專利名稱：用于轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)類胡蘿卜素的相關(guān)基因的合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域中的植物生物反應(yīng)器，更具體地說是通過化學(xué)合成的方法合成能在植物體內(nèi)生產(chǎn)類胡蘿卜素的6個相關(guān)基因。
類胡蘿卜素是重要的天然色素，廣泛存在動物和植物體內(nèi)，自目前為止有600多種類胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)，其顏色從黃色至橙紅色，長期用來修飾食品的顏色。隨著對類胡蘿卜素化學(xué)結(jié)構(gòu)的了解，類胡蘿卜素的功能逐漸被挖掘。
類胡蘿卜素具有抗氧化功能。在類胡蘿卜素化學(xué)結(jié)構(gòu)中有9-11個共軛雙鍵，能夠與自由基結(jié)合。避免細(xì)胞的氧化損害累積到一定程度后造成細(xì)胞老化甚至死亡。類胡蘿卜素具有抗癌變作用。在研究蝦青素等類胡蘿卜素對黃曲霉毒素引發(fā)肝癌的影響中發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素可以降低肝癌病灶的數(shù)目和大小。類胡蘿卜素具有增強(qiáng)機(jī)體免疫作用。蝦青素等類胡蘿卜素能夠刺激抗體的產(chǎn)生(劉子貽，1997，中國海洋藥物)。
類胡蘿卜素眾多功能的發(fā)現(xiàn)，大大增加了市場上對該類化合物的需求。僅蝦青素一種，每年的需求額即超過一億美元(梁世中，2000，食品與發(fā)酵工業(yè))。目前大部分類胡蘿卜素化合物是通過化學(xué)合成獲得，需要很高的成本和資源(Johnson EA，1995，Adv Biochem Eng Biotechnol)。通過大面積培養(yǎng)杜氏耐鹽藻生物也可獲得大量的類胡蘿卜素，但是這種藻類只能在干旱的地區(qū)養(yǎng)殖，對水質(zhì)、環(huán)境及光的要求很高(鄭曉東，2000，浙江大學(xué)學(xué)報(bào))。蝦青素等類胡蘿卜素化合物還可以直接從甲科類動物中提取，但是含量很低，不適合大量生產(chǎn)(中國飼料行業(yè)信息網(wǎng))。利用微生物生產(chǎn)蝦青素等類胡蘿卜素化合物成了近些年研究的重點(diǎn)，其中以紅法夫酵母菌研究最多，該菌具有作為色素生物來源的一些必要特征快速異氧代謝，培養(yǎng)時間短，能夠在發(fā)酵罐中實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵。雖然這類微生物具有很大的開發(fā)潛力，但目前普遍存在產(chǎn)量低的缺陷，還未能進(jìn)行大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)(王菊芳，2000，生物工程進(jìn)展)。
利用基因工程技術(shù)，將合成蝦青素等類胡蘿卜素的關(guān)鍵酶基因克隆并改造，利用合適的啟動子進(jìn)行調(diào)控，將這些基因同時轉(zhuǎn)化到細(xì)菌、酵母以及植物中，實(shí)現(xiàn)蝦青素等類胡蘿卜素化合物的高效表達(dá)，將能滿足迅速發(fā)展的市場對這些產(chǎn)品的巨大需求。其中以培育能大量生產(chǎn)β-胡蘿卜素和蝦青素的植物更具社會價(jià)值和市場價(jià)值。以水稻、甘藍(lán)和油菜等作物作為材料生產(chǎn)的金色水稻、金色甘藍(lán)和金色油菜，將成為人類健康的風(fēng)景線。
從糖酵解產(chǎn)物乙酰輔酶A開始合成β-胡蘿卜素需要一系列酶催化。大多數(shù)生物要經(jīng)過乙酰輔酶A到法呢基焦磷酸(FPP)階段，F(xiàn)PP在不同的酶作用下，合成麥角固醇或β-胡蘿卜素。從FPP到β-胡蘿卜素需要四種酶參與。法呢基焦磷酸(FPP)在垅牛兒基垅牛兒基焦磷酸合成酶(CrtE)催化下合成垅牛兒基垅牛兒基焦磷酸(GGPP)，GGPP在八氫番茄紅素合成酶(CrtB)作用下產(chǎn)生八氫番茄紅素，之后在八氫番茄紅素去飽和酶(CrtI)作用下逐漸形成番茄紅素，最后在番茄紅素β環(huán)化酶(CrtY)催化下，番茄紅素合成β-胡蘿卜素。蝦青素是β-胡蘿卜素合成的終止點(diǎn)，由β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)槲r青素需要加上兩個酮基和羥基，體外合成比較困難。但是在生物體內(nèi)只需在兩個酶的催化下即能由β-胡蘿卜素合成蝦青素。β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ)和β-胡蘿卜素酮酶(CrtW)能夠在β-胡蘿卜素的C3\C3’和C4\C4’位置上加上羥基和酮基，形成蝦青素(Claudia SD，2000，EnviromentalBiotechnology)。
至目前為止，分別從細(xì)菌、植物、藻類和真菌中克隆了近150個與類胡蘿卜素合成有關(guān)的基因(Hirschberg J，1997，Purelity Applied Chemical)。這些功能相近的基因在核苷酸水平上差異很大。一方面，這些基因能夠根據(jù)功能組合在一起，轉(zhuǎn)化到不同的微生物或植物中，生產(chǎn)出各種各樣的類胡蘿卜素產(chǎn)品(Misawa N，1998，Applied and Environmental Microbiology)。另一方面，基因的差異給植物生產(chǎn)類胡蘿卜素產(chǎn)品提供了保證，外源基因的轉(zhuǎn)化不能改變植物中同功能基因的功能，造成基因沉默現(xiàn)象，相反能夠加強(qiáng)類似基因的功能，提高產(chǎn)品的產(chǎn)量(Hirschberg J，2000，Nature Biotechnology)。
本發(fā)明以副球菌(Pracoccus marcusii)在蝦青素合成中相關(guān)的6種酶的氨基酸為模板(ncbi.nlm.nih.gov80)，根據(jù)植物偏愛密碼，化學(xué)合成這些基因。這6個基因分別為垅牛兒基垅牛兒基焦磷酸合成酶基因(crtE)；八氫番茄紅素合成酶基因(crtB)；八氫番茄紅素去飽和酶基因(crtI)；番茄紅素β環(huán)化酶基因(crtY)；β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)和β-胡蘿卜素酮酶基因(crtW)。
大多數(shù)類胡蘿卜素合成酶基因(crt)曾在大腸桿菌中克隆并表達(dá)，但是大腸桿菌中類胡蘿卜素產(chǎn)量極低(每克細(xì)胞干重僅有10-500微克)；將類胡蘿卜素合成酶基因轉(zhuǎn)化酵母，能獲得較高的產(chǎn)量(每克細(xì)胞干重含有0.4毫克)，相當(dāng)于紅法夫酵母中產(chǎn)生的蝦青素含量(Johnson EA，1995，Adv BiochemEng Biotechnol)。然而，大多數(shù)酵母在類胡蘿卜素合成過程中，很容易進(jìn)行另外一條代謝途徑，產(chǎn)生麥角固醇，從而使類胡蘿卜素的產(chǎn)量減低(BalleyJE，1991，Science)。利用植物生產(chǎn)蝦青素等類胡蘿卜素物質(zhì)具有很多優(yōu)點(diǎn)(1)成本低；(2)安全；(3)穩(wěn)定，能夠遺傳，在后代表達(dá)。
正因?yàn)橐灾参锷a(chǎn)類胡蘿卜素具有極誘人的發(fā)展前景，國際上很多實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行這方面的研究工作，并在煙草、番茄、水稻中成功地合成了β-胡蘿卜素物質(zhì)，使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量大幅度提高提高(NormileD，2000，Science)。這些研究工作有力地證明了植物在開發(fā)類胡蘿卜素化合物中有巨大的發(fā)展?jié)摿?。為了提高這類化合物的產(chǎn)量，我們根據(jù)植物偏愛密碼設(shè)計(jì)了合成蝦青素的6個基因。
國內(nèi)至今還沒有利用基因工程方法生產(chǎn)蝦青素的報(bào)道，國外曾在食用酵母(Candida utilis)中利用上述6個基因生產(chǎn)蝦青素獲得成功(MisawaN，1998，Applied and Environmental Microbiology)，在植物中合成蝦青素也有成功報(bào)道，但是合成過程中的中間產(chǎn)物是植物自身產(chǎn)生的β-胡蘿卜素，由于β-胡蘿卜素在植物中的含量很低，蝦青素的含量也很低(BramleyPM，2000，Nature Biotechnology)。
本發(fā)明的目的是利用重疊延伸PCR擴(kuò)增技術(shù)以crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ、crtW六個基因?yàn)槟０?，合成具有植物偏愛密碼的蝦青素合成相關(guān)基因。
本發(fā)明的另一目的是將合成的基因在植物中表達(dá)，生產(chǎn)蝦青素等類胡蘿卜素物質(zhì)。
本發(fā)明的再一目的為利用合成的基因來改良糧食作物以及蔬菜的品質(zhì)，以制備有利于人們身體健康的保健食品。
本發(fā)明采用如下的方法實(shí)施本發(fā)明根據(jù)植物偏愛密碼重新設(shè)計(jì)副球菌中β胡蘿卜素酮酶基因(CrtW)和番茄紅素β環(huán)化酶基因(crtY)的核苷酸序列，并組成聯(lián)合基因CrtWcrtY。
CrtWcrtY基因的合成采用重疊延伸PCR方法，結(jié)合高保真的耐高溫聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；蛟诖竽c桿菌中克隆并測定核苷酸序列，從起始密碼ATG到終止密碼TAA長度為1997bp核苷酸。在基因的726～786位置處插入上一段自動切割序列CAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCA。
全合成的crtWcrtY基因的核苷酸和氨基酸序列如下ATGTCCGCACACGCACTCCCAAAAGCAGACCTCACCGCAACCTCCCTCATCGTCTCCGGTGGTATCATCGCA-- 72M S A H A L P K A D L T A T S L I V S G G I I AGCATGGCTCGCACTCCACGTCCACGCACTCTGGTTCCTCGACGCAGCAGCACACCCAATCCTCGCAGTCGCA--144A W L A L H V H A L W F L D A A A H P I L A V AAACTTCCTCGGTCTCACCTGGCTCTCCGTCGGTCTCTTCATCATCGCACACGACGCAATGCACGGTTCCGTC--216N F L G L T W L S V G L F I I A H D A M H G S VGTCCCAGGTAGACCAAGAGCAAACGCAGCAATGGGTCAACTCGTCCTCTGGCTCTACGCAGGTTTCTCCTGG--288V P G R P R A N A A M G Q L V L W L Y A G F S WAGAAAGATGATCGTCAAGCACATGGCACACCACAGACACGCAGGTACTGACGACGACCCAGACTTCGACCAC--360R K M I V K H M A H H R H A G T D D D P D F D HGGTGGTCCAGTCAGATGGTACGCAAGATTCATCGGTACTTACTTCGGTTGGAGAGAAGGTCTCCTCCTCCCA--432G G P V R W Y A R F I G T Y F G W R E G L L L PGTCATCGTCACCGTCTACGCACTCATCCTCGGTGACAGATGGATGTACGTCGTCTTCTGGCCACTCCCATCC--504V I V T V Y A L I L G D R W M Y V V F W P L P SATCCTCGCATCCATCCAACTCTTCGTCTTCGGCACCTGGCTCCCACACAGACCAGGTCACGACGCATTCCCA--576I L A S I Q L F V F G T W L P H R P G H D A F PGACAGACACAACGCAAGATCCTCCAGAATCTCCGACCCAGTCTCCCTCCTCACCTGCTTCCACTTCGGTGGC--648D R H N A R S S R I S D P V S L L T C F H F G GTACCACCACGAACACCACCTCCACCCAACCGTCCCTTGGTGGAGACTCCCATCCACCAGAACCAAAGGCGAC--720Y H H E H H L H P T V P W W R L P S T R T K G DACCGCACAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCAATGACC--792T A Q L L N F D L L K L A G D V E S N P G P M TCACGACGTCCTCCTCGCAGGTGCAGGTCTCGCAAACGGTCTCATCGCACTCGCACTCAGAGCAGCAAGACCA--864H D V L L A G A G L A N G L I A L A L R A A R PGACCTCAGAGTCCTCCTCCTCGACCACGCAGCAGGTCCATCCGAAGGTCACACCTGGTCCTGCCACGACCCA--936D L R V L L L D H A A G P S E G H T W S C H D PGACCTCTCCCCACACTGGCTCGCAAGACTCAAGCCACTCAGAAGAGCAAACTGGCCAGACCAAGAAGTCAGA-1008D L S P H W L A R L K P L R R A N W P D Q E V RTTCCCAAGACACGCAAGAAGACTCGCAACCGGCTACGGCTCCCTCGACGGTGCAGCACTCGCAGACGCAGTC-1080F P R H A R R L A T G Y G S L D G A A L A D A VGTCAGATCCGGTGCAGAAATCAGATGGGACTCCGACATCGCACTCCTCGACGCACAAGGTGCAACCCTCTCC-1152V R S G A E I R W D S D I A L L D A Q G A T L STGCGGTACTAGAATCGAAGCAGGCTCCGTCCTCGACGGCAGAGGCCCACACCCATCCAGACACCTCACCCTC-1224C G T R I E A G S V L D G R G P H P S R H L T LGGCTTCCACAAGTTCCTCGGTGTCGAAATCGAAACCGACAGACCACACGGTGTCCCAAGACCAGTCATCATG-1296
G F H K F L G V E I E T D R P H G V P R P V I MGACGGCACCGTCACCCAAAGAGACGGCTACGGCTTCATCTACCTCCTCCCATTCTCCAGAACCAGAATCCTC-1368D G T V T Q R D G Y G F I Y L L P F S R T R I LATCGAAGACACCAGATACTCCGACGGCGGCGACCTCGACGACGACGCACTCGCAGCAGCATCCCAAGACTAC-1440I E D T R Y S D G G D L D D D A L A A A S Q D YGCAAGACAACAAGGCTGGACCGGTGCAGAAGTCAGAAGAGAAAGAGGCATCCTCCCAATCGCACTCGCACAC-1512A R Q Q G W T G A E V R R E R G I L P I A L A HGACGCAGCAGGTTTCTGGGCAGACCACGCAGAAGGTCCAGTCCCAGTCGGTCTCAGAGCAGGCTTCTTCCAC-1584D A A G F W A D H A E G P V P V G L R A G F F HCCAGTCACCGGCTACTCCCTCCCATACGCAGCACAAGTCGCAGACGTCGTCGCAGGTCTCTCCGGTCCACCA-1556P V T G Y S L P Y A A Q V A D V V A G L S G P PGGCACCGACGCACTCAGAGGTGCAATCAGAGACTACGCAATCGACAGAGCAAGAAGAGACAGATTCCTCAGA-1728G T D A L R G A I R D Y A I D R A R R D R F L RCTCCTCAACAGAATGCTCTTCAGAGGCTGCGCACCAGACAGAAGATACACCCTCCTCCAAAGACTCTACAGA-1800L L N R M L F R G C A P D R R Y T L L Q R L Y RATGCCACACGGTCTCATCGAAAGATTCTACGCAGGTAGACTCTCCGTCGCAGACCAACTCAGAATCGTCACC-1872M P H G L I E R F Y A G R L S V A D Q L R I V TGGCAAGCCACCAATCCCACTCGGCACCGCAATCAGATGCCTCCCAGAAAGACCACTCCTCAAGGAAAACGCA-1994G K P P I P L G T A I R C L P E R P L L K E N A根據(jù)植物偏愛密碼重新設(shè)計(jì)副球菌中八氫番茄紅素去飽和酶基因(crtZ)和β胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ))的核苷酸序列，并組合成聯(lián)合基因CrtIcrtZ。
CrtIcrtZ基因的合成采用重疊延伸PCR方法，結(jié)合高保真的耐高溫聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。基因在大腸桿菌中克隆并測定核苷酸序列，從起始密碼ATG到終止密碼TAA長度為2034bp核苷酸。在基因的1485～1545位置處插入上一段自動切割序列CAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCA。
全合成的crtIcrtZ基因的核苷酸和氨基酸序列如下ATGAACGCACACTCCCCAGCAGCAAAGACCGCAATCGTCATCGGTGCAGGTTTCGGTGGTCTCGCACTCGCA-- 72M N A H S P A A K T A I V I G A G F G G L A L AATCAGACTCCAATCCGCAGGCATCGCAACCACCCTCGTCGAGGCAAGAGACAAGCCAGGCGGTAGAGCATAC--144I R L Q S A G I A T T L V E A R D K P G G R A YGTCTGGCACGACCAAGGCCACGTCTTCGACGCAGGTCCAACCGTCATCACCGACCCAGACGCACTCAAGGAA--216V W H D Q G H V F D A G P T V I T D P D A L K ECTCTGGGCACTCACCGGTCAAGACATGGCAAGAGACGTCACCCTCATGCCAGTCTCCCCATTCTACAGACTC--288L W A L T G Q D M A R D V T L M P V S P F Y R LATGTGGCCAGGTGGCAAGGTCTTCGACTACGTCAACGAGGCAGACCAACTCGAAAGACAAATCGCACAATTC--360M W P G G K V F D Y V N E A D Q L E R Q I A Q FAACCCAGACGACCTCGAAGGTTACAGAAGATTCAGAGACTACGCAGAGGAGGTCTACCAGGAGGGCTACGTC--432N P D D L E G Y R R F R D Y A E E V Y Q E G Y VAAACTCGGCACCGTCCCATTCCTCAAGCTCGGTCAAATGCTCAAGGCAGCACCAGCACTCATGAAACTCGAA--504K L G T V P F L K L G Q M L K A A P A L M K L EGCATACAACTCCGTCCACGCAAAGGTCGCAACCTTCATCAAGGACCCATACCTCAGACAGGCATTCTCCTAC--576A Y N S V H A K V A T F I K D P Y L R Q A F S YCACACCCTCCTCGTCGGTGGTAATCCATTCTCCACCTCCTCCATCTACGCACTCATCCACGCACTCGAAAGA--648H T L L V G G N P F S T S S I Y A L I H A L E RAGAGGTGGTGTCTGGTTCGCAAAGGGTGGCACCAACCAGCTCGTCGCAGGTATGGTCGCACTCTTCGAGAGA--720R G G V W F A K G G T N Q L V A G M V A L F E RCCAGGTGGTCAAATGATGCTCAACGCAAAGGTCGCAAGAATCGAAACCGAGGGTGCAAGAACCACCGGTGTC--792P G G Q M M L N A K V A R I E T E G A R T T G VACCCTCGCAGACGGTAGATCCCTCAGAGCAGACATGGTCGCATCCAACGGTGACGTCATGCACAACTACAGA--864T L A D G R S L R A D M V A S N G D V M H N Y RGACCTCCTCGGTCACACCGCAAGAGGTCAATCCAGAGCAAAGTCCCTCGACAGAAAGAGATGGTCCATGTCC--936D L L G H T A R G Q S R A K S L D R K R W S M SCTCTTCGTCCTCCACTTCGGTCTCAGAGAAGCACCAAAGGACATCGCACACCACACCATCCTCTTCGGTCCA-1008L F V L H F G L R E A P K D I A H H T I L F G PAGATACAAGGAACTCGTCAACGAAATCTTCAAGGGTCCAAAACTCGCAGAGGACTTCTCCCTCTACCTCCAC-1080R Y K E L V N E I F K G P K L A E D F S L Y L HTCCCCATGCACCACCGACCCAGACATGGCACCACCAGGCATGTCCACCCACTACGTCCTCGCACCAGTCCCA-1152S P C T T D P D M A P P G M S T H Y V L A P V PCACCTCTCCAGAGCAGAAATCGACTGGGCAGTCGAAGGCCCAAGATACGCAGACAGAATCCTCGCATTCCTC-1224H L S R A E I D W A V E G P R Y A D R I L A F LGAAGAAAGACTCATCCCAAACCTCAGAGCAAACCTCACCAGAACCAGAATCTTCACCCCAGCAGACTTCGCA-1296E E R L I P N L R A N L T R T R I F T P A D F ATCCGAACTCAACGCACACCACGGCTCCGCATTCTCCGTCGAACCAATCCTCACCCAATCCGCATGGTTCAGA-1368S E L N A H H G S A F S V E P I L T Q S A W F RCCACACAACAGAGACAAGACCATCAGAAACTTCTACCTCGTCGGTGCAGGTACTCACCCAGGTGCAGGTATC-1440P H N R D K T I R N F Y L V G A G T H P G A G ICCAGGTGTCGTCGGTTCCGCAAAGGCAACCGCACAAGTCATGCTCCAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAA-1512P G V V G S A K A T A Q V M L Q L L N F D L L KCTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCAATGACCAACTTCCTCATCGTCGTCGCAACCGTCCTCGTC-1584L A G D V E S N P G P M T N F L I V V A T V L VATGGAACTCACCGCATACTCCGTCCACAGATGGATCATGCACGGTCCACTCGGCTGGGGCTGGCACAAATCC-1656M E L T A Y S V H R W I M H G P L G W G W H K SCACCACGAAGAACACGACCACGCACTCGAAAAAAACGACCTCTACGGTCTCGTCTTCGCAGTCATCGCAACC-1728H H E E H D H A L E K N D L Y G L V F A V I A TGTCCTCTTCACCGTCGGTTGGATCTGGGCACCAGTCCTCTGGTGGATCGCACTCGGTATGACCGTCTACGGT-1800V L F T V G W I W A P V L W W I A L G M T V Y GCTCATCTACTTCGTCCTCCACGACGGTGTCGTCCACCAAAGATGGCCATTCAGATACATCCCAAGAAAGGGC-1872
L I Y F V L H D G V V H Q R W P F R Y I P R K GTACGCAAGAAGACTCTACCAAGCACACAGACTCCACCACGCAGTCGAAGGCAGAGACCACTGCGTCTCCTTC-1944Y A R R L Y Q A H R L H H A V E G R D H C V S FGGCTTCATCTACGCACCACCAGTCGATAAACTCAAAGAAGACCTCAAGACCTCCGGCGTCCTCAGAGCAGAA-2016G F I Y A P P V D K L K E D L K T S G V L R A EGCAGAAGAAAGAACCTAA-2034A E E R T根據(jù)植物偏愛密碼重新設(shè)計(jì)副球菌中八氫番茄紅素合成酶基因(crtB)和垅牛兒基垅兒基焦磷酸合成酶基因(crtE)的核苷酸序列，并組成聯(lián)合基因crtBcrtE。
crtBcrtE基因的合成采用重疊延伸PCR方法，結(jié)合高保真的耐高溫聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。基因在大腸桿菌中克隆并測定核苷酸序列，從起始密碼ATG到終止密碼TAA長度為1848bp核苷酸。在基因的912～972位置處插入上一段自動切割序列CAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCA。
全合成的crtBcrtE基因的核苷酸和氨基酸序列如下ATGTCCGACCTCGTCCTCACCTCCACCGAGGCCATCACCCAGGGCTCCCAATCCTTCGCCACCGCAGCCAAA-- 72M S D L V L T S T E A I T Q G S Q S F A T A A KCTCATGCCACCAGGCATCAGAGACGACACCGTCATGCTCTACGCCTGGTGCAGACACGCAGACGACGTCATC--144L M P P G I R D D T V M L Y A W C R H A D D V IGACGGTCAGGCACTCGGCTCCAGACCAGAGGCAGTCAACGACCCACAGGCCAGACTCGACGGTCTCAGAGCC--216D G Q A L G S R P E A V N D P Q A R L D G L R AGACACCCTCGCAGCACTCCAGGGTGACGGTCCAGTCACTCCACCATTCGCAGCACTCAGAGCAGTCGCAAGA--288D T L A A L Q G D G P V T P P F A A L R A V A RAGACACGACTTCCCACAGGCATGGCCAATGGACCTCATCGAGGGCTTCGCAATCGACGTTGAGGCAAGAGAC--360R H D F P Q A W P M D L I E G F A I D V E A R DTACAGAACCCTCGACGACGTCCTCGAATACTCCTACCACGTCGCAGGCATCCTCGGTGTCATGATGGCCAGA--432Y R T L D D V L E Y S Y H V A G I L G V M M A RGTCATGGGTGTCAGAGACCACCCAGTCCTCGACAGAGCCTGCGACCTCGGTCTCGCCTTCCAGCTCACCCAC--504V M G V R D H P V L D R A C D L G L A F Q L T HATCGCAAGAGACGTCATCGACTACGCAAGAATCGGCAGATGCTACCTCCCAGGCGACTGGCTCGACCACGCA--576I A R D V I D Y A R I G R C Y L P G D W L D H AGGCGCAAGAGTCGATGGTCCAGTCCCATCCCCAGAACTCTACACCGTCATCCTCAGACTCCTCGACGCAGCA--648G A R V D G P V P S P E L Y T V I L R L L D A A
GAGCCATACTACCCATCCGCAAGAGTCGGTCTCGCAGACCTCCCACCAAGATGCGCATGGTCCATCCCAGCA--720E P Y Y P S A R V G L A D L P P R C A W S I P AGCATTCAGAATCTACAGAGCAATCGGTCTCCCAATCAGAAAGGGTGGTCCAGAGGCATACAGACAAAGAATC--792A F R I Y R A I G L P I R K G G P E A Y R Q R ITCCACCTCCAAGGCAGCAAAGATCGGTCTCCTCGGCATCGGTGGTTGGGACGTCGCAGACCACGCTTGCAGA--864S T S K A A K I G L L G I G G W D V A D H A C RGGCTCCGGTGTCTCCAGACAAGACCTCTGGACCAGACCACACCACGCACAACTCCTCAACTTCGACCTCCTC--936G S G V S R Q D L W T R P H H A Q L L N F D L LAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCAATGAGAAGAGACGTCAACCCAATCCACGCAACCCTC--1008K L A G D V E S N P G P M R R D V N P I H A T LCTCCAAACCAGAATCGAAGAAATCGCACAAGGCTTCGGTGCAGTCCTCCAACCACTCGGTGCAGCAATGGCA--1080L Q T R I E E I A Q G F G A V L Q P L G A A M AGCACTCTCCTCCGGTAAGAGATTCAGAGGTATGCTCATGCTCCTCGCAGCAGAAGCATCCGGTGGTGTCTGC--1152A L S S G K R F R G M L M L L A A E A S G G V CGACACCATCGTCGATGCAGCCTGCGCAGTCGAAATGGTCCACGCAGCATCCCTCATCTTCGACGACCTCCCA--1224D T I V D A A C A V E M V H A A S L I F D D L PTGTATGGACGACGCAGGTCTCAGAAGAGGTCAACCAGCAACCCACGTCGCACACGGTGAATCCAGAGCAGTC--1296C M D D A G L R R G Q P A T H V A H G E S R A VCTCGGTGGCATCGCACTCATCACCGAAGCAATGGCACTCCTCGCAGGTGCAAGAGGTGCATCCGGTACTGTC--1368L G G I A L I T E A M A L L A G A R G A S G T VAGAGCACAACTCGTCAGAATCCTCTCCAGATCCCTCGGTCCACAAGGTCTCTGCGCAGGTCAAGACCTCGAC--1440R A Q L V R I L S R S L G P Q G L C A G Q D L DCTCCACGCAGCAAAGAACGGTGCAGGTGTCGAACAAGAACAAGACCTCAAAACCGGTGTCCTCTTCATCGCA--1512L H A A K N G A G V E Q E Q D L K T G V L F I AGGTCTCGAAATGCTCGCAGTCATCAAAGAGTTCGACGCAGAAGAACAAACCCAAATGATCGACTTCGGTAGA--1584G L E M L A V I K E F D A E E Q T Q M I D F G RCAACTCGGTAGAGTCTTCCAATCCTACGACGACCTCCTCGAAGTCGTCGGTGATCAAGCAGCACTCGGTAAA--1656Q L G R V F Q S Y D D L L E V V G D Q A A L G KGACACCGGTAGAGACGCAGCAGCACCAGGTCCAAGAAGAGGTCTCCTCGCAGTCTCCGACCTCCAAAAGGTC--1728D T G R D A A A P G P R R G L L A V S D L Q K VTCCAGACAATACGAAGCATCCAGAGCACAACTCGAAGGTATGGTCGGTTCCAAGAGACTCCAAGCACCAGAA--1800S R Q Y E A S R A Q L E G M V G S K R L Q A P EATCGAAGCACTCCTCGAAAGAGTCCTCCCATACGCAGCAAGAGCATAA--1848I E A L L E R V L P Y A A R A本發(fā)明利用先進(jìn)的基因合成方法，將合成蝦青素必須的6個基因，通過體外擴(kuò)增的方法進(jìn)行了合成和克隆。合成的基因具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)以副球菌中蝦青素合成的6個基因crtW，crtZ，crtY，crtI，crtB和crtE為基因背景，全部采用植物偏愛密碼，將核苷酸進(jìn)行改造，同時注意將基因內(nèi)部常規(guī)的核苷酸限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。
(2)將6個基因兩兩組合成一個聯(lián)合基因，即crtWcrtY，crtIcrtZ，crtBcrtE，在基因與基因的連接處加上一段自動切割序列CAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCA。聯(lián)合基因在植物中表達(dá)時，一分為二，產(chǎn)生兩個具有完整功能的蛋白質(zhì)。聯(lián)合基因的合成減少了表達(dá)元件的構(gòu)建步驟，使多基因的植物轉(zhuǎn)化變得簡便易行。
(3)合成的6個基因具有很強(qiáng)的功能，在缺少這些基因的大腸桿菌中能產(chǎn)生蝦青素，菌落表現(xiàn)紅色。


圖1.crtWcrtY基因片段1(從5’ATG起始到1008位點(diǎn))的引物設(shè)計(jì)圖2.crtWcrtY基因片段2(從1008位點(diǎn)到3’TAA終止1997)引物設(shè)計(jì)。
圖3.crtIcrtZ基因片段1(從5’ATG起始到1080位點(diǎn))的引物設(shè)計(jì)。
圖4.crtIcrtZ基因片段2(從1080位點(diǎn)到3’TAA終止2034)的引物設(shè)計(jì)。
圖5.crtBcrtE基因片段1(從5’ATG起始到936位點(diǎn))的引物設(shè)計(jì)。
圖6.crtBcrtE基因片段2(從936位點(diǎn)到3’TAA終止1848)的引物設(shè)計(jì)。
圖7.crtWcrtY基因的合成過程。先合成1008bp(1)和990bp(3)條帶，通過PCR將兩片段連接成1997bp(2)。
圖8.crtIcrtZ基因的合成過程。先合成1080bp(1)和954bp(4)條帶，通過PCR將兩片段連接成2034bp(3)。
圖9.crtBcrtE基因的合成過程。先合成936bp(3)和912bp(4)條帶，通過PCR將兩片段連接成1848bp(1)。
圖10.蝦青素合成的6個基因crtIcrtZ，crtBcrtE，crtWcrtY在大腸桿菌中表達(dá)，紅色菌落為已經(jīng)轉(zhuǎn)化這些基因的大腸桿菌。
實(shí)施例1 crtWcrtY基因的化學(xué)合成按照圖1和圖2所示設(shè)計(jì)寡核苷酸合成引物，引物長度為60-90bp，兩引物間重疊序列為20-30bp，Tm值為64-80℃。寡核苷酸引物合成已商業(yè)化，由上海生物工程分公司合成。
利用高保真的耐高溫DNA聚合酶eXTaq(日本TAKANA公司)合成基因，將所有引物加入后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，中間引物用量為5-10ng，兩邊引物用量為100-200ng，PCR擴(kuò)增條件為94℃，30s；60-72℃，30s；72℃，1-2min。共進(jìn)行25-35個循環(huán)。
crtWcrtY基因分兩段合成第一段從基因起始密碼ATG開始到1008位，共設(shè)計(jì)16個引物。引物的核苷酸順序?yàn)镠CE1GGT，CTC，CTC，CTC，CCA，GTC，ATC，GTC，ACC，GTC，TAC，GCA，CTC，ATC，CTC，GGT，GAC，AGA，TGG，ATG，TAC，GTC，GTC，TTC，TGG，CCA，CTC，CCA，TCC，ATCHCE3ACT，TCG，ACC，ACG，GTG，GTC，CAG，TCA，GAT，GGT，ACG，CAA，GAT，TCA，TCG，GTA，CTT，ACT，TCG，GTT，GGA，GAG，AAG，GTC，TCC，TCC，TCC，CAG，TCA，TCGHCE5TCT，CCT，GGA，GAA，AGA，TGA，TCG，TCA，AGC，ACA，TGG，CAC，ACC，ACA，GAC，ACG，CAG，GTA，CTG，ACG，ACG，ACC，CAG，ACT，TCG，ACC，ACG，GTG，GTC，CAGHCE7GTC，GTC，CCA，GGT，AGA，CCA，AGA，GCA，AAC，GCA，GCA，ATG，GGT，CAA，CTC，GTC，CTC，TGG，CTC，TAC，GCA，GGT，TTC，TCC，TGG，AGA，AAG，ATG，ATC，GTCHCE9ACT，TCC，TCG，GTC，TCA，CCT，GGC，TCT，CCG，TCG，GTC，TCT，TCA，TCA，TCG，CAC，ACG，ACG，CAA，TGC，ACG，GTT，CCG，TCG，TCC，CAG，GTA，GAC，CAA，GAGHCE11GTC，CAC，GCA，CTC，TGG，TTC，CTC，GAC，GCA，GCA，GCA，CAC，CCA，ATC，CTC，GCA，GTC，GCA，AAC，TTC，CTC，GGT，CTC，ACC，TGG，CTCHCE13ACC，GCA，ACC，TCC，CTC，ATC，GTC，TCC，GGT，GGT，ATC，ATC，GCA GCA，TGG，
CTC，GCA，CTC，CAC，GTC，CAC，GCA，CTC，TGG，TTC，CTCHCE15AGG，ATC，CAA，CAA，TGT，CCG，CAC，ACG，CAC，TCC，CAA，AAG，CAG，ACC，TCA，CCG，CAA，CCT，CCC，TCA，TCG，TCHCE2GGG，AAT，GCG，TCG，TGA，CCT，GGT，CTG，TGT，GGG，AGC，CAG，GTG，CCG，AAG，ACG，AAG，AGT，TGG，ATG，GAT，GCG，AGG，ATG，GTA，GGG，AGT，GGC，CAG，AAGHCE4CGA，AGT，GGA，AGC，AGG，TGA，GGA，GGG，AGA，CTG，GGT，CGG，AGA，TTC，TGG，AGG，ATC，TTG，CGT，TGT，GTC，TGT，CTG，GGA，ATG，CGT，CGT，GAC，CTG，GTCHCE6GGT，TCT，GGT，GGA，TGG，GAG，TCT，CCA，CCA，AGG，GAC，GGT，TGG，GTG，GAG，GTG，GTG，TTC，GTG，GTG，GTA，GCC，ACC，GAA，GTG，GAA，GCA，GGT，GAG，GAGHCE8AT，TCG，ACG，TCG，CCT，GCG，AGT，TTG，AGG，AGG，TCG，AAG，TTG，AGG，AGT，TGT，GCG，GTG，TCG，CCT，TTG，GTT，CTG，GTG，GAT，GGG，AGT，CTCHCE10GCG，ATG，AGA，CCG，TTT，GCG，AGA，CCT，GCA，CCT，GCG，AGG，AGG，ACG，TCG，TGG，GTC，ATT，GGG，CCT，GGG，TTG，GAT，TCG，ACG，TCG，CCT，GCG，AGT，TTGHCE12CGG，ATG，GAC，CTG，CTG，CGT，GGT，CGA，GGA，GGA，GGA，CTC，TGA，GGT，CTG，GTC，TTG，CTG，CTC，TGA，GTG，CGA，GTG，CGA，TGA，GAC，CGT，TTG，CGA，GACHCE14GAG，TGG，CTT，GAG，TCT，TGC，GAG，CCA，GTG，TGG，GGA，GAG，GTC，TGG，GTC，GTG，GCA，GGA，CCA，GGT，GTG，ACC，TTC，GGA，TGG，ACC，TGC，TGC，GTG，GTCHCE16GTT，GCG，AGT，CTT，CTT，GCG，TGT，CTT，GGG，AAT，CTG，ACT，TCT，TGG，TCT，GGC，CAG，TTT，GCT，CTT，CTG，AGT，GGC，TTG，AGT，CTT，GCG，AGC第二段從基因1008位ATG開始到終止密碼TAA，共設(shè)計(jì)14個引物。引物的核苷酸順序?yàn)镠CF1CGA，CCT，CGA，CGA，CGA，CGC，ACT，CGC，AGC，AGC，ATC，CCA，AGA，CTA，CGC，AAG，ACA，ACA，AGG，CTG，GAC，CGG，TGC，AGA，AGT，CAG，AAG，AGA，AAG，AGGHCF3TTC，ATC，TAC，CTC，CTC，CCA，TTC，TCC，AGA，ACC，AGA，ATC，CTC，ATC，GAA，GAC，ACC，AGA，TAC，TCC，GAC，GGC，GGC，GAC，CTC，GAC，GAC，GAC，GCA，CTCHCF5AGA，CCA，CAC，GGT，GTC，CCA，AGA，CCA，GTC，ATC，ATG，GAC，GGC，ACC，GTC，ACC，CAA，AGA，GAC，GGC，TAC，GGC，TTC，ATC，TAC，CTC，CTC，CCA，TTC，TCC
HCF7GCC，CAC，ACC，CAT，CCA，GAC，ACC，TCA，CCC，TCG，GCT，TCC，ACA，AGT，TCC，TCG，GTG，TCG，AAA，TCG，AAA，CCG，ACA，GAC，CAC，ACG，GTG，TCC，CAA，GACHCF9ACG，CAC，AAG，GTG，CAA，CCC，TCT，CCT，GCG，GTA，CTA，GAA，TCG，AAG，CAG，GCT，CCG，TCC，TCG，ACG，GCA，GAG，GCC，CAC，ACC，CAT，CCA，GAC，ACCHCF11AGC，ACT，CGC，AGA，CGC，AGT，CGT，CAG，ATC，CGG，TGC，AGA，AAT，CAG，ATG，GGA，CTC，CGA，CAT，CGC，ACT，CCT，CGA，CGC，ACA，AGG，TGC，AAC，CCT，CTCHCF13CAA，GAC，ACG，CAA，GAA，GAC，TCG，CAA，CCG，GCT，ACG，GCT，CCC，TCG，ACG，GTG，CAG，CAC，TCG，CAG，ACG，CAG，TCG，TCHCF2GAC，TGG，ACC，TTC，TGC，GTG，GTC，TGC，CCA，GAA，ACC，TGC，TGC，GTC，GTG，TGC，GAG，TGC，GAT，TGG，GAG，GAT，GCC，TCT，TTC，TCT，TCT，GAC，TTC，TGCHCF4GAC，TTG，TGC，TGC，GTA，TGG，GAG，GGA，GTA，GCC，GGT，GAC，TGG，GTG，GAA，GAA，GCC，TGC，TCT，GAG，ACC，GAC，TGG，GAC，TGG，ACC，TTC，TGC，GTG，GTCHCF6TAG，TCT，CTG，ATT，GCA，CCT，CTG，AGT，GCG，TCG，GTG，CCT，GGT，GGA，CCG，GAG，AGA，CCT，GCG，ACG，ACG，TCT，GCG，ACT，TGT，GCT，GCG，TAT，GGG，AGGHCF8CA，GCC，TCT，GAA，GAG，CAT，TCT，GTT，GAG，GAG，TCT，GAG，GAA，TCT，GTC，TCT，TCT，TGC，TCT，GTC，GAT，TGC，GTA，GTC，TCT，GAT，TGC，ACC，TCT，GAGHCF10T，TCG，ATG，AGA，CCT，TGT，GGC，ATT，CTG，TAG，AGT，CTT，TGG，AGG，AGG，GTG，TAT，CTT，CTG，TCT，GGT，GCG，CAG，CCT，CTG，AAG，AGC，ATT，CTG，TTGHCF12GGA，TTG，GTG，GCT，TGC，CGG，TGA，CGA，TTC，TGA，GTT，GGT，CTG，CGA，CGG，AGA，GTC，TAC，CTG，CGT，AGA，ATC，TTT，CGA，TGA，GAC，CGT，GTG，GCA，TTCHCF14TTG，AGC，TCT，TAT，GCG，TTT，TCC，TTG，AGG，AGT，GGT，CTT，TCT，GGG，AGG，CAT，CTG，ATT，GCG，GTG，CCG，AGT，GGG，ATT，GGT，GGC，TTG，CCG，GTG，ACG基因兩段合成后，將PCR產(chǎn)物混合，進(jìn)行新一輪PCR擴(kuò)增，將兩片段合并成一個聯(lián)合基因。PCR擴(kuò)增條件為94℃，30s；62℃，30s；72℃，2min 30s。共進(jìn)行25-35個循環(huán)。合成的聯(lián)合基因crtWcrtY總長度為1997bP。
實(shí)施例2 crtIcrtZ基因的化學(xué)合成按照圖3和圖4所示設(shè)計(jì)寡核苷酸合成引物，引物長度為60-90bp，兩引物間重疊序列為20-30bp，Tm值為64-80℃。
利用高保真的耐高溫DNA聚合酶eXTaq(日本TAKANA公司)合成基因，將所有引物加入后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，中間引物用量為5-10ng，兩邊引物用量為100-200ng，PCR擴(kuò)增條件為94℃，30s；60-72℃，30s；72℃，1-2min。共進(jìn)行25-35個循環(huán)。
crtIcrtZ基因分兩段合成第一段從基因起始密碼ATG開始到1080位，共設(shè)計(jì)16個引物。引物的核苷酸順序?yàn)镠CC1TTC，CTC，AAG，CTC，GGT，CAA，ATG，CTC，AAG，GCA，GCA，CCA，GCA，CTC，ATG，AAA，CTC，GAA，GCA，TAC，AAC，TCC，GTC，CAC，GCA，AAG，GTC，GCA，ACC，TTCHCC3AGA，AGA，TTC，AGA，GAC，TAC，GCA，GAG，GAG，GTC，TAC，CAG，GAG，GGC，TAC，GTC，AAA，CTC，GGC，ACC，GTC，CCA，TTC，CTC，AAG，CTC，GGT，CAA，ATG，CTCHCC5GTC，AAC，GAG，GCA，GAC，CAA，CTC，GAA，AGA，CAA，ATC，GCA，CAA，TTC，AAC，CCA，GAC，GAC，CTC，GAA，GGT，TAC，AGA，AGA，TTC，AGA，GAC，TAC，GCA，GAGHCC7ACG，TCA，CCC，TCA，TGC，CAG，TCT，CCC，CAT，TCT，ACA，GAC，TCA，TGT，GGC，CAG，GTG，GCA，AGG，TCT，TCG，ACT，ACG，TCA，ACG，AGG，CAG，ACC，AAC，TCGHCC9AAC，CGT，CAT，CAC，CGA，CCC，AGA，CGC，ACT，CAA，GGA，ACT，CTG，GGC，ACT，CAC，CGG，TCA，AGA，CAT，GGC，AAG，AGA，CGT，CAC，CCT，CAT，GCC，AGT，CTCHCC11GCA，AGA，GAC，AAG，CCA，GGC，GGT，AGA，GCA，TAC，GTC，TGG，CAC，GAC，CAA，GGC，CAC，GTC，TTC，GAC，GCA，GGT，CCA，ACC，GTC，ATC，ACC，GAC，CCA，GACHCC13AGG，TTT，CGG，TGG，TCT，CGC，ACT，CGC，AAT，CAG，ACT，CCA，ATC，CGC，AGG，CAT，CGC，AAC，CAC，CCT，CGT，CGA，GGC，AAG，AGA，CAA，GCC，AGG，CGG，TAGHCC15AGG，ATC，CAT，GGA，CGC，ACA，CTC，CCC，AGC，AGC，AAA，GAC，CGC，AAT，CGT，CAT，CGG，TGC，AGG，TTT，CGG，TGG，TCT，CGC，ACT，CHCC2GAG，AAT，GGA，TTA，CCA，CCG，ACG，AGG，AGG，GTG，TGG，TAG，GAG，AAT，GCC，TGT，CTG，AGG，TAT，GGG，TCC，TTG，ATG，AAG，GTT，GCG，ACC，TTT，GCG，TGGHCC4ACC，CTT，TGC，GAA，CCA，GAC，ACC，ACC，TCT，TCT，TTC，GAG，TGC，GTG，GAT，GAG，TGC，GTA，GAT，GGA，GGA，GGT，GGA，GAA，TGG，ATT，ACC，ACC，GAC，GAG
HCC6TGA，GCA，TCA，TTT，GAC，CAC，CTG，GTC，TCT，CGA，AGA，GTG，CGA，CCA，TAC，CTG，CGA，CGA，GCT，GGT，TGG，TGC，CAC，CCT，TTG，CGA，ACC，AGA，CAC，CACHCC8TAC，CGT，CTG，CGA，GGG，TGA，CAC，CGG，TGG，TTC，TTG，CAC，CCT，CGG，TTT，CGA，TTC，TTG，CGA，CCT，TTG，CGT，TGA，GCA，TCA，TTT，GAC，CAC，CTG，GTCHCC10ACC，GAG，GAG，GTC，TCT，GTA，GTT，GTG，CAT，GAC，GTC，ACC，GTT，GGA，TGC，GAC，CAT，GTC，TGC，TCT，GAG，GGA，TCT，ACC，GTC，TGC，GAG，GGT，GAC，ACCHCC12ACG，AAG，AGG，GAC，ATG，GAC，CAT，CTC，TTT，CTG，TCG，AGG，GAC，TTT，GCT，CTG，GAT，TGA，CCT，CTT，GCG，GTG，TGA，CCG，AGG，AGG，TCT，CTG，TAG，TTGHCC14ATC，TTG，GAC，CGA，AGA，GGA，TGG，TGT，GGT，GTG，CGA，TGT，CCT，TTG，GTG，CTT，CTC，TGA，GAC，CGA，AGT，GGA，GGA，CGA，AGA，GGG，ACA，TGG，ACC，ATCHCC16GG，AGG，TAG，AGG，GAG，AAG，TCC，TCT，GCG，AGT，TTT，GGA，CCC，TTG，AAG，ATT，TCG，TTG，ACG，AGT，TCC，TTG，TAT，CTT，GGA，CCG，AAG，AGG，ATG，GTG第二段從基因1080位到TAA終止密碼，共設(shè)計(jì)16個引物。引物的核苷酸順序?yàn)镠CD1GCA，ACC，GCA，CAA，GTC，ATG，CTC，CAA，CTC，CTC，AAC，TTC，GAC，CTC，CTC，AAA，CTC，GCA，GGC，GAC，GTC，GAA，TCC，AAC，CCA，GGC，CCA，ATG，ACC，AACHCD3ACT，TCT，ACC，TCG，TCG，GTG，CAG，GTA，CTC，ACC，CAG，GTG，CAG，GTA，TCC，CAG，GTG，TCG，TCG，GTT，CCG，CAA，AGG，CAA，CCG，CAC，AAG，TCA，TGC，TCC，HCD5CTC，CGT，CGA，ACC，AAT，CCT，CAC，CCA，ATC，CGC，ATG，GTT，CAG，ACC，ACA，CAA，CAG，AGA，CAA，GAC，CAT，CAG，AAA，CTT，CTA，CCT，CGT，CGG，TGC，AGGHCD7AGA，ACC，AGA，ATC，TTC，ACC，CCA，GCA，GAC，TTC，GCA，TCC，GAA，CTC，AAC，GCA，CAC，CAC，GGC，TCC，GCA，TTC，TCC，GTC，GAA，CCA，ATC，CTC，ACCHCD9TAC，GCA，GAC，AGA，ATC，CTC，GCA，TTC，CTC，GAA，GAA，AGA，CTC，ATC，CCA，AAC，CTC，AGA，GCA，AAC，CTC，ACC，AGA，ACC，AGA，ATC，TTC，ACC，CCA，GCAHCD11GCA，CCA，GTC，CCA，CAC，CTC，TCC，AGA，GCA，GAA，ATC，GAC，TGG，GCA，GTC，GAA，GGC，CCA，AGA，TAC，GCA，GAC，AGA，ATC，CTC，GCA，TTCHCD13ATG，CAC，CAC，CGA，CCC，AGA，CAT，GGC，ACC，ACC，AGG，CAT，GTC，CAC，CCA，
CTA，CGT，CCT，CGC，ACC，AGT，CCC，ACA，CCT，CTC，CHCD1553bpCAG，AGG，ACT，TCT，CCC，TCT，ACC，TCC，ACT，CCC，CAT，GCA，CCA，CCG，ACC，CAG，ACA，TGHCD2ATG，ATC，CAT，CTG，TGG，ACG，GAG，TAT，GCG，GTG，AGT，TCC，ATG，ACG，AGG，ACG，GTT，GCG，ACG，ACG，ATG，AGG，AAG，TTG，GTC，ATT，GGG，CCT，GGG，TTGHCD4TTT，TTC，GAG，TGC，GTG，GTC，GTG，TTC，TTC，GTG，GTG，GGA，TTT，GTG，CCA，GCC，CCA，GCC，GAG，TGG，ACC，GTG，CAT，GAT，CCA，TCT，GTG，GAC，GGA，GTAHCD6CCA，GAT，CCA，ACC，GAC，GGT，GAA，GAG，GAC，GGT，TGC，GAT，GAC，TGC，GAA，GAC，GAG，ACC，GTA，GAG，GTC，GTT，TTT，TTC，GAG，TGC，GTG，GTC，GTG，TTCHCD8TCG，TGG，AGG，ACG，AAG，TAG，ATG，AGA，CCG，TAG，ACG，GTC，ATA，CCG，AGT，GCG，ATC，CAC，CAG，AGG，ACT，GGT，GCC，CAG，ATC，CAA，CCG，ACG，GTG，AAGHCD10GAG，TCT，TCT，TGC，GTA，GCC，CTT，TCT，TGG，GAT，GTA，TCT，GAA，TGG，CCA，TCT，TTG，GTG，GAC，GAC，ACC，GTC，GTG，GAG，GAC，GAA，GTA，GAT，GAGHCD12AGA，TGA，AGC，CGA，AGG，AGA，CGC，AGT，GGT，CTC，TGC，CTT，CGA，CTG，CGT，GGT，GGA，GTC，TGT，GTG，CTT，GGT，AGA，GTC，TTC，TTG，CGT，AGC，CCT，TTCHCD14G，ACG，CCG，GAG， GTC，TTG，AGG，TCT，TCT，TTG，AGT，TTA，TCG，ACT，GGT，GGT，GCG，TAG，ATG， AAG，CCG，AAG，GAG，ACG，CAGHCD16G，TTG，GTG，ACC，TTA，GGT，TCT，TTC，TTC，TGC，TTC，TGC，TCT，GAG，GAC，GCC，GGA，GGT，CTT，GAG，GTC基因兩段合成后，將PCR產(chǎn)物混合，進(jìn)行新一輪PCR擴(kuò)增，將兩片段合并成一個聯(lián)合基因。PCR擴(kuò)增條件為94℃，30s；62℃，30s；72℃，2min 30s。共進(jìn)行25-35個循環(huán)。合成的聯(lián)合基因crtIcrtE總長度為2034bP。
實(shí)施例3crtBcrtE基因的化學(xué)合成按照圖5和圖6所示設(shè)計(jì)寡核苷酸合成引物，引物長度為60-90bp，兩引物間重疊序列為20-30bp，Tm值為64-80℃。
利用高保真的耐高溫DNA聚合酶eXTaq(日本TAKANA公司)合成基因，將所有引物加入后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，中間引物用量為5-10ng，兩邊引物用量為100-200ng，PCR擴(kuò)增條件為94℃，30s；60-72℃，30s；72℃，1-2min。共進(jìn)行25-35個循環(huán)。
crtBcrtE基因分兩段合成第一段從基因起始密碼ATG開始到936位，共設(shè)計(jì)14個引物。引物的核苷酸順序?yàn)镠CA1TCC，TAC，CAC，GTC，GCA，GGC，ATC，CTC，GGT，GTC，ATG，ATG，GCC，AGA，GTC，ATG，GGT，GTC，AGA，GAC，CAC，CCA，GTC，CTC，GAC，AGA，GCC，TGC，GAC，CTCHCA3CTC，ATC，GAG，GGC，TTC，GCA，ATC，GAC，GTT，GAG，GCA，AGA，GAC，TAC，AGA，ACC，CTC，GAC，GAC，GTC，CTC，GAA，TAC，TCC，TAC，CAC，GTC，GCA，GGC，ATCHCA5CTC，CAC，CAT，TCG，CAG，CAC，TCA，GAG，CAG，TCG，CAA，GAA，GAC，ACG，ACT，TCC，CAC，AGG，CAT，GGC，CAA，TGG，ACC，TCA，TCG，AGG，GCT，TCG，CAA，TCGHCA7ACA，GGC，CAG，ACT，CGA，CGG，TCT，CAG，AGC，CGA，CAC，CCT，CGC，AGC，ACT，CCA，GGG，TGA，CGG，TCC，AGT，CAC，TCC，ACC，ATT，CGC，AGC，ACT，CAGHCA9TGC，AGA，CAC，GCA，GAC，GAC，GTC，ATC，GAC，GGT，CAG，GCA，CTC，GGC，TCC，AGA，CCA，GAG，GCA，GTC，AAC，GAC，CCA，CAG，GCC，AGA，CTC，GAC，GGT，CTCHCA11CCT，TCG，CCA，CCG，CAG，CCA，AAC，TCA，TGC，CAC，CAG，GCA，TCA，GAG，ACG，ACA，CCG，TCA，TGC，TCT，ACG，CCT，GGT，GCA，GAC，ACG，CAG，ACG，ACG，TCAHCA13AGG，ATC，CAA，CAA，TGT，CCG，ACC，TCG，TCC，TCA，CCT，CCA，CCG，AGG，CCA，TCA，CCC，AGG，GCT，CCC，AAT，CCT，TCG，CCA，CCG，CAG，CCA，AACHCA2GTA，GCA，TCT，GCC，GAT，TCT，TGC，GTA，GTC，GAT，GAC，GTC，TCT，TGC，GAT，GTG，GGT，GAG，CTG，GAA，GGC，GAG，ACC，GAG，GTC，GCA，GGC，TCT，GTC，GAGHCA490bpTAG，AGT，TCT，GGG，GAT，GGG，ACT，GGA，CCA，TCG，ACT，CTT，GCG，CCT，GCG，TGG，TCG，AGC，CAG，TCG，CCT，GGG，AGG，TAG，CAT，CTG，CCG，ATT，CTT，GCGHCA6GCG，AGA，CCG，ACT，CTT，GCG，GAT，GGG，TAG，TAT，GGC，TCT，GCT，GCG，TCG，AGG，AGT，CTG，AGG，ATG，ACG，GTG，TAG，AGT，TCT，GGG，GAT，GGA，CTG，GHCA8GGA，GAC，CGA，TTG，CTC，TGT，AGA，TTC，TGA，ATG，CTG，CTG，GGA，TGG，ACC，ATG，CGC，ATC，TTG，GTG，GGA，GGT，CTG，CGA，GAC，CGA，CTC，TTG，CGG，ATGHCA10
CGA，TCT，TTG，CTG，CCT，TGG，AGG，TGG，AGA，TTC，TTT，GTC，TGT，ATG，CCT，CTG，GAC，CAC，CCT，TTC，TGA，TTG，GGA，GAC，CGA，TTG，CTC，TGT，AGA，TTCHCA12TGT，CTG，GAG，ACA，CCG，GAG，CCT，CTG，CAA，GCG，TGG，TCT，GCG，ACG，TCC，CAA，CCA，CCG，ATG，CCG，AGG，AGA，CCG，ATC，TTT，GCT，GCC，TTG，GAG，GTGHCA14GAG，GAG，GTC，GAA，GTT，GAG，GAG，TTG，TGC，GTG，GTG，TGG，TCT，GGT，CCA，GAG，GTC，TTG，TCT，GGA，GAC，ACC，GGA，GCC，TC第二段從基因936位到TAA終止密碼，共設(shè)計(jì)14個引物。引物的核苷酸順序?yàn)镠CB1CGC，ACT，CAT，CAC，CGA，AGC，AAT，GGC，ACT，CCT，CGC，AGG，TGC，AAG，AGG，TGC，ATC，CGG，TAC，TGT，CAG，AGC，ACA，ACT，CGT，CAG，AAT，CCT，CTC，CAGHCB3GTC，TCA，GAA，GAG，GTC，AAC，CAG，CAA，CCC，ACG，TCG，CAC，ACG，GTG，AAT，CCA，GAG，CAG，TCC，TCG，GTG，GCA，TCG，CAC，TCA，TCA，CCG，AAG，CAA，TGGHCB5CGC，AGT，CGA，AAT，GGT，CCA，CGC，AGC，ATC，CCT，CAT，CTT，CGA，CGA，CCT，CCC，ATG，TAT，GGA，CGA，CGC，AGG，TCT，CAG，AAG，AGG，TCA，ACC，AGC，AACHCB7GTA，TGC，TCA，TGC，TCC，TCG，CAG，CAG，AAG，CAT，CCG，GTG，GTG，TCT，GCG，ACA，CCA，TCG，TCG，ATG，CAG，CCT，GCG，，CAG，TCG，AAA，TGG，TCC，ACG，CAGHCB9CTT，CGG，TGC，AGT，CCT，CCA，ACC，ACT，CGG，TGC，AGC，AAT，GGC，AGC，ACT，CTC，CTC，CGG，TAA，GAG，ATT，CAG，AGG，TAT，GCT，CAT，GCT，CCT，CGC，AGCHCB11ATG，AGA，AGA，GAC，GTC，AAC，CCA，ATC，CAC，GCA，ACC，CTC，CTC，CAA，ACC，AGA，ATC，GAA，GAA，ATC，GCA，CAA，GGC，TTC，GGT，GCA，GTC，CTC，CAA，CCAHCB13CAC，AAC，TCC，TCA，ACT，TCG，ACC，TCC，TCA，AAC，TCG，CAG，GCG，ACG，TCG，AAT，CCA，ACC，CAG，GCC，CAA，TGA，GAA，GAG，ACG，TCA，ACC，CAA，TCHCB2TGC，ACC，GTT，CTT，TGC，TGC，GTG，GAG，GTC，GAG，GTC，TTG，ACC，TGC，GCA，GAG，ACC，TTG，TGG，ACC，GAG，GGA，TCT，GGA，GAG，GAT，TCT，GAC，GAG，TTGHCB4ACT，GCG，AGC，ATT，TCG，AGA，CCT，GCG，ATG，AAG，AGG，ACA，CCG，GTT，TTG，AGG，TCT，TGT，TCT，TGT，TCG，ACA，CCT，GCA，CCG，TTC，TTT，GCT，GCG，TGGHCB6A，CTC，TAC，CGA，GTT，GTC，TAC，CGA，AGT，CGA，TCA，TTT，GGG，TTT，GTT，CTT，CTG，CGT，CGA，ACT，CTT，TGA，TGA，CTG，CGA，GCA，TTT，CGA，GAC，CTG
HCB8CCG，GTG，TCT，TTA，CCG，AGT，GCT，GCT，TGA，TCA，CCG，ACG，ACT，TCG，AGG，AGG，TCG，TCG，TAG，GAT，TGG，AAG，ACT，CTA，CCG，AGT，TGT，CTA，CCG，AAGHCB10GAC，CTT，TTG，GAG，GTC，GGA，GAC，TGC，GAG，GAG，ACC，TCT，TCT，TGG，ACC，TGG，TGC，TGC，TGC，GTC，TCT，ACC，GGT，GTC，TTT，ACC，GAG，TGC，TGC，TTGHCB12GTG，CTT，GGA，GTC，TCT，TGG，AAC，CGA，CCA，TAC，CTT，CGA，GTT，GTG，CTC，TGG，ATG，CTT，CGT，ATT，GTC，TGG，AGA，CCT，TTT，GGA，GGT，CGG，AGA，CTGHCB14TT，GAG，CTC，TTA，TGC，TCT，TGC，TGC，GTA，TGG，GAG，GAC，TCT，TTC，GAG，GAG，TGC，TTC，GAT，TTC，TGG，TGC，TTG，GAG，TCT，CTT，GGA，ACC基因兩段合成后，將PCR產(chǎn)物混合，進(jìn)行新一輪PCR擴(kuò)增，將兩片段合并成一個聯(lián)合基因。PCR擴(kuò)增條件為94℃，30s；62℃，30s；72℃，2min 30s。共進(jìn)行25-35個循環(huán)。合成的聯(lián)合基因crtBcrtE總長度為1848bP。
實(shí)施例4 合成基因的功能鑒定。
利用PCR方法在合成基因crtWcrtY的兩端加上BamHI和SalI酶切位點(diǎn)，在合成基因crtIcrtZ的兩端加上SalI和HindIII酶切位點(diǎn)，在合成基因crtBcrtE的兩端加上EcoRI+SacI和KpnI酶切位點(diǎn)。將crtWcrtY基因插入pBluescripsMCS載體(上海農(nóng)科院生物中心三室構(gòu)建，1998)，之后在SalI和HindIII酶切位點(diǎn)再插入crtIcrtZ基因，將4個串聯(lián)的基因用BamHI和KpnI酶切后插入pCAMBIA1301載體(購自美國CAMBIA公司)相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再用EcoRI和KpnI酶切crtBcrtE基因，插入該載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)成6基因串聯(lián)的聯(lián)合基因。
為了驗(yàn)證基因的功能，將6個基因構(gòu)建在原核啟動子控制下，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，讓它們在大腸桿菌中表達(dá)。用BamHI和SacI酶切串聯(lián)基因后，插入pYP2001(上海農(nóng)科院生物中心三室構(gòu)建，1998)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建6個串聯(lián)基因的表達(dá)系統(tǒng)，化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，大腸桿菌均勻涂布在含有卡那霉素培養(yǎng)基的平板上，37℃培養(yǎng)12小時后，觀察菌落的顏色變化(圖10)，出現(xiàn)紅色菌落的大腸桿菌表明基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并在其中表達(dá)出有活性蛋白，使大腸桿菌合成蝦青素。
權(quán)利要求
1.由來自副球菌的垅牛兒基垅牛兒基焦磷酸合成酶基因(crtE)；八氫番茄紅素合成酶基因(crtB)；八氫番茄紅素去飽和酶基因(crtI)；番茄紅素β環(huán)化酶基因(crtY)；β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)和β-胡蘿卜素酮酶基因(crtW)，其特征在于由前述六種基因改造成主導(dǎo)蝦青素生物合成的crtW crtY基因和crtI crtZ及crtB crtE聯(lián)合基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述主導(dǎo)蝦青素生物合成的crtWcrtY基因核苷酸和氨基酸序列如下ATGTCCGCACACGCACTCCCAAAAGCAGACCTCACCGCAACCTCCCTCATCGTCTCCGGTGGTATCATCGCA-- 72M S A H A L P K A D L T A T S L I V S G G I I AGCATGGCTCGCACTCCACGTCCACGCACTCTGGTTCCTCGACGCAGCAGCACACCCAATCCTCGCAGTCGCA--144A W L A L H V H A L W F L D A A A H P I L A V AAACTTCCTCGGTCTCACCTGGCTCTCCGTCGGTCTCTTCATCATCGCACACGACGCAATGCACGGTTCCGTC--216N F L G L T W L S V G L F I I A H D A M H G S VGTCCCAGGTAGACCAAGAGCAAACGCAGCAATGGGTCAACTCGTCCTCTGGCTCTACGCAGGTTTCTCCTGG--288V P G R P R A N A A M G Q L V L W L Y A G F S WAGAAAGATGATCGTCAAGCACATGGCACACCACAGACACGCAGGTACTGACGACGACCCAGACTTCGACCAC--360R K M I V K H M A H H R H A G T D D D P D F D HGGTGGTCCAGTCAGATGGTACGCAAGATTCATCGGTACTTACTTCGGTTGGAGAGAAGGTCTCCTCCTCCCA--432G G P V R W Y A R F I G T Y F G W R E G L L L PGTCATCGTCACCGTCTACGCACTCATCCTCGGTGACAGATGGATGTACGTCGTCTTCTGGCCACTCCCATCC--504V I V T V Y A L I L G D R W M Y V V F W P L P SATCCTCGCATCCATCCAACTCTTCGTCTTCGGCACCTGGCTCCCACACAGACCAGGTCACGACGCATTCCCA--576I L A S I Q L F V F G T W L P H R P G H D A F PGACAGACACAACGCAAGATCCTCCAGAATCTCCGACCCAGTCTCCCTCCTCACCTGCTTCCACTTCGGTGGC--648D R H N A R S S R I S D P V S L L T C F H F G GTACCACCACGAACACCACCTCCACCCAACCGTCCCTTGGTGGAGACTCCCATCCACCAGAACCAAAGGCGAC--720Y H H E H H L H P T V P W W R L P S T R T K G DACCGCACAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCAATGACC--792T A Q L L N F D L L K L A G D V E S N P G P M TCACGACGTCCTCCTCGCAGGTGCAGGTCTCGCAAACGGTCTCATCGCACTCGCACTCAGAGCAGCAAGACCA--864H D V L L A G A G L A N G L I A L A L R A A R PGACCTCAGAGTCCTCCTCCTCGACCACGCAGCAGGTCCATCCGAAGGTCACACCTGGTCCTGCCACGACCCA--936D L R V L L L D H A A G P S E G H T W S C H D PGACCTCTCCCCACACTGGCTCGCAAGACTCAAGCCACTCAGAAGAGCAAACTGGCCAGACCAAGAAGTCAGA-1008D L S P H W L A R L K P L R R A N W P D Q E V RTTCCCAAGACACGCAAGAAGACTCGCAACCGGCTACGGCTCCCTCGACGGTGCAGCACTCGCAGACGCAGTC-1080F P R H A R R L A T G Y G S L D G A A L A D A VGTCAGATCCGGTGCAGAAATCAGATGGGACTCCGACATCGCACTCCTCGACGCACAAGGTGCAACCCTCTCC-1152V R S G A E I R W D S D I A L L D A Q G A T L STGCGGTACTAGAATCGAAGCAGGCTCCGTCCTCGACGGCAGAGGCCCACACCCATCCAGACACCTCACCCTC-1224C G T R I E A G S V L D G R G P H P S R H L T LGGCTTCCACAAGTTCCTCGGTGTCGAAATCGAAACCGACAGACCACACGGTGTCCCAAGACCAGTCATCATG-1296G F H K F L G V E I E T D R P H G V P R P V I MGACGGCACCGTCACCCAAAGAGACGGCTACGGCTTCATCTACCTCCTCCCATTCTCCAGAACCAGAATCCTC-1368D G T V T Q R D G Y G F I Y L L P F S R T R I LATCGAAGACACCAGATACTCCGACGGCGGCGACCTCGACGACGACGCACTCGCAGCAGCATCCCAAGACTAC-1440I E D T R Y S D G G D L D D D A L A A A S Q D YGCAAGACAACAAGGCTGGACCGGTGCAGAAGTCAGAAGAGAAAGAGGCATCCTCCCAATCGCACTCGCACAC-1512A R Q Q G W T G A E V R R E R G I L P I A L A HGACGCAGCAGGTTTCTGGGCAGACCACGCAGAAGGTCCAGTCCCAGTCGGTCTCAGAGCAGGCTTCTTCCAC-1584D A A G F W A D H A E G P V P V G L R A G F F HCCAGTCACCGGCTACTCCCTCCCATACGCAGCACAAGTCGCAGACGTCGTCGCAGGTCTCTCCGGTCCACCA-1556P V T G Y S L P Y A A Q V A D V V A G L S G P PGGCACCGACGCACTCAGAGGTGCAATCAGAGACTACGCAATCGACAGAGCAAGAAGAGACAGATTCCTCAGA-1728G T D A L R G A I R D Y A I D R A R R D R F L RCTCCTCAACAGAATGCTCTTCAGAGGCTGCGCACCAGACAGAAGATACACCCTCCTCCAAAGACTCTACAGA-1800L L N R M L F R G C A P D R R Y T L L Q R L Y RATGCCACACGGTCTCATCGAAAGATTCTACGCAGGTAGACTCTCCGTCGCAGACCAACTCAGAATCGTCACC-1872M P H G L I E R F Y A G R L S V A D Q L R I V TGGCAAGCCACCAATCCCACTCGGCACCGCAATCAGATGCCTCCCAGAAAGACCACTCCTCAAGGAAAACGCA-1994G K P P I P L G T A I R C L P E R P L L K E N A
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述主導(dǎo)蝦青素生物合成的crtIcrtZ基因核苷酸和氨基酸序列如下ATGAACGCACACTCCCCAGCAGCAAAGACCGCAATCGTCATCGGTGCAGGTTTCGGTGGTCTCGCACTCGCA-- 72M N A H S P A A K T A I V I G A G F G G L A L AATCAGACTCCAATCCGCAGGCATCGCAACCACCCTCGTCGAGGCAAGAGACAAGCCAGGCGGTAGAGCATAC--144I R L Q S A G I A T T L V E A R D K P G G R A YGTCTGGCACGACCAAGGCCACGTCTTCGACGCAGGTCCAACCGTCATCACCGACCCAGACGCACTCAAGGAA--216V W H D Q G H V F D A G P T V I T D P D A L K ECTCTGGGCACTCACCGGTCAAGACATGGCAAGAGACGTCACCCTCATGCCAGTCTCCCCATTCTACAGACTC--288L W A L T G Q D M A R D V T L M P V S P F Y R LATGTGGCCAGGTGGCAAGGTCTTCGACTACGTCAACGAGGCAGACCAACTCGAAAGACAAATCGCACAATTC--360M W P G G K V F D Y V N E A D Q L E R Q I A Q FAACCCAGACGACCTCGAAGGTTACAGAAGATTCAGAGACTACGCAGAGGAGGTCTACCAGGAGGGCTACGTC--432N P D D L E G Y R R F R D Y A E E V Y Q E G Y VAAACTCGGCACCGTCCCATTCCTCAAGCTCGGTCAAATGCTCAAGGCAGCACCAGCACTCATGAAACTCGAA--504K L G T V P F L K L G Q M L K A A P A L M K L EGCATACAACTCCGTCCACGCAAAGGTCGCAACCTTCATCAAGGACCCATACCTCAGACAGGCATTCTCCTAC--576A Y N S V H A K V A T F I K D P Y L R Q A F S YCACACCCTCCTCGTCGGTGGTAATCCATTCTCCACCTCCTCCATCTACGCACTCATCCACGCACTCGAAAGA--648H T L L V G G N P F S T S S I Y A L I H A L E RAGAGGTGGTGTCTGGTTCGCAAAGGGTGGCACCAACCAGCTCGTCGCAGGTATGGTCGCACTCTTCGAGAGA--720R G G V W F A K G G T N Q L V A G M V A L F E RCCAGGTGGTCAAATGATGCTCAACGCAAAGGTCGCAAGAATCGAAACCGAGGGTGCAAGAACCACCGGTGTC--792P G G Q M M L N A K V A R I E T E G A R T T G VACCCTCGCAGACGGTAGATCCCTCAGAGCAGACATGGTCGCATCCAACGGTGACGTCATGCACAACTACAGA--864T L A D G R S L R A D M V A S N G D V M H N Y RGACCTCCTCGGTCACACCGCAAGAGGTCAATCCAGAGCAAAGTCCCTCGACAGAAAGAGATGGTCCATGTCC--936D L L G H T A R G Q S R A K S L D R K R W S M SCTCTTCGTCCTCCACTTCGGTCTCAGAGAAGCACCAAAGGACATCGCACACCACACCATCCTCTTCGGTCCA-1008L F V L H F G L R E A P K D I A H H T I L F G PAGATACAAGGAACTCGTCAACGAAATCTTCAAGGGTCCAAAACTCGCAGAGGACTTCTCCCTCTACCTCCAC-1080R Y K E L V N E I F K G P K L A E D F S L Y L HTCCCCATGCACCACCGACCCAGACATGGCACCACCAGGCATGTCCACCCACTACGTCCTCGCACCAGTCCCA-1152S P C T T D P D M A P P G M S T H Y V L A P V PCACCTCTCCAGAGCAGAAATCGACTGGGCAGTCGAAGGCCCAAGATACGCAGACAGAATCCTCGCATTCCTC-1224H L S R A E I D W A V E G P R Y A D R I L A F LGAAGAAAGACTCATCCCAAACCTCAGAGCAAACCTCACCAGAACCAGAATCTTCACCCCAGCAGACTTCGCA-1296E E R L I P N L R A N L T R T R I F T P A D F ATCCGAACTCAACGCACACCACGGCTCCGCATTCTCCGTCGAACCAATCCTCACCCAATCCGCATGGTTCAGA-1368S E L N A H H G S A F S V E P I L T Q S A W F RCCACACAACAGAGACAAGACCATCAGAAACTTCTACCTCGTCGGTGCAGGTACTCACCCAGGTGCAGGTATC-1440P H N R D K T I R N F Y L V G A G T H P G A G ICCAGGTGTCGTCGGTTCCGCAAAGGCAACCGCACAAGTCATGCTCCAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAA-1512P G V V G S A K A T A Q V M L Q L L N F D L L KCTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCAATGACCAACTTCCTCATCGTCGTCGCAACCGTCCTCGTC-1584L A G D V E S N P G P M T N F L I V V A T V L VATGGAACTCACCGCATACTCCGTCCACAGATGGATCATGCACGGTCCACTCGGCTGGGGCTGGCACAAATCC-1656M E L T A Y S V H R W I M H G P L G W G W H K SCACCACGAAGAACACGACCACGCACTCGAAAAAAACGACCTCTACGGTCTCGTCTTCGCAGTCATCGCAACC-1728H H E E H D H A L E K N D L Y G L V F A V I A TGTCCTCTTCACCGTCGGTTGGATCTGGGCACCAGTCCTCTGGTGGATCGCACTCGGTATGACCGTCTACGGT-1800V L F T V G W I W A P V L W W I A L G M T V Y GCTCATCTACTTCGTCCTCCACGACGGTGTCGTCCACCAAAGATGGCCATTCAGATACATCCCAAGAAAGGGC-1872L I Y F V L H D G V V H Q R W P F R Y I P R K GTACGCAAGAAGACTCTACCAAGCACACAGACTCCACCACGCAGTCGAAGGCAGAGACCACTGCGTCTCCTTC-1944Y A R R L Y Q A H R L H H A V E G R D H C V S FGGCTTCATCTACGCACCACCAGTCGATAAACTCAAAGAAGACCTCAAGACCTCCGGCGTCCTCAGAGCAGAA-2016G F I Y A P P V D K L K E D L K T S G V L R A EGCAGAAGAAAGAACCTAA-2034A E E R T
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述主導(dǎo)蝦青素生物合成的crtBcrtE基因核苷酸和氨基酸序列如下ATGTCCGACCTCGTCCTCACCTCCACCGAGGCCATCACCCAGGGCTCCCAATCCTTCGCCACCGCAGCCAAA-- 72M S D L V L T S T E A I T Q G S Q S F A T A A KCTCATGCCACCAGGCATCAGAGACGACACCGTCATGCTCTACGCCTGGTGCAGACACGCAGACGACGTCATC--144L M P P G I R D D T V M L Y A W C R H A D D V IGACGGTCAGGCACTCGGCTCCAGACCAGAGGCAGTCAACGACCCACAGGCCAGACTCGACGGTCTCAGAGCC--216D G Q A L G S R P E A V N D P Q A R L D G L R AGACACCCTCGCAGCACTCCAGGGTGACGGTCCAGTCACTCCACCATTCGCAGCACTCAGAGCAGTCGCAAGA--288D T L A A L Q G D G P V T P P F A A L R A V A RAGACACGACTTCCCACAGGCATGGCCAATGGACCTCATCGAGGGCTTCGCAATCGACGTTGAGGCAAGAGAC--360R H D F P Q A W P M D L I E G F A I D V E A R DTACAGAACCCTCGACGACGTCCTCGAATACTCCTACCACGTCGCAGGCATCCTCGGTGTCATGATGGCCAGA--432Y R T L D D V L E Y S Y H V A G I L G V M M A RGTCATGGGTGTCAGAGACCACCCAGTCCTCGACAGAGCCTGCGACCTCGGTCTCGCCTTCCAGCTCACCCAC--504V M G V R D H P V L D R A C D L G L A F Q L T HATCGCAAGAGACGTCATCGACTACGCAAGAATCGGCAGATGCTACCTCCCAGGCGACTGGCTCGACCACGCA--576I A R D V I D Y A R I G R C Y L P G D W L D H AGGCGCAAGAGTCGATGGTCCAGTCCCATCCCCAGAACTCTACACCGTCATCCTCAGACTCCTCGACGCAGCA--648G A R V D G P V P S P E L Y T V I L R L L D A AGAGCCATACTACCCATCCGCAAGAGTCGGTCTCGCAGACCTCCCACCAAGATGCGCATGGTCCATCCCAGCA--720E P Y Y P S A R V G L A D L P P R C A W S I P AGCATTCAGAATCTACAGAGCAATCGGTCTCCCAATCAGAAAGGGTGGTCCAGAGGCATACAGACAAAGAATC--792A F R I Y R A I G L P I R K G G P E A Y R Q R ITCCACCTCCAAGGCAGCAAAGATCGGTCTCCTCGGCATCGGTGGTTGGGACGTCGCAGACCACGCTTGCAGA--864S T S K A A K I G L L G I G G W D V A D H A C RGGCTCCGGTGTCTCCAGACAAGACCTCTGGACCAGACCACACCACGCACAACTCCTCAACTTCGACCTCCTC--936G S G V S R Q D L W T R P H H A Q L L N F D L LAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCAATGAGAAGAGACGTCAACCCAATCCACGCAACCCTC--1008K L A G D V E S N P G P M R R D V N P I H A T LCTCCAAACCAGAATCGAAGAAATCGCACAAGGCTTCGGTGCAGTCCTCCAACCACTCGGTGCAGCAATGGCA--1080L Q T R I E E I A Q G F G A V L Q P L G A A M AGCACTCTCCTCCGGTAAGAGATTCAGAGGTATGCTCATGCTCCTCGCAGCAGAAGCATCCGGTGGTGTCTGC--1152A L S S G K R F R G M L M L L A A E A S G G V CGACACCATCGTCGATGCAGCCTGCGCAGTCGAAATGGTCCACGCAGCATCCCTCATCTTCGACGACCTCCCA--1224D T I V D A A C A V E M V H A A S L I F D D L PTGTATGGACGACGCAGGTCTCAGAAGAGGTCAACCAGCAACCCACGTCGCACACGGTGAATCCAGAGCAGTC--1296C M D D A G L R R G Q P A T H V A H G E S R A VCTCGGTGGCATCGCACTCATCACCGAAGCAATGGCACTCCTCGCAGGTGCAAGAGGTGCATCCGGTACTGTC--1368L G G I A L I T E A M A L L A G A R G A S G T VAGAGCACAACTCGTCAGAATCCTCTCCAGATCCCTCGGTCCACAAGGTCTCTGCGCAGGTCAAGACCTCGAC--1440R A Q L V R I L S R S L G P Q G L C A G Q D L DCTCCACGCAGCAAAGAACGGTGCAGGTGTCGAACAAGAACAAGACCTCAAAACCGGTGTCCTCTTCATCGCA--1512L H A A K N G A G V E Q E Q D L K T G V L F I AGGTCTCGAAATGCTCGCAGTCATCAAAGAGTTCGACGCAGAAGAACAAACCCAAATGATCGACTTCGGTAGA--1584G L E M L A V I K E F D A E E Q T Q M I D F G RCAACTCGGTAGAGTCTTCCAATCCTACGACGACCTCCTCGAAGTCGTCGGTGATCAAGCAGCACTCGGTAAA--1656Q L G R V F Q S Y D D L L E V V G D Q A A L G KGACACCGGTAGAGACGCAGCAGCACCAGGTCCAAGAAGAGGTCTCCTCGCAGTCTCCGACCTCCAAAAGGTC--1728D T G R D A A A P G P R R G L L A V S D L Q K VTCCAGACAATACGAAGCATCCAGAGCACAACTCGAAGGTATGGTCGGTTCCAAGAGACTCCAAGCACCAGAA--1800S R Q Y E A S R A Q L E G M V G S K R L Q A P EATCGAAGCACTCCTCGAAAGAGTCCTCCCATACGCAGCAAGAGCATAA--1848I E A L L E R V L P Y A A R A
5.主導(dǎo)蝦青素生物合成的crtWcrtY、crtIcrtZ和crtBcrtE基因的合成方法，其特征在于采用高保真的耐高溫聚合酶PCR進(jìn)行擴(kuò)增，基因在大腸桿菌中克隆并測核苷酸序列，在crtWcrtY、crtIcrtZ和crtBcrtE基因的連接處插入自動切割序列不同位置插入自動切割序列CAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCA進(jìn)行合成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述主導(dǎo)蝦青素生物合成基因的合成方法，其特征在于合成crtWcrtY基因，從起始密碼ATG到終止密碼TAA共1997個核苷酸堿基對，在基因的726～786位置處插入自動切割序列CAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCA。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述主導(dǎo)蝦青素生物合成基因的合成方法，其特征在于合成crtIcrtZ基因，從起始密碼ATG到終止密碼TAA共2034個核苷酸堿基對，在基因的1485～1545位置處插入自動切割序列CAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCA。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述主導(dǎo)蝦青素生物合成基因的合成方法，其特征在于合成crtBcrtE基因，從起始密碼ATG到終止密碼TAA共1848個核苷酸堿基對，在基因的912～972位置處插入一自動切割序列CAACTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAACTCGCAGGCGACGTCGAATCCAACCCAGGCCCA。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述主導(dǎo)蝦青素生物合成基因的合成方法，其特征在于對crtWcrtY，crtIcrtZ，crtBcrtE的兩端分別加上BamHI和SalI酶切位點(diǎn)；SalI和HindIII酶切位點(diǎn)；EcoRI+SacI和KpnI酶切位點(diǎn)，將crtWcrtY基因插入pBluescripsMCS載體，將SalI和HindIII酶切位點(diǎn)再插入crtIcrtZ基因，再將四個串聯(lián)的基因用BamHI和KpnI酶切后插入pCAMBIA1301載體相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再用EcoRI和KpnI酶切crtBcrtE基因，插入該載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)成6基因串聯(lián)的聯(lián)合基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述主導(dǎo)蝦青素生物合成基因功能應(yīng)用采用6個基因串聯(lián)，構(gòu)建在原核啟動子控制下，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使它們在大腸桿菌中表達(dá)，用BamHI和SacI酶切串聯(lián)基因后，插入pYP2001相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成六個串聯(lián)基因的表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出有活性蛋白使大腸桿菌合成蝦青素。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述主導(dǎo)蝦青素生物合成基因，其特征在于按crtW與crtY；crtI與crtZ；crtB與crtE串聯(lián)組成3個聯(lián)合基因，按照植物的偏愛密碼合成核苷酸。
12.如權(quán)利要求1所述主導(dǎo)蝦青素生物合成基因，可在改造植物品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)蝦青素中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)類胡蘿卜素的相關(guān)基因。利用重疊延伸PCR擴(kuò)增技術(shù)以crtE、crtB、crtI、crtW、crtY、crtZ六種基因?yàn)槟０搴铣删哂兄参锲珢勖艽a的蝦青素合成相關(guān)基因,并將合成的基因在植物中表達(dá),生產(chǎn)蝦青素等胡蘿卜素物質(zhì)來改良糧食作物及蔬菜的品質(zhì)。
文檔編號C12N15/70GK1380415SQ01105878
公開日2002年11月20日 申請日期2001年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月6日
發(fā)明者姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生 申請人:上海永業(yè)農(nóng)科生物工程有限公司, 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心