草魚(yú)呼腸孤病毒i型ii型iii型rt-lamp熒光檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于靶DNA片斷的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。該試劑盒包括病毒RNA提取試劑和RT-LAMP熒光反應(yīng)試劑，所述的RT-LAMP熒光反應(yīng)試劑中含有用于檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒I型、II型和III型的RT-LAMP擴(kuò)增用核酸引物組和熒光染料，該熒光染料為SYTO9。該試劑盒檢測(cè)特異性強(qiáng)，敏感性高，檢測(cè)時(shí)間短（最快15分鐘可出結(jié)果），具有巨大的優(yōu)勢(shì)和創(chuàng)新性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】草魚(yú)呼腸孤病毒I型I I型I I I型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于靶DNA片斷的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(reverse-transcript1n, Loop-mediated isothermal amplificat1n, RT-LAMP)技術(shù)與熒光顯色技術(shù)快速同時(shí)檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒三種基因型的試劑盒及檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]草魚(yú)出血病病毒是中國(guó)分離的第一種魚(yú)類(lèi)病毒，隸屬呼腸孤病毒科，水生動(dòng)物呼腸孤病毒屬，直徑70-80nm，20面體球形顆粒，含有11個(gè)片段的雙鏈RNA，被定名為草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus,簡(jiǎn)稱(chēng)GCRV)。不同地區(qū)存在不同的毒株。目前已報(bào)道了 10個(gè)分離株，該病毒主要引起中國(guó)淡水養(yǎng)殖主要品種草魚(yú)在魚(yú)種階段發(fā)生出血病，死亡率高達(dá)90%以上，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。目前己經(jīng)報(bào)道了近20個(gè)分離株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV HZ08、GCRV JX09-0U GCRV JX09-02、GCRV⑶10、GCRV104株等，不同分離株在基因組序列、基因組帶型、細(xì)胞病變、對(duì)草魚(yú)的致病力等方面差異較大。到目前為止，有報(bào)道的只有GCRV 873株、GCRV HZ08、GCRV⑶10和GCRV104已完成全基因組序列分析，而其它毒株只完成了部分節(jié)段或者部分序列的測(cè)序工作。草魚(yú)呼腸孤病毒比較復(fù)雜，不同分離株的各基因節(jié)段存在重配和抗原漂移現(xiàn)象，根據(jù)目前的研究，草魚(yú)呼腸孤病毒根據(jù)基因分型，至少被分為三類(lèi):基因I型(代表株為873株)，基因II型(代表株為HZ08株)，基因III型(代表株為104株)。這三個(gè)基因型的草魚(yú)呼腸孤病毒常常單獨(dú)感染草魚(yú)，也常出現(xiàn)混合感染的現(xiàn)象。
[0003]檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒的方法很多，有電鏡觀察法、細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離法、病毒核酸聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、免疫檢測(cè)法、RT-PCR方法和RT-LAMP方法等。電鏡觀察法和細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離法雖然經(jīng)典，但是操作繁瑣、花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，并且不能區(qū)分草魚(yú)呼腸孤病毒與其它病毒的感染；免疫學(xué)方法在敏感性和特異性上較差，并且存在空窗期、交叉反應(yīng)、血清型差異等問(wèn)題；RT-PCR方法，具有很大優(yōu)勢(shì)，但需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，其中用到的核酸EB染料具有致癌性，對(duì)人造成潛在安全。RT-LAMP結(jié)合熒光染料建立的方法，與其它方法相比，簡(jiǎn)化了操作程序、降低了樣品交叉污染，并且根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)弱，可在檢測(cè)過(guò)程中實(shí)時(shí)觀察結(jié)果，通常20分鐘以?xún)?nèi)就可判斷結(jié)果，在操作性和時(shí)效性上具有巨大的優(yōu)勢(shì)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒。本試劑盒包含了檢測(cè)基因I型、基因II型、基因III型的草魚(yú)呼腸孤病毒所必須的恒溫?cái)U(kuò)增引物、熒光染料和其它優(yōu)化的試劑組合。該試劑盒檢測(cè)特異性強(qiáng)，敏感性高，檢測(cè)時(shí)間短(最快15分鐘可出結(jié)果)，具有巨大的優(yōu)勢(shì)和創(chuàng)新性。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種利用草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒的方法。本方法可以在60分鐘內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中的三種基因型的草魚(yú)呼腸孤病毒。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
所述的草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒，包括熒光反應(yīng)液，反應(yīng)酶，密封液，DEPC水，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。其特征在于所述的熒光反應(yīng)液中含有用于檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型的恒溫?cái)U(kuò)增用核酸引物組和熒光染料，該引物組包含引物 GCRV1-FIP、引物 GCRV1-BIP、引物 GCRV1-F3、引物 GCRV1-B3、引物 GCRV1-LF、引物GCRV1-LB、弓 | 物 GCRV2-FIP、弓 | 物 GCRV2-BIP、弓 | 物 GCRV2-F3、弓 | 物 GCRV2-B3、弓 | 物 GCRV2-LF、引物 GCRV2-LB、引物 GCRV3-FIP、引物 GCRV3-BIP、引物 GCRV3-F3、引物 GCRV3-B3、引物GCRV3-LF、引物 GCRV3-LB ；
所述的引物GCRV1-FIP序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的引物GCRV1-BIP序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的引物GCRV1-F3序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的引物GCRV1-B3序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的引物GCRV1-LF序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的引物GCRV1-LB序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的引物GCRV2-FIP序列如SEQ ID NO:7所示；
所述的引物GCRV2-BIP序列如SEQ ID NO:8所示；
所述的引物GCRV2-F3序列如SEQ ID NO:9所示；
所述的引物GCRV2-B3序列如SEQ ID NO:10所示；
所述的引物GCRV2-LF序列如SEQ ID NO:11所示；
所述的引物GCRV2-LB序列如SEQ ID NO:12所示；
所述的引物GCRV3-FIP序列如SEQ ID NO:13所示；
所述的引物GCRV3-BIP序列如SEQ ID NO:14所示；
所述的引物GCRV3-F3序列如SEQ ID NO:15所示；
所述的引物GCRV3-B3序列如SEQ ID NO:16所示；
所述的引物GCRV3-LF序列如SEQ ID NO:17所示；
所述的引物GCRV3-LB序列如SEQ ID NO:18所示；
所述的草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP熒光反應(yīng)試劑包括以下組分:
1)熒光反應(yīng)液:38?42mMpH為8.5?9.0的Tris_HCl、9?llmM硫酸鎂、19?21mM 氯化鉀、19 ?21mM 硫酸按、0.2% Triton Χ_100、2.6 ?2.8 mM dNTP、1.4 ?1.6Μ甜菜堿、0.05 ?0.ΙμΜ SYT0 9、3.0 ?3.2 μ Μ 引物 GCRV1_FIP、3.0 ?3.2 μ Μ 引物GCRV1-BIP.3.0 ?3.2 μ Μ 弓丨物 GCRV2_FIP、3.0 ?3.2 μ Μ 弓丨物 GCRV2_BIP、3.0 ?3.2 μ Μ 弓|物 GCRV3-FIP、3.0 ?3.2 μ M 引物 GCRV3_BIP、0.3 ?0.5 μ Μ 引物 GCRV1_F3、0.3 ?0.5 μ Μ引物 GCRV1-B3、0.3 ?0.5 μ Μ 引物 GCRV2_F3、0.3 ?0.5 μ Μ 引物 GCRV2_B3、0.3 ?0.5 μ Μ引物 GCRV3-F3、0.3 ?0.5 μ Μ 引物 GCRV3-B3、1.4 ?1.6 μ Μ 引物 GCRV1-LF、1.4 ?1.6μΜ引物 GCRV1-LBU.4 ?1.6 μ Μ 引物 GCRV2-LF、1.4 ?1.6 μ Μ 引物 GCRV2-LB、1.4 ?1.6μΜ引物 GCRV3-LF 和 1.4 ?1.6 μ Μ 引物 GCRV3-LB ；
2)反應(yīng)酶:每1.5 μ L含8個(gè)活性單位的Bst聚合酶和5個(gè)活性單位的AMV反轉(zhuǎn)錄酶； 3)密封液:無(wú)核酸酶的液體石蠟油。
[0007]所述的病毒RNA提取試劑包含以下組分:含有5?15 mM Tris、120?150 mMNaCU0.6 ?1% NP-40、0.1 ?0.2% SDS,3 ?5mol/L 異硫氰酸胍、1%β _ 巰基乙醇，pH 8.0的裂解液；異丙醇，濃度100% ;異丙醇，濃度55% ;乙醇，濃度70%。
[0008]所述的草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)的方法，其特征在于包括以下工藝步驟:
1)RNA抽提:取草魚(yú)內(nèi)臟組織0.03?0.05g或草魚(yú)培養(yǎng)細(xì)胞，采用病毒RNA提取試劑樣品中的總RNA ；
2)草魚(yú)呼腸孤病毒的RT-LAMP熒光擴(kuò)增:
①根據(jù)待檢測(cè)RNA的數(shù)目，設(shè)置所需RT-LAMP反應(yīng)管數(shù)N，N=樣品數(shù)+2，其中I管為陽(yáng)性對(duì)照，I管為陰性對(duì)照；
②吸取所述的熒光反應(yīng)液體積為NX12.5 μ L,加入一潔凈的1.5mL離心管中,然后加入NX 1.5 μ L反應(yīng)酶和ΝΧ6 μ L去離子水，混合均勻，1500?2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上清之混合液；
③向設(shè)定的N個(gè)RT-LAMP反應(yīng)管中分別加入20uL步驟②得到的混合液，得到N個(gè)RT-LAMP反應(yīng)管，向上述N個(gè)RT-LAMP反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對(duì)照、待檢RNA模板和陽(yáng)性對(duì)照各5uL ；
④在上述步驟③得到的反應(yīng)管中再分別加入20uL密封液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒；
⑤在帶熒光檢測(cè)的反應(yīng)儀(熒光定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀)中63°C下反應(yīng)60分鐘，實(shí)時(shí)查看熒光值。
[0009]所述的LAMP檢測(cè)試劑盒還具有陽(yáng)性對(duì)照試樣和陰性對(duì)照試樣，所述陽(yáng)性對(duì)照試樣為草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RNA混合物，所述的陰性對(duì)照試樣為無(wú)核酸酶的去離子水。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
(1)本發(fā)明根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)了草魚(yú)呼腸孤病毒檢測(cè)用引物組，能特異性識(shí)別草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型靶序列上的八個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶和BstDNA聚合酶的作用下啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和鏈置換反應(yīng)，在祀標(biāo)區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖一環(huán)DNA混合物，由于LAMP技術(shù)只有在四條引物完全識(shí)別靶序列六個(gè)結(jié)合區(qū)的情況下才能順利進(jìn)行，所以本發(fā)明的引物組在很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)的背景影響，大大增強(qiáng)了草魚(yú)呼腸孤病毒檢測(cè)的特異性；
(2)采用本發(fā)明的引物組能同時(shí)對(duì)基因I型II型III型的草魚(yú)呼腸孤病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合核酸熒光染料的使用，可以在出現(xiàn)微量擴(kuò)增的情況下，就能通過(guò)熒光檢測(cè)器檢出熒光信號(hào)，因?yàn)樘禺愋院挽`敏度高，所以可以根據(jù)熒光值的變化就能判斷病毒核酸的存在與否；
(3)本發(fā)明的快速診斷試劑盒是利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒，檢測(cè)靈敏度高；
(4)本發(fā)明的快速診斷試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到Ih即可完成擴(kuò)增，且能通過(guò)熒光檢測(cè)儀實(shí)時(shí)觀察結(jié)果，最快17分鐘就可以判斷檢測(cè)結(jié)果； (5)本發(fā)明的快速診斷試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀，可通過(guò)肉眼觀察鑒定。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1試劑盒對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒RNA熒光擴(kuò)增測(cè)試圖；
A1:基因I型草魚(yú)呼腸孤病毒RNA ； A2:基因II型草魚(yú)呼腸孤病毒RNA ； A3:基因III型草魚(yú)呼腸孤病毒RNA ；A4:陰性對(duì)照。
[0012]圖2試劑盒對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA熒光擴(kuò)增測(cè)試圖；
A1:基因I型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA ； A2:基因II型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA ； A3:基因III型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA ； A4:基因I型和II型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA混合物；A5:基因I型和III型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA混合物；A6:基因II型和III型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA混合物；A7:基因I型、II型和III型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA混合物；A8:陰性對(duì)照。
[0013]圖3試劑盒對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA熒光擴(kuò)增測(cè)試電泳圖；
M:DL1000 Marker ； 1:基因I型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA ； 2:基因II型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA ； 3:基因III型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA ； 4:基因I型和II型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA混合物；5:基因I型和III型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA混合物；6:基因II型和III型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA混合物；7:基因I型、II型和III型草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA混合物；N:陰性對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0014]以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0015]實(shí)施例1
1)用RNA提取試劑抽提RNA:
取草魚(yú)脾臟或肝臟或腎臟組織0.03?0.05g,于冰上離心管中用研磨棒研磨，加600μ L 裂解液(裂解液含有 5 ?15 mM Tris、120 ?150 mM NaCl、0.6?l% ΝΡ_40、0.1 ?0.2%SDS、3?5mol/L異硫氰酸胍、1%β-巰基乙醇，pH 8.0)后，繼續(xù)研磨充分后，室溫靜置10分鐘，然后加入900 μ L的異丙醇混勻，室溫5分鐘，之后llOOOg離心10分鐘，去除上清液，沉淀中加入800 μ L百分比濃度為50%的冷異丙醇，llOOOg離心3分鐘，去除上清液，沉淀用70%乙醇洗漆2次，室溫干燥5?lOmin后以30 μ L去離子水重懸。
[0016]2)草魚(yú)呼腸孤病毒的RT-LAMP熒光擴(kuò)增:
根據(jù)待檢測(cè)RNA的數(shù)目，設(shè)置所需RT-LAMP反應(yīng)管數(shù)Ν，Ν=樣品數(shù)+2，其中1管為陽(yáng)性對(duì)照，1管為陰性對(duì)照；吸取所述的熒光反應(yīng)液(熒光反應(yīng)液含有38?42mM pH為8.5?9.0的 Tris-HCl、9 ?llmM 硫酸鎂、19 ?21mM 氯化鉀、19 ?21mM硫酸按、0.2% Triton X-100、
2.6 ?2.8 mM dNTP、1.4 ?1.6 Μ 甜菜堿、0.05 ?0.1 μ M SYT0 9、3.0 ?3.2 μ Μ 引物GCRV1-FIP、3.0 ?3.2 μ Μ 弓丨物 GCRV1_BIP、3.0 ?3.2 μ Μ 弓丨物 GCRV2_FIP、3.0 ?3.2 μ Μ 弓|物 GCRV2-BIP、3.0 ?3.2 μ M 引物 GCRV3_FIP、3.0 ?3.2 μ Μ 引物 GCRV3_BIP、0.3 ?0.5 μ Μ引物 GCRV1-F3、0.3 ?0.5 μ Μ 引物 GCRV1_B3、0.3 ?0.5 μ Μ 引物 GCRV2_F3、0.3 ?0.5 μ Μ引物 GCRV2-B3、0.3 ?0.5 μ Μ 弓I物 GCRV3_F3、0.3 ?0.5 μ M 弓|物 GCRV3-B3U.4 ?1.6 μ Μ引物GCRV1-LF、1.4 ?1.6 μ Μ 引物 GCRV1-LB、1.4 ?1.6 μ Μ 引物 GCRV2-LF、1.4 ?1.6 μ Μ 弓I物GCRV2-LB、1.4 ?1.6yM$*GCRV3-1i^P 1.4 ?1.6 μ M 引物GCRV3-LB)體積為 NX 12.5μ L,加入一潔凈的1.5mL離心管中，然后加入NX 1.5 μ L反應(yīng)酶和ΝΧ6 μ L去離子水,混合均勻，1500?2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，得到NX 20 μ L的預(yù)混液，再分別向設(shè)定的N個(gè)RT-LAMP反應(yīng)管中加入20 uL預(yù)混液，得到N個(gè)RT-LAMP反應(yīng)管，向上述N個(gè)RT-LAMP反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對(duì)照、待檢RNA模板和陽(yáng)性對(duì)照各5uL ;然后在每個(gè)反應(yīng)管中再分別加入20 uL由液體石蠟油組成的密封液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記,2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；在63°C下恒溫反應(yīng)60分鐘，實(shí)時(shí)查看熒光值，當(dāng)熒光值短時(shí)段出現(xiàn)較大上升時(shí)，判斷為陽(yáng)性。反應(yīng)結(jié)束后也可用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外分析儀下觀察，可發(fā)現(xiàn)階梯狀的擴(kuò)增特征條帶，說(shuō)明樣品中有草魚(yú)呼腸孤病毒。
[0017]實(shí)施例1中RNA提取試劑的裂解液也可以采用含8?12 mM Tris、120?150 mMNaCU0.8 ?1% NP-40、0.1 ?0.15% SDS,4 ?5mol/L 異硫氰酸胍、1% β -巰基乙醇，pH 8.0的裂解液；或采用含 5 ?15 mM Tris、130 ?150 mM NaCU0.6 ?1% ΝΡ_40、0.15 ?0.2%SDS,3?5mol/L異硫氰酸胍、1%β -巰基乙醇，pH 8.0的裂解液。
[0018]實(shí)施例1中RT-LAMP熒光反應(yīng)試劑的熒光反應(yīng)液也可以采用含有38?42mM pH為8.5?9.0的Tris-HClUO?IlmM硫酸鎂、19?21mM氯化鉀、19?21mM硫酸按、0.2%Triton Χ_100、2.6 ?2.8 mM dNTP、1.5?1.6 M 甜菜堿、0.03 ?0.1 μ M SYTO 9、3.0 ?3.2μ M 引物 GCRV1-FIP、3.0 ?3.2 μ M 引物 GCRV1_BIP、3.0 ?3.2 μ M 引物 GCRV2-FIP、3.0 ?3.2μΜ 引物 GCRV2-BIP、3.0 ?3.2μΜ 引物 GCRV3_FIP、3.0 ?3.2 μ M 引物GCRV3-BIP、0.3 ?0.5 μ M 引物 GCRV1-F3、0.3 ?0.5 μ M 引物 GCRV1-B3、0.3 ?0.5 μ M 引物GCRV2-F3、0.3 ?0.5 μ M 引物 GCRV2_B3、0.3 ?0.5 μ M 引物 GCRV3_F3、0.3 ?0.5μΜ 引物GCRV3-B3、1.4 ?1.6 μ M 弓I物 GCRV1-LF, 1.4 ?1.6 μ M 引物 GCRV1-LB、1.4 ?1.6 μ M 引物GCRV2-LF、1.4 ?1.6 μ M 引物 GCRV2-LB、1.4 ?1.6 μ M 引物 GCRV3-LF 和 1.4 ?1.6μ M 弓丨物GCRV3-LB的熒光反應(yīng)液。
[0019]上述的引物GCRV1-FIP序列如SEQ ID NO:1所示；上述的引物GCRV1-BIP序列如SEQ ID NO:2所示；上述的引物GCRV1-F3序列如SEQ ID NO:3所示；上述的引物GCRV1-B3序列如SEQ ID NO:4所示；上述的引物GCRVl-LF序列如SEQ ID NO:5所示；上述的引物GCRVl-LB序列如SEQ ID NO:6所示；上述的引物GCRV2-FIP序列如SEQ ID NO:7所示；上述的引物GCRV2-BIP序列如SEQ ID NO:8所示；上述的引物GCRV2-F3序列如SEQ ID NO:9所示；上述的引物GCRV2-B3序列如SEQ ID NO:10所示；上述的引物GCRV2-LF序列如SEQID NO:11 所示；
上述的引物GCRV2-LB序列如SEQ ID NO:12所示；上述的引物GCRV3-FIP序列如SEQID NO:13所示；上述的引物GCRV3-BIP序列如SEQ ID NO:14所示；上述的引物GCRV3-F3序列如SEQ ID NO:15所示；上述的引物GCRV3-B3序列如SEQ ID NO: 16所示；上述的引物GCRV3-LF序列如SEQ ID NO:17所示；上述的引物GCRV3-LB序列如SEQ ID NO:18所示。
[0020]采用上述快速診斷試劑盒和方法進(jìn)行RT-LAMP熒光法檢測(cè)三種基因型的草魚(yú)呼腸孤病毒RNA和cDNA，試驗(yàn)結(jié)果如附圖1、2和3所示。
[0021]圖1試劑盒對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒RNA熒光擴(kuò)增測(cè)試圖，如圖所示，三種基因型的草魚(yú)呼腸孤病毒RNA，在25分鐘以?xún)?nèi)就可以檢測(cè)到陽(yáng)性熒光峰圖，陰性對(duì)照在60分鐘之內(nèi)未出熒光峰。
[0022]圖2試劑盒對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA熒光擴(kuò)增測(cè)試圖，如圖所示，三種基因型的草魚(yú)呼腸孤病毒單獨(dú)或不同組合的cDNA，在6.5?13分鐘就可以檢測(cè)出所有樣品的熒光峰圖，陰性對(duì)照在50分鐘之內(nèi)未出熒光峰。
[0023]圖3試劑盒對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒cDNA熒光擴(kuò)增測(cè)試電泳圖，如圖所示，三種基因型的草魚(yú)呼腸孤病毒單獨(dú)或不同組合的cDNA，反應(yīng)50分鐘后都出現(xiàn)典型的階梯狀擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照在50分鐘之內(nèi)都未見(jiàn)擴(kuò)增條帶。
【權(quán)利要求】
1.草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒，包括病毒RNA提取試劑和RT-LAMP熒光反應(yīng)試劑，其特征在于所述的RT-LAMP熒光反應(yīng)試劑中含有用于檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒I型、II型和III型的RT-LAMP擴(kuò)增用核酸引物組和熒光染料，該熒光染料為SYTO 9，該引物組包含引物GCRV1-FIP、引物GCRV1-B IP、引物GCRV1-F3、引物GCRV1-B3、引物 GCRV1-LF、引物 GCRV1-LB、引物 GCRV2-FIP、引物 GCRV2-BIP、引物 GCRV2-F3、引物GCRV2-B3、弓I物 GCRV2-LF、弓I物 GCRV2-LB、弓I物 GCRV3-FIP、弓I物 GCRV3-BIP、弓I物 GCRV3-F3、弓 I 物 GCRV3-B3、引物 GCRV3-LF、弓 I 物 GCRV3-LB ； 所述的引物GCRV1-FIP序列如SEQ ID NO:1所示； 所述的引物GCRV1-BIP序列如SEQ ID NO:2所示； 所述的引物GCRV1-F3序列如SEQ ID NO:3所示； 所述的引物GCRV1-B3序列如SEQ ID NO:4所示； 所述的引物GCRVl-LF序列如SEQ ID NO:5所示； 所述的引物GCRVl-LB序列如SEQ ID NO:6所示； 所述的引物GCRV2-FIP序列如SEQ ID NO:7所示； 所述的引物GCRV2-BIP序列如SEQ ID NO:8所示； 所述的引物GCRV2-F3序列如SEQ ID NO:9所示； 所述的引物GCRV2-B3序列如SEQ ID NO:10所示； 所述的引物GCRV2-LF序列如SEQ ID NO:11所示； 所述的引物GCRV2-LB序列如SEQ ID NO:12所示； 所述的引物GCRV3-FIP序列如SEQ ID NO:13所示； 所述的引物GCRV3-BIP序列如SEQ ID NO:14所示； 所述的引物GCRV3-F3序列如SEQ ID NO:15所示； 所述的引物GCRV3-B3序列如SEQ ID NO:16所示； 所述的引物GCRV3-LF序列如SEQ ID NO:17所示； 所述的引物GCRV3-LB序列如SEQ ID N0:18所示。
2.如權(quán)利要求1所述的草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP熒光反應(yīng)試劑包括以下組分: 1)熒光反應(yīng)液:38?42mMpH為8.5?9.0的Tris_HCl、9?IlmM硫酸鎂、19?21mM 氯化鉀、19 ?21mM 硫酸按、0.2% Triton Χ_100、2.6 ?2.8 mM dNTP、1.4?1.6M甜菜堿、0.05 ?0.1 μΜ SYTO 9、3.0 ?3.2 μ M 引物 GCRV1_FIP、3.0 ?3.2 μ M 引物GCRV1-BIP、3.0 ?3.2 μ M 弓丨物 GCRV2_FIP、3.0 ?3.2 μ M 弓丨物 GCRV2_BIP、3.0 ?3.2 μ M 弓I物 GCRV3-FIP、3.0 ?3.2 μ M 引物 GCRV3_BIP、0.3 ?0.5 μ M 引物 GCRV1_F3、0.3 ?0.5 μ M引物 GCRV1-B3、0.3 ?0.5 μ M 引物 GCRV2_F3、0.3 ?0.5 μ M 引物 GCRV2_B3、0.3 ?0.5 μ M引物 GCRV3-F3、0.3 ?0.5 μ M 引物 GCRV3-B3、1.4 ?1.6 μ M 引物 GCRV1-LF、1.4 ?1.6μΜ引物 GCRV1-LB、1.4 ?1.6 μ M 引物 GCRV2-LF、1.4 ?1.6 μ M 引物 GCRV2-LB、1.4 ?1.6μΜ引物 GCRV3-LF 和 1.4 ?1.6 μ M 引物 GCRV3-LB ； 2)反應(yīng)酶:每1.5 μ L含8個(gè)活性單位的Bst DNA聚合酶和5個(gè)活性單位的AMV反轉(zhuǎn)錄酶； 3)密封液:由礦物油或液體石蠟油組成。
3.如權(quán)利要求1所述的草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的病毒RNA提取試劑包含以下組分:含有5?15 mM Tris、120?150 mMNaCU0.6 ?1% NP-40、0.1 ?0.2% SDS,3 ?5mol/L 異硫氰酸胍、1%β _ 巰基乙醇，pH 8.0的裂解液；異丙醇，濃度100% ;異丙醇，濃度55% ;乙醇，濃度70%。
4.如權(quán)利要求1所述的草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RT-LAMP熒光檢測(cè)試劑盒，其特征是還具有陽(yáng)性對(duì)照試樣和陰性對(duì)照試樣，所述陽(yáng)性對(duì)照試樣為草魚(yú)呼腸孤病毒I型II型III型RNA混合物，所述的陰性對(duì)照試樣為無(wú)核酸酶的去離子水。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK104450962SQ201410684920
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】沈錦玉, 潘曉藝, 郝貴杰, 袁雪梅, 藺凌云, 姚嘉赟, 徐洋, 尹文林 申請(qǐng)人:浙江省淡水水產(chǎn)研究所