCGCCCTACG3')BTVlS10T7EcoRI(51CGGAATTCTAATACGACTCACTATAGTTAAAGGTCGTGCCATGCTA3‘)NS3BsmBi rev(5' GTAAGTGTGTAGTATCGCGCACCS‘)結(jié)果通過共轉(zhuǎn)染以來自兩種血清型的BTV mRNA的基因組片段的重組株。從來自核的 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過允許細(xì)胞的轉(zhuǎn)染而回收有傳染性的BTV已經(jīng)被證明[1]。為了產(chǎn)生BTV的反 向遺傳學(xué)系統(tǒng)，從一個(gè)BTV血清型到另一個(gè)的基因組片段導(dǎo)入被研究作為中間步驟，其先 于源于cDNA的基因組片段的導(dǎo)入。如前所述，感染性的核產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用從BTV-I及 BTV-9制備[1]。來自該兩個(gè)血清型的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物要么在同一轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中同時(shí)地產(chǎn)生或被分 別制備而后混合。匯合的BSR單層被轉(zhuǎn)染以轉(zhuǎn)錄混合物，同時(shí)病毒被從所產(chǎn)生的病毒斑中 擴(kuò)增。dsRNA被從每個(gè)擴(kuò)增的病毒斑中純化，同時(shí)基因組片段的來源通過非變性PAGE凝 膠上的電泳測(cè)定，其使一些來自不同分離物的基因組片段可被辨別。當(dāng)使用來自BTV-I及 BTV-9的共合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物時(shí)，子代病毒被產(chǎn)生，其具有來自兩個(gè)親代來源的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基因 組片段[重配株](圖1A)。道1含有在片段的遺傳學(xué)背景中具有BTV片段1以及片段4的 重配株，其如BTV-9遷移。類似地，道2含有在BTV-I遺傳學(xué)背景中的BTV-9片段3的重配 株，以及道3含有在BTV-I遺傳學(xué)背景中具有BTV-9片段1的重配株。當(dāng)BTV-I及BTV-9 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染之前被分別地制備并混合時(shí)，重配株子代病毒也產(chǎn)生，這標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物的共合成對(duì)于重組發(fā)生不是必須的(圖1B)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了對(duì)于將不同來源的基因組 片段導(dǎo)入BTV基因組中，以病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的混合物共轉(zhuǎn)染是一個(gè)可行的策略。得自cDNA克隆的BTV片段導(dǎo)入BTV-I基因組。基因組片段用得自cDNA克隆的T7 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的靶向替換隨后作為克隆序列導(dǎo)入BTV基因組的模型被研究。選擇將BTV-10片 段10T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物導(dǎo)入BTV-I基因組，以使得進(jìn)行病毒斑的快速篩選，其基于BTV-10片段10在PAGE凝膠上的遷移速度比BTV-I快。BTV-10片段10的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從pNS3BsmBI產(chǎn)生， 其具有T7啟動(dòng)子，以產(chǎn)生正確的5’末端，以及BsmBI位點(diǎn)，以產(chǎn)生正確的3’末端序列(圖 2)。從轉(zhuǎn)錄核心產(chǎn)生的BTV-I轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與BTV-10片段10的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合，并用于轉(zhuǎn)染 匯合的BSR單層。T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與對(duì)應(yīng)的核產(chǎn)生的mRNA的摩爾比為5 1被發(fā)現(xiàn)是最好的并 用于所有實(shí)驗(yàn)中，提高T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)BTV-I轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的比例，降低了回收的病毒斑的總數(shù) (數(shù)據(jù)未顯示)。典型地，在六孔板中使用1. 5 μ g得自核的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及0.75 μ g T7轉(zhuǎn) 錄產(chǎn) 物轉(zhuǎn)染后，從每個(gè)孔中回收 50個(gè)病毒斑。從這些病毒斑中擴(kuò)增病毒，并純化dsRNA?；?組片段10的來源一開始用dsRNA在PAGE凝膠上的電泳測(cè)定。以足夠高的頻率(15-80% ) 獲得了包含來自BTV-10的更快遷移的片段10的dsRNA基因組型，使病毒斑的篩選是可實(shí) 施的選擇(圖3A)。片段10的一致性使用RT-PCR，隨后通過對(duì)顯示出類型1和類型10之 間差異的區(qū)域進(jìn)行測(cè)序來確認(rèn)(圖3B、C和D)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了自質(zhì)粒得到的BTV-10片 段10回收到活的BTV-I的基因組中。當(dāng)細(xì)胞被兩種不同的株感染時(shí)，BTV天然地產(chǎn)生重組的子代基因組[21]。為了破 壞兩種病毒之間的天然重組成為片段10重配株的來源的可能性，含有引入的沉默HaeII位 點(diǎn)(pNS3Hae)作為標(biāo)記物的BTV-10片段10克隆通過pNS3BsmBI的定點(diǎn)突變產(chǎn)生。使用來 自BTV-I核的mRNA及得自pNS3Hae的含有引入突變的BTV-10片段10T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的混合 物轉(zhuǎn)染BSR單層。含有此突變的BTV-10片段10序列的病毒回收最初通過其在PAGE凝膠 上提高的遷移速率進(jìn)行篩選(圖4A)。HeaII位點(diǎn)向BTV基因組片段10的引入通過來自病 毒斑純化病毒的dsRNA的RT-PCR，隨后用HaeII消化(圖4B)，以及通過所述RT-PCR產(chǎn)物 的測(cè)序確認(rèn)(圖4C和D)。通過測(cè)序全長(zhǎng)RT-PCR產(chǎn)物，確定片段10與在pNS3Hae中編碼的 片段在其全部長(zhǎng)度上都相同(數(shù)據(jù)未顯示)。來自cDNA克隆的兩種BTV-10片段同時(shí)導(dǎo)入BTV-I基因組。為了估計(jì)同時(shí)改變兩 個(gè)基因組片段的可能性，研究了將來自BTV-10的編碼外殼蛋白的片段(片段2和5)導(dǎo)入 BTV-I基因組片段的背景中。這些基因組片段替換以另一血清型的片段，將使得該病毒的 血清型被改變。得自BTV-10片段2及5的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別由pVP2BsmBI及pVP5BsmBI制 備，并與來自BTV-I核的mRNA以每個(gè)T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與所相應(yīng)的來自核的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 1的 比例混合。匯合的BSR細(xì)胞單層由該RNA混合物轉(zhuǎn)染，從回收的病毒斑制備dsRNA。片段2 和5的來源一開始由它們?cè)赑AGE凝膠上的遷移速率評(píng)估(圖5A)。來自BTV-10的片段2 及5都以高頻率(20-80% )共同回收。所述片段的一致性由RT-PCR，隨后限制性內(nèi)切確定 (圖5B和C)。通過RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序，片段2和片段5的全部序列被確定為BTV-10的序 列(數(shù)據(jù)未顯示)。未回收到只含有來自BTV-10的片段2或者只含有片段5的子代(三 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的19個(gè)病毒斑中的0個(gè))，說明含有來自一個(gè)親代的片段2的病毒和來自另 一個(gè)親代的片段5的病毒或者具有降低的生存能力，或者相比雙重重配株以更低的頻率產(chǎn) 生。當(dāng)來自BTV-10的片段2或片段5導(dǎo)入BTV-I被單獨(dú)地嘗試，并沒有回收到重配株子代 時(shí)，該現(xiàn)象進(jìn)一步被支持(數(shù)據(jù)未顯示)。BTV完全從T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物回收。盡管上述方法是可實(shí)施的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，其使BTV 基因組片段可以操作，從野生型病毒斑中篩選重配株病毒斑會(huì)阻礙緩慢生長(zhǎng)的突變株的回 收。理想的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)會(huì)允許完全來自T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的感染性病毒的組裝。為了使每 一個(gè)基因組片段產(chǎn)生活的克隆的可能性最大化，各個(gè)基因組片段的RT-PCR擴(kuò)增與BTV-I的
18dsRNA,使用不依賴序列的為dsRNA模板開發(fā)的FLAC方法進(jìn)行[18]。各個(gè)RT-PCR產(chǎn)物被 克隆入pUC19 [22]，各個(gè)克隆的全序列被與各個(gè)RT-PCR產(chǎn)物的全序列比較，以確定是否代 表性的分子在每個(gè)情況下被克隆(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)編碼變化或任何在所克隆的基因組片 段末端上200nt之內(nèi)的區(qū)別存在時(shí)，將可選的克隆測(cè)序。一旦獲得全套的十個(gè)克隆，各個(gè)基 因組片段被使用高保真KOD熱啟動(dòng)DNA聚合酶(Novagen)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以在基因組片段 上游直接引入T7啟動(dòng)子，及在下游直接引入限制性酶切位點(diǎn)(圖2)。這些功能性盒也在 PUC19中被克隆。當(dāng)在非變性瓊脂糖凝膠上分析時(shí)，確定了使用限制性消化的質(zhì)?？寺?合成的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有所期待的大小(圖6A和B)。從限制性消化質(zhì)粒制備的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以按重量的均等的比例混合，并使用總計(jì) 3-4 μ g，以轉(zhuǎn)染匯合的BSR單層。轉(zhuǎn)染的單層覆蓋以瓊脂糖，病毒斑在轉(zhuǎn)染后3-6日出現(xiàn) (圖7A)。從病毒斑擴(kuò)增的dsDNA與BTV-I病毒保存株在PAGE凝膠上比較，并發(fā)現(xiàn)其是不可 區(qū)別的，確認(rèn)了 BTV-I已經(jīng)被回收(圖7B)。為了進(jìn)一步證實(shí)BTV可以得自T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，制 備了 BTV-I片段8的T7克隆的突變體，其含有引入的沉默的BglII位點(diǎn)，pBTVlSSBgl。在 轉(zhuǎn)染了全套T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染中，并其中片段8 BglII標(biāo)記轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物替換了野生型S8轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物，回收病毒斑(圖8A)。得自擴(kuò)增的病毒斑的dsDNA與BTV-I病毒保存株在PAGE凝 膠上相比時(shí)，發(fā)現(xiàn)其是不可區(qū)別的(圖8B)。通過轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞擴(kuò)增病毒斑，并通過用引物 NS2_Bam_R及NS2_Bam_T7F通過RT-PCR擴(kuò)增S8片段。所述RT-PCR產(chǎn)物的消化證實(shí)了已經(jīng) 引入了 BglII位點(diǎn)(圖9A)。所述RT-PCR產(chǎn)物使用BTV1_S8_627R引物測(cè)序，證實(shí)了標(biāo)記序 列的引入(圖9B)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了從T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的全套基因組回收BTV，并用此系統(tǒng)引 入可行的突變是可能的。BTVl delta VP6病毒的回收。為了產(chǎn)生DISC疫苗株，在野生型片段9的克隆中在 必需蛋白VP6中進(jìn)行了框架外大段刪除，以產(chǎn)生pBTVlS9delta(圖10)。體外合成的T7轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物的全套基因組如前述制備，然而含有被刪除的片段9轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而不是野生型片段9 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)染階段使用BSR VP6細(xì)胞系代替野生型BSR細(xì)胞，回收了相應(yīng)的突變病毒 株，BTVl delta VP6。不可區(qū)分自BTV CPE的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)在轉(zhuǎn)染后5天，在轉(zhuǎn)染孔 中可見，標(biāo)志著回收到感染性病毒(數(shù)據(jù)未顯示)。BTVl delta VP6在BSR VP6細(xì)胞系中復(fù)制。通過與野生型BTV-I在野生型BSR 細(xì)胞中復(fù)制相比，確定BTVl delta VP6病毒是否在BSR VP6細(xì)胞系中健壯地復(fù)制。通過用 BTVl delta VP6感染BSR VP6細(xì)胞系產(chǎn)生的CPE等價(jià)于當(dāng)使用野生型BTV-I轉(zhuǎn)染野生型 BSR細(xì)胞所產(chǎn)生的CPE，標(biāo)志著在BTVl Delta VP6的復(fù)制中沒有顯而易見的缺陷(參見圖 11)。使用BSR VP6 cell line評(píng)估了 BTVl delta VP6形成病毒斑的潛能(參見圖12)。 所述BSR VP6被發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充BTVl delta VP6的生長(zhǎng)，以至于產(chǎn)生正常外觀的病毒斑，使BTVl delta VP6可以正常滴定。采用BSR VP6細(xì)胞系，BTV delta VP6病毒可以生長(zhǎng)到與野生型 BTV-I可比的滴度(超過IO7感染單位/ml)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了 BTVl delta VP6病毒在補(bǔ) 充BSR VP6細(xì)胞系中有效復(fù)制。BTV delta VP6的基因組片段9的表征。BTVl delta VP6在BSR VP6細(xì)胞系中繁 殖，病毒雙鏈RNA如前所述地提取及純化。所述BTVl delta VP6基因組缺少野生型S9片 段并含有更小的基因組片段，對(duì)應(yīng)于將野生型S9片段替換以刪除的S9片段(圖13A)。來 自BTVl delta VP6的S9片段通過RT-PCR，使用在S9片段末端退火的引物(EcoT7_S9_F及EcoBsmB_S9_R)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生期待的650nt的產(chǎn)物(圖13B)，并使用相同的引物測(cè)序。擴(kuò) 增的基因片段的所看到的序列與PBTVl S9delta中的序列相同(數(shù)據(jù)未顯示)，證明所回收 的病毒被正確地構(gòu)建。BTVl delta VP6在非補(bǔ)充細(xì)胞系中的生長(zhǎng)的表征。DISC疫苗株的重要特征是其 應(yīng)該不能在宿主有機(jī)體內(nèi)完成復(fù)制周期。為了評(píng)估BTVl deltaVP6是否是有瑕疵的，BTV有 效地在其中復(fù)制的哺乳動(dòng)物BSR細(xì)胞系(BHK-21亞克隆)以及昆蟲細(xì)胞系C6/36，被用作哺 乳動(dòng)物及昆蟲宿主的代表。兩種細(xì)胞系使用BTVl delta VP6感染，同時(shí)產(chǎn)生的全部病毒使 用BSR VP6補(bǔ)充細(xì)胞系，經(jīng)72小時(shí)由病毒斑化驗(yàn)監(jiān)測(cè)。BTVl delta VP6不在任一個(gè)細(xì)胞系 中復(fù)制，但野生型BTV-I在兩個(gè)細(xì)胞系中都顯示出有效的復(fù)制(圖14A及B)。該數(shù)據(jù)證實(shí) VP6基因的破壞導(dǎo)致了當(dāng)VP6蛋白不由補(bǔ)充細(xì)胞系提供時(shí)，病毒不能復(fù)制。BTVl Delta VP6在非補(bǔ)全BSR細(xì)胞系中表達(dá)病毒蛋白。任意DISC疫苗必須在宿 主中表達(dá)病毒蛋白，以誘導(dǎo)免疫響應(yīng)。為了評(píng)估BTVl deltaVP6是否能夠表達(dá)蛋白質(zhì)，使用 野生型BSR細(xì)胞作為哺乳動(dòng)物宿主的代表。非結(jié)構(gòu)蛋白NS2的檢測(cè)，被用做病毒蛋白表達(dá) 的標(biāo)記。在BTVl deltaVP6病毒與野生型BTV-I的蛋白質(zhì)表達(dá)的比較中，NS2蛋白的表達(dá) 水平在BTVl delta VP6感染的BSR及BTV-I感染的BSR中均隨時(shí)間提高(圖15)。來自 BTVl delta VP6病毒的蛋白質(zhì)表達(dá)水平低于野生型BTV-I的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，這對(duì)于有缺 陷的病毒是可以預(yù)知的。該數(shù)據(jù)證實(shí)了 BTVl deltaVP6病毒在非補(bǔ)充BSR細(xì)胞中表達(dá)病毒 蛋白質(zhì)。標(biāo)記抗原可被加入到BTV基因組中。從BTV基因組表達(dá)標(biāo)記抗原/多肽的能力 將使得可以產(chǎn)生適合DIVA的疫苗株(DIVA:鑒別感染的和接種的動(dòng)物)。為了證實(shí)可以連 同補(bǔ)充細(xì)胞系使用反向遺傳學(xué)方法，制備了含有帶eGFP的框架融合的NS3的克隆，pBTVl SlOGFP0如前所述制備了體外合成的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物完整基因組，但其含有所述的NS3-eGFP 融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而不含有野生型片段10轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。相應(yīng)的突變病毒，BTV1S10GFP，在轉(zhuǎn)染中 使用BSR NS3補(bǔ)充細(xì)胞系，而不是用野生型BSR細(xì)胞，如前所述地被回收。當(dāng)非補(bǔ)充C6/36 細(xì)胞使用BTVl SlOGFP感染時(shí)，eGFP的表達(dá)由其在紫外線下的熒光確定(數(shù)據(jù)未顯示)。BTVl SlOGFP的基因組片段10的表征。BTVl SlOGFP的基因組缺少野生型SlO片 段，并含有更大的片段，對(duì)應(yīng)于SlO GFP融合(圖16A)。來自BTVl SlOGFP的所述SlO片 段使用在SlO片段末端退火的引物(BTV1S 10T7 EcoRI及NS3BsmBirev)，由RT-PCR擴(kuò)增， 所期待的1446nt的產(chǎn)物被擴(kuò)增(圖16B)。對(duì)BTVl SlOGFP的RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序，從而eGFP 基因的存在被確認(rèn)(參見圖17)，證明了所回收的病毒被正確地構(gòu)建。從自質(zhì)粒得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的提高的病毒回收效率。作出了增強(qiáng)從自質(zhì)粒得到的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的藍(lán)舌病毒回收效率的兩個(gè)變化。這些 變化都是前述轉(zhuǎn)染方法的變化。每個(gè)改進(jìn)導(dǎo)致從自質(zhì)粒得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物回收病毒的效率提 高 10倍，共計(jì)導(dǎo)致病毒回收的 100倍的提高。修改#1，雙重轉(zhuǎn)染如前所述，每次使用整組十種來自質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染兩次(而不是一 次)。所述轉(zhuǎn)染相隔18小時(shí)進(jìn)行，并導(dǎo)致病毒回收相對(duì)于采用單次轉(zhuǎn)染 10倍的提高。使 用雙重轉(zhuǎn)染方法的病毒回收的提高當(dāng)使用制自BTV核的ssRNA時(shí)(圖18)，及當(dāng)使用整組十 種cDNA克隆制得的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物時(shí)(圖19)被觀測(cè)到。
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修改#2，基因組片段2、5、7和10從第一次轉(zhuǎn)染的省略如修改#1所述，細(xì)胞被轉(zhuǎn)染兩次，然而編碼基因組片段2、5、7和10的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物被從第一轉(zhuǎn)染中省略。第二次轉(zhuǎn)染使用整套的十種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。所述轉(zhuǎn)染間隔18小時(shí)進(jìn) 行，比使用前述的雙重轉(zhuǎn)染時(shí)導(dǎo)致病毒恢復(fù) 10倍的進(jìn)一步增強(qiáng)(圖20)。碰所描述的兩種方法代表BTV的可選的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，使用真實(shí)的病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 及T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的混合物，或T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的整套基因組。其拓展了當(dāng)用于轉(zhuǎn)染許可的細(xì)胞 時(shí)，BTV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是感染性的這一發(fā)現(xiàn)[1]，并證實(shí)了在體外合成的在5’末端有帽類似物的 T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以從功能上代替由核顆粒合成的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物?；厥盏阶哟《荆w子代病毒帶有源自兩個(gè)獨(dú)立的來自核mRNA制備品的基因組 片段，這建立了通過與真實(shí)的病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合向BTV基因組中引入外來轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的原理 (圖1B)。在轉(zhuǎn)錄后混合mRNA制備品的觀點(diǎn)在制備重配株中是有效的，所述重配株被允許將 得自質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與得自核的mRNA —起使用，以向BTV基因組中引入靶向的突變的可能 性。研究了 BTV-10片段10轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物向BTV-I基因組中的引入，以確定將自質(zhì)粒得到的轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物引入到感染性的BTV中是否可以容易地實(shí)現(xiàn)。該模型系統(tǒng)顯示，使用過量的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物以一定頻率產(chǎn)生了重配株病毒斑，該頻率使得個(gè)別病毒斑的篩選是實(shí)用的(15-80% )。 病毒斑最初通過片段IOdsRNA在PAGE凝膠上遷移速率的的篩選(圖3)被通過RT-PCR產(chǎn) 物的測(cè)序證實(shí)(圖3)。T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及真實(shí)的病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物間的高效重組意味著可選的標(biāo) 記物途徑不是必須的。HaeII位點(diǎn)標(biāo)記物突變引入BTV的片段10，證實(shí)了重配株得自體外 合成的片段10T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(圖4)。含有HaeII的片段10以類似于野生型BTV-10片段10 的效率回收。兩種片段10重配株病毒均證實(shí)了相比野生型BTV-I而言，沒有顯而易見的復(fù) 制缺陷(數(shù)據(jù)未顯示)。這表示得自BTV-10的基因組片段10在功能上與BTV-I基因組片 段背景，在RNA包裝及復(fù)制的水平及NS3/NS3A蛋白功能上是可比的。使用過量的兩種T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，將兩種T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物同時(shí)重組進(jìn)入BTV基因組，從而 以得自BTV-10 cDNA克隆的病毒外殼蛋白替代作為抗原重要的BTV-I外殼蛋白，表現(xiàn)為可 行的(圖5)。含有BTV-10片段2及5的子代病毒斑以20到80%的頻率被回收，然而未分 離得到只含有BTV-10片段2或片段5的重配株。這證明了 BTV-10的片段2及5 —起可 以在功能上代替相應(yīng)的BTV-I的基因組片段，說明來自這些血清型的片段2及片段5在某 種程度上具有不相容性。編碼的蛋白，VP2和VP5，由于它們?cè)诓《绢w粒表面暴露于免疫選 擇壓力，是高度可變的。我們偏好的解釋是VP2及VP5蛋白已共進(jìn)化，及一種血清型的VP2 的三維結(jié)構(gòu)不必然地與另一種血清型的VP5相容。這與前面報(bào)道的來自一些血清型組合的 VP2和VP5在BTV病毒樣顆粒的傳代中所觀察到的的不相容性相一致[23，24]。在一些血清 型組合中，在RNA包裝層面上的片段2及片段5的不相容性是另一種可能性。來自另一血 清型的兩種外殼蛋白同時(shí)引入使得基于相同的遺傳學(xué)背景，產(chǎn)生對(duì)于不同血清型的疫苗株 成為可能。BTV-I及BTV-10的VP2蛋白之間的高度氨基酸序列差異性(40%氨基酸相同) 暗示多種VP2+VP5對(duì)加到BTV病毒保守的核上的組裝是可行的。研究了 BTV-I從一套完整的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的回收，以確定具有完全確定的基因組的 病毒是否可以從cDNA克隆中回收。由十種T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)染的BSR單層被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致病毒斑 的產(chǎn)生(圖7)。BglII標(biāo)記物突變到S8片段的回收證實(shí)了所回收的病毒是得自轉(zhuǎn)染中所使用的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(圖8和9)。單獨(dú)從T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物回收到到有感染性的BTV證明了在帽類 似物存在下合成的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在復(fù)制周期的所有階段在功能上等價(jià)于真實(shí)的病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物。如果病毒粒子要傳代，T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必須在基因組包裝階段被翻譯、選擇，并充當(dāng)負(fù)鏈合 成的模板。進(jìn)一步地，在負(fù)鏈合成后，所產(chǎn)生的dsRNA基因組片段必須有能力在下一輪感染 中轉(zhuǎn)錄。BTV從T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的回收導(dǎo)致，相比使用等量的得自核的病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物時(shí)， 100 倍少的病毒斑的回收。較低的效率可能源于在帽類似物的存在下產(chǎn)生的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只有 一部分具有結(jié)合于5’末端的帽類似物。除了較差地被翻譯，未帶帽的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可能在RNA 包裝過程中、負(fù)鏈合成中或在下一輪感染的轉(zhuǎn)錄中出錯(cuò)。重要地，該未加帽的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有 5’三磷酸部分，其已知為病原體相關(guān)的分子樣式(PAMP)，該樣式由RIG-I識(shí)別，并導(dǎo)致引起 抗病毒應(yīng)答[25-28]。可選地，與產(chǎn)生十種具有完整保守末端序列的ssRNA分子相關(guān)的該技 術(shù)問題可能促使用T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所觀察到的較低回收。全部從自質(zhì)粒得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的BTV回收使具有相同遺傳學(xué)背景的BTV突變產(chǎn) 生。該方法在突變體的回收中有用，所述突變體預(yù)料具有緩慢復(fù)制的顯型，因?yàn)椴恍枰谝?生型病毒斑中篩選期待的變異株的病毒斑。在此類情況下，將沒有可能阻礙回收復(fù)制較慢 變異株的復(fù)制較快病毒的背景。該方法也能用于回收初代及低次代的BTV分離株，避免了 這些株對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)條件的逐步改變。含有一個(gè)自質(zhì)粒得到的基因組片段的重配株的回收要 求單克隆或PCR產(chǎn)物的構(gòu)建，并且對(duì)于任意基因組片段都是可行的。此單構(gòu)建方法可用于 研究單獨(dú)的病毒基因，而不需要構(gòu)建整套的十個(gè)克隆。由于呼腸弧病毒科成員具有共同的 復(fù)制策略，重組株及僅有T7的反向遺傳學(xué)方法可對(duì)于缺少反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的廣泛病毒是 適用的。在兩個(gè)方法中體外合成的T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的使用，避免了通過使用重組痘病毒感染提 供T7RNA聚合酶的需要，所述重組痘病毒可以妨礙所回收的病毒的復(fù)制。可選的反向遺傳學(xué)方法已經(jīng)在呼腸弧病毒科的其他屬中成功應(yīng)用[2-4]。第一種 反向遺傳學(xué)系統(tǒng)為哺乳動(dòng)物正呼腸弧病毒的輔助病毒系統(tǒng)[3]。該方法將許可的細(xì)胞的呼 腸弧病毒感染與用病毒dsRNA、病毒mRNA、T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及體外翻譯的病毒mRNA轉(zhuǎn)染相結(jié)合。 另一種輔助病毒方法使得輪狀病毒的外殼蛋白替換為另一種血清型的對(duì)應(yīng)蛋白[2]。所述 引入基因組片段的表達(dá)在體內(nèi)由重組的T7痘苗病毒系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)，以及對(duì)等價(jià)的輔助病毒蛋 白的選擇性壓力由選用抗體提供。最近，哺乳動(dòng)物正呼腸弧病毒已經(jīng)通過基于質(zhì)粒的系統(tǒng) 被回收，該系統(tǒng)類似首先和負(fù)鏈病毒使用的T7驅(qū)動(dòng)的系統(tǒng)[4]。在本案中，所有十種基因組 片段的表達(dá)在體內(nèi)由重組T7痘苗病毒系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)。所有成功的反向遺傳學(xué)策略具有幾個(gè)共 同的顯著特征1)得自cDNA克隆的基因組片段在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中作為信號(hào)感受轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 被提供。2)所使用的得自cDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與對(duì)應(yīng)的病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有同樣的5’及3’末 端序列。所述5’末端通過使用具有適當(dāng)?shù)男蛄械腡7啟動(dòng)子產(chǎn)生，而3’末端通過體內(nèi)使用 丁型肝炎病毒核酶或者體外限制性酶位點(diǎn)來產(chǎn)生。呼腸弧病毒科成員中的所有基因組片段 在其5’及3’最末端具有短的保守序列，其功能仍需闡明。3)類似真正的病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，得 自cDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被加帽，或者在體外使用帽類似物或者在體內(nèi)通過與痘苗T7RNA聚合酶 重組體相關(guān)的交叉加帽活性[13]。為了達(dá)到感染性病毒的回收，基因表達(dá)必須足以使子代 核顆?？梢越M裝，其本身為具有轉(zhuǎn)錄活性的，并導(dǎo)致基因表達(dá)的擴(kuò)增。為了組裝這些不完全 的病毒粒子，高水平的基因表達(dá)是必須的，以及在得自cDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’末端無帽結(jié)構(gòu) 的情況下，其穩(wěn)定性和翻譯水平會(huì)被大大降低[14]。
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缺乏病毒基因的DISC病毒已經(jīng)使用BTV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)結(jié)合補(bǔ)充細(xì)胞系獲得。 所回收的病毒滿足以下BTV DISC病毒疫苗株的準(zhǔn)則1)在非補(bǔ)充哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)病 毒蛋白(圖15) ；2)在非補(bǔ)充哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞系中無可檢測(cè)到的感染性病毒產(chǎn)生(圖 14)；以及3)在相應(yīng)的補(bǔ)充細(xì)胞系中健壯的復(fù)制(圖12)。除此之外，表達(dá)外來蛋白或多肽 的能力已經(jīng)被使用eGFP蛋白插入NS3開放讀寫框證實(shí)了，使得產(chǎn)生含有免疫標(biāo)記的病毒疫 苗株，所述標(biāo)記可以在接種的動(dòng)物中檢測(cè)，以將其從感染的動(dòng)物區(qū)分開，也即DIVA概念(鑒 別感染的和接種的動(dòng)物)。T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或病毒ssRNA在呼腸弧病毒科家族成員的復(fù)制周期中具有兩種功能 1)被翻譯以產(chǎn)生病毒蛋白；2)作為復(fù)制中間體起作用，以合成新的雙鏈基因組片段。為了 使在細(xì)胞中成功拯救，使用單轉(zhuǎn)染方法，一部分轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必須在裝配子代病毒顆粒中保持 可以包裝和復(fù)制。期待這在病毒回收效率中成為限制性的步驟，這是由于不像正常的感染， 沒有新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被持續(xù)地從感染性核顆粒處合成。為了增加回收的效率，當(dāng)期待形態(tài)發(fā) 生學(xué)上已經(jīng)達(dá)到了包裝階段時(shí)，進(jìn)行了第二次轉(zhuǎn)染，以引入額外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于包裝。使用病 毒ssRNA或者T7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物觀察到病毒回收中所預(yù)測(cè)的增長(zhǎng)(圖18及19)以及被發(fā)現(xiàn)為十 倍。為了進(jìn)一步提高回收的效率，從第一次轉(zhuǎn)染中省略了基因組片段，以使得形態(tài)發(fā) 生學(xué)上不超過衣殼內(nèi)層的組裝。使用該方法以捕獲在包裝即將發(fā)生的階段的組裝體。編碼 所忽略的片段的基因組片段為片段2編碼VP2 (外殼)，片段5編碼VP5 (外殼)，片段7編 碼VP7 (衣殼中層)以及片段10編碼NS3 (病毒釋放所需)。忽略片段2，5，7，10的結(jié)果是 三層衣殼的中間層及外層未被合成，以及釋放蛋白NS3不存在。發(fā)現(xiàn)以這種方式捕獲形態(tài)， 當(dāng)整套十種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在第二次轉(zhuǎn)染中提供時(shí)，進(jìn)一步增加了病毒回收的10倍(圖20)。轉(zhuǎn)染步驟這兩個(gè)改進(jìn)共計(jì)導(dǎo)致病毒回收相對(duì)使用單轉(zhuǎn)染100倍的提高，使得野生 型或突變病毒可以可靠地回收。這些改進(jìn)使得遺傳地有缺陷的病毒使用補(bǔ)充細(xì)胞系可以可 靠地回收。反向遺傳學(xué)，及其他病毒，可以幫助對(duì)BTV在數(shù)個(gè)研究領(lǐng)域內(nèi)的理解。使用任一系 統(tǒng)將特定突變回收進(jìn)入BTV基因組的能力不僅提供了 BTV及相關(guān)環(huán)狀病毒的分子剖分的新 工具，也提供了開發(fā)針對(duì)這些病毒的特異性地減低毒性的疫苗的機(jī)會(huì)。至今，BTV蛋白質(zhì)功 能的研究主要基于重組蛋白表達(dá)。將特定的突變引入BTV基因中的能力將使我們進(jìn)一步了 解病毒蛋白質(zhì)在復(fù)制病毒中的功能，并使得進(jìn)一步證實(shí)已經(jīng)被指出的功能?？刂骗h(huán)狀病毒 基因組復(fù)制、包裝及表達(dá)的順式作用RNA序列還未被繪制圖譜，被了解得很少。反向遺傳學(xué) 使得繪制這些調(diào)控序列的圖譜成為可能，并可以協(xié)助研究其如何起效。外殼蛋白質(zhì)的替換 可以在普通遺傳學(xué)背景上，用于產(chǎn)生不同血清的疫苗株。進(jìn)一步地，可以確定BTV及相關(guān)的 環(huán)狀病毒的致病性的決定性因素，并設(shè)計(jì)多重的毒性減低的疫苗株。參考文獻(xiàn)1. Boyce, M. and Roy, P. 2007. Recovery of Infectious Bluetongue Virus from RNA. J. Virol. 81 (5) :2179_2186.2. Komoto, S. , J. Sasaki, and K. Taniguchi. 2006. Reverse genetics system for introduction of site-specific mutations into the double-stranded RNA genome of infectious rotavirus. Proc, Natl. Acad. ScL USA 103:4646—4651.
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權(quán)利要求
制備作為呼腸弧病毒科家族成員的病毒的疫苗病毒株的方法，所述方法包括向呼腸弧病毒科病毒中引入突變，以使必需基因的功能被破壞；使用得自病毒基因組并含有所述突變的病毒單鏈RNA(ssRNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；和在合適的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以導(dǎo)致疫苗病毒株的產(chǎn)生，其中所述細(xì)胞補(bǔ)充關(guān)鍵病毒基因的功能，從而使得所述疫苗病毒株在細(xì)胞中復(fù)制。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中轉(zhuǎn)染細(xì)胞包括2或更多轉(zhuǎn)染步驟，其中(1)第一轉(zhuǎn)染步驟包括使用ssRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述ssRNA至少編碼病毒衣殼內(nèi)層的組裝 所需的組分；以及(2)第二轉(zhuǎn)染步驟包括使用ssRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述ssRNA為病毒基因組的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及包 含所述突變，并編碼病毒組裝所需的所有組分。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中在第一及第二轉(zhuǎn)染步驟之間有至少6個(gè)小時(shí)的時(shí)間 間隔。
4.如權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒為環(huán)狀病毒屬的成員。
5.如權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒為藍(lán)舌病毒、非洲馬瘟病毒或流 行性出血熱病毒。
6.如權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒為藍(lán)舌病毒。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中部分ssRNA是含有所述突變的病毒基因組 cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
8.如權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)所述的方法，其中所有ssRNA為含有所述突變的病毒基因 組cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中多于一個(gè)必需基因的功能被破壞。
10.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述必需基因?yàn)榫酆厦?、螺旋酶、加帽?或非結(jié)構(gòu)蛋白。
11.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述細(xì)胞為BHK21細(xì)胞、Vero細(xì)胞，293T 細(xì)胞、BSR細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、C6/36細(xì)胞或KC細(xì)胞。
12.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病毒ssRNA是分離 的 ssRNA。
13.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，還包括從細(xì)胞分離所述疫苗病毒株。
14.得自病毒的基因組的分離的病毒ssRNA，所述病毒為呼腸弧病毒科家族成員，其中 所述ssRNA包含突變，該突變破壞必需基因的功能，及其中所述病毒ssRNA適用于權(quán)利要求 1到3任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞方法中。
15.表達(dá)呼腸弧病毒科病毒必需基因的細(xì)胞，其使得來自權(quán)利要求14所述ssRNA的疫 苗病毒株可以復(fù)制。
16.如權(quán)利要求15所述的細(xì)胞，其由權(quán)利要求14所述的ssRNA感染。
17.由權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述方法制備的疫苗病毒株。
18.藥物組合物，其含有權(quán)利要求7所述的疫苗病毒株及藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或 賦形劑。
19.藥物組合物，其含有權(quán)利要求4所述的分離的病毒ssRNA及藥學(xué)上可接受的載體、 佐劑或賦形劑。
20.如權(quán)利要求17所述的疫苗病毒株在治療中的應(yīng)用。
21.如權(quán)利要求14所述的分離的病毒ssRNA在治療中的應(yīng)用。
22.如權(quán)利要求17所述的疫苗病毒株在給動(dòng)物接種抵抗病毒中的應(yīng)用。
23.如權(quán)利要求14所述的分離的病毒ssRNA在給動(dòng)物接種抵抗病毒中的應(yīng)用。
24.如權(quán)利要求22所述的疫苗病毒株或權(quán)利要求23所述的分離的病毒ssRNA，其中所 述病毒為AHSV及所述動(dòng)物選自馬、騾、驢或斑馬。
25.如權(quán)利要求22所述的疫苗病毒株或權(quán)利要求23所述的分離的病毒ssRNA，其中所 述病毒為EHDV及所述動(dòng)物選自鹿、家?；蚓d羊。
26.如權(quán)利要求22所述的疫苗病毒株或權(quán)利要求23所述的分離的病毒ssRNA，其中所 述病毒為BTV，及所述動(dòng)物選自家牛、綿羊、山羊、水牛、鹿、單峰駱駝或羚羊。
27.接種動(dòng)物抵抗病毒的方法，所述病毒為呼腸弧病毒科家族成員，所述方法包括遞送 有效量的根據(jù)權(quán)利要求17所述的疫苗病毒株到動(dòng)物。
28.接種動(dòng)物抵抗病毒的方法，所述病毒為呼腸弧病毒科成員，所述方法包括遞送有效 量的根據(jù)權(quán)利要求14所述的分離的病毒ssRNA到動(dòng)物。
29.如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中所述病毒為AHSV，及所述動(dòng)物選自馬、騾、驢 或斑馬。
30.如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中所述病毒為EHDV及所述動(dòng)物選自鹿、家?；蚓d羊。
31.如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中所述病毒為BTV，及所述動(dòng)物選自家牛、綿 羊、山羊、水牛、鹿、單峰駱駝或羚羊。
32.試劑盒，其含有權(quán)利要求14所述的分離的ssRNA及細(xì)胞，所述細(xì)胞補(bǔ)充ssRNA突變 的必需基因。
33.確定病毒必需基因的篩選方法，所述病毒為呼腸弧病毒科家族成員，所述方法包括向呼腸弧病毒科病毒中引入突變，以使必需基因的功能被破壞； 使用得自病毒基因組并含有所述突變的ssRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞；和 在合適的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其中如果培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后產(chǎn)生的病毒為致病性的，所述病毒基因不是必需基因。
34.本發(fā)明還提供產(chǎn)生作為呼腸弧病毒科家族成員的病毒的改良病毒株的方法，所述 方法包括向呼腸弧病毒科病毒中引入修飾；向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染病毒單鏈RNA (ssRNA)，所述RNA得自病毒基因組并包含所述修飾；及 在適宜的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以導(dǎo)致改良病毒株的產(chǎn)生； 其中所述細(xì)胞使得改良病毒株在細(xì)胞中復(fù)制。
35.如權(quán)利要求1所述的方法，其中轉(zhuǎn)染細(xì)胞包括2個(gè)或更多轉(zhuǎn)染步驟，其中(1)第一轉(zhuǎn)染步驟包括使用ssRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述ssRNA至少編碼病毒衣殼內(nèi)層的組裝 所需的組分；以及(2)第二轉(zhuǎn)染步驟包括使用ssRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述ssRNA為病毒基因組的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及包含突變，并編碼病毒組裝所需的所有組分。
36.如權(quán)利要求2所述的方法，其中第一及第二轉(zhuǎn)染步驟之間有至少6小時(shí)的時(shí)間間隔。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為呼腸弧病毒科家族成員的病毒的改良病毒株的制造方法，以及尤其涉及環(huán)狀病毒屬的疫苗病毒株。
文檔編號(hào)C12N7/04GK101970645SQ200880125535
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月26日
發(fā)明者M·博伊斯, P·羅伊 申請(qǐng)人:倫敦衛(wèi)生及熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院