專利名稱：轉基因植物中生育酚水平的操縱的制作方法
相關申請交叉文獻本申請要求1998年8月25日提交的美國臨時申請No.60/097,863的優(yōu)先權。
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背景技術：
維生素E是哺乳動物飲食中的必需組分。流行病學證據(jù)表明補充維生素E能減少心血管病和癌癥的危險，有助于免疫功能，并且通常能防止或減緩人體內許多退行性疾病的進程(Traber和Sies,Annu.Rev.Nutr.16:321-347,1996)。維生素E的作用是使生物膜的磷脂雙層穩(wěn)定(Skrypin和Kagan,Biochim.Biophys.Acta815:2091995；Kagan,N.Y.Acad.Sci.121頁，1989；GomezFemandez等人，Ann.N,Y,Acad.Sci.109頁，1989)，減少脂氧化產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸(PUFA)自由基(Fukuzawa等人，Lipids17:511-513,1982)，并消除單態(tài)氧(Fryer,Plant Cell Environ.15(4):38l-392,1992)。
維生素E或α生育酚屬于一類可溶于脂類的抗氧化劑，它包括α,β,γ和δ-生育酚以及α,β,γ和δ-生育三烯酚(tocotrienol)以及稱為質體醌的相關化合物。盡管有時出于出版的目的將α,β,γ和δ-生育酚和α,β,γ和δ-生育三烯酚統(tǒng)稱為“維生素E”,但是在化學上維生素E合適的定義僅僅為α-生育酚。在食品中存在的各種生育酚中，α-生育酚對人健康最重要，因為它是最具生物活性的生育酚，而且它是最易被人體吸收和保留的生育酚(Traber和Sies,Annu.Rev.Nutr.16:321-347,1996)。α-生育酚的體內抗氧化劑活性高于β、γ和δ-生育酚的抗氧化劑活性(Kamal-Eldin和Appelqzvist Lipids31:671-701,1996)。
只有植物和其它某些光合成微生物(包括藍細菌)合成生育酚。因此，飲食中的生育酚絕大多數(shù)是從植物獲得的。植物組織在生育酚總含量和生育酚組成上差別很大。在光合成綠色植物組織中，主要的生育酚是α-生育酚。葉組織可含有10-50微克總生育酚/克鮮重。
非綠色植物組織和器官表現(xiàn)出生育酚總含量和生育酚組成的范圍更寬。通常，大多數(shù)主要食物的主要作物(例如水稻、玉米、小麥、土豆)產(chǎn)生水平低的至極低的總生育酚，而其中只有一小部分是α-生育酚(Hess,《高等植物的抗氧化劑維生素E、α-生育酚》,R.Alscher和J.Hess,編輯，1993,CRC Press,Boca Raton.111-134頁)。油籽作物通常含有高得多的總生育酚水平；然而，α-生育酚僅占一小部分，而β、γ和δ-生育酚占多數(shù)(Taylor和Barnes,Chemy Ind.,Oct:722-726,1981)。
建議每日飲食攝入15-30毫克維生素E，以獲得最適的血漿α-生育酚水平。美國平均飲食很難實現(xiàn)這一維生素E攝入水平。例如，通過每日服用750克以上的菠菜葉(其中α-生育酚占總生育酚的60％)或200-400克大豆油，才能獲得建議的每日維生素E補給量。
單單依靠飲食來獲得建議的維生素E水平的一種方案是服用維生素E補充物。然而，大多數(shù)維生素E補充物是合成的維生素E，它具有6個立體異構體，而天然的維生素E是單個異構體。另外，補充物相當貴，而且一般人不愿意定期服用維生素補充物。
盡管對生育酚在植物中的功能的研究比生育酚在哺乳動物系統(tǒng)中的功能要少，但植物中有可能生育酚也會產(chǎn)生在動物中所起的類似功能?？傊l(fā)現(xiàn)植物生育酚水平隨各種應激(尤其是氧化應激)增加而增加。作物中α-生育酚水平的增加與新鮮的和經(jīng)加工的植物產(chǎn)品的穩(wěn)定性增加以及保藏期延長有關(Peterson,Cereal-Chem72(1):21-24,1995；Ball,《食物分析中的脂溶性維生素試驗綜述》London:Elsevier SciencePublishers LTD,1988)。
給豬、牛和家禽飼料添加維生素E表明，能顯著提高肉質量，并能通過延遲加工后的脂氧化(脂氧化會形成令人討厭的味道的組分)而延長加工后肉制品的保藏期(Ball，同上1988；Sante和Lacourt,J.Sci.Food Agric.65(4):503-507,1994；Buckley等人.,J.ofAnimal Science73:3122-3130,1995)。
相關的化合物質體醌(在本文中有時稱為PQ)以及生育酚是植物細胞質體中產(chǎn)生的最豐富的醌。這些化合物通過共同的途徑合成，該途徑描述在

圖1中。PQ是葉綠體光合成電子輸送鏈中的重要成分，它占植物細胞質體中總醌水平的高達50％。從合成途徑可以了解，PQ和生育酚的水平與催化產(chǎn)生兩類化合物的前體的酶有關。
發(fā)明概述本發(fā)明基于一種分離的DNA片段，該片段包括編碼轉基因植物中的2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基(solanyl)質體醌-9甲基轉移酶的序列。
本發(fā)明還包括一種異源基因構建物，它包含2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶的編碼序列以及與該序列操作性相連但天然不相連的植物、細菌或真菌啟動子。
本發(fā)明另一方面是一種改變植物生育酚組成的方法，該方法包括下列步驟(a)提供一個異源基因構建物，它包含2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶的編碼序列以及與該序列操作性相連但天然不相連的植物啟動子；和(b)將此構建物導入植物基因組中。
本發(fā)明還涉及轉基因植物，該植物的δ-生育酚與γ-生育酚之比以及α-生育酚與β-生育酚之比有所改變，從而提高了該植物及其產(chǎn)品對人和動物的營養(yǎng)價值。
在另一個實施方案中，本發(fā)明是一種植物，該植物的基因組中包含一個異源基因構建物，該構建物包含2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶的編碼序列以及與該序列操作性相連的在植物中起作用的啟動子。
本發(fā)明的一個目的是提供δ-生育酚與γ-生育酚之比改變的植物。
本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點可在閱讀了說明書和權利要求后明了。
幾副附圖的簡要說明圖1說明了生育酚和質體醌的生物合成途徑。
圖2說明了生育酚和質體醌的整體分子結構。
圖3示意說明了如下文實施例所述對本文感興趣的基因進行DNA的分子操作的一些內容。
圖4說明了在下文實施例中描述的對集胞藍細菌突變株的HPLC分析結果。
圖5說明了對擬南芥菜屬組織中生育酚的定量分析及其相對豐度。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分涉及一種植物，該植物的基因組中包含有一基因構建物，該構建物包含2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶的編碼序列以及與該編碼序列操作性相連但天然不相連的植物啟動子。該轉基因植物表現(xiàn)出生育酚和質體醌水平相對于同種類的野生型植物有所改變。為了易于稱呼，該酶有時在本文中稱為甲基轉移酶1。
生育酚和質體醌是植物質體中最豐富的醌，它們由共同的途徑合成(Hess，《高等植物中的抗氧化劑》，CRC Press:Boca Raton140-152頁，1993；Soll,《植物細胞膜》，Academic Press:San Diego383-392頁，1987)。生育酚的合成涉及由至少6種酶促活性催化的四個步驟。該途徑的一部分顯示在圖1中。生育酚的合成可分解為涉及最少6種酶促活性的四個步驟。
第一步是合成尿黑酸頭部基團。生育酚和質體醌的頭部基團-尿黑酸(HGA)是靠酶對羥苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD酶)從對羥苯基丙酮酸(HPP)產(chǎn)生的。
第二步是加疏水性尾部，產(chǎn)生2-甲基-6-葉綠基質體醌。使HGA葉綠基化/異戊二烯基化(葉綠基和茄基，分別為C20和C45)，同時結合脫羧，形成第一個真正的生育酚和質體醌中間物，分別為2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9。途徑的該步驟是碳形成生育酚/生育三烯酚或質體醌的分支點。
步驟3-5涉及甲基化和環(huán)化，產(chǎn)生一整套生育酚和質體醌。通過葉綠醇-PP加成到HGA中(或對于生育三烯酚加GGDP)產(chǎn)生的2-甲基-6-葉綠基質體醌是合成所有生育酚的共同中間物。生育酚合成的下一步是環(huán)甲基化和環(huán)化。在分離的菠菜葉綠體中，對于α-生育酚合成，這些反應的較佳次序是1)在2-甲基-6-葉綠基質體醌的3位上環(huán)甲基化，產(chǎn)生2,3-二甲基-6-葉綠基質體醌，或在2-甲基-6-茄基質體醌-9的3位上甲基化，產(chǎn)生質體醌-9；2)環(huán)化產(chǎn)生δ-生育酚；最后3)在5位上進行第二次環(huán)甲基化，產(chǎn)生α-生育酚(20)。第一次環(huán)甲基化是生育酚和質體醌合成所共有的，由一個酶2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶(甲基轉移酶1)來進行。具體地說，該酶使6-甲基-6-葉綠基質體醌和2-甲基-6-茄基質體醌芳族頭部基團的3位甲基化。支持該共同的第一甲基化酶的證據(jù)來自玉米突變株，該突變株中生育酚和質體醌合成的3位甲基化被破壞，結果積累了2-甲基-6-茄基質體醌-9和β-生育酚(21,DellaPenna和Shintani，未公開)。第二次環(huán)甲基化酶(δ-生育酚甲基轉移酶)的酶促活性與第一個甲基轉移酶不同，它已從植物中純化出來(22,23)。第一個甲基轉移酶，即2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶已被克隆得到，并在集胞藍細菌中作了特性分析，其在植物中的分子操作在下文有所描述。
盡管上述步驟1和2可能對于調節(jié)組織中合成的生育酚總量很關鍵，但該甲基化酶主要參與調節(jié)生育酚群體的最終組成。向日葵突變株研究獲得的數(shù)據(jù)提示，盡管催化芳族頭部甲基化的酶對總體生育酚組成有很大的影響，但是對這些酶活性進行遺傳操作不會影響對生育酚含量的整體調節(jié)(24)。通常，在栽培的向日葵(Helianthus annuus)中種子生育酚組成主要是α-生育酚(即，整個生育酚群體的95-100％)(25)。然而，已經(jīng)鑒定出兩個向日葵突變株具有的生育酚組成分別為95％δ-生育酚/5％α-生育酚和50％β-生育酚/50％α-生育酚。盡管這些假定的生育酚甲基化突變株顯示出種子中生育酚組成有很大改變，但是其整體總生育酚水平與野生型向日葵沒有顯著差別(24)。這些結果表明，通過操縱2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶，應當可以改變不同種類作物的生育酚組成，而對該目標組織中的總生育酚群體水平?jīng)]有不利影響。
通過單獨操縱2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶，或與最近克隆的δ-生育酚甲基轉移酶組合，本文公開的內容為在各種農(nóng)業(yè)作物和植物組織中分子操縱生育酚組成提供了科學根據(jù)。我們已經(jīng)從光合成細菌集胞藍細菌中分離出了一個基因，該基因編碼了生育酚合成第一甲基化步驟以及質體醌合成唯一的甲基化步驟所需的2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶(甲基轉移酶1)。通過對集胞藍細菌中的基因破壞以及大腸桿菌表達的體外2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶活性對該基因作了功能分析，明確了集胞藍細菌2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因所編碼蛋白(2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶)的活性。植物中的該基因或分離自植物的同源基因所編碼的蛋白過度表達能在含有這些底物的任何組織中將β-生育酚轉變?yōu)棣?生育酚，將δ-生育酚轉變?yōu)棣?生育酚。編碼該酶活性的植物基因表達受反義抑制，將導致消耗α-生育酚而累積β-生育酚，消耗δ-生育酚而累積δ-生育酚。盡管以前所述的兩個甲基化反應都是α-生育酚合成所需的，但是2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶能在大多數(shù)植物組織中調節(jié)δ型與γ型以及β型與α型生育酚和生育三烯酚的比例。增加2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶活性將降低這些生育酚的比例，而抑制其表達則會增加這些生育酚的比例。
如下文實施例和其它數(shù)據(jù)所示，經(jīng)過基因構建物轉化的植物種子表現(xiàn)出δ-生育酚與γ-生育酚之比顯著增加，該構建物中包含的甲基轉移酶1在種子特異性啟動子或組成型啟動子的控制下。通過甲基轉移酶1基因在給定植物組織中表達，有可能將該植物組織中的幾乎所有δ-生育酚催化成γ-生育酚。
通過同時進行實施例中詳細描述的互補分子基因方法，就可從集胞藍細菌PCC6803分離出2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因并對其進行功能分析。這些相同的技術還可用來探測其它種類的基因組，以獲得其它那些種類中的同源基因。已經(jīng)證實集胞藍細菌和模型植物種類南芥菜屬通過相似或相同的途徑合成生育酚，且兩者均是易控制的基因、分子和生物化學系統(tǒng)。
集胞藍細菌PCC6803的2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因的DNA序列顯示在SEQ ID NO:1中。相應推導的蛋白氨基酸序列顯示在SEQID NO:2中。
預計可用任何光合成微生物的2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因來實施本發(fā)明。用本文公開的序列來分離植物2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因是本領域技術人員力所能及的。該序列可用來篩選植物cDNA(dbEST數(shù)據(jù)庫)和基因組序列的公眾計算機數(shù)據(jù)庫?；蛘?，該序列可用來設計探針，用于鑒定含有2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶序列的基因組或cDNA克隆。另一種方法是用該序列來設計寡核苷酸引物，用于從植物DNA中PCR擴增2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因。
為了確定是否已經(jīng)鑒定出2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶序列，可用野生型集胞藍細菌進行基因置換研究，用集胞藍細菌敲除突變株進行互補研究，或用合適底物以及大腸桿菌或其它合適表達系統(tǒng)表達出的2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶蛋白進行體外酶試驗。這種在大腸桿菌中測試的一個實施例在下文有所描述?？蓸嫿ê?-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶編碼序列并與植物啟動子操作性相連的基因構建物，并用該構建物轉化擬南芥菜屬或感興趣的植物或種植物。基因組中含該構建物的轉基因植物預計相對于未轉化的野生型植物具有改變的2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶的表達和改變的生育酚組成。
預計具有一個以上2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因拷貝的多倍體植物可能在γ-生育酚甲基轉移酶基因序列中具有等位基因變異。預計與SEQ ID NO:1同源性小于100％的推定的2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因序列能編碼出具有2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶活性的蛋白。
可以預計，SEQ ID NO:1的微小序列差異、即核苷酸增加、缺失和突變，無論是天然存在的還是體外導入的，均不會影響甲基轉移酶1的活性。本發(fā)明范圍包括甲基轉移酶1序列中有微小變異的序列。另外，通過改變共同氨基酸的特定密碼子或在編碼酶的非關鍵部分的DNA序列處進行保守性氨基酸置換來改變基因編碼序列，也是植物基因工程領域普通技術人員力所能及的。
用本領域已知的標準分子生物學技術，可以構建出表達載體，該表達載體包含2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶編碼序列以及與其操作性相連但天然不相連的植物啟動子。該植物啟動子可以是組織特異性啟動子，如種子特異性啟動子(如napin或DC3)、組成型啟動子如CaMV35S、發(fā)育階段特異性啟動子或可誘導的啟動子。啟動子還可含有提高轉錄效率的某些增強序列元件。構建物可任選地含有終止信號，如胭脂氨酸合成酶終止子(NOS)。較佳的，該構建物包括有助于鑒定轉化子的可選擇或可篩選的標記物。該構建物可具有有義或反義取向的編碼區(qū)。
一旦獲得了包含2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因的基因構建物，就很容易用本領域已知的標準方法將其導入植物或植物組織。例如，已知農(nóng)桿菌轉化系統(tǒng)能很好地用于雙子葉植物和某些單子葉植物。還可采用其它同樣可用于雙子葉植物和單子葉植物的其它轉化方法。轉基因植物可用顆粒轟擊、電穿孔或植物分子生物學領域技術人員已知的其它轉化方法獲得。迄今為止植物基因工程技術的經(jīng)驗已經(jīng)提示基因導入方法不會影響轉基因植物中所達到的表型。
轉基因植物可通過轉化培養(yǎng)物中的植物細胞、然后再生植物來直接獲得。更實用的是，轉基因植物可通過親代轉基因植物的轉基因種子獲得。轉基因植物象對待其固有基因那樣通過正常的孟德爾遺傳將插入的基因(有時稱為轉基因)傳給其后代。農(nóng)業(yè)上感興趣的植物的育種和再生方法是本領域已知的。轉基因植物的經(jīng)驗還表明，插入的基因(或轉基因)很容易通過常規(guī)的植物育種技術轉移到任何所需的遺傳背景中。
下表2列出了通用種植物和蔬菜中生育酚種類的相對豐度。該表中間一欄是目前這些植物中產(chǎn)生的生育酚水平和相對豐度。該表右手欄顯示了通過在這些植物中表達有效的異源甲基轉移酶1所能達到的這些生育酚的相對豐度。對存在的生育酚種類比例的影響對于某些植物是令人驚奇的，而對于其它植物則是中等的，這取決于天然植物中的生育酚組成。如果將獲得的甲基轉移酶1基因與獲得的前述γ-生育酚甲基轉移酶基因組合，則可能會指導一種植物中產(chǎn)生的全部生育酚是α-生育酚，如果需要的話。
可以合理地預計，異源甲基轉移酶1在轉基因植物中的表達將導致植物中生育酚組成的改變。除了固有的增加δ-生育酚與γ-生育酚之比的優(yōu)點外，生育酚組成的改變可能會產(chǎn)生獨特的、有利的表型。本發(fā)明也包括通過實施本發(fā)明所獲得的植物中生育酚生物合成改變所產(chǎn)生的有益的表型。
利用本申請公開的信息以及本領域已知的標準方法，本領域技術人員能用感興趣的種植物或飼料植物來實施本發(fā)明。
下列非限制性例子只是用來說明。還應理解本發(fā)明不局限于列舉的實施方案或下文例子的實施，而是包括了在下文權利要求范圍內的所有這些變化和改動。
實施例擬南芥菜屬和集胞藍細菌作為用來研究和操縱植物中生育酚生物合成的互補模型系統(tǒng)在鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)和集胞藍細菌株PCC6803中并行實施互補的分子遺傳方法，分離并特性分析集胞藍細菌2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶。選擇這兩個模型生物是因為兩者通過相同途徑合成生育酚，且兩者都是很容易控制的基因、分子和生物活性系統(tǒng)。兩個生物中的許多反應和途徑是相似的，與本專利最相關的是兩者在生育酚合成中的相似性。由于集胞藍細菌中的基因功能容易用基因破壞來進行測試，結合最近報道的完整的集胞藍細菌基因組序列(27)，從而使集胞藍細菌成為分離生育酚(合成)途徑酶的優(yōu)秀模型系統(tǒng)，并成為分析參與生育酚合成的植物衍生的cDNA功能的快速試驗生物。同樣，本發(fā)明者已經(jīng)鑒定并克隆了該途徑的擬南芥菜屬基因，證實這些基因有助于從集胞藍細菌中分離其它基因的同系物。
集胞藍細菌中潛在的生育酚生物合成操縱子的鑒定最近，集胞藍細菌PCC6803基因組的全部DNA序列已經(jīng)被確定并可從因特網(wǎng)可進入的數(shù)據(jù)庫中獲得(27)。本發(fā)明者以前已經(jīng)報道了ORF(命名為SLR0089)編碼的獨特但可能有關的酶-δ-生育酚甲基轉移酶的分離和鑒定。用SLR0089的蛋白質序列作為探針，在集胞藍細菌基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定有關的基因。鑒定出數(shù)個ORF，其中命名為SLL0418的ORF顯示出與SLR0089的同源性最高，這提示它可能是相關的生育酚甲基轉移酶。SLL0418包括公開的集胞藍細菌數(shù)據(jù)庫序列中的堿基2096618-2097574。進一步檢查后，發(fā)現(xiàn)SLL0418有保守的S-腺嘌呤核苷基甲硫氨酸(SAM)結合結構域，而預計該結構域在生育酚甲基轉移酶內。為了驗證集胞藍細菌基因SLL0418編碼2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶的假設，用兩種方法測試集胞藍細菌SLL0418基因編碼的蛋白的功能。第一種方法是用基因置換方法(26)破壞其天然宿主中的SLL0418集胞藍細菌基因。然后分析所得集胞藍細菌SLL0418突變株的產(chǎn)物/功能喪失，即生育酚中間物的積累或正常生育酚組成中的其它變化。第二種方法是在大腸桿菌中表達集胞藍細菌基因，直接分析這些大腸桿菌菌株的2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶活性。
集胞藍細菌完整基因組的測序(27)對感興趣的具體基因的鑒定、分離和功能分析有很大幫助。一旦在數(shù)據(jù)庫中鑒定到目標基因，就可用聚合酶鏈反應(PCR)從集胞藍細菌基因組DNA擴增這些基因序列。然后將所得擴增產(chǎn)物克隆到合適的質粒載體中，或是在大腸桿菌中表達，或是用來產(chǎn)生集胞藍細菌基因置換實驗(26)所需的基因破壞構建物。用如圖3所述的策略，用該方法擴增和克隆了推定的2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因SLL0418。
集胞藍細菌開放讀框SLL0418的PCR擴增用聚合酶鏈反應(PCR)從集胞藍細菌PCC6803基因組DNA擴增SLL0418 DNA序列。如Williams(《酶學方法》(1987)167:766-778)所述的那樣，分離集胞藍細菌基因組DNA。根據(jù)對應于Synechocystis Cyanobase網(wǎng)站(www.kazusa.or.jp/cyanobase/about.html)描述的SLL0418開放讀框的DNA序列設計PCR引物。命名為SLL0418F的有義鏈特異性引物和命名為SLL0418R的反義鏈特異性引物具有下列序列SLL0418F=5′-CATATGCCCGAGTATTTGCTTCTG-3′SLL0418R=5′-TTTAAGCTTGAGTGGCGTTTTTTC-3′SLL0418開放讀框的擴增在含有0.4mMdATP,0.4mMdGTP,0.4mMdCTP,0.4mMdTTP,20皮摩爾SLL0418F引物，20皮摩爾SLL0418R引物，20毫微克集胞藍細菌PCC6803基因組DNA,20mMTris-HCl(pH8.4),50mMKCl,2mMMgCl2,2.5單位pfu聚合酶(Statagene)的100微升反應物中進行。PCR熱循環(huán)條件如下進行5分鐘95℃(1輪)1分鐘95℃→1分鐘55℃→2分鐘72℃(35輪)10分鐘72℃(1輪)擴增的SLL0418開放讀框的亞克隆將擴增的SLL0418開放讀框PCR產(chǎn)物亞克隆到pBluescript KS Ⅱ中。用苯酚CHCl3(1體積∶1體積)抽提，隨后用乙醇沉淀，純化PCR反應物。將含有擴增的SLL0418產(chǎn)物的乙醇沉淀重懸于水中。用限制性酶EcoRⅤ消化克隆載體pBluescript Ⅱ KS。然后使PCR片段和EcoRⅤ消化的pBluescript Ⅱ KS質粒在0.7％瓊脂糖TBE凝膠上分級。從凝膠上切下PCR片段，用Genesorb試劑盒純化。將純化的PCR片段和EcoRⅤ消化的pBluescript Ⅱ KS合并到含有20mMTris-HCl(pH7.6)、5mMMgCl2、5mMDTT、50微克/毫升牛血清白蛋白、0.5mMATP、50單位/毫升T4連接酶、15％聚乙二醇的DNA連接反應物中。室溫培育連接反應物過夜。然后將此連接反應物轉化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α細胞中，接種到含有100毫克/升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上。然后分離氨芐青霉素抗性菌落，純化質粒。用T7和T3測序引物對得到的命名為SLL0418-1的質粒進行測序，以確認擴增的SLL0418開放讀框DNA序列的存在及其方向。
SLL0418基因置換載體的構建由于它容易轉化(28,29)且同源重組的效率高(26,29)，因此很容易對集胞藍細菌進行分子基因操作。集胞藍細菌中基因置換方法已經(jīng)被光合成研究者廣泛并成功使用，作為在編碼光合體系組分的幾乎每個基因中產(chǎn)生定點突變的方法。基因置換程序包括使內源基因與體外構建的編碼序列中含有破壞的同源基因重組。在我們的例子中，破壞是通過在PCR克隆的目標基因編碼區(qū)中插入卡那霉素抗性盒來產(chǎn)生的，如圖3所示。在轉化期間，當內源基因被基因破壞構建物成功置換后，得到的重組集胞藍細菌表現(xiàn)出卡那霉素抗性表型。由于已知集胞藍細菌的單個細胞內含有多拷貝基因組(29)，因此在選擇培養(yǎng)基上進行抗生素抗性菌落數(shù)次繼代培養(yǎng)，以確保所有野生型基因組與突變的基因組分離。最后，進行Southern印跡和PCR分析，以確證發(fā)生了所預計的基因置換行為。然后用HPLC分析兩個獨立的真正的基因置換突變株的有關生育酚合成的產(chǎn)物/功能損失。
在集胞藍細菌中，轉座子Tn903的氨基糖苷3′-磷酸轉移酶基因賦予卡那霉素抗性。將該基因從質粒pUC4K亞克隆到pSLL0418-1中SLL0418開放讀框內獨特的NcoⅠ限制性位點上。以BamH1片段的形式從pUC4K上切下氨基糖苷3′-磷酸轉移酶基因，用Klenow酶將BamH1位點填平產(chǎn)生平頭。用BamH1消化大約10微克pUC4K2小時。然后用苯酚氯仿抽提純化，隨后乙醇沉淀。然后將得到的含有消化質粒的沉淀重懸于含有50mM Tris-HCl(pH7.2),0.4mMdCTP,0.4mMdGTP,0.4mMdATP,0.4mMdTTP,10mMMgCl2,1mMDTT,2單位Klenow的50微升溶液中，37℃培育1小時。用Ncol消化亞克隆的SLL0418質粒構建物pSLL0418-1。如上文BamH1消化的pUC4K質粒所述，用Klenow填充Nco1消化的pSLL0418-1的末端。然后，用Genesorb試劑盒從0.7％瓊脂糖TBE中分離出含有氨基糖苷3′-磷酸轉移酶的pUC4K的平頭BamH1片段和得到的平頭pSLL0418-1Nco1片段。然后將這兩個DNA片段合并，形成DNA連接反應物，該反應物含有20mMTris-HCl(pH7.6),5mM MgCl2,5mMDTT,50微克/毫升牛血清白蛋白，0.SmM ATP,50單位/毫升T4連接酶，15％聚乙二醇。室溫下培育連接反應物過夜。然后將該連接反應物轉化到感受態(tài)大腸桿菌DH5a細胞中，接種到含有50毫克/升卡那霉素和100毫克/升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上。然后，分離對卡那霉素和氨芐青霉素均有抗性的菌落，純化質粒。所得質粒命名為pSLL0418-2。
用SLL0418基因置換載體轉化集胞藍細菌PCC6803用Williams(Methods in Enzymology(1987)167:766-778)描述的方法將SLL0418基因置換載體pSLL0418-2轉化到集胞藍細菌PCC6803中。在含有15mM葡萄糖和15mM卡那霉素的BG-11培養(yǎng)基上選擇轉化的集胞藍細菌。所有培養(yǎng)物在26℃、連續(xù)光照下生長。通過5次單菌落傳代培養(yǎng)，將兩個獨立的轉化子轉移到新鮮培養(yǎng)基上。所得轉化的集胞藍細菌菌株命名為pSLL0418-2a和2b。
集胞藍細菌脂質的抽提從BG-11瓊脂培養(yǎng)基上生長的2周齡集胞藍細菌培養(yǎng)物刮下大約200毫克細胞。用polytron勻漿器使細胞在含有1毫克/毫升丁基化羥基甲苯(BHT)的6毫升2∶1(體積∶體積)甲醇∶氯仿中勻漿。然后，在勻漿物中加入2毫升氯仿和3.4毫升雙蒸水。取出下部的脂質相，在氮氣下干燥。將干燥的脂質重懸于含有1毫克/毫升BHT的200毫升HPLC級己烷中。
生育酚分析用具有熒光檢測器的Hewlett-Packard系列1100HPLC系統(tǒng)對生育酚進行HPLC分析。對于生育酚的正常相HPLC分析，在真空下干燥氯仿萃取物，并將所得脂質殘余物重懸于己烷中。42℃下，用己烷中8％-18％二異丙基乙醚的20分鐘線性梯度以1毫升/分鐘的流速在Licosorb Si60A4.6X250mmHPLC柱上對生育酚進行分級。對于正常相分析，在290納米波下激發(fā)后，在325納米下熒光檢測生育酚。通過將其熒光信號與用已知量的真正生育酚標準品制備的標準曲線比較，定量測定單個生育酚種類。從圖4中可以看出，野生型集胞藍細菌產(chǎn)生α生育酚作為其最豐富的生育酚，即占生育酚總量的95％以上。在圖4中，顯示了野生型和敲除型集胞藍細菌菌株的HPLC柱輸出結果。最頂部的圖(命名為A)對應于SLL0418敲除型突變株，第三個圖C表示野生型菌株，而第四個圖D顯示了生育酚的峰值位置。當SLL0418被破壞后，集胞藍細菌合成α-生育酚的水平大大降低，而積累了非常高水平的β-生育酚(如圖4A所示)?？傊?，SLL0418的生產(chǎn)被消除時α-生育酚產(chǎn)生的大量減少和β-生育酚的持續(xù)積累都證實，SLL0418編碼2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶(α-生育酚生物合成中的第一個甲基轉移酶以及質體醌合成中的甲基轉移酶)。
用聚合酶鏈反應確認SLL0418基因置換用PCR確定集胞藍細菌染色體和導入的基因置換質粒pSLL0418-2a之間是否發(fā)生同源重組。如上所述從野生型集胞藍細菌中分離基因組DNA，用pSLL0418-2(即菌株pSLL0418-2a和b)轉化集胞藍細菌菌株。然后如上所述，用SLL0418特異性PCR引物(即上述SLL0418F和SLL0418R引物)以及從野生型和pSLL-418-2a和b集胞藍細菌菌株中分離的基因組DNA模板進行PCR反應。對照PCR反應也如上所述那樣進行，用pSLL0418-1和pSLL0418-2 DNA作為對照模板。所得PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖TBE凝膠上分級，并在用溴化乙錠對凝膠染色后顯色。
通過在大腸桿菌中的表達和生物化學分析證實生育酚的生物合成酶活性和SLL0418基因在大腸桿菌中的表達鑒定集胞藍細菌基因和蛋白參與生育酚生物合成的第二種方法包括這些基因在大腸桿菌中的表達和生物化學分析。將集胞藍細菌SLL0418基因序列以Nde/Hind3片段形式從pSLL0418-1亞克隆到大腸桿菌表達載體pET30B的Ndel和Hind3位點內。所得質粒構建物命名為p041798，將它轉化入大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysS中。用1mM異丙基硫代-b-半乳糖苷誘導轉化了p041798的細胞和轉化了空的pET30B載體的細胞中的蛋白表達。使誘導的培養(yǎng)物在振搖培育器中28℃下生長3小時，然后通過4℃8000g離心10分鐘來收獲細胞，并保藏于80℃。將細胞沉淀重懸于50mMTris-HClpH8.0,5mMDTT,1mMPMSF中，用超聲儀的四次10秒沖擊勻漿化。然后加入TritonX100至最終濃度為1％，將混合物培養(yǎng)在冰上30分鐘。然后40000g離心30分鐘，除去不溶物，留下上清液用于甲基轉移酶試驗。
2-甲基-6-葉綠基質體醌底物的制備如Henry等人.(1987)Biochem J242:367-373中所述的那樣，合成6種不同甲基葉綠基質體醌異構物的混合物。將250毫克混合的甲基葉綠基質體醌異構物制備物懸浮在乙醚中。加入100毫克氧化銀使該混合物氧化，室溫下培育該混合物2小時。然后離心除去氧化銀，氮氣下干燥甲基葉綠基質體醌異構物，并重懸于己烷中。在7.8×300mmWaters mPorasil HPLC柱上從該異構體混合物中純化2-甲基-6-葉綠基質體醌。用999∶1(體積/體積)己烷∶二噁烷組成的移動相洗脫該化合物。收集含有純化的2-甲基-6-葉綠基質體醌的級分，在氮氣流下干燥。然后將2-甲基-6-葉綠基質體醌重懸于硅烷化管中1毫升無水乙醇中，通過加入50微升50毫克/毫升氫硼化鈉還原成2-甲基-6-葉綠基質體醌。室溫下培育混合物5分鐘。加入200微升0.1M乙酸終止反應，再室溫培育該混合物5分鐘。然后加入300微升水和1毫升己烷萃取2-甲基-6-葉綠基質體醌。收集己烷相，氮氣下干燥，重懸于100微升乙醇中，用于甲基轉移酶試驗。
2-甲基-6-茄基質體醌底物的制備從鳶尾鱗莖純化2-甲基-6-茄基質體醌底物。在500毫升丙酮中對100克鳶尾鱗莖勻漿。使勻漿物過濾通過兩層miracloth。在濾液中加入500毫升石油醚。然后加入水直至形成兩相。下部相(水級分)棄去，上部相(有機部分)用水洗兩次，以除去殘余丙酮。然后干燥有機級分并重懸于10毫升乙醚中。然后加入200毫克氧化銀，室溫下培育混合物1小時。使氧化銀離心沉淀，氮氣下干燥上清液。將所得脂質殘余物重懸于己烷中，在硅膠TLC板上以20％乙醚80％石油醚中展開分級。如Crane和Barr(1971)Methodsin Enzymology,18:137-169中所述，用無色亞甲藍噴灑一小部分TLC板，以檢測2-甲基-6-茄基質體醌條帶。然后將2-甲基-6-茄基質體醌條帶從板上刮下，用乙醚從硅膠上洗脫。氮氣下干燥2-甲基-6-茄基質體醌，重懸于乙醇。然后如2-甲基-6-葉綠基質體醌底物所述那樣，還原2-甲基-6-茄基質體醌并制備用于試驗。
大腸桿菌表達的SLL0418基因的體外2-甲基-6-葉綠基質體醌和2-甲基-6-茄基質體醌甲基轉移酶試驗測試表達SLL0418基因的大腸桿菌抽提物的2-甲基-6-葉綠基質體醌和2-甲基-6-茄基質體醌甲基轉移酶活性。大腸桿菌抽提物(如上所述那樣制得)測試在含有50mMTris-HCl pH8.0,5mMDTT,約5mM2-甲基-6-葉綠基質體醌或2-甲基-6-茄基質體醌(如上所述制得)和1.7μM[14C-甲基]-S-腺苷基甲硫氨酸(58mCi/毫摩爾)的1毫升反應物中進行。室溫培育反應物30分鐘。然后加入4.5毫升2∶1(體積∶體積)CHCl3∶甲醇和2毫升0.9％氯化納，充分混合每個小管。離心分離相，將氯仿下相轉移到新的管中。然后在氯仿相中加入少量氧化銀，隨后在空氣流下使氯仿蒸發(fā)。然后將干燥殘余物重懸于己烷中，點樣到硅膠TLC板上。使TLC板在7∶3(體積∶體積)石油醚∶乙醚中展開，曝光膠片過夜。將對應于2,3-二甲基葉綠基質體醌之一質體醌的正確Rf值的放射標記化合物的TLC級分從TLC板上刮下，進行閃爍計數(shù)。這些試驗的結果表明，大腸桿菌表達的SLL0418能使2-甲基-6-葉綠基質體醌或2-甲基-6-茄基質體醌甲基化，分別形成2,3-二甲基葉綠基質體醌和2,3-二甲基茄基質體醌(如下表1所示)。從轉化了空載體對照的大腸桿菌分離的抽提物不能使任一底物甲基化。
表1大腸桿菌中表達的SLL0418蛋白的生物化學分析
對于該表1中歸納的工作，測試經(jīng)空載體對照(pET30B)和SLL0418表達構建物轉化的大腸桿菌細胞抽提物，使2-甲基-6-葉綠基質體醌和2-甲基-6-茄基質體醌甲基化的能力。試驗如上所述進行。表中的數(shù)值分別表示用2-甲基-6-葉綠基質體醌和2-甲基-6-茄基質體醌作為底物在反應中產(chǎn)生的14C標記的2,3-二甲基-6-葉綠基質體醌和2,3-二甲基茄基質體醌產(chǎn)物的數(shù)量。盡管在采用表達SLL0418基因的細胞抽提物的試驗中2,3-二甲基-6-葉綠基質體醌和2,3-二甲基-6-茄基質體醌產(chǎn)物中摻入了高于背景水平的顯著量的放射活性，但是在采用對照細胞抽提物的試驗中卻沒有發(fā)現(xiàn)這兩個產(chǎn)物中有顯著摻入。
通過集胞藍細菌2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶的過度表達來定量控制擬南芥菜屬和其它植物中的生育酚從上述基因和生物化學研究，證實SLL0418編碼集胞藍細菌2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶-光合成生物體中生育酚和質體醌合成中的第一個甲基轉移酶。集胞藍細菌2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶可通過在所需植物組織中過度表達其活性來直接改變植物組織中的α-、δ-、γ-和β-生育酚水平。我們選擇擬南芥菜屬作為模型植物系統(tǒng)來證實SLL0418過度表達在植物組織中的效果，以及在不同植物組織中的植物同系物。選擇擬南芥菜屬是因為它容易通過真空浸潤(infiltration)來轉化，而且隨后對轉化子的分子和基因分析是常規(guī)和已經(jīng)建立的。然而，重要強調的是，擬南芥菜葉子和種子中的生育酚組成與眾多農(nóng)業(yè)作物中的相似，并證實通過在這些組織中表達集胞藍細菌γ-生育酚甲基轉移酶來改變集胞藍細菌生育酚組成將與任何農(nóng)業(yè)作物中得到的結果相似。
用HPLC分析擬南芥菜屬組織的生育酚水平(圖5和表2)，結果顯示擬南芥菜屬種子具有相對簡單的生育酚組成，即種子含有95％的γ-生育酚和5％的δ-生育酚。這些簡單的生育酚組成使這些擬南芥菜屬種子成為顯示SLL0418在植物中表達的功能后果的理想靶標。從定性的角度來看，增加擬南芥菜屬種子中2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因表達，將增加種子γ-生育酚在總生育酚中所占的比例，即將δ-生育酚轉變成γ-生育酚，接近100％。因此，通過分子技術用SLL0418來改進植物中的2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶活性可用來積極地實現(xiàn)從δ-生育酚產(chǎn)生γ-生育酚，以及從β-生育酚產(chǎn)生α-生育酚。利用CaMV35S啟動子和以下三種不同的SLL0418構建物，就能使SLL0418組成型過度表達1)沒有靶向序列的SLL0418,2)具有擬南芥菜屬γ-生育酚甲基轉移酶基因的靶向序列的SLL0418，和3)具有核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基靶向序列(它將其指向基質)的SLL0418。這種改變的表達對各種植物組織中生育酚、質體醌和類胡蘿卜素水平和組成的影響可如下所述那樣進行測定。如果需要，可用種子特異性啟動子來使種子中的表達受到限制和最大化。
對每個構建物可產(chǎn)生多個獨立的轉化子，用Southern分析確認，鑒定其mRNA水平以及對所分析的感興趣的個別葉綠體組分的作用。每個品系中的每個嵌合基因的整合和基因拷貝數(shù)可通過Southern分析來確認，SLL0418mRNA的水平可用Northern印跡分析來測定，2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶活性根據(jù)(22)中描述的方法來測定。用HPLC、光譜和質譜相結合，分析生育酚、質體醌和類胡蘿卜素。利用已知的標準品和標準曲線，通過具有熒光檢測的HPLC來分析生育酚水平，需要時可通過LC或GC質譜來分析。在MS分析中，生育酚的絕對水平用含有抽提開始時加入的已知的“重碳”生育酚標準品的同位素稀釋液來定量。還根據(jù)組織的鮮重或相對于葉綠素a來進行測定。用分光光度法測定類胡蘿卜素總體水平，用C18HPLC對各個胡蘿卜素的水平進行定量，用光譜根據(jù)標準品定量。在這些試驗期間，鑒定出具有簡單插入物、在子代中以單個遺傳基因座的形式分離的高表達品系。
SLL0418植物同系物的分離和功能測試SLL0418作為一種2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶為分離植物同系物提供了幾個工具。首先，可用SLL0418DNA序列作為探針通過同源性來分離植物同系物。其次，SLL0418的DNA和蛋白序列可用來篩選植物cDNA和基因組序列的公眾或私人計算機數(shù)據(jù)庫。一旦鑒定出有前景的候選物，可通過反義抑制或在擬南芥菜屬中過度表達以及上述集胞藍細菌SLL0418敲除突變株的功能互補來對其進行功能測試?；蛘?，可在大腸桿菌中表達該基因，并用合適的底物直接測定蛋白質。在后一情況下，如果植物cDNA是SLL0418的功能同系物，則該cDNA在SLL0418敲除突變株中的表達將恢復敲除突變株的α-生育酚生產(chǎn)。如果敲除突變株中觀察到有選擇表型時，敲除突變株還可通過功能互補用于直接選擇植物同系物。一旦鑒定出植物同系物，它們就可如上述SLL0418那樣用來直接修飾宿主植物或其它植物的生育酚生產(chǎn)。
SLL0418的植物同系物可用本領域熟知的技術來分離，這些技術包括用包含SEQID NO:1序列至少一部分的探針來篩選植物基因組或cDNA文庫。植物cDNA文庫可用本領域現(xiàn)有的程序(如Sambrook等人(34)中公開的那些)來常規(guī)制得?；蚝Y選預先制得的cDNA文庫(如那些從Stratagene獲得的)。
用含有SEQ ID NO:1序列至少一部分的探針篩選cDNA或基因組文庫可用嚴謹?shù)碾s交條件進行。嚴謹?shù)臈l件取決于序列，在不同的情況下是不同的。通常，選擇嚴謹條件使其比具體序列在確定的離子強度和pH下的正常熱解鏈溫度(Tm)低大約5℃。Tm是50％的靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度(在確定的離子強度和pH下)。通常，嚴謹?shù)臈l件涉及65℃下用0.2xSSC洗滌兩次。另一種方法是用本領域現(xiàn)有的PCR程序(如Innis等人公開的程序，納入本文作為參考)來擴增植物同系物。
表1所選作物和植物油(2,19)中生育酚水平和組成以及預計SLL0418過度表達引起的變化
1McLaughlin PJ,Weihrauch JC(1979)《食物中的維生素E含量》J Am Diet Ass75:647-665。
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150 160 170 180190* * * * * * * * * *TTG GAA TAT TAC TGG GGC GAC CAT ATC CAC CTC GGC CAT TAT GGC GATLeu Glu Tyr Tyr Trp Gly Asp His Ile His Leu Gly His Tyr Gly Asp>
200 210 220 230 240* * * * * * * * * *CCG CCA GTG GCC AAG GAT TTC ATC CAA TCG AAA ATT GAT TTT GTC CATPro Pro Val Ala Lys Asp Phe Ile Gln Ser Lys Ile Asp Phe Val His>
250 260 270 280* * * * * * * * *CCG ATG GCC CAG TGG GGC GGA TTA GAT ACA CTT CCC CCC GGC ACA ACGAla Mat Ala Gln Trp Gly Gly Lau Asp Thr Lau Pro Pro Gly Thr Thr>290 300 310 320 330* * * * * * * * * *GTA TTG GAT GTG GGT TGC GGC ATT GGC GGT AGC AGT CGC ATT CTC GCCVal Lau Asp Val Gly Cys Gly Ile Gly Gly Sar Sar Arg Ile Leu Ala>340 350 360 370 380* * * * * * * * *AAA GAT TAT GGT TTT AAC GTT ACC GGC ATC ACC ATT AGT CCC CAA CAGLys Asp Tyr Gly Phe Asn Val Thr Gly Ile Thr Ile Ser Pro Gln Gln>
390 400 410 420 430* * * * * * * * * *GTG AAA CGG GCG ACG GAA TTA ACT CCT CCC GAT GTG ACG GCC AAG TTTVal Lys Arg Ala Thr Glu Leu Thr Pro Pro Asp Val Thr Ala Lys Phe>
440 450 460 470 480* * * * * * * * * *GCG GTG GAC GAT GCT ATG GCT TTG TCT TTT CCT GAC GGT AGT TTC GACAla Val Asp Asp Ala Met Ala Leu Ser Phe Pro Asp Gly Ser Phe Asp>
490 500 510 520* * * * * * * * *GTA GTT TGG TCG GTG GAA GCA GGG CCC CAC ATG CCT GAC AAA GCT GTGVal Val Trp Ser Val Glu Gly Pro His Met Pro Asp Lys Ala Val>530 540 550 560 570* * * * * * * * * *TTT GCC AAG GAA TTA CTG CGG GTC GTG AAA CCA GGG GGC ATT CTG GTGPhe Ala Lys Glu Leu Leu Arg Val Val Lys Pro Gly Gly Ile Leu Val>580 590 600 610 620* * * * * * * * *GTG GCG GAT TGG AAT CAA CGG GAC GAT CGC CAA GTG CCC CTC AAC TTCVal Ala Asp Trp Asn Gln Arg Asp Asp Arg Gln Val Pre Leu Asn Phe>
630 640 650 660670* * * * * * * * * *TGG GAA AAA CCA GTG ATG CGA CAA CTG TTG GAT CAA TGG TCC CAC CCTTrp Glu Lys Pro Val Met Arg Gln Leu Leu Asp Gln Trp Ser His Pro>
680 690 700 710 720* * * * * * * * * *GCC TTT GCC AGC ATT GAA GGT TTT GCG GAA AAT TTG GAA GCC ACG GGTAla Phe Ala Ser Ile Glu Gly Phe Ala Glu Asn Leu Glu Ala Thr Gly>
730 740 750 760* * * * * * * * *TTG GTG GAG GGC CAG GTG ACT ACT GCT GAT TGG ACT GTA CCG ACC CTCLeu Val Glu Gly Gln Val Thr Thr Ala Asp Trp Thr Val Pro Thr Leu>770 780 790 800 810* * * * * * * * * *CCC GCT TGG TTG GAT ACC ATT TGG CAG GGC ATT ATC CGG CCC CAG GGCPro Ala Trp Leu Asp Thr Ile Trp Gln Gly Ile Ile Arg Pro Gln Gly>820 830 840 850 860* * * * * * * * *TGG TTA CAA TAC GGC ATT CGT GGG TTT ATC AAA TCC GTG CGG GAA GTATrp Leu Gln Tyr Gly Ile Arg Gly Phe Ile Lys Ser Val Arg Glu Val>
870 880 890 900 910* * * * * * * * * *CCG ACT ATT TTA TTG ATG CGC CTT GCC TTT GGG GTA GGA CTT TGT CGCPro Thr Ile Leu Leu Met Arg Leu Ala Phe Gly Val Gly Leu Cys Arg>
920 930 940 950* * * * * * * * *TTC GGT ATG TTC AAA GCA GTC CGA AAA AAC GCC ACT CAA GCT TAAPhe Gly Met Phe Lys Ala Val Arg Lys Asn Ala Thr Gln Ala ***>
權利要求
1．一種基因構建物，它包含2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶的編碼序列，該序列在與其天然不相連的植物可表達啟動子的控制下。
2．根據(jù)權利要求1所述的基因構建物，其中2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶的編碼序列是SEQ ID NO:1。
3．一種轉基因植物，它的基因組中包含權利要求1所述的基因構建物。
4．根據(jù)權利要求3所述的植物，其中該植物的δ-生育酚γ-生育酚之比相對于未轉化的野生型植物有所改變。
5．權利要求3所述的植物的種子。
6．一種轉基因植物，該品種天然產(chǎn)生δ-生育酚，該轉基因植物經(jīng)改變產(chǎn)生γ-生育酚替代了δ-生育酚。
7．權利要求6所述的植物的種子。
8．根據(jù)權利要求6所述的轉基因植物，其中轉基因植物的基因組中攜帶有外來的基因構建物，該基因構建物包含2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因。
9．根據(jù)權利要求8所述的轉基因植物，其中2-甲基-6-葉綠基質體醌/2-甲基-6-茄基質體醌-9甲基轉移酶基因是SEQ ID NO:1。
全文摘要
本發(fā)明公開了被鑒定為編碼光合成生物體的2－甲基－6－葉綠基質體醌/2－甲基－6－茄基質體醌－9甲基轉移酶的基因序列。該酶2－甲基－6－葉綠基質體醌/2－甲基－6－茄基質體醌－9甲基轉移酶是高等植物中產(chǎn)生生育酚和質體醌的基本的酶。認為2－甲基－6－葉綠基質體醌/2－甲基－6－茄基質體醌－9甲基轉移酶參與調節(jié)光合成生物體中各生育酚的相對量。通過將具有在植物啟動子控制下的2－甲基－6－葉綠基質體醌/2－甲基－6－茄基質體醌－9甲基轉移酶編碼序列的基因構建物導入植物中,制成的轉基因植物的2－甲基－6－葉綠基質體醌/2－甲基－6－茄基質體醌－9甲基轉移酶表達有所改變,從而影響植物生育酚組成的改變。這樣就得到了組織中生育酚水平改變的轉基因植物。
文檔編號C12P17/06GK1324211SQ99812505
公開日2001年11月28日 申請日期1999年8月25日 優(yōu)先權日1998年8月25日
發(fā)明者D·德拉彭娜 申請人:內華達州立大學