專利名稱：檢測(cè)含有篩選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的基因芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)含有篩選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的基因芯片及其應(yīng)用，屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉(zhuǎn)基因作物已在很多國家獲得批準(zhǔn)種植 和生產(chǎn)，有的被加工成食品、飼料或用做食物添加劑。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生態(tài)安全和食用安 全一直備受爭(zhēng)議，40多個(gè)國家和地區(qū)相繼實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度。各國轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度的相繼建立，對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性提出了嚴(yán) 格的要求，各種轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)也成為研究熱點(diǎn)。常用的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)法，外源蛋白檢測(cè)法，基因芯片檢測(cè)技術(shù)。雖然國外對(duì)轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)方法研究已 有十幾年，但由于轉(zhuǎn)基因作物的種類多、數(shù)量大，一些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品經(jīng)過深加工、各種條件處 理與保存后，轉(zhuǎn)基因成分部分或完全降解，所以檢測(cè)難度大。因此，需要根據(jù)科學(xué)技術(shù)的發(fā) 展不斷更新檢測(cè)方法。但不容樂觀的是，設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物是一個(gè)棘手的問題，必須確保反應(yīng)中兩條引 物有相近的熔接溫度，引物之間不會(huì)發(fā)生相互作用，另外還要注意非特異性擴(kuò)增，特別是當(dāng) 非特異性擴(kuò)增帶與目的帶相近時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)假陽性問題，從而干擾結(jié)果的判斷。隨著GMO檢 測(cè)技術(shù)的發(fā)展情況及研究趨勢(shì)，基因芯片技術(shù)在此展示了更大的優(yōu)勢(shì)。基因芯片檢測(cè)原理 是利用帶有熒光標(biāo)記的樣品同探針特異雜交，從而產(chǎn)生陽性信號(hào)。因而非目的帶的擴(kuò)增只 要不產(chǎn)生陽性信號(hào)，就不會(huì)干擾，而且芯片檢測(cè)不依據(jù)電泳條帶。并且基因芯片可根據(jù)任 何已知基因組序列設(shè)計(jì)特異性探針，以人工合成的方法快速制備芯片，且高度并行性、高通 量、微型化、自動(dòng)化、高準(zhǔn)確度和靈敏度等優(yōu)點(diǎn)具有廣泛的應(yīng)用前景。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有專利和其他文獻(xiàn)的檢索，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于Hpt基因的基因芯片檢測(cè)技術(shù)的 專利報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足和實(shí)際檢測(cè)的需要，本發(fā)明提供了一種特異性檢測(cè)含篩 選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片及其應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種檢測(cè)含篩選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片，包括表面醛基化修 飾的載玻片和陣列涂布于其上的篩選基因Hpt探針以及核酸固定的陽性對(duì)照(HEX)、雜交 陽性對(duì)照(PC)、陽性質(zhì)控探針(18S rRNA)、陰性質(zhì)控探針和空白對(duì)照；其中，所述陽性對(duì)照和雜交陽性對(duì)照為北京博奧生物技術(shù)有限公司提供的晶芯 核酸固定陽性對(duì)照(HEX)(產(chǎn)品號(hào)為502000)和晶芯 雜交陽性對(duì)照(PC)(產(chǎn)品號(hào)為 503000)；
所述陽性質(zhì)控探針為18S rRNA，其探針序列為 NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-ATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCG ；所述陰性質(zhì)控探針為SHDC-人類表達(dá)特異蛋白基因，其探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-ATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCC,所述陽性質(zhì)控探針和陰性質(zhì)控探針序列均來源于許小丹，文思遠(yuǎn)等(檢測(cè)及鑒定 轉(zhuǎn)基因大豆寡核苷酸芯片的制備.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13 (4) 429-434)的報(bào)道；所述空白對(duì)照為點(diǎn)樣液_雙蒸水；
所述的篩選基因Hpt探針序列為NH2-(CH2)6-0-Poly(dT)15-ATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGC。上述檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因Hpt的基因芯片，還包括探針對(duì)照，探針 對(duì)照選自轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米Btll轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基 因玉米TC1507轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米GA21 轉(zhuǎn)化體特異性探針。轉(zhuǎn)基因玉米GA21、Btl 1、Mon810、TC1507和Btl76的轉(zhuǎn)化體特異性探針均來源于 路興波，武海斌等(轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體特異性寡核苷酸芯片檢測(cè)方法的研制.作物學(xué)報(bào)， 2009，35 (8) 1432-1438)的報(bào)道。所述芯片的陣列布局為人為規(guī)定，可以任意布局，本發(fā)明所用的布局如圖1所示。
所述的陽性對(duì)照、雜交陽性對(duì)照、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針、空白對(duì)照、篩選基 因Hpt探針的點(diǎn)樣濃度為25 μ mol/L。探針對(duì)照的點(diǎn)樣濃度為25 μ mol/L。本發(fā)明的基因芯片的的應(yīng)用方法為提取待測(cè)植物的基因組DNA，然后在二重?zé)?光PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增，其中，熒光染料為Cy3-Amidite ；然后取PCR產(chǎn)物，與雜交液混勻 后，于PCR儀中95°C熱變性lOmin，冰浴驟冷后加樣于芯片上的點(diǎn)樣區(qū)，蓋玻片封片；42°C水 浴雜交2h ；雜交后，芯片分別在42°C的洗液I和洗液II中各清洗4min，500r/min離心甩 干，用晶芯 LuxScanTM IOK激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描，波長532nm ；PMT為850v，Power為 90v,產(chǎn)生分析精度為10 μ m的16位TIFF圖像；用LuxScan3. 0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖像分 析，分析掃描圖像的熒光強(qiáng)度值以確定是否含有Hpt基因；所述雜交液包括3XSSC緩沖液，0. 2% SDS，25% 甲酰胺，5XDenhart，s，33nmol/ LPC雜交陽性對(duì)照樣品；所述洗液I包括2X SSC緩沖液，0. 1 X SDS ；所述洗液II為0. 2XSSC緩沖液。本發(fā)明的芯片的制備原理是以含有篩選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)為材料； 以轉(zhuǎn)基因玉米Btll、Btl76和TC1507，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因棉花Mon531、Monl445、 Monl5985和LLcotton25，轉(zhuǎn)基因油菜MS8、RF3,非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958、非轉(zhuǎn)基因大豆 1138-2、非轉(zhuǎn)基因棉花中49等作為對(duì)照，根據(jù)Hpt序列，利用Primer premier 5. 0引物設(shè) 計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并對(duì)引物進(jìn)行篩選和優(yōu)化。熒光標(biāo)記引物在5’端用Cy3-Amidite 進(jìn)行熒光標(biāo)記。利用Primer premier 5. 0和Oligo 6. 0軟件設(shè)計(jì)40mer Oligo Hpt備選 探針，探針在5’端以氨基己烷修飾，氨基和探針序列之間以間隔臂poly(dT15)相連，使最 終探針長度為55bp。檢測(cè)含篩選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因Hpt特異性中的應(yīng)用?？梢岳帽景l(fā)明設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品 篩選基因Hpt特異性定性PCR檢測(cè)，也可以利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn) 品篩選基因Hpt特異性芯片檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)含篩選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片，具有很好的特異 性，靈敏度高，為篩選基因Hpt基因芯片檢測(cè)分析提供了基于簡單、可靠的測(cè)定方法，可以 用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測(cè)。本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)提供了一種有用的參考，為轉(zhuǎn)基因 產(chǎn)品的控制提供了必要的手段，可以滿足我國在進(jìn)出口檢驗(yàn)、種子市場(chǎng)抽檢、轉(zhuǎn)基因作物監(jiān) 控監(jiān)測(cè)等方面的檢測(cè)需求，提高我國轉(zhuǎn)基因生物的監(jiān)管水平。


圖1為本發(fā)明的基因芯片陣列分布圖；其中al a5_核酸固定的陽性對(duì)照(HEX)，a6 al0、b6 bl0、c6 cl0、dl d5、d6 dl0、cl c5、e6 elO-空白對(duì)照(點(diǎn)樣液)；bl b5_雜交陽性對(duì)照(PC) ；el e5-Hpt探針；fl f5，g6 glO-陽性質(zhì)控探針(18S rRNA) ；f6 flO, gl g5_陰性質(zhì) 控探針(SHDC-人類表達(dá)特異蛋白基因)；圖2為本發(fā)明的實(shí)施例1中的基因芯片陣列分布圖；其中，Al A5-核酸固定的陽性對(duì)照(HEX) ；A6 A10，B6 BlO-空白對(duì)照(點(diǎn) 樣液)；Bl B5-雜交陽性對(duì)照(PC) ；Cl C5-Btll ；C6 C10-GA21 ；Dl D5-TC1507 ； D6 D10-Mon810 ；El E5_Hpt 探針；E6 E10_Btl76 ；Fl F5，G6 GlO-陽性質(zhì)控探針 (18SrRNA) ；F6 F10，Gl G5-陰性質(zhì)控探針(SHDC-人類表達(dá)特異蛋白基因)。圖3為篩選基因Hpt特異性PCR檢測(cè)示意圖；其中M-分子量Marker ；1_陽性對(duì)照DNA模板；2_轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)基因組DNA 模板；3_轉(zhuǎn)基因玉米Btll基因組DNA模板；4-轉(zhuǎn)基因玉米Btl76基因組DNA模板；5-轉(zhuǎn) 基因玉米TC1507基因組DNA模板；6-轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基因組DNA模板；7-轉(zhuǎn)基因 棉花Monl445基因組DNA模板；8-轉(zhuǎn)基因棉花Monl5985基因組DNA模板；9-轉(zhuǎn)基因棉花 LLCotton25基因組DNA模板；10-轉(zhuǎn)基因棉花Mon531基因組DNA模板；11_轉(zhuǎn)基因油菜MS8 基因組DNA模板；12-轉(zhuǎn)基因油菜RF3基因組DNA模板；13-非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958基因組 DNA模板；14-非轉(zhuǎn)基因大豆1138-2基因組DNA模板；15-非轉(zhuǎn)基因棉花中49基因組DNA 模板；16-空白對(duì)照。圖4(a)為篩選基因Hpt特異性芯片雜交信號(hào)圖；圖4(b)為非轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的芯片雜交信號(hào)圖(為圖4(a)的對(duì)照)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例1 1、引物和探針設(shè)計(jì)根據(jù)Hpt基因序列，利用Primer premier 5. 0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)篩選基因Hpt特 異性檢測(cè)引物，并對(duì)引物進(jìn)行篩選和優(yōu)化。熒光標(biāo)記引物在5’端用Cy3-Amidite進(jìn)行熒光 標(biāo)記。引物由上海博亞生物公司合成，引物稀釋成ΙΟμπιοΙ/L備用。
利用Primer premier 5.0 和 Oligo 6· O 軟件根據(jù) Hpt 的序列設(shè)計(jì) 40mer Oligo 備選探針，設(shè)計(jì)一般原則為(1)具有較相近的TM值，上下波動(dòng)范圍為5°C ； (2)GC含量為 45% 55%之間，否則將增加非特異性雜交背景；(3)重復(fù)的單一堿基連續(xù)不超過4個(gè)； (4)探針分子最穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)配對(duì)堿基長度不大于4bp。探針在5’端以氨基己烷修飾，氨 基和探針序列之間以間隔臂poly(dT15)相連，使最終探針長度為55bp。所有探針在上海博 亞生物公司合成。2、芯片制備將篩選基因Hpt的特異性探針溶解在芯片點(diǎn)樣液中，稀釋成25ymol/L，取20μ L 轉(zhuǎn)移到384孔板，用博奧生物芯片有限公司晶芯 SmartArrayerTM-16芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。先 預(yù)點(diǎn)40點(diǎn)后再點(diǎn)至醛基化玻片上，點(diǎn)間距為350 μ m，點(diǎn)樣后的芯片進(jìn)行處理備用。每種樣 品點(diǎn)樣重復(fù)5次，并同時(shí)點(diǎn)有核酸固定的陽性對(duì)照(HEX)，雜交陽性對(duì)照(PC)，陽性質(zhì)控探 針(ISSrRNA)，陰性質(zhì)控探針(SHDC-人類表達(dá)特異蛋白基因)，空白對(duì)照(點(diǎn)樣液)，探針 對(duì)照。以保證信號(hào)的重復(fù)性及穩(wěn)定性。圖2為本實(shí)施例所制備芯片陣列示意圖，除包括篩 選基因Hpt的特異性探針外，還包括GA21、Btl76、Btll、Mon810、及TC1507的特異性探針對(duì) 照。3、應(yīng)用方法 1)利用本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的特異性引物序列進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因 Hpt特異性定性PCR檢測(cè)方法所設(shè)計(jì)的引物序列如下Hpt-F :5，TGACGGCAATTTCGATGATG 3，Hpt-R :5，TCTGCGGGCGATTTGTGTAC 3，。用博日Biospin植物基因組DNA提取試劑盒，分別取轉(zhuǎn)基因玉米Btll、Btl76 禾口 TC1507等轉(zhuǎn)基因玉米；轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因棉花Monl445, Monl5985, LLcotton25, Mon531 ；轉(zhuǎn)基因油菜MS8，RF3 ；非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958、非轉(zhuǎn)基因大豆1138-2、 非轉(zhuǎn)基因棉花中49的基因組DNA為模板，應(yīng)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在20 μ L反應(yīng)體系中 以IOOng不同來源的基因組DNA為模板，其他各組分終濃度為PCR Buffer 2X (含有IU Taq DNA聚合酶，IOmM Tris-HCLpH 8. 3,50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 250 μ M dNTPs)，引物各為 0.5 μ Μ。反應(yīng)條件為，95°C 5min預(yù)變性，95°C 30秒，58°C 30秒，72C 30秒，循環(huán)35次，72C 保溫2分鐘。PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物。2)利用本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的特異性探針序列進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因 Hpt特異性基因芯片檢測(cè)方法所述的篩選基因Hpt探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-ATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGC所述的探針對(duì)照轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-TGCCCGTCACCGAGATCTGATGTTCTCTCCTCCATTGATG。所述的探針對(duì)照轉(zhuǎn)基因玉米Btll轉(zhuǎn)化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-TGTATCCGCTCATGGAGGGATTCTTGGATTTTTGGTGGAG。
所述的探針對(duì)照的轉(zhuǎn)基因玉米TC1507轉(zhuǎn)化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-GCGGAACACAAGAACGAAAGCACCTTTTCATTCTTTCATA。所述的探針對(duì)照轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO轉(zhuǎn)化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-ACCTGAACGAGGACTTTCGGTAGCCTTCTTTCATTTCCGA。所述的探針對(duì)照轉(zhuǎn)基因玉米GA21轉(zhuǎn)化體特異性探針的序列為NH2-(CH2) 6-0-Poly (dT)15-ATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGGGTCCG。在30 μ L 二重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系中以IOOng待測(cè)植物的基因組DNA為模板，其 他各組分終濃度為PCR Buffer 2X(含有 IU Taq DNA 聚合酶，IOmM Tris-HCl, pH 8.3， 50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 250 μ M dNTPs)，0. 4 μ M 上下游玉米引物，0. 04 μ M 的 18S rRNA 的 上下游引物。反應(yīng)條件為，95°C 5min預(yù)變性，95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，循環(huán)35 次，72°C保溫5分鐘。取7yL PCR產(chǎn)物與8μ L雜交液(3XSSC，0. 2% SDS，25%甲酰胺， 5XDenhart' s，33nmol/L PC雜交陽性對(duì)照樣品)混勻后，于PCR儀中95°C熱變性IOmin, 冰浴驟冷后加樣于芯片上的點(diǎn)樣區(qū)，蓋玻片封片。42°C水浴雜交2h。雜交后，芯片分別在 421的洗液1(2\55(，0. 1 X SDS)和洗液 11(0. 2 X SSC)中各清洗 4min，500r/min 離心甩 干，用晶芯 LuxScanTM IOK激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描(波長532nm)。PMT為850v，Power 為90v，產(chǎn)生分析精度為10 μ m的16位TIFF圖像。用LuxScan3. 0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖 像分析。所有的反應(yīng)都重復(fù)3次。以非轉(zhuǎn)基因玉米的基因組DNA作為對(duì)照。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1)利用本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的特異性引物序列進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因 Hpt特異性定性PCR檢測(cè)方法利用所設(shè)計(jì)的引物以提取的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。由圖 可見，只有陽性對(duì)照和含有篩選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)基因組成功擴(kuò)增出特異性 IOObpPCR產(chǎn)物，而其他轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣品做模板時(shí)都沒有擴(kuò)增產(chǎn)物可觀察到。因此，該 引物具有良好的特異性，適合用于轉(zhuǎn)化體特異性的檢測(cè)。2)利用本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的特異性探針序列進(jìn)行篩選基因Hpt特異性基因芯片檢 測(cè)方法針對(duì)外源基因與玉米基因組連接區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針，利用二重?zé)晒釶CR產(chǎn)物與 芯片雜交，經(jīng)反復(fù)對(duì)雜交溫度、雜交時(shí)間等條件的優(yōu)化，驗(yàn)證是否產(chǎn)生預(yù)期的有效信號(hào)。并 且無其他探針產(chǎn)生非特異性信號(hào)來說明探針的特異性。結(jié)果如圖4(a)、(b)所示。探針特 異性檢驗(yàn)結(jié)果表明，針對(duì)轉(zhuǎn)化體特異性基因所設(shè)計(jì)的探針符合預(yù)期設(shè)計(jì)的目的，核酸固定 的陽性對(duì)照(HEX)，雜交陽性對(duì)照(PC)，陽性質(zhì)控探針(18S rRNA)和篩選基因Hpt特異性 相應(yīng)探針點(diǎn)樣位置均有陽性信號(hào)，而陰性質(zhì)控探針(SHDC-人類表達(dá)特異蛋白基因)，空白 對(duì)照(點(diǎn)樣液)及其他轉(zhuǎn)基因玉米探針對(duì)照均無陽性信號(hào)出現(xiàn)，說明所設(shè)計(jì)的探針具有很 好的特異性，所建立的芯片檢測(cè)平臺(tái)是可靠的。以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因Hpt特異性基因芯片 檢測(cè)分析提供了基于簡單、可靠的測(cè)定方法，可以用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因Hpt 的檢測(cè)。本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)提供了一種有用的參考，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的控制提供了必要的 手段。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)含有篩選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片，其特征在于包括表面醛基化修飾的載玻片和陣列涂布于其上的篩選基因Hpt探針以及核酸固定的陽性對(duì)照、雜交陽性對(duì)照、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針和空白對(duì)照；所述陽性質(zhì)控探針為18S rRNA，其探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-ATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCG；所述陰性質(zhì)控探針為SHDC-人類表達(dá)特異蛋白基因，其探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-ATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCC；所述空白對(duì)照為點(diǎn)樣液為雙蒸水；所述的篩選基因Hpt探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-ATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGG GTCGATGCGACGC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)含篩選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片，其 特征在于，還包括探針對(duì)照，探針對(duì)照選自轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉 米Btll轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米TC1507轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO轉(zhuǎn) 化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米GA21轉(zhuǎn)化體特異性探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因Hpt的基因芯片，其特征 在于探針對(duì)照的點(diǎn)樣濃度為25 μ mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)含篩選基因Hpt轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片， 其特征在于所述的陽性對(duì)照、雜交陽性對(duì)照、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針、空白對(duì)照、篩 選基因Hpt探針的點(diǎn)樣濃度均為25 μ mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因Hpt的基因芯片在檢 測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因Hpt特異性中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因芯片應(yīng)用的方法是提取待測(cè)植 物的基因組DNA，然后在二重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系中擴(kuò)增；然后取PCR產(chǎn)物，與雜交液混勻后， 于PCR儀中95°C熱變性lOmin，冰浴驟冷后加樣于芯片上的點(diǎn)樣區(qū)，蓋玻片封片；42C水浴 雜交2h ；雜交后，芯片分別在42°C的洗液I和洗液II中各清洗4min，500r/min離心甩干， 用晶芯LuxScanTM IOK激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描，波長532nm ；PMT為850V，Power為90V， 產(chǎn)生分析精度為10 μ m的16位TIFF圖像；用LuxScan3. O軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖像分析， 分析掃描圖像的熒光強(qiáng)度值以確定待測(cè)植物是否含有Hpt基因；所述雜交液包括:3XSSC 緩沖液，0. 2% SDS，25% 甲酰胺，5XDenhart，s，33nmol/L PC 雜交陽性對(duì)照樣品；所述洗液I包括:2XSSC緩沖液，0. IXSDS ；所述洗液II為0. 2XSSC緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)含有篩選基因Hpt的轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的基因芯片及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該種芯片，包括表面醛基化修飾的載玻片和陣列涂布于其上的篩選基因Hpt探針以及核酸固定的陽性對(duì)照、雜交陽性對(duì)照、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針和空白對(duì)照；其中所述的篩選基因Hpt的序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-ATTTCGATGATGCAGCTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGC。本發(fā)明設(shè)計(jì)的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因Hpt的基因芯片，能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因Hpt特異性檢測(cè)，具有較高的特異性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101838692SQ20101012366
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月15日
發(fā)明者劉同金, 莊乾營, 王鵬, 路興波 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所