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      一種草魚呼腸孤病毒ⅰ型和ⅱ型的雙重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法

      文檔序號(hào):518732閱讀:312來源:國(guó)知局
      一種草魚呼腸孤病毒ⅰ型和ⅱ型的雙重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種草魚呼腸孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法,該方法可以實(shí)現(xiàn)在一個(gè)待測(cè)樣本中同時(shí)檢測(cè)草魚呼腸孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的存在,并能對(duì)兩種病毒的負(fù)載水平進(jìn)行定量。本發(fā)明還提供了一種用于草魚呼腸孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)方法及試劑盒操作簡(jiǎn)便,特異性強(qiáng),檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確率高、可靠,具有廣泛的應(yīng)用前景。
      【專利說明】—種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法及其試劑盒
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及一種雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒,具體涉及一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒,進(jìn)一步涉及了一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002]草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)隸屬水生呼腸孤病毒屬,為呼腸孤病毒科一新成員,是中國(guó)大陸分離的第一株魚類病毒。該病毒主要引起中國(guó)、越南、緬甸等亞洲國(guó)家淡水養(yǎng)殖中的草魚品種在魚種階段發(fā)生出血病,死亡率可高達(dá)60%以上。該病毒流行廣、危害大、死亡率高、發(fā)病季節(jié)長(zhǎng),嚴(yán)重威脅漁業(yè)生產(chǎn)。草魚呼腸孤病毒具雙層衣殼,病毒粒子平均直徑為60 nm~70nm,二十面體對(duì)稱,無囊膜,基因組由11條分節(jié)段的雙鏈RNA組成。目前己經(jīng)報(bào)道了 20多個(gè)分離株,包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV HZ08、GCRV JX09-01、GCRV JX09-02, GCRV⑶10、GCRV GCRV104株等,不同分離株在基因組序列、基因組帶型、細(xì)胞病變、對(duì)草魚的致病力等方面差異較大。到目前為止,已完成全基因組序列分析的毒株有GCRV 873株、GCRV HZ08、GCRV⑶10、GCRV 104等,也有比較多的毒株只完成了部分節(jié)段或者部分序列的測(cè)序工作。草魚呼腸孤病毒比較復(fù)雜,不同分離株的各基因節(jié)段存在重配和抗原漂移現(xiàn)象,使得目前還沒在血清學(xué)或者基因型上對(duì)其進(jìn)行亞型分類。但是通過現(xiàn)有的分離株序列信息來看,至少應(yīng)該有三類,各類的代表株分別是:第一類為873株和JX09-01株,第二類為HZ08株和⑶10株,第三類型為104株。在相關(guān)的研究報(bào)道中已有提到將其進(jìn)行基因分型的探討,即分別把一、二和三類按照基因序列差異分為1、II和III型(曾偉偉,王慶,劉永奎等.一株草魚呼腸孤病毒弱毒株的分離、鑒定及免疫原性初步分析.水生生物學(xué)報(bào),2011.35 (5):790-795 ;曾偉偉,王慶,王英英,張樂生,劉寶芹,石存斌,吳淑勤.草魚呼腸孤病毒三`重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及其初步應(yīng)用.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué).2013,20(2): 329-335)。同一亞型的毒株,其對(duì)應(yīng)各節(jié)段基因同源性均在95%以上。
      [0003]當(dāng)前,全國(guó)各地分離到的流行株中,三類亞型均有報(bào)道,有的單獨(dú)感染,也有混合感染。根據(jù)近幾年的草魚出血病監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查分析表明,目前導(dǎo)致草魚出血病流行和爆發(fā)的最主要為GCRV II型,其次是GCRV I型,而GCRV III型幾乎沒有檢測(cè)和分離到因此,根據(jù)草魚出血病的流行特點(diǎn)和草魚呼腸孤病毒分子生物學(xué)特性,根據(jù)同一亞型不同毒株之間共有的保守序列分別設(shè)計(jì)引物,建立針對(duì)目前主要流行基因型的草魚呼腸孤病毒均能同時(shí)作診斷,并且可以鑒定其亞型的雙重?zé)晒舛縍T-PCR快速、特異檢測(cè)技術(shù)。
      [0004]草魚呼腸孤病毒的檢測(cè)方法有多種,各具優(yōu)勢(shì)和缺陷,病毒分離、電鏡觀察、核酸帶型分析至今仍是檢測(cè)草魚呼腸孤病毒普遍采用的方法,但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作比較復(fù)雜,不能對(duì)病毒進(jìn)行快速診斷,不利于草魚出血病的流行病學(xué)調(diào)查工作。全病毒診斷涉及病毒培養(yǎng)、純化及濃縮等過程,不僅制作過程復(fù)雜,耗時(shí),成本較高,而且還潛在散毒危險(xiǎn),因此不利于推廣使用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)某片段基因進(jìn)行擴(kuò)大數(shù)百萬倍。該技術(shù)特異性強(qiáng),敏感性高、檢測(cè)快速,已被廣泛用于醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等學(xué)科的各領(lǐng)域。草魚呼腸孤病毒不同毒株的RT-PCR檢測(cè)方法已經(jīng)廣泛建立起來,該方法具有快速性、準(zhǔn)確性和高靈敏性等優(yōu)點(diǎn),能夠?qū)Σ蒴~呼腸孤病毒感染作出早期診斷,給疫情的快速分析和控制提供有力的技術(shù)支撐。其中的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)平臺(tái)作為簡(jiǎn)捷和可靠的草魚呼腸孤病毒檢測(cè)方法,不僅可以定性檢測(cè)病毒的有無,而且可以定量分析病毒含量的多少,對(duì)于草魚出血病的診斷和草魚呼腸孤病毒的基礎(chǔ)研究均具有重要的意義。多重?zé)晒舛縋CR是一種特殊熒光定量PCR形式,其最突出特點(diǎn)是一次PCR可同時(shí)檢測(cè)多種病原,尤其適用于病原復(fù)雜或基因型較多的病原檢測(cè)。
      [0005]因此,建立能夠同時(shí)對(duì)草魚呼腸孤病毒I型和II型進(jìn)行快速檢測(cè)的技術(shù),不僅可以做到對(duì)不同亞型的草魚呼腸孤病毒進(jìn)行鑒別診斷和定量分析,而且可以簡(jiǎn)化操作程序、節(jié)約成本,對(duì)草魚出血病的流行病學(xué)調(diào)查、病原監(jiān)測(cè)及早期預(yù)警都具有重要的意義。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006]本發(fā)明的目的在于提供一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒。
      [0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法,該方法可以實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)待測(cè)樣本中同時(shí)檢測(cè)草魚呼腸孤病毒I型和II型的存在,并能對(duì)兩種病毒的負(fù)載水平進(jìn)行定量。
      [0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
      一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒,包括如下成分:雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液、酶混合液、RT-PCR反應(yīng)液、陽(yáng)性質(zhì)控品和無RNA酶去離子水,所述雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液中含有草魚呼腸 孤病毒I型和II型特異性引物及雙重探針,序列分別為:草魚呼腸孤病毒I型:
      上游引物:GCRV-1 -F:5’ -CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’ (SEQ ID N0.1);
      下游引物:GCRV-1 -R:5’-CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ (SEQ ID N0.2);
      熒光探針:GCRV-1 -P:5,-FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3,(SEQ IDN0.3)
      草魚呼腸孤病毒II型:
      上游引物:GCRV-11-F:5’ -TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’ (SEQ ID N0.4);
      下游引物:GCRV-11-R:5’ -GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’ (SEQ ID N0.5);
      熒光探針:GCRV-11-P:5’ -CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.6)草魚呼腸孤病毒I型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM,草魚呼腸孤病毒II型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5,淬滅基團(tuán)為BHQl。
      [0009]進(jìn)一步的,所述雙重突光定量反應(yīng)液的組成如下:
      GCRV-1 -F (100 μ Μ)5μ L
      GCRV-1 -R (100 μ Μ)5 μ L
      GCRV-1 -P (100 μ Μ)4μ L
      GCRV-11-F (100 μ Μ)6 μ LGCRV-11-R (100 μ Μ)6 μ L
      GCRV-11-P (100 μ Μ)5 μ L
      無RNA酶去離子水169 μ L
      Total200 μ L。
      [0010]進(jìn)一步的,所述酶混合液包括逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶。
      [0011]進(jìn)一步的,所述陽(yáng)性質(zhì)控品為滅活的草魚呼腸孤病毒I型GCRV09-01株和II型GCRV-HZ08株的培養(yǎng)液。
      [0012]一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法,包括如下步驟:
      1)提取待測(cè)樣品中的病毒RNA;
      2)以提取的RNA為模板,使用草魚呼腸孤病毒I型的
      上游引物:GCRV-1 -F:5’ -CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’ (SEQ ID N0.1);
      下游引物:GCRV-1 -R:5’-CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ (SEQ ID N0.2);
      熒光探針:GCRV-1 -P:5,-FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3,(SEQ IDN0.3)和草魚呼腸孤病毒II型的
      上游引物:GCRV-11-F:5’ -TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’ (SEQ ID N0.4);
      下游引物:GCRV-11-R:5’ -GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’ (SEQ ID N0.5);
      熒光探針:GCRV-11-P:5’ -CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.6)進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè),其中,草魚呼腸孤病毒I型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM,草魚呼腸孤病毒II型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5,淬滅基團(tuán)為BHQl ;
      3)結(jié)果分析:反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)待測(cè)樣品的熒光Ct值判斷待測(cè)樣品是否為草魚呼腸孤病毒I型、草魚呼腸孤病毒II型陽(yáng)性。
      [0013]進(jìn)一步的,所述雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)體系包括病毒RNA模板、雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液、酶混合液、RT-PCR反應(yīng)液、無RNA酶去離子水。
      [0014]進(jìn)一步的,所述雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)條件為42 °C 30min,94~96°C 3~8min,然后經(jīng)94~96°C 7~IOs和58~62°C 32~38s采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)。
      [0015]本發(fā)明的有益效果是:
      本發(fā)明提供的試劑盒可同時(shí)對(duì)草魚呼腸孤病毒I型和II型兩種病毒進(jìn)行快速檢測(cè),并能夠?qū)悠分胁≡w的核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)精確檢測(cè)和定量分析,準(zhǔn)確率高,操作簡(jiǎn)便,成本低,具有廣泛的應(yīng)用前景。
      [0016]本發(fā)明提供的試劑盒引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針,使得檢測(cè)的靈敏度和特異性得到很大程度的提高,從而避免了其他檢測(cè)方法特異性不高容易漏診和誤診的問題,基于上述優(yōu)點(diǎn),該草魚呼腸孤病毒I型和II檢測(cè)試劑盒對(duì)草魚出血病的流行病學(xué)調(diào)查、病原監(jiān)測(cè)及早期預(yù)警都具有重要的意義。
      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0017]圖1為GCRV I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)草魚出血病臨床樣品的結(jié)果圖;
      圖2為雙重?zé)晒釶CR體系中檢測(cè)I型 草魚呼腸孤病毒的靈敏度實(shí)驗(yàn)圖,從左到右依次為 I X 108、I X 107、I X 106、I X 105、I X IO4、I X 103、IXlO2、I X 10 拷貝 / μ L 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果;
      圖3為雙重?zé)晒釶CR體系中檢測(cè)II型草魚呼腸孤病毒的靈敏度實(shí)驗(yàn)圖,從左到右依次為 1X108、1X107、1X106、1X105、1X104、1X103、、1X10 拷貝 / μ L 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果;圖4為雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法中GCRV I型病毒的特異性實(shí)驗(yàn)圖;
      圖5為雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法中GCRV II型病毒的特異性實(shí)驗(yàn)圖;
      圖6為雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法中GCRV I型和II型病毒的特異性實(shí)驗(yàn)圖。
      【具體實(shí)施方式】
      [0018]下面結(jié)合具本實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明,但并不局限于此。
      [0019]實(shí)施例1:
      1、特異性引物及探針的設(shè)計(jì)
      根據(jù)從Genbank上檢索到的草魚呼腸孤病毒I型和II型的核酸序列,設(shè)計(jì)用于檢測(cè)草魚呼腸孤病毒I型和II型的引物和探針,其序列如下:
      魚呼腸孤病毒I型:
      上游引物:GCRV-1 -F:5’ -CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’ (SEQ ID N0.1);
      下游引物:GCRV-1 -R:5’-CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ (SEQ ID N0.2);
      熒光探針:GCRV-1 -P:5,-FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3,(SEQ IDN0.3),擴(kuò)增片段159bp ;
      草魚呼腸孤病毒II型:
      上游引物:GCRV-11-F:5’ -TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’ (SEQ ID N0.4);
      下游引物:GCRV-11-R:5’ -GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’ (SEQ ID N0.5);
      熒光探針:GCRV-11-P:5’ -CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.6)擴(kuò)增片段198bp。
      [0020]用于檢測(cè)草魚呼腸孤病毒I型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM,用于檢測(cè)草魚呼腸孤病毒II型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5,淬滅基團(tuán)為BHQl。
      [0021]2、陽(yáng)性質(zhì)控品的制備
      將草魚呼腸孤病毒I型GCRV09-01株和II型GCRV-HZ08株的培養(yǎng)液進(jìn)行沸水浴30min,進(jìn)行滅活處理,滅活后的草魚呼腸孤病毒I型GCRV09-01株和II型GCRV-HZ08株的培養(yǎng)液即為陽(yáng)性質(zhì)控品。
      [0022]3、病毒RNA的提取
      按Trizol試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司,貨號(hào):15596-026)的說明書或按照QiagenRNA提取試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司,貨號(hào):74104)的說明書步驟,從感染相應(yīng)病毒的魚體內(nèi)臟組織中提取RNA,作為RT-PCR反應(yīng)的模板。
      [0023]4、雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增
      每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下,RT-PCR反應(yīng)液12.5 μ L、待檢測(cè)樣品的RNA模板5 μ L、雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液4 μ L、酶混合液I μ L、無RNA酶去離子水2.5 μ L,同樣按照上述體系設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照,加入陽(yáng)性質(zhì)控品或無RNA的去離子水 5μ L進(jìn)行擴(kuò)增。其中RT-PCR反應(yīng)液包括 500mmol/L KC1、100mmol/L Tris-HCl、1.5mmol/L MgCl2、lOmmol/L dNTPs 和 l%(v/v)TritonX-1OO0[0024]將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi),設(shè)置各檢測(cè)的名稱和熒光基團(tuán)種類(檢測(cè)GCRV-1的報(bào)告基團(tuán)選擇FAM,檢測(cè)GCRV-1I的報(bào)告基團(tuán)選擇CY5,淬滅基團(tuán)選擇BHQ1),設(shè)定反應(yīng)條件為42°C 30min,95°C 5min,然后經(jīng)95°C 8s和60°C 35s采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)。
      [0025]5、結(jié)果分析和判定
      反應(yīng)結(jié)束后,在FAM通道內(nèi),熒光曲線呈S型曲線且Ct值< 34.0,判定為草魚呼腸孤病毒I型陽(yáng)性;若無典型S型曲線或以值> 34.0,判定為草魚呼腸孤病毒I型陰性。在CY5通道內(nèi),熒光曲線呈S型曲線且Ct值< 34.0,判定為草魚呼腸孤病毒II型陽(yáng)性;若無典型S型曲線或Ct值> 34.0,判定為草魚呼腸孤病毒II型陰性。二者均為陽(yáng)性,則判斷為型草魚呼腸孤病毒I型和II共陽(yáng)型。
      [0026]根據(jù)上述檢測(cè)方法,取15份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),具體檢測(cè)結(jié)果見圖1,從圖1中可以看出,15份樣品中,檢測(cè)到I型信號(hào)的有2份,檢測(cè)到II型信號(hào)的有5份。另外,所有參與檢測(cè)的臨床樣品同時(shí)分別通過細(xì)胞分離和常規(guī)的RT-PCR方法檢測(cè),其檢測(cè)結(jié)果與本發(fā)明的雙重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)結(jié)果一致。
      [0027]6、靈敏度實(shí)驗(yàn)
      分別提取I型和II型草魚呼腸孤病毒RNA (1.0X IO8拷貝/ μ L),依次稀釋為IX 108、I X 107、1Χ 106、1Χ 105、1Χ 104、1Χ103、1.0Χ102、1Χ10 拷貝 / μ L,進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。
      [0028]雙重?zé)晒舛縋CR體系中I型草魚呼腸孤病毒檢測(cè)的靈敏度實(shí)驗(yàn)見圖2,從左到右依次為 I X 108、1Χ 107、1Χ 106、1Χ 105、1Χ104、1 Χ103、1.0Χ102、1Χ10 拷貝 / μ L 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。雙重?zé)晒舛縋CR體系中II型草魚呼腸孤病毒檢測(cè)的靈敏度實(shí)驗(yàn)見圖3,從左到右依次為 I X 108、1Χ 107、1Χ 106、1Χ 105、1Χ104、1 Χ103、1.0Χ102、1Χ10 拷貝 / μ L 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。
      [0029]檢測(cè)結(jié)果表明,本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)1.0X 10拷貝/μ L,并且Ct值隨濃度減少呈梯度改變,精確性優(yōu)于普通PCR方法,表明本發(fā)明試劑盒和檢測(cè)方法對(duì)草魚呼腸孤病毒I型/ II型的診斷具有高度的靈敏性。
      [0030]7、特異性實(shí)驗(yàn)
      為了檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的特異性,用本發(fā)明的草魚呼腸孤病毒I型/ II型雙重?zé)晒舛?RT-PCR 檢測(cè)試劑盒來檢測(cè) KHV、IHNV, LMBV, ISKNV, GCRV ΗΖ08 株、GCRV JX09-01 株和陰性對(duì)照組(無RNA去離子水),分析本試劑盒對(duì)魚類其它常見病毒和草魚呼腸孤病毒的檢測(cè)情況。
      [0031]檢測(cè)結(jié)果表明:
      FAM通道僅對(duì)I型草魚呼腸孤病毒進(jìn)行擴(kuò)增(如圖4所示),從圖4中可以看出,GCRVJX09-01株為陽(yáng)性,KHV、IHNV, LMBV, ISKNV和陰性對(duì)照組均為陰性。
      [0032]CY5通道僅對(duì)II型草魚呼腸孤病毒進(jìn)行擴(kuò)增(如圖5所示),從圖5中可以看出,GCRV ΗΖ08株為陽(yáng)性,KHV、IHNV, LMBV, ISKNV和陰性對(duì)照組均為陰性。
      [0033]當(dāng)樣本中存在草魚呼腸孤病毒I型和II型兩類病毒時(shí),F(xiàn)AM通道和CY5通道均能進(jìn)行擴(kuò)增(如圖6所示)。從圖6中可以看出,GCRV JX09-01株和GCRV ΗΖ08株為陽(yáng)性,KHV、IHNV, LMBV, ISKNV和陰性對(duì)照組均為陰性。
      [0034]上述結(jié)果說明,本發(fā)明檢測(cè)試劑盒能特異性擴(kuò)增出相對(duì)應(yīng)基因型的一種或兩種草魚呼腸孤病毒,而不與其它病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。說明本發(fā)明方法及試劑盒特異性好,未出現(xiàn)假陽(yáng)性。
      [0035]本發(fā)明的試劑盒經(jīng)過多次不同的重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí),具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
      【權(quán)利要求】
      1.一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒包括如下成分--雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液、酶混合液、RT-PCR反應(yīng)液、陽(yáng)性質(zhì)控品和無RNA酶去離子水,其特征在于:所述雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液中含有草魚呼腸孤病毒I型和II型特異性引物及雙重探針,序列分別為: 草魚呼腸孤病毒I型:
      上游引物:GCRV-1 -F:5’ -CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’ ; 下游引物:GCRV-1 -R:5’-CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ ; 熒光探針:
      GCRV-1 -P:5’ -FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3’ ; 草魚呼腸孤病毒II型:
      上游引物:GCRV-11-F:5’ -TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’ ;
      下游引物:GCRV-11-R:5’ -GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’ ; 熒光探針:
      GCRV-11-P:5’ -CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ ; 草魚呼腸孤病毒I型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM,草魚呼腸孤病毒II型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5,淬滅基團(tuán)為BHQl。`
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒,其特征在于:所述雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液的組成如下: GCRV-1 -F (100 μ Μ)5μ L GCRV-1 -R (100 μ Μ)5 μ L GCRV-1 -P (100 μ Μ)4μ L GCRV-11-F (100 μ Μ)6 μ L GCRV-11-R (100 μ Μ)6 μ L GCRV-11-P (100 μ Μ)5 μ L 無RNA酶去離子水169 μ L Total200 μ L。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒,其特征在于:所述酶混合液包括逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒,其特征在于:所述陽(yáng)性質(zhì)控品為滅活的草魚呼腸孤病毒I型GCRV09-01株和II型GCRV-HZ08株的培養(yǎng)液。
      5.一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法,其特征在于:包括以下步驟: 1)提取待測(cè)樣品中的病毒RNA; 2)以提取的RNA為模板,使用草魚呼腸孤病毒I型的 上游引物:GCRV-1 -F:5’ -CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’ ;
      下游引物:GCRV-1 -R:5’ -CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ ; 熒光探針:GCRV-1 -P:5’ -FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3’ 和草魚呼腸孤病毒II型的上游引物:GCRV-11-F:5’ -TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’ ; 下游引物:GCRV-11-R:5’ -GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’ ; 熒光探針:GCRV-11-P:5’ -CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ 進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè),其中,草魚呼腸孤病毒I型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM,草魚呼腸孤病毒II型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5,淬滅基團(tuán)為BHQl ; 3)結(jié)果分析:反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)待測(cè)樣品的熒光Ct值判斷待測(cè)樣品是否為草魚呼腸孤病毒I型、草魚呼腸孤病毒II型陽(yáng)性。
      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法,其特征在于:所述雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)體系包括病毒RNA模板、雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液、酶混合液、RT-PCR反應(yīng)液和無RNA酶去離子水。
      7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種草魚呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法,其特征在于:所述雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)條件為42°C 30min, 94~96°C 3~8min,然后經(jīng)94~96°C 7~IOs和58 ~62°C 32~38s采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)。
      【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103484568SQ201310430466
      【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
      【發(fā)明者】曾偉偉, 王慶, 吳淑勤, 王英英, 劉春 , 梁紅茹, 石存斌, 李瑩瑩 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
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