專利名稱：含有人干擾素的藥物組合物在制備預防或/和治療呼吸道病毒感染疾病藥物方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種含有人干擾素的藥物組合物在制備預防或/和治療呼吸道病毒感染疾病藥物方面的應用，屬于醫(yī)藥領域。
背景技術：
干擾素(interferons，IFNs)是一類至少在同種細胞上有廣譜抗病毒、抗細胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性和在不同途徑上影響細胞的代謝、生長和分化的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮需新合成RNA和蛋白質(zhì)。它是一類重要的細胞素.經(jīng)近30多年的臨床研究和應用，說明它是一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物。
迄今所知，人干擾素存在多個型別干擾素-α，β，δ，γ，ε，κ，λ，τ和ω等型別，它們的主要特點和可能的臨床應用見下表

目前，研究較多并用于臨床治療的有α、β、γ；其它型別干擾素的臨床應用價值尚在研究之中。
干擾素目前主要用于抗病毒和腫瘤治療方面，具有相當明顯的療效，尤其在肝炎的治療方面被認為是首選藥物。鑒于干擾素的廣譜抗菌作用，很有希望用于SARS及其它呼吸道病毒感染疾病的治療，因而，在呼吸道病毒感染疾病方面進行干擾素的應用研究十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有人干擾素的藥物組合物在制備預防或/和治療呼吸道病毒感染疾病藥物方面的用途。
所述的呼吸道病毒可以是濾泡性口腔炎病毒(VSV)，禽流感病毒，SARS冠狀病毒，鼻病毒，麻疹病毒，腸道病毒，腺病毒，皰疹病毒，漢坦病毒。
所述的禽流感病毒可以是低致病性禽流感H9H2或高致病性禽流感H5N1。
所述的鼻病毒可以是鼻病毒14型。
所述的皰疹病毒可以是單純皰疹病毒-1(HSV-1)或單純皰疹病毒-2(HSV-2)。
所述的腸道病毒可以是腸道病毒CoxB1。
所述的腺病毒可以是腺病毒7型。
上述藥物組合物含有如下重量份的組分人干擾素 1-99其它輔料 1-99。
所述的重量份可以是斤、兩、g、Kg等藥劑學上常用的計量單位。
本發(fā)明藥物組合物通過進一步的處理，可以制成藥劑學上可接受的各種劑型，優(yōu)選為注射劑、噴(氣)霧劑、凍干粉針等。
輔料含有保護劑、緩沖溶液。
其中，為了不影響干擾素的活性發(fā)揮，組分中保護劑的含量應不高于0.2％，一般應控制在0.1-0.2％之間。
緩沖溶液的用量應在10-50mmol/L之間，優(yōu)選含量為15-25mmol/L。
上述的人干擾素優(yōu)選人干擾素α2b、α1b、β，還可以是其它I型干擾素，如干擾素ω、干擾素κ、干擾素λ、干擾素ε、即所有人I型干擾素。
上述人干擾素可以是重組人干擾素，也可以是用其他方法制備的人干擾素，如提取的自然人干擾素。
上述的重組人干擾素可以是采用原核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)或真核表達系統(tǒng)生產(chǎn)制備的重組人干擾素。
上述人干擾素優(yōu)選為人干擾素α2b或重組人干擾素α2b。
上述保護劑可以是人白蛋白、牛血清白蛋白、甘露醇、氯化鈉、聚糖、麥芽糖、苯甲醇、聚乙烯醇、甘油等可用的物質(zhì)。
緩沖溶液優(yōu)選磷酸緩沖液。
可以選擇其中的全部或部分使用，用量為藥劑學上的有效劑量，以實現(xiàn)緩沖、穩(wěn)定、防腐作用。
上述人干擾素可以通過發(fā)酵工程制備得到，也可通過商購得到。
上述組合物劑型中，按照實際用量的需要，人干擾素的活性可以是0.1-500萬IU/mL或0.1-500萬IU/g。
干擾素噴霧劑要求干擾素必須達到一定濃度才能有好的效果，而提高干擾素的濃度卻使噴霧劑的穩(wěn)定性變差，因此制備高濃度的干擾素噴霧劑是一個需要突破的技術問題。
本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)，在輔料中選用麥芽糖可以很好的增加制劑的穩(wěn)定性，特別是使噴霧劑的穩(wěn)定性得以增強。
上述劑型的制備方法可以是藥劑學上的通用方法。
所制得的藥物制劑可以用來預防、治療、預防和治療呼吸道病毒感染藥物，特別是用來制備預防、治療、預防和治療SARS病毒、副流感病毒或流感病毒等引起的呼吸道感染藥物。
從實驗室研究、猴體試驗和較大規(guī)模的臨床驗證研究已經(jīng)獲得的大量數(shù)據(jù)證明本發(fā)明噴霧劑預防SARS病毒、副流感病毒、流感病毒等引起的呼吸道感染有較確切的流行病學效果。
本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)重組人干擾素α2b以及其它類型的干擾素在細胞培養(yǎng)上可以抑制SARS病毒的繁殖。
本發(fā)明研究人員采用經(jīng)典的干擾素活性測定方法，采用SARS病毒-RDa細胞(人橫紋肌瘤細胞株)系統(tǒng)，將生長在10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基的RDa細胞按1×105/ml接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔體積100μl，過夜培養(yǎng)后加入100μl系列稀釋的干擾素α2b、α1b、β、ω(各三個平行孔)，作用12小時后棄培養(yǎng)液，重新加入用含2％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的50×TCID50的SARS病毒150μl(中國疾控中心病毒病所分離、培養(yǎng))，24小時后觀察病變，待病毒對照完全病變后，目測記錄抑制50％細胞病變(CPE)的干擾素的最小量，結果證實重組人干擾素a2b、a1b、β在RDa細胞培養(yǎng)上對SARS病毒(冠9株)有明顯的抑制作用。
本發(fā)明所述的藥物組合物對預防或/和治療呼吸道病毒感染疾病有著很好的效果，而且藥物的副作用小，有利于病患者使用。


圖1正常對照組 HE染色 10×40 鼻腔部上皮組織未見增厚，組織結構正常圖2給藥組 HE染色 10×40 上皮組織未見增生，角化不過度，組織結構正常圖3正常對照組 HE染色 10×40 肌肉組織未見有腫脹，未見有炎癥圖4給藥組 HE染色 10×40 肌肉組織未見有腫脹圖5正常對照組 HE染色 10×40 血管內(nèi)有輕度淤血圖6給藥組 HE染色 10×40 血管內(nèi)有輕度淤血圖74種重組人干擾素抑制SARS病毒在Rda細胞系培養(yǎng)上50％病變的最小干擾素單位(n＝4)(各組之間顯著性測定P值均＞0.1)圖84種感染素抑制SARS病毒引起的50％病變的最小干擾素蛋白質(zhì)量(n＝4)在rIFN-a2b、IFN-w1b與rIFN-a1b之間，P＜0.02；其余各組間P＞0.05圖9微陣列基因芯片技術檢測SARS病毒在不同條件下的RNA轉錄水平。
AIFN-0表示沒有預先用干擾素α2b處理的SARS病毒各個基因的RNA水平；BIFN-1-100和CIFN-10000分別表示預先用干擾素α2b 100和10000IU處理細胞的條件下SARS病毒各個基因的RNA水平。
圖10重組人干擾素a2b抑制多種病毒在細胞培養(yǎng)上繁殖相對活性的比較(以抑制VSV引起病變的50％為1與其它病毒進行比較)1VSV，2H9N2，3H5N1，4SARS，5MV，6CoxB1，7Ad-7，8HSV-1，9HSV-2，10EHFV，11RV圖11本發(fā)明產(chǎn)品抑制多種病毒在細胞培養(yǎng)上繁殖相對活性的比較(以抑制VSV引起病變的50％為1與其它病毒進行比較)1VSV，2H9N2，3H5N1，4SARS，5MV，6CoxB1，7Ad-7，8HSV-1，9HSV-2，10EHFV，11RV圖12對照#0401肺組織局灶間質(zhì)性炎，局灶肺間隔增厚圖13對照組#0402肺組織間質(zhì)性炎，肺間隔增厚伴炎細胞浸潤圖14試驗組#0407肺組織形態(tài)基本正常圖15試驗組#0408肺間質(zhì)性炎，增厚肺間隔內(nèi)炎細胞浸潤圖16試驗組#0409肺間質(zhì)性炎，肺間隔融合伴炎細胞浸潤圖17試驗組#0410肺組織形態(tài)基本正常圖18干擾素組和對照組中和抗體滴度的幾何均數(shù)圖19SARS病毒攻擊后27天干擾素組和對照組IgG抗體滴讀的幾何均數(shù)圖20對照組和感染素組在SARS病毒攻擊后不同時間內(nèi)猴咽拭子病毒基因拷貝數(shù)的消長情況(real-timePCR結果)?？v坐標為SARS病毒攻擊后天數(shù)；縱坐標為病毒基因拷貝數(shù)(log)圖21干擾素-α2b噴霧劑對SARS接觸者的預防感染效果(1,730例)(SARS-CoV-IgG抗體陽性率)圖22第一階段實驗兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測情況(927人)圖23第二階段實驗兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測情況(558人)圖24第一、二階段實驗兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測情況(1485人)圖25對照組與干擾素組免疫后陽性標本中的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較圖26對照組與干擾素組免疫后陽性標本的風疹病毒基因拷貝數(shù)的比較圖27對照組與干擾素組免疫后陽性標本中的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較圖28對照組與干擾素組免疫后陽性標本的風疹病毒基因拷貝數(shù)的比較圖29Ct值的確定圖30熒光定量標準曲線圖31對照組與干擾素組免疫后陽性標本中的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較圖32Ct值的確定圖33熒光定量標準曲線圖34對照組與干擾素組免疫后陽性標本的風疹病毒基因拷貝數(shù)的比較
具體實施例方式實施例1按照藥劑學上的方法，制備噴霧劑，每瓶裝量為3.65毫升，其中重組人干擾素-α2b(北京遠策藥業(yè)有限責任公司)活性含量為300萬IU/毫升，人白蛋白含量為0.5％，苯甲醇含量為0.5％，聚糖含量為0.1％，磷酸緩沖液濃度為20mmol/L。
本實施例產(chǎn)品每瓶為300萬IU/mL*3.65mL，一個預防療程為1瓶，使用3-5天，既保證了干擾素局部使用的有效劑量，又可限定用量。
對動物進行了試驗，其對黏膜、皮損皮膚的刺激性與生理鹽水相似，未發(fā)現(xiàn)有嚴重副反應，與美國IntronA粉針劑比較，其副作用為中度，而本實施例產(chǎn)品副作用可忽略不計，可見本發(fā)明產(chǎn)品噴霧劑的具有明顯的副作用小的優(yōu)點。
中藥研究所實驗動物中心進行小鼠鼻咽給藥的安全性試驗，結果表明噴霧劑未見明顯的鼻腔呼吸部的刺激癥狀，組織結構正常。
實施例2按照注射劑的制備方法，將重組人干擾素-α1a(北京遠策藥業(yè)有限責任公司)加入pH為7的磷酸緩沖溶液，使干擾素活性含量為100萬IU/mL，加入苯甲醇作為防腐劑，重量含量為0.5％。
實施例3參照實施例2的方法，將得到的注射液分裝入西林瓶中，每瓶1.5毫升，冷凍干燥，得到凍干粉針劑。
實施例4取重組人干擾素-β(北京遠策藥業(yè)有限責任公司)1000萬IU，7.8g氯化鈉，3.5g Na2HPO4·12H2O，4.4g聚糖，加入注射用水，配制成1000mL溶液，使用H3PO4調(diào)節(jié)pH為7.0，制得水針劑，人干擾素-β活性含量為1萬IU/mL。
實施例5取重組人干擾素-α2b(北京遠策藥業(yè)有限責任公司)1000萬IU，8.5g氯化鈉，1.7gNaH2PO4·2H2O，5.0g聚糖，加入注射用水，配制成1000mL溶液，使用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，制得水針劑，人干擾素-α2b活性含量為1萬IU/mL。
實施例6按照實施例4的方法，將調(diào)節(jié)pH值后的溶液冷凍干燥，制備凍干粉針劑20支，每支人干擾素-β活性含量為50萬IU/mL。
實施例7參照實施例1的制備過程，將其中的聚糖替換為麥芽糖，制得噴霧劑。
比較例將實施例1的產(chǎn)品和實施例7的產(chǎn)品進行長期穩(wěn)定性測試，兩者外觀、澄明度、pH沒有明顯變化，生物活性的穩(wěn)定性表明，實施例1和實施例7的噴霧劑在4-8℃放置24個月活性沒有明顯下降，其他各項指標均符合質(zhì)量要求；在20℃下放置11個月實施例1產(chǎn)品干擾素效價沒有改變，實施例7產(chǎn)品在14個月后效價沒有改變，說明本發(fā)明噴霧劑穩(wěn)定性很好。
實驗例1本實驗例通過對實施例1鼻腔噴霧劑對小白鼠的鼻粘膜刺激作用實驗，進行噴霧劑安全性研究。
1、儀器自動脫水機日本Sakura切片機德國Leitz自動染色機日本Sakura RSH-100光學顯微鏡日本Nikon自動照相生物顯微鏡日本Olympus BH-22、方法2003年6月17日送檢鼠11只，正常對照組5只，給藥組6只。動物處死后解剖，肉眼觀察，立即取外鼻部、鼻粘膜，固定于10％甲醛溶液中，取材后流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲笨透明，浸蠟包埋，切片，HE染色，光學樹脂封片，光學顯微鏡下觀察，照相。各組均附顯微照相彩色照片。
3、觀察結果(1)肉眼觀察結果正常對照組5只小鼠的鼻外膜未見有充血、水腫，未見有潰爛，也未見有明顯的病理形態(tài)學變化。給藥組6只小鼠的鼻外膜基本同正常對照組，未見有充血、水腫，未見有潰爛，未見有明顯的病理形態(tài)學變化。給藥組6只小鼠的鼻外膜基本同正常對照組，未見有充血、y網(wǎng)中，未見有潰(2)鏡下觀察結果5只正常對照組小鼠的鼻上皮丈膜未見有增厚，腔呼吸部表面角化不過度，未見炎癥細胞浸潤。粘膜下層肌肉組織未見有腫脹，有一只小鼠上皮下血管內(nèi)有淤血，組織結構正常。
6只給藥組所送小鼠的鼻腔呼吸部上皮層粘膜未見有增厚，表面角化不過度，未見炎癥細脂浸潤，粘膜下肌肉組織未見有腫脹，上皮下有兩只小鼠血管內(nèi)有淤血，其它組織結構正常。
4、結論所送檢的動物給藥組與正常對照組相比，未見有明顯的鼻腔呼吸部的刺激癥狀，組織結構正常。
5、參考資料(1)《實用組織學》杜卓民主編 人民衛(wèi)生出版社 1998，P48(2)《實用外科病理學》陳忠年主編 上海醫(yī)科大學出版社 1997，P513-536(3)《研究用生物顯微鏡》余炳生 張儀編著 1989，P53-547、小鼠鼻咽部給藥刺激實驗病理組織切片照片，見圖1-6。
實驗例2本發(fā)明產(chǎn)品抗SARS病毒的實驗室研究具體數(shù)據(jù)如下表4種重組人干擾素抑制SARS病毒在Rda細胞系培養(yǎng)上50％病變的最小干擾素單位(n＝4)

注各型干擾素均由大腸桿菌產(chǎn)生，純度均大于95％。各組之間顯著性測定P值均＞0.14種重組人干擾素抑制SARS病毒在Rda細胞系培養(yǎng)上50％病變的最小干擾素單位(n＝4)(各組之間顯著性測定P值均＞0.1)，見圖7。
4種干擾素在Rda細胞系培養(yǎng)上抑制SARS病毒引起50％病變的最小干擾素蛋白量(n＝4)，在rIFN-a2b、IFN-w1b與rIFN-a1b之間，P＜0.02；其余各組間P＞0.05，見下表

4種感染素抑制SARS病毒引起的50％病變的最小干擾素蛋白質(zhì)量(n＝4)在rIFN-a2b、IFN-w1b與rIFN-a1b之間，P＜0.02；其余各組間P＞0.05，見圖8。
SARS病毒全基因組cDNA微陣列生物芯片圖見下表

微陣列基因芯片技術檢測SARS病毒在不同條件下的RNA轉錄水平見圖9，其中AIFN-0表示沒有預先用干擾素α2b處理的SARS病毒各個基因的RNA水平；BIFN-1-100和CIFN-10000分別表示預先用干擾素α2b 100和10000IU處理細胞的條件下SARS病毒各個基因的RNA水平。
實驗例3本發(fā)明產(chǎn)品抑制多種呼吸道病毒的研究(1)鼻病毒除冠狀病毒外，引起感冒的病原主要是鼻病毒，所以我們采用三種人二倍體細胞，研究了重組人α2b型干擾素抗14型鼻病毒的敏感性，結果表明本發(fā)明產(chǎn)品抑制鼻病毒繁殖的活性十分強烈，見下表重組人α2b型干擾素抗鼻病毒的敏感性試驗

干擾素在VSV/WISH測定系統(tǒng)上效價為500000IU/ml作為1計算，表中所列為2次實驗的結果，每次實驗的數(shù)據(jù)均為2次測試的平均數(shù)。由上表可見，鼻病毒-14(RV14)對干擾素是十分敏感的，它與對干擾素最敏感的VSV病毒相比幾乎接近。
(2)11種病毒在不同細胞上對重組人干擾素α2b的敏感性比較。
采用上述同樣的方法，在不同的細胞系統(tǒng)上，比較研究了重組人α2b型干擾素對禽流感強毒株H5N1、弱毒株H9N2，SARS病毒北京分離株，麻疹病毒，柯薩奇病毒CoxB1，7型腺病毒，單純皰疹病毒1和II型，出血熱病毒和鼻病毒等的相對抑制能力，結果見圖10。
圖10結果表明，本發(fā)明產(chǎn)品的抗病毒活性是廣譜的，其中對鼻病毒、SARS病毒，禽流感病毒尤其敏感。
實驗例4本發(fā)明產(chǎn)品對低和高致病性禽流感等11種病毒在細胞培養(yǎng)上的抑制病毒試驗目的在不同細胞培養(yǎng)上研究干擾素α2b多種病毒的抑制作用方法病毒株濾泡性口腔炎病毒(VSV)，低致病性禽流感H9H2，高致病性禽流感H5N1，SARS冠狀病毒病毒所株及香港株，麻疹病毒，腸道病毒CoxB1，腺病毒7型，單純皰疹病毒-1，2(HSV-1，2)，漢坦病毒，鼻病毒14型均由病毒所毒種室提供。
細胞系MDCK細胞系檢測H9N2和H5N1；WISH細胞系測定干擾素活性；人橫紋肌瘤(Rda)細胞系SARS病毒；原代地鼠腎細胞檢測漢坦病毒；二倍體細胞株(WI38)檢測其它病毒。
敏感性比較由于干擾素有很嚴格的種屬特異性，同一干擾素在不同種屬的細胞培養(yǎng)上有不同的活性，因此所有比較均以VSV病毒在所用細胞培養(yǎng)上的干擾素活性為1進行比較，相對活性愈小愈敏感。每次實驗重復3次。
結果11種病毒在不同細胞上對重組人干擾素α2b的敏感性比較見圖11。由圖11可見，人干擾素α2對SARS病毒，禽流感病毒，鼻病毒均很敏感。
實驗例5本實驗例為實施例1產(chǎn)品鼻腔噴霧劑預防和治療恒河猴感染SARS-CoV病毒感染的效果試驗。
由中國醫(yī)學科學院動物研究所恒河猴作為SARS-CoV病毒感染動物模型。
本研究的試驗動物來源于昆明中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所；種屬品系恒河猴；動物級別SPF級；體重2.4-4.2kg；年齡3歲。共10只恒河猴，雌雄兼用，隨機分為2組，每組5只。分別為試驗組(實施例1)和對照組(空白干擾素噴霧劑)。病毒株為PUMC01(Sino-3)株SARS-CoV；病毒滴度為5.08LgCCID50/ml，-80℃保存，攻擊病毒量為105TCID50，1.0ml/只，經(jīng)鼻腔噴霧吸入。
分別在攻毒前19h和1h，攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h經(jīng)鼻腔不同時間經(jīng)鼻腔噴霧干擾素-α2b，每次0.4ml/只。按計劃定時取咽拭子做real-time PCR檢測和病毒分離；取靜脈血做病毒分離檢測、中和抗體、IgG抗體、血常規(guī)、血生化和血凝指標以及大體解剖和組織病理檢查。
10只動物隨機分為2組，5只/組。分別為試驗組(實施例1)和對照組(空白干擾素)。分別在攻毒前19h和1h，攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h不同時間經(jīng)鼻吸入受試物，0.4ml/只。按計劃定時取咽拭子做real-time PCR檢測和病毒分離；取靜脈血做病毒分離檢測、中和抗體、IgG、血常規(guī)、血生化和血凝指標。
結果1.對照組全部動物咽拭子標本經(jīng)real-time PCR均檢出SARS-CoV病毒，持續(xù)時間從攻毒后2天至8天。攻毒后2天3只、5天1只、7天2只，其咽拭子標本中病毒分離陽性，攻毒后，誘導產(chǎn)生高滴度的中和抗體和IgG，證實病毒感染。大體解剖全部動物肺臟為灰白色，有大面積出血，2只動物肺臟與胸壁有粘連。病理結果顯示2只動物有肺間質(zhì)性炎，其中#0402病變范圍較#0401廣，表現(xiàn)為以肺間隔增厚、單核樣細胞為主的炎細胞浸潤為主要特征的肺部病變，病變較單一；其它各受檢臟器均未見明顯異常。2.試驗組和對照組相同時取的咽拭子等標本中，real-time PCR檢測和病毒分離均未檢出病毒。攻毒后病毒導致機體產(chǎn)生的中和抗體和IgG抗體的反應很弱。3.血常規(guī)、血生化和血凝指標結果表明干擾素試驗組動物攻毒后各項指標較試驗前比較沒有顯著性改變；大體解剖動物肺臟為灰粉色，4只動物肺臟有少量出血，其中1只動物肺臟與胸壁有粘連。病理結果顯示2只動物肺組織形態(tài)基本正常，2只動物有肺間質(zhì)性炎，表現(xiàn)為以肺間隔增厚、單核樣細胞為主的炎細胞浸潤為主要特征的肺部病變，病變較單一，其中1只增厚的肺間隔有局灶相互融合，這2例肺部病變與對照組的病變表現(xiàn)一致，而病變累及范圍較模型組??；其它各受檢臟器均未見明顯異常。
結論本發(fā)明實施例1可以有效阻斷或減弱SARS-CoV病毒對恒河猴的感染。對恒河猴有保護作用。臨床觀察無不良反應。
目的評價重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑對預防治療SARS-CoV病毒感染恒河猴的作用受試物1.名稱本發(fā)明實施例1腔噴霧劑用于試驗組干擾素含量300萬單位/毫升，每瓶3.65毫升，共1095萬單位制備方法大腸桿菌生產(chǎn)，高度純化(＞95％)保存條件4℃溶劑磷酸緩沖液、人白蛋白、甘露醇、氯化鈉、苯甲醇2.名稱空白干擾素鼻腔噴霧劑，用于對照組干擾素含量無制備方法以生理鹽水替代干擾素保存條件4℃溶劑磷酸緩沖液、人白蛋白、甘露醇、氯化鈉、苯甲醇3.攻擊用毒種名稱PUMC01(Sino-3)株SARS-CoV提供單位中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所病毒滴度5.08LgCCID50/ml保存條件-80℃動物來源中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所種屬品系恒河猴動物級別SPF級合格證號滇實動證第2003006體重2.4-4.2kg年齡3歲每組動物數(shù)5只性別雌雄兼用飼養(yǎng)條件動物飼養(yǎng)在BSL-III實驗室內(nèi)，隔離柜單籠飼養(yǎng)，壓差-20Pa，溫度20±1℃，換氣次數(shù)為14-17次/小時，每日飼喂2次混合顆粒飼料。試驗前動物適應1周，檢查動物的血常規(guī)、血凝指標、血生化、抗SARS抗體等各項指標，擇其正常，健康，雌性無孕的動物作為受試動物。
飼料種類猴膨化飼料供給單位軍事醫(yī)學科學院動物中心合格證號SCXK-(軍)2002-001動物分組及劑量

分組方法隨機分組動物攻毒劑量105TCID50，1.0ml/只動物攻毒途徑經(jīng)鼻吸入給受試物途徑與臨床擬用途徑一致經(jīng)鼻吸入實驗室中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所生物安全三級防護實驗室(BSL-III)。
許可證號SYXK(京)2003-0004試驗方法10只動物隨機分為2組，5只/組。分別為試驗組(重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑)和對照組(空白干擾素)。共給予10次受試物，分別為攻毒前19h和1h，攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h。經(jīng)鼻吸入受試物，0.4ml/只(0.2ml/鼻孔)。攻毒后1-8天每天取咽拭子做real-timePCR檢測；攻毒后2天、5天、7天咽拭子和血漿做病毒分離；攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天取血測血常規(guī)、血生化和血凝指標；攻毒后11天、19天和27天取血測IgG；攻毒后19、27天取血測中和抗體。
觀察指標1.一般狀態(tài)的觀察。
2.中和抗體攻毒后19、27天。
3.IgG試驗前及攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。
4.real-time PCR檢測咽拭子攻毒后1-8天。
5.病毒分離(咽拭子和血漿)攻毒后2天、5天、7天。
6.血常規(guī)攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。
7.血生化攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。
8.血凝攻毒后3天、7天、11天、15天、19天、23天和27天。
9.臟器系數(shù)。
10.大體解剖。
11.組織病理。
結果一.一般狀態(tài)的觀察對照組動物攻毒后1-2天時體溫一過性升高，第3天全部動物出現(xiàn)精神欠佳、活動減少、攝食量減少，3只動物出現(xiàn)呼吸短促等臨床癥狀，到攻毒后第7天有所緩解。干擾素試驗組動物未見異常。
試驗組體溫在攻毒后7天和11天與對照組比較有顯著性降低，P＜0.05，對照組攻毒0天、3天和11天與試驗前比較有顯著性升高，P＜0.05。結果見下表動物體溫結果，n＝5，單位℃

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。
二.中和抗體動物攻毒后19天，試驗組動物中和抗體水平很低，1∶5-10，GMT為7.6，與對照組比較有非常顯著性差異，P＜0.01；對照組動物中和抗體滴度1∶20-80，GMT為45.9。攻毒后27天，試驗組動物中和抗體仍然處于低水平，滴度為1∶5-10，GMT為10.0，與對照組比較有顯著性差異，P＜0.05；對照組動物中和抗體滴度1∶10-80，GMT為40.0。中和抗體結果見下表


血清1∶5開始對倍稀釋，終濃度到1∶640，GMT為幾何均數(shù)。
*表示試驗組動物明顯低于對照組動物，且經(jīng)t檢驗，與對照組有顯著性差異，P＜0.05；**表示試驗組與對照組比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
三.IgG試驗組動物從攻毒后15天到第27天，產(chǎn)生低水平抗體或未有抗體產(chǎn)生；此期間對照組動物產(chǎn)生較高抗體，并持續(xù)到27天安樂死。結果見下表

四.real-time PCR對照組全部動物咽拭子均檢出SARS-CoV病毒，持續(xù)時間從攻毒后2天至8天。試驗組動物咽拭子未檢出病毒?？截悢?shù)目見下表

五.病毒分離對照組動物咽拭子攻毒后2天3只為陽性，5天1只為陽性，7天2只為陽性。試驗組動物咽拭子和所有動物血漿均為陰性。病毒分離結果見下表

六.血常規(guī)動物攻毒后3天、7天，試驗組與對照組比較RBC、HgB有顯著性升高，P＜0.05；攻毒后11天、15天和19天試驗組和對照組與攻毒前比較有顯著性降低，P＜0.05。結果見表6～表13。
表6試驗前血常規(guī)，n＝5

試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
表7攻毒3天血常規(guī)，n＝5

*表示試驗組動物明顯低于對照組動物，且經(jīng)t檢驗，與對照組有顯著性差異，P＜0.05。
表8攻毒7天血常規(guī)，n＝5


*表示試驗組動物明顯低于對照組動物，且經(jīng)t檢驗，與對照組有顯著性差異，P＜0.05；#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
表9攻毒11天血常規(guī)，n＝5

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
表10攻毒15天血常規(guī)，n＝5

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
表11攻毒19天血常規(guī)，n＝5

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
表12攻毒23天血常規(guī)，n＝5

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。
表13攻毒27天血常規(guī)，n＝5


#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
七.血生化對照組動物攻毒后ALT、AST、CK、UREA、ALP與試驗前比較顯著性升高，P＜0.05。試驗組動物ALP、LDH、CK與試驗前比較顯著性升高，P＜0.05。結果見表14～表21。
表14試驗前血生化，n＝5

試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
表15攻毒3天血生化，n＝5

**表示試驗組與對照組有非常顯著性差異P＜0.01。#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。
表16攻毒7天血生化，n＝5


#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
表17攻毒11天血生化，n＝5

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
表18攻毒15天血生化，n＝5

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
表19攻毒19天血生化，n＝5


#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
表20攻毒23天血生化，n＝5

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
表21攻毒27天血生化，n＝5

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05.##表示與試驗前自身比較有非常顯著性差異，P＜0.01。試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
八.血凝指標攻毒后19天試驗組與對照組比較，APTT顯著性升高，P＜0.05；攻毒后23天試驗組與對照組比較，TT顯著性降低，P＜0.05；但與試驗前比較，均無顯著性改變。試驗組APTT與攻毒前比較有顯著性下降，P＜0.05。結果見表22～表29。
表22試驗前血凝指標，n＝5

*表示試驗組動物明顯低于對照組動物，且經(jīng)t檢驗，與對照組有顯著性差異，P＜0.05；**表示試驗組與對照組有非常顯著性差異P＜0.01。
表23攻毒3天血凝指標，n＝5


試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
表24攻毒7天血凝指標，n＝5

*表示試驗組動物明顯低于對照組動物，且經(jīng)t檢驗，與對照組有顯著性差異，P＜0.05；#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示有非常顯著性差異P＜0.01。
表25攻毒11天血凝指標，n＝5

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示有非常顯著性差異P＜0.01。
表26攻毒15天血凝指標，n＝5

#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。##表示有非常顯著性差異P＜0.01。
表27攻毒19天血凝指標，n＝5

*表示試驗組動物明顯低于對照組動物，且經(jīng)t檢驗，與對照組有顯著性差異，P＜0.05；表28攻毒23天血凝指標，n＝5

*表示試驗組動物明顯低于對照組動物，且經(jīng)t檢驗，與對照組有顯著性差異，P＜0.05；#表示與試驗前自身比較有顯著性差異，P＜0.05。
表29攻毒27天血凝，n＝5

試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
九.臟器系數(shù)表30臟器系數(shù)結果，n＝5


試驗組與對照組比較，未見顯著性改變。
十.大體解剖對照組全部動物肺臟為灰白色，有大面積出血，其中2只動物肺臟與胸壁有粘連。
試驗組動物肺臟為灰粉色，4只動物肺臟有少量出血，其中1只動物肺臟與胸壁有粘連。
十一.組織病理對照組恒河猴#0401、#0402有肺間質(zhì)性炎，其中#0402病變范圍較#0401廣，表現(xiàn)為以肺間隔增厚、單核樣細胞為主的炎細胞浸潤為主要特征的肺部病變，病變較單一；其它各受檢臟器均未見明顯異常。
試驗組恒河猴#0407、#0410肺組織形態(tài)基本正常，#0408、#0409有肺間質(zhì)性炎，表現(xiàn)為以肺間隔增厚、單核樣細胞為主的炎細胞浸潤為主要特征的肺部病變，病變較單一，#0409增厚的肺間隔有局灶相互融合，#0408、#0409肺部病變與對照組的病變表現(xiàn)一致，而病變累及范圍較模型組?。黄渌魇軝z臟器均未見明顯異常。
見圖12-17。
病理結果顯示對照組恒河猴2例動物肺病理變化顯示肺間質(zhì)性炎改變，說明模型成立。受試物干擾素α2b可使試驗組動物的病變范圍減少或不發(fā)病。
研究結論如下1.PCR檢測、病毒分離結果表明實施例1噴霧劑可以有效阻斷SARS-CoV病毒對恒河猴的呼吸道感染。
2.中和抗體和IgG檢測結果表明實施例1噴霧劑能有效抑制了病毒的感染和復制，導致機體產(chǎn)生的中和抗體和IgG抗體的水平降低，對照組動物由于沒有干擾素保護，病毒感染機體后，在體內(nèi)大量復制，誘導產(chǎn)生高滴度的中和抗體和IgG抗體，證實病毒感染。
3.血常規(guī)、血生化和血凝指標結果表明試驗組動物攻毒后各項指標較試驗前比較沒有顯著性改變，證明重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑對恒河猴無不良反應。
4.病理結果顯示對照組恒河猴2例動物肺病理變化顯示肺間質(zhì)性炎改變，與建立SARS動物模型時的結果一致，說明模型成立。受試物干擾素-α2b可使試驗組動物的病變范圍減少或不發(fā)病。
本實驗例的主要數(shù)據(jù)見圖18-20。
猴體試驗結果表明，本發(fā)明鼻腔噴霧劑預防和治療恒河猴SARS冠狀病毒感染的效果是明顯的。
實驗例6本發(fā)明噴霧劑預防SARS及其它呼吸道病毒感染的流行病學效果評價研究經(jīng)過SFDA批準，并由科技部SARS公關組立項委托廣州第一軍醫(yī)大學流行病教研室由俞守義教授負責承擔觀察和驗證本發(fā)明噴霧劑預防SARS病毒感染的安全性和流行病學效果評價研究。采用實驗流行病學的方法，總觀察對象為15,611人；為分兩個階段開展評價研究。第一階段在2003年5-6月期間進行，在高危人群中采用多中心、整群抽樣和分組同期平行的方法進行實驗，對照為空白對照。第二階段在2003年12月-2004年2月進行，在人群中采用雙盲、安慰劑對照和隨機分組的方法進行實驗。在預防SARS病毒感染的流行病學效果評價研究的同時，經(jīng)SFDA批準，還對幾種常見呼吸道病毒感染的預防效果同時進行了流行病學預防效果的觀察。
2003年5月下旬至6月中旬在6個現(xiàn)場同時鋪開工作，研究對象共14391人，分布于六個省(直轄市市)21個單位。其中8881人為用藥組，5510人為對照組(空白對照)，收集調(diào)查表13254份，脫落1137人，完成研究應答率92.1％，共采血約6892人份(雙份血清)。
2003年12月～2004年2月又選擇對SARS易感、隨訪觀察研究對象共1220人，其中實驗組545人，對照組675人。共采血約共271人份(雙份血清)。
1、本發(fā)明噴霧劑(實施例1)的安全性共觀察14472人。實驗組用藥的第二天，觀察到一些較輕的流感樣不良反應，發(fā)生的高峰在第三天(個別在第二天或第四天)但所有癥狀均為可逆性反應，停藥后消失。未見有其它嚴重不良反應的發(fā)生。
用藥組出現(xiàn)的常見不良反應有頭痛、頭暈、乏力、肌肉酸痛、咽干、咽痛、等，但主要出現(xiàn)在用藥的前3天；不良反應在停藥后顯著下降，其發(fā)生率甚至顯著低于對照組。在觀察期間始終未發(fā)現(xiàn)在接受干擾素噴霧劑的人員中出現(xiàn)有血涕副反應。
2、對SARS發(fā)病的保護效果觀察(1)兩個階段兩組觀察人群均沒有發(fā)生SARS病例，故未能評價本藥物對SARS發(fā)病的直接保護效果。
(2)對SARS病毒感染的保護率抽取了接觸SARS病人機會相等的1,730人的雙份血清，其中試驗組930人；對照組800人，同時間內(nèi)進行SARS病毒IgG抗體檢測，結果表明試驗組的總抗體陽性率為2.15％，對照組為3.50％，對照組較試驗組高，但未達到統(tǒng)計學的顯著性要求(p＞0.05)。另一方面，在當時SARS流行的特定情況下，研究組無法保證對照組人員不私下使用其它免疫制劑、干擾素或其它的抗病毒藥物。
實施例1噴霧劑對SARS接觸者的預防感染效果(1,730例)(SARS-CoV-IgG抗體陽性率)見圖21。
待檢的雙份血清同時采用SARS-CoV-IgG抗體ELISA試劑盒進行篩檢，篩檢陽性者再重做一次，兩次陽性者則確定為陽性。試劑盒采用北京華大吉比愛生物技術有限公司生產(chǎn)的“冠狀病毒IgG抗體檢測試劑盒”。方法按使用說明書進行。
(3)病人和接觸者使用干擾素的回顧性調(diào)查結果對2003年1月份以來在廣州軍隊醫(yī)院住院的SARS確診病人149人以及疑似病人14人進行了流行病學回顧性調(diào)查表明，所有上述病例在發(fā)病前10天均未用過任何干擾素制劑。而這些醫(yī)院接觸SARS的醫(yī)務人員中，使用自制的α干擾素或其他干擾素滴鼻液者共1020人，無一人發(fā)生SARS、疑似SARS和流感病例。
以上結果說明實施例1噴霧劑預防SARS病毒感染的可行性是明顯的。
3、對呼吸道其它病毒感染的保護效果觀察在兩個階段的安全性試驗中，盡管在用藥期間實驗組觀察到出現(xiàn)咽干等癥狀較對照組高，但停藥后有關癥狀消減。用藥5天后停藥繼續(xù)觀察5天，對照組的上呼吸道癥狀反而顯著高于服藥組，就已經(jīng)提示本藥物可能對一般上呼吸病毒道感染有一定的預防作用。為此，對2003年5月～6月和2003年12月～2月進行了兩次系統(tǒng)的人群實驗，抽取了部分人群的血清以檢測常見呼吸道病毒感染情況。我們重點以1-3型副流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒(3，7型)等常見的呼吸道病毒感染為觀察指標來評價本藥物對病毒性呼吸道感染的保護作用。
待檢血清采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對副流感病毒(1、2、3型混合)、腺病毒(3、7型)、呼吸道合胞病毒和B型流感病毒IgM抗體進行篩檢，篩檢陽性者再重做一次，兩次陽性者則確定為陽性。試劑盒采用深圳賽爾生物技術有限公司生產(chǎn)的“呼吸道感染病毒IgM/抗體EIA試劑盒(96T/48T)”。方法按使用說明書進行。
第一階段實驗兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測情況(927人)見下表

第一階段實驗兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測情況(927人)見圖22。
第二階段實驗兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測情況(558人)見下表

第二階段實驗兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測情況(558人)見圖23。
第一、二階段實驗兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測情況(1485人)見圖24。
以上結果表明，在第一階段927例雙份血清試驗中，試驗組的副流感病毒、B型流感病毒和呼吸道合胞病毒的IgM陽性率顯著低于對照組，P值分別為＜0.01，＝0.05和＜0.05。在第二階段558例雙份血清試驗中，試驗組的副流感病毒、B型流感病毒的IgM陽性率也顯著低于對照組，P值分別為＜0.01和＜0.05。這說明本發(fā)明噴霧劑對副流感病毒1-3型、乙型流感病毒等常見呼吸道病毒感染有一定預防效果。
以上副流感病毒和B型流感病毒均為兒童和成年人呼吸道感染的常見病原；而呼吸道合胞病毒和3，7型腺病毒為兒童時期的呼吸道感染的常見病原。
這一情況與上述以成人為對象的研究結果是吻合的。詳細資料如下2003年3月我國突發(fā)SARS流行，國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)于同年4月同意批準北京遠策藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)的本發(fā)明噴霧劑開展預防SARS病毒感染的流行病學效果評價研究。為了觀察和驗證實施例1噴霧劑預防SARS病毒感染的安全性和預防效果，我們采用實驗流行病學的方法，總觀察對象為15,611人為分二個階段開展評價研究。第一階段在2003年5-6月期間進行，在高危人群中采用多中心、整群抽樣和分組同期平行的方法進行實驗，對照為空白對照。第二階段在2003年12月-2004年2月進行，在人群中采用雙盲、安慰劑對照和隨機分組的方法進行實驗。在預防SARS病毒感染的流行病學效果評價研究的同時，經(jīng)SFDA批準，還對幾種常見呼吸道病毒感染的預防效果同時進行了流行病學預防效果的觀察，評估研究結果如下第一部分 實驗現(xiàn)場、人群和方法第一階段現(xiàn)場工作(準實驗研究)研究開始時正值我國2003年SARS流行的中、后期，按照臨床試驗的要求和規(guī)范以及當時SARS流行的嚴重性和特殊性以及SARS預防的實際情況(國家要求零病例措施！)開展研究，因此不可能采用評估新藥效果應當采用的隨機、雙盲、安慰劑對照方法，只能采用準實驗研究(非雙盲、非隨機分組對照)方法進行效果評估。
現(xiàn)場河南、北京、天津、河北、內(nèi)蒙和廣東六省市。
研究對象入選標準SARS發(fā)生較多地區(qū)的重點人群，能夠理解并能按要求用藥和填寫調(diào)查表的成年人，知情同意，自愿參加。
研究對象排除標準疑似或確診的SARS病人，有干擾素過敏史的人，患有腫瘤、糖尿病、慢性肝炎等免疫力低下的病人，孕婦及哺乳期婦女。
剔除標準對已被選入本臨床研究，屬于以下情況之一者，作為剔除對象。
1.不符合納入標準，或符合排除標準者2.一次藥未用者3.無任何記錄者脫落(退出)標準對已被選入本臨床研究，屬于以下情況之一者，作為脫落者。
1.受試者依從性差，不能按時按量用藥。
2.受試者不愿意繼續(xù)進行臨床試驗，向研究者提出退出者。
用藥方法1.藥物名稱和規(guī)格名稱本發(fā)明實施例1噴霧劑研制單位北京遠第藥業(yè)有限責任公司規(guī)格3.65×300萬IU/ml，每噴一下0.1ml保存2～8℃避光保存2.用量和方法每天噴兩次，每次分別噴左右鼻腔、咽喉各一下(即60萬IU/天)，連用五天(共1000萬IU)。
觀察內(nèi)容和方法1.調(diào)查內(nèi)容調(diào)查表內(nèi)容包括一般情況(姓名、年齡、性別、噴藥前兩周及噴藥期間服用藥物情況等)和使用干擾素噴霧劑后常見的不良反應(體溫、咳嗽、咳痰、頭痛、頭暈、乏力、肌肉酸痛、鼻塞、打噴嚏、咽痛、咽干、腹瀉、腹痛和皮疹等)。
方法給每個實驗對象發(fā)調(diào)查表，由其從試驗的第一天開始每晚自填研究開始后十天的反應。
2.干擾素噴霧劑應用情況學校和戰(zhàn)士研究開始后，對實驗組發(fā)放調(diào)查表和干擾素噴霧劑，以學員隊為單位統(tǒng)一管理。每天中午12:30和下午19:00由班長發(fā)放干擾素噴霧劑，學員按照說明書使用，噴完后由班長統(tǒng)一收集，放回隊部配有的專用冰箱中進行保存。
醫(yī)院、賓館和其他人群干擾素發(fā)給每個實驗對象，由其自己保存(存放于單位或家中的冰箱里)，每天中午和晚上使用。
對照組人群每天晚上填表，但不用干擾素噴霧劑。
3.觀察項目和時間觀察項目不良反應、SARS發(fā)病情況、SARS感染情況(SARS病毒IgG抗體陽性為標準)和影響實驗結果的其他干擾因素。
觀察時間10天，前5天用藥，停藥后繼續(xù)觀察至第十天。
4.血清采集研究開始時對實驗組和對照組所有人員抽血，當天分離出血清保存于4℃冰箱內(nèi)，20天后抽第二次血，分離血清，雙份血清均在-20℃保存。
血清學檢測1.血清抗SARS-CoV-IgG抗體的檢測待檢的雙份血清同時采用SARS-CoV-IgG抗體ELISA試劑盒進行篩檢，篩檢陽性者再重做一次，兩次陽性者則確定為陽性。
試劑盒采用北京華大吉比愛生物技術有限公司生產(chǎn)的“冠狀病毒IgG抗體檢測試劑盒”。方法按使用說明書進行。
(2)呼吸道病毒血清IgM抗體的檢測待檢血清采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對副流感病毒(1、2、3型混合)、腺病毒(3、7型)、呼吸道合胞病毒和B型流感病毒IgM抗體進行篩檢，篩檢陽性者再重做一次，兩次陽性者則確定為陽性。
試劑盒采用深圳賽爾生物技術有限公司生產(chǎn)的“呼吸道感染病毒IgM/抗體EIA試劑盒(96T/48T)”。方法按使用說明書進行。
安全性評價對用藥期間出現(xiàn)的所有不良反應和不良事件均進行記錄和分析。
預防效果評價對兩組人群SARS發(fā)病情況進行比較，對接觸SARS的高危人群(醫(yī)務人員)用藥前后的血清進行檢測，分析SARS病毒IgG抗體陽性率的變化情況。同時觀察對常見呼吸道病毒血清IgM抗體的變化情況。
統(tǒng)計分析本研究的數(shù)據(jù)處理和分析工作由暨南大學經(jīng)濟管理學院負責進行，用Epidata2.1軟件建立數(shù)據(jù)庫，所有調(diào)查表均由專人負責錄入、檢查錯誤和整理。由專人用SPSS10.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。
質(zhì)量控制(1)統(tǒng)一方法(2)開展研究前對研究人員集中進行培訓(3)研究開始前在參試人員中開設講座，說明重組人干擾素α-2b噴霧劑的作用、可能的不良反應、使用方法和調(diào)查表的內(nèi)容及填寫方式。
(4)研究期間派專人對各個現(xiàn)場進行監(jiān)察訪問，保證各現(xiàn)場按照研究計劃進行。
(5)隨訪期間每天由專人督促服藥和填表，確保漏服率＜5％，失訪率＜10％。
2003年5月下旬至6月中旬在6個現(xiàn)場同時鋪開工作，研究對象共14391人，分布于六個省(直轄市市)21個單位。其中8881人為用藥組，5510人為對照組(空白對照)，收集調(diào)查表13254份，脫落1137人，完成研究應答率92.1％，共采血約6892人份(雙份血清)。
第二階段現(xiàn)場工作(雙盲、安慰劑對照隨機試驗)；2003年12月～2004年2月進行，選擇對SARS易感、便于隨訪觀察研究對象共1220人，其中實驗組545人，對照組675人。
研究人群1廣州省軍區(qū)教導大隊新兵連，研究對象共221人，其中實驗組111人，安慰劑組110人。血清共221人份。
研究人群2珠海警備區(qū)新兵團，研究對象共549人，實驗組234人，安慰劑組315人。血清兩組共回收50人份。
研究人群3廣州市槎頭野生動物市場從業(yè)人員，研究對象450人，實驗組200人，對照組250人。
采用完全隨機方法分組，雙盲實驗，對照組采用外形與藥物完全相同但不含藥物成分的安慰劑。
除了隨機分組、雙盲和安慰劑對照外，研究方法如研究對象的納入和排除標準、服藥和隨訪方法、評價指標和方法、資料分析和統(tǒng)計方法、質(zhì)量控制方法均同第一階段實驗。
本階段研究對象1220人中，脫落僅2人，完成研究應答率為99.99％。
兩階段研究合計脫落1139人，脫落率合計為7.3％。
第二部分 研究結果1、研究對象脫落情況本研究中，兩階段段研究合計有7.3％的研究對象脫落，其中第一階段脫落率為7.9％，第二階段僅為0.16％。對第一階段廣州點實驗組105名脫落研究對象進行了調(diào)查，脫落的原因構成如下表


調(diào)查表明因用藥后感到不適而停止用藥的人僅占很小的比例。
2、本發(fā)明噴霧劑的安全性實驗組用藥的第二天，觀察到一些較輕的流感樣不良反應，發(fā)生的高峰在第三天(個別在第二天或第四天)但所有癥狀均為可逆性反應，停藥后消失。未見有其它嚴重不良反應的發(fā)生，見下表

兩階段用藥組和對照組隨訪第3天(或發(fā)生率最高的時間)不良反應發(fā)生率比較(14472人)※第2天※※第4天第一階段實驗時，與對照組比較，用藥組體溫未見異常；用藥期間用藥組出現(xiàn)的不良反應如頭痛、頭暈、乏力、肌肉酸痛、咽干、咽痛、腹痛、腹瀉等的發(fā)生率雖然高于對照組，但主要出現(xiàn)在用藥的前3天，見下表

第一階段實驗隨訪第3天時(或發(fā)生率最高的時間)兩組不良反應發(fā)生率比較(13,254人)※第2天※※第4天不良反應在停藥后顯著下降，其發(fā)生率甚至顯著低于對照組。在觀察期間始終未發(fā)現(xiàn)在接受干擾素噴霧劑的人員中出現(xiàn)有血涕副反應。
第二階段用藥期間，與對照組比較，用藥組體溫也未見異常，對照組體溫異常率反而高于用藥組；用藥期間用藥組的不良反應只有乏力和咽干顯著高于對照組(率差分別為2.12％和3.87％，見下表


第二階段實驗隨訪第3天時兩組不良反應發(fā)生率比較(1218人)。
與第一階段實驗相同，不良反應主要出現(xiàn)在用藥的前3天，停藥后顯著下降，其發(fā)生率甚至顯著低于對照組。
與第一階段一樣，在觀察期間始終未發(fā)現(xiàn)在接受干擾素噴霧劑的人員中出現(xiàn)有血涕副反應。
上述第一、二階段現(xiàn)場安全性研究結果表明重組人干擾素α-2b噴霧劑(遠策素噴霧劑)的安全性是良好的，使用者是可以耐受的。始終未發(fā)現(xiàn)在接受干擾素噴霧劑的人員中出現(xiàn)有血涕副反應。
2、對SARS發(fā)病的保護效果觀察(1)對SARS發(fā)病的保護率兩個階段兩組觀察人群均沒有發(fā)生SARS病例，故未能評價本藥物對SARS發(fā)病的保護效果。
(2)對SARS病毒感染的保護率抽取了接觸SARS病人機會相等的1,730人的雙份血清，其中試驗組930人；對照組800人，同時間內(nèi)進行SARS病毒IgG抗體檢測，結果表明試驗組的總抗體陽性率為2.15％，對照組為3.50％，對照組較試驗組高，但未達到統(tǒng)計學的顯著性要求(p＞0.05)。另一方面，在當時SARS流行的特定情況下，研究組無法保證對照組人員不私下使用其它免疫制劑、干擾素或其它的抗病毒藥物。
(3)病人和接觸者使用干擾素調(diào)查情況對2003年1月份以來在廣州軍隊醫(yī)院住院的SARS確診病人149人以及疑似病人14人進行了流行病學調(diào)查表明，所有上述病例在發(fā)病前10天均未用過任何干擾素制劑。而這些醫(yī)院接觸SARS的醫(yī)務人員中，使用自制的α干擾素或其他干擾素滴鼻液者共1020人，無一人發(fā)生SARS、疑似SARS和流感。
根據(jù)以上結果，可以認為，重組人干擾素α-2b噴霧劑(遠策素噴霧劑)可能對SARS病毒感染有保護作用。
3、對呼吸道其它病毒感染的保護效果觀察(1)兩個階段的實驗均表明，盡管在用藥期間實驗組出現(xiàn)咽干等癥狀較對照組高，但停藥后有關癥狀消減。用藥5天后停藥繼續(xù)觀察5天，對照組的上呼吸道癥狀反而顯著高于服藥組，提示本藥物可能對一般上呼吸病毒道感染有一定的預防作用。
(2)對2003年5月～6月和2003年12月～2月兩次的人群實驗，抽取了部分人群的血清以檢測常見呼吸道病毒感染情況。。我們重點以1-3型副流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒(3，7型)等常見的呼吸道病毒感染為觀察指標來評價本藥物對病毒性呼吸道感染的保護作用。
第一階段實驗兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測情況(927人)見下表

第二階段實驗兩組血清三種呼吸道病毒IgM檢測情況(558人)見下表


以上結果表明，在第一階段927例雙份血清試驗中，試驗組的副流感病毒、B型流感病毒和呼吸道合胞病毒的IgM陽性率顯著低于對照組，P值分別為＜0.01，＝0.05和＜0.05。在第二階段558例雙份血清試驗中，試驗組的副流感病毒、B型流感病毒的IgM陽性率也顯著低于對照組，P值分別為＜0.01和＜0.05。
這說明本發(fā)明噴霧劑對常見呼吸道病毒感染有一定預防效果。
以上副流感病毒和B型流感病毒均為兒童和成年人呼吸道感染的常見病原；而呼吸道合胞病毒和3，7型腺病毒為兒童時期的呼吸道感染的常見病原。這一情況與上述結果也是吻合的。
實驗例7本發(fā)明噴霧劑預防SARS及其它呼吸道病毒感染的人體安全性2003年4月24日SFDA批準重組人干擾素a2b噴霧劑進行預防SARS的臨床研究，主要由由廣州第一軍醫(yī)大學負責，評估遠策素噴霧劑預防SARS及其它呼吸道病毒感染的效果和安全性；與此同時，北京遠策藥業(yè)有限責任公司也組織力量，就藥物的安全性和效果進行臨床研究。遠策藥業(yè)已發(fā)放約10萬瓶，用于下列人群1.北京地區(qū)專收SARS病人的醫(yī)院的一、二線人員包括中日友好醫(yī)院；中國醫(yī)學科學院整形醫(yī)院；2.寧夏疾病預防和控制中心的一、二線人員；3.內(nèi)蒙古呼而浩特一線人員；(廣州俞守義教授提供，用以對比)4.華南某高校一線人員；(廣州俞守義教授提供，用以對比)5.北京SARS高流行區(qū)的重點人群；6.2004年4月病毒所實驗室SARS病毒泄露的一、二線人員。
獲得如下結論(1)連續(xù)使用1-2瓶無嚴重副反應，使用者主訴有鼻、咽干燥、打噴嚏、鼻塞、乏力、頭暈等副反應，基本上與廣州研究組的結果一致，實施例1噴霧劑是安全的，未發(fā)現(xiàn)有血涕副反應。
在SARS流行期間使用實施例1噴霧劑的副反應見下表統(tǒng)計

注一線直接接觸SARS病人二線間接接觸SARS患者；一般人群SARS流行區(qū)流行期間的人群。
(1)使用1瓶噴霧劑；(2)使用2瓶噴霧劑；(3)每人1-3瓶(47人使用3瓶，3610人使用2瓶，其余使用1瓶)。
*數(shù)據(jù)來源于廣州俞教授，用以對比。
(2)回顧性流行病學調(diào)查表明，凡接受用藥的人群未發(fā)現(xiàn)發(fā)燒病例、疑似病例或可能病例。
(3)2004年4月病毒所發(fā)現(xiàn)實驗室泄露SARS病毒后，全所所有人員約400人(隔離前和隔離后)使用了2瓶實施例1噴霧劑，在用藥后18天后檢測受試者的血清SARS病毒IgG抗體和IgM抗體均未發(fā)現(xiàn)陽性者；也未發(fā)現(xiàn)有SARS可能病例。
實驗例8本發(fā)明噴霧劑干預麻疹、風疹和腮腺炎病毒減毒活疫苗鼻腔接種后的免疫效果的初步研究(江蘇省疾病預防和控制中心(JS-CDC)。
2004年初經(jīng)過SFDA批準由江蘇省疾病預防和控制中心承擔初步探討重組人干擾素a2b干預麻疹、風疹和腮腺炎病毒減毒活疫苗(原為注射用)鼻腔接種后免疫效果的干預作用，以期間接說明重組人干擾素a2b預防麻疹、風疹和腮腺炎病毒感染有無預防效果。
在江蘇省CDC的組織下，選擇計劃免疫較差的地區(qū)，麻疹抗體水平低于800者約100余人，參加研究。
使用的疫苗為麻疹、風疹減毒活疫苗，由北京生物制品研究所產(chǎn)品。麻風腮三聯(lián)減毒活疫苗由法國Aventis Pastuer公司生產(chǎn)，均使用注射的同樣劑量，但改為滴鼻接種。
隨機分為對照組和干擾素組.干擾素組使用實施例1噴霧劑(3.65ml1095MIU)。對照藥使用不含重組人干擾素α2b，但含其它成份的噴霧劑。
干擾素組在疫苗接種前2天，開始噴干擾素，連續(xù)用藥10天；第三天進行疫苗接種。每日噴2次，每次每個鼻孔各噴一下、咽喉一下，每噴一下為0.1ml。
在活疫苗接種后第3天取咽拭子測定干擾素組和對照組人群病毒基因的拷貝數(shù)；在疫苗接種后21天、28天各采取三份血清，以備檢測抗體水平之用。
1.應用實時定量PCR技術評估本發(fā)明噴霧劑在人群中對麻疹病毒減毒活疫苗的干預作用對照組共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標本共7份，4份檢測為陽性；陽性率為57.1％；干擾素組也共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標本共7份，3份標本檢測結果陽性，陽性率為42.9％。由于樣本數(shù)量小，無統(tǒng)計學意義。但是，在病毒基因陽性標本中，兩組病毒基因的拷貝數(shù)的比較卻有明顯的差別，見圖25和下表對照組與干擾素組免疫后陽性標本的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

上述有限樣本初步說明，干擾素組麻疹病毒基因拷貝數(shù)比對照組的病毒基因拷貝數(shù)要低4.4倍，可以初步看出人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細胞內(nèi)的繁殖。
接種風疹疫苗的對照組共有22人，其中男5人、女17人，平均年齡19.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時每人采集咽拭子標本共22份，僅3份檢測為陽性；干擾素組共有8人，全為女性，平均年齡為21.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時每人采集咽拭子標本共8份，僅2份檢測為陽性。兩組陽性標本中病毒基因拷貝數(shù)的比較見圖26和下表對照組與干擾素組免疫后陽性標本的風疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

從上表和圖26中，可以發(fā)現(xiàn)干擾素組病毒拷貝數(shù)比對照組的要低兩個數(shù)量級，初步說明人重組干擾素a2b在一定程度上是可以抑制風疹病毒的繁殖。
2.重組人干擾素a2b噴霧劑在人群中對風疹、麻疹和腮腺炎減毒活疫苗鼻腔接種后免疫效果的干預作用(1)實施例1噴霧劑干預麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果ELISA測定結果見下表干擾素噴霧劑干預麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果

比較免前與免后21天和28天平均P/N值的差數(shù)，兩組有顯著差異，從有限樣本來說，初步表明實施例1噴霧劑能干預麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后加腔免疫的免疫反應。
(2)實施例1噴霧劑干預風疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果風疹病毒血凝抑制反應測定結果見下表干擾素噴霧劑干預風疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果


比較免前與免后21天和28天血清風疹病毒血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組有差異，從有限樣本來說，初步表明干擾素鼻腔噴霧在一定程度上干預風疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后加腔免疫的免疫反應。
(3)重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑干預風風腮三聯(lián)病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果風疹血凝抑制反應測定結果見表5.比較免前與免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組有差異，但是28天結果無差別；腮腺炎血凝抑制反應測定結果見下表干擾素噴霧劑干預麻風腮病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果

比較免前與免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組無差異，但是28天結果有輕微差別；從有限樣本來說，初步表明干擾素鼻腔噴霧干預麻風腮三聯(lián)疫苗鼻腔接種加腔免疫的免疫反應不如單價疫苗明顯。
3.研究結論及分析1.有限樣本數(shù)的初步結果表明，使用干擾素噴霧劑組的風疹病毒和麻疹病毒陽性標本中病毒基因拷貝數(shù)均比對照組要低，麻疹組低4.4倍，風疹組低兩個數(shù)量級。因此可見，人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒和風疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細胞內(nèi)的繁殖。但是，在麻疹和風疹的對照組和干擾素組中，在病毒活疫苗接種后第3天采取的咽拭子樣本中，病毒檢出陽性率均太低麻疹噴霧免疫組的對照組病毒陽性率僅為57.1％；干擾素組的陽性率僅為42.9％；風疹噴霧免疫組的病毒陽性率更低；可能的原因是所選擇的對象均曾經(jīng)感染過麻疹和風疹，均不是初次免疫，上呼吸道已經(jīng)有低水平抗體存在，這些低水平的特異性抗體可以掩蓋干擾素非特異性抗病毒活性，所以，病毒攻擊后的病毒檢出率太低。
2.由于選擇的人群是麻疹抗體低水平人群，雖然樣本小，但已經(jīng)可以看到重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑對麻疹減毒活疫苗鼻腔接種后的再次免疫效果確有一定的干預作用，在免疫后第21天，干擾素組與對照組的平均P/N值的差異有顯著詫異(P＝0.025)；這與病毒基因拷貝數(shù)的減少是相吻合的。
3.麻疹和風疹減毒活疫苗原為注射免疫接種，現(xiàn)在改為鼻腔噴霧接種，這次研究雖然沒有同時比較注射免疫與鼻腔免疫的效果，但是，從有限的初步的結果來看，鼻腔噴霧1次加強免疫后，血清抗體水平平均增加2.28(血凝抑制抗體)-3.58倍(ELISA)，這說明進行鼻腔噴霧加強免疫有一定作用。但是麻風腮三聯(lián)疫苗鼻腔接種的效果不明顯，可能的原因是，麻風腮三種病毒在上呼吸道同時繁殖相互有干擾作用。
4.鑒于很難選擇麻疹低抗體人群；關于選擇風疹低抗體人群，因無試劑無法選擇。所以，這一技術路線擬不再繼續(xù)，改為在雙盲、隨機的人群中使用干擾素噴霧劑和不含干擾素的噴霧劑，在一定期間內(nèi)檢測呼吸道病毒IgM抗體差異的方法來評估干擾素噴霧劑的抗病毒效果。
實驗例9本實驗例初步探討本發(fā)明噴霧劑干預麻疹、風疹和腮腺炎病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫效果的作用，間接說明重組人干擾素a2b噴霧劑預防麻疹、風疹和腮腺炎病毒感染的效果。
目標1.驗證原為皮下注射的風疹和麻疹減毒活疫苗改為鼻腔接種的毒副反應；2.檢驗該地區(qū)上述人群對接種該病毒疫苗的血清抗體的本底情況和鼻腔接種加強免疫后的反應性；3.初步探討干擾素噴霧劑干預病毒減毒活疫苗的作用。
地區(qū)選擇江蘇省計劃免疫較差的地區(qū)。
人群的入選標準(1)年齡20-25歲，男女不限；(2)非過敏體質(zhì)的健康人；(3)無慢性呼吸道疾病；(4)體溫正常；
(5)選擇麻疹抗體水平低于800者。
人群排除標準(1)對干擾素和疫苗中任何成份有過敏史者；(2)慢性呼吸道疾病患者，鼻咽部黏膜有病理改變者；(3)妊娠期或哺乳期婦女；或在近幾個月內(nèi)有可能懷孕的婦女；(4)患有心、腎等重要臟器嚴重器質(zhì)性疾患；(5)患有血液病、糖尿病等疾病；(6)患有嚴重的神經(jīng)、精神病、癲癇病史者；(7)入組前3個月內(nèi)參加過其他臨床試驗者；(8)拒絕合作者。
中止臨床研究的標準(1)因嚴重不良反應不能完成觀察者，應納入不良反應統(tǒng)計，但不計入療效統(tǒng)計；(2)在試驗過程中違背研究計劃或者使用不利于觀察藥物療效的藥物者；(3)拒絕在知情同意書上簽字者；(4)違約或失防的病人，拒絕抽血者；(5)依從性差者。
研究方法(一)藥品及來源1.試驗用藥實施例1產(chǎn)品，其質(zhì)量已經(jīng)中國藥品和生物制品研究所檢定。
2.對照藥使用不含重組人干擾素α2b，但含其它成份的噴霧劑。
3.疫苗麻疹、風疹減毒活疫苗北京生物制品研究所產(chǎn)品。麻風腮三聯(lián)減毒活疫苗(Aventis Pastuer)均使用同樣劑量，改為滴鼻接種。
(二)試驗方法1.預防人群數(shù)共用2種疫苗，檢測2種呼吸道病毒，每種疫苗用藥組和對照組各20例。
2.療程疫苗接種均為滴鼻接種，在疫苗接種前2天，開始噴藥，連續(xù)用藥10天；第三天進行疫苗接種。
3.給藥途徑每日噴2次，每次每個鼻孔各噴一下、咽喉一下，每噴一下為0.1ml。
4.每位觀察者在病毒疫苗接種前和接種后21天、28天各采取三份血清，以備檢測抗體水平之用。
觀察指標1.對2種病毒抗體的檢測在開始用藥之日和在病毒活疫苗接種后21天和28天各采血1次，分離血清，檢測2種病毒抗體的增長幅度。
2.病毒檢測在病毒疫苗接種后5天，取咽拭子.采用定量RT-PCR技術檢測2種病毒基因的拷貝數(shù)。
3.副反應觀察在使用A或B藥期間，每日記錄可能產(chǎn)生的副反應，包括癥狀和體征(體溫)。
在用藥前后由耳鼻喉科醫(yī)生對試驗者進行鼻粘膜檢測各1次。
療效評價1、用干擾素組的疫苗病毒血清抗體滴度比對照組有顯著性降低為有效。
2、用干擾素組的咽拭子疫苗病毒定量PCR檢測，試驗組量與對照組相比有顯著性降低為有效。
藥物安全性評價1、參加試驗的醫(yī)生認真觀察及記錄不良事件，及時填寫不良事件報告表，并由主管醫(yī)生簽字。
2、對不良事件應及時處理，對危及患者生命的不良事件應立即進行搶救，對患者不能耐受的不良事件應及時停藥，并進行處理，輕度不良事件可繼續(xù)觀察。
3、不良事件與藥物的關系分析(1)肯定有關在用藥的相應期間出現(xiàn)明顯的藥物反應，停藥后反應消失，再次用藥反應再現(xiàn)。
(2)可能有關明顯的藥物反應，停藥后反應消失，但不能用病人本病的癥狀作出相應的解釋。
(3)可能無關與用藥有密切的時間關系，但存在其他有關的因素。
(4)肯定無關疾病本身的反應、或用藥前即存在的癥狀、或伴隨疾病的表現(xiàn)。
(5)無法判定。
研究結果(一)應用實時定量PCR技術評估人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對麻疹病毒減毒活疫苗的干預作用對照組共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標本共7份，4份檢測為陽性；陽性率為57.1％；干擾素組也共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標本共7份，3份標本檢測結果陽性，陽性率為42.9％。由于樣本數(shù)量小，無統(tǒng)計學意義。但是，在病毒基因陽性標本中，兩組病毒基因的拷貝數(shù)的比較卻有明顯的差別，見圖27和下表對照組與干擾素組免疫后陽性標本的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

上述有限樣本初步說明，干擾素組麻疹病毒基因拷貝數(shù)比對照組的病毒基因拷貝數(shù)要低4.4倍，可以初步看出人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細胞內(nèi)的繁殖。
(二)應用實時定量PCR技術評估人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對風疹病毒減毒活疫苗的干預作用對照組共有22人，其中男5人、女17人，平均年齡19.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時每人采集咽拭子標本共22份，僅3份檢測為陽性；干擾素組共有8人，全為女性，平均年齡為21.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時每人采集咽拭子標本共8份，僅2份檢測為陽性。兩組陽性標本中病毒基因拷貝數(shù)的比較見圖28和下表對照組與干擾素組免疫后陽性標本的風疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

可以發(fā)現(xiàn)干擾素組病毒拷貝數(shù)比對照組的要低兩個數(shù)量級，初步說明人重組干擾素a2b在一定程度上是可以抑制風疹病毒的繁殖。
(三)人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對風疹、麻疹和腮腺炎減毒活疫苗鼻腔接種后免疫效果的干預作用1、重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑干預麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果ELISA測定結果見表3.比較免前與免后21天和28天平均P/N值的差數(shù)，兩組有顯著差異，從有限樣本來說，初步表明重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑能干預麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后加腔免疫的免疫反應。
干擾素噴霧劑干預麻疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果見下表

2.重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑干預風疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果風疹病毒血凝抑制反應測定結果見表4。比較免前與免后21天和28天血清風疹病毒血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組有差異，從有限樣本來說，初步表明干擾素鼻腔噴霧在一定程度上干預風疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后加腔免疫的免疫反應。
干擾素噴霧劑干預風疹病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果見下表

3.重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑干預風風腮三聯(lián)病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果風疹血凝抑制反應測定結果見表5。比較免前與免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組有差異，但是28天結果無差別，腮腺炎血凝抑制反應測定結果見下表干擾素噴霧劑干預麻風腮病毒減毒活疫苗鼻腔接種后免疫反應的結果


比較免前與免后21天血清血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)，兩組無差異，但是28天結果有輕微差別；從有限樣本來說，初步表明干擾素鼻腔噴霧干預麻風腮三聯(lián)疫苗鼻腔接種加腔免疫的免疫反應不如單價疫苗明顯。研究結論及分析1、限樣本數(shù)的初步結果表明，使用干擾素噴霧劑組的風疹病毒和麻疹病毒陽性標本中病毒基因拷貝數(shù)均比對照組要低，麻疹組低4.4倍，風疹組低兩個數(shù)量級。因此可見，人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒和風疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細胞內(nèi)的繁殖。但是，在麻疹和風疹的對照組和干擾素組中，在病毒活疫苗接種后第3天采取的咽拭子樣本中，病毒檢出陽性率均太低麻疹噴霧免疫組的對照組病毒陽性率僅為57.1％；干擾素組的陽性率僅為42.9％；風疹噴霧免疫組的病毒陽性率更低；可能的原因是所選擇的對象均曾經(jīng)感染過麻疹和風疹，均不是初次免疫，上呼吸道已經(jīng)有低水平抗體存在，這些低水平的特異性抗體可以掩蓋干擾素非特異性抗病毒活性，所以，病毒攻擊后的病毒檢出率太低。
2、由于選擇的人群是麻疹抗體低水平人群，雖然樣本小，但已經(jīng)可以看到重組人干擾素α2b鼻腔噴霧劑對麻疹減毒活疫苗鼻腔接種后的再次免疫效果確有一定的干預作用，在免疫后第21天，干擾素組與對照組的平均P/N值的差異有顯著詫異(P＝0.025)；這與病毒基因拷貝數(shù)的減少是相吻合的。
3、麻疹和風疹減毒活疫苗原為注射免疫接種，現(xiàn)在改為鼻腔噴霧接種，這次研究雖然沒有同時比較注射免疫與鼻腔免疫的效果，但是，從有限的初步的結果來看，鼻腔噴霧1次加強免疫后，血清抗體水平平均增加2.28(血凝抑制抗體)-3.58倍(ELISA)，這說明進行鼻腔噴霧加強免疫有一定作用。但是麻風腮三聯(lián)疫苗鼻腔接種的效果不明顯，可能的原因是，麻風腮三種病毒在上呼吸道同時繁殖相互有干擾作用。
4、鑒于很難選擇麻疹低抗體人群；關于選擇風疹低抗體人群，因無試劑無法選擇。所以，這一技術路線擬不再繼續(xù)，改為在雙盲、隨機的人群中使用干擾素噴霧劑和不含干擾素的噴霧劑，在一定期間內(nèi)檢測呼吸道病毒IgM抗體差異的方法來評估干擾素噴霧劑的抗病毒效果。
實驗例10應用實時定量PCR技術評估本發(fā)明噴霧劑在人群中對麻疹病毒減毒活疫苗的干預作用本實驗例的目的在于研究人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對麻疹病毒減毒活疫苗的抑制作用，通過實時定量PCR的方法，對實驗組和對照組所采集的咽拭子樣本進行檢測，判斷麻疹病毒陽性標本并得出陽性標本的病毒拷貝數(shù)。結果的有限樣本初步說明，干擾素組麻疹病毒拷貝數(shù)比對照組的病毒的拷貝數(shù)要低4.4倍。結論人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒在上呼吸道的繁殖。
麻疹病毒(Measles virus)是一種導致麻疹的副粘病毒科麻疹病毒屬的單股負鏈RNA病毒。麻疹是兒童最常見一種急性呼吸道傳染病。臨床上以發(fā)熱、上呼吸道炎癥、結膜炎、口腔粘膜斑及全身丘疹為特征。麻疹病毒的實驗室檢測包括病毒分離、分子雜交直接檢測病毒RNA、RT-PCR、血清學診斷等。
重組人干擾素a2b噴霧劑是用于鼻腔噴霧的一種干擾素劑型。干擾素具有廣譜抗病毒、抗細胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)，在經(jīng)過近半個世紀的臨床研究和應用，說明它是一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物，并且有研究表明干擾素a2b在細胞水平上抑制病毒的復制。
實時定量PCR技術是體外酶促核酸擴增的一項技術革命，在近年來發(fā)展迅速。特別是在微生物的檢測上，具有高靈敏度、高特異性、高效快速、防污染以及易于標準化的特點。它可以分為探針法和熒光摻入法，其中探針方面可供選擇的有TaqMan探針、FRET探針以及分子信標(molecular beacon)，這種方法存在特異性高的優(yōu)點，但是設計合成困難、成本高、價格貴。而熒光摻入法是利用DNA結合染料SYBR GreenI可以特異性結合雙鏈DNA的特性進行熒光檢測，它價格低廉，可以發(fā)展成一種能廣泛應用于臨床檢測價格低廉的病毒定量診斷方法。
本實驗例的目的是采用實時定量PCR技術評估本發(fā)明噴霧劑在人群中對麻疹病毒減毒活疫苗的干預作用。
材料與方法1、人群選擇和臨床方案江蘇省徐州市唯唯豆奶集團20-25歲的初次篩選麻疹低抗體的人群，共30人，分為兩組。一組為對照組噴鼻接種麻風腮三聯(lián)減毒活疫苗(美國默沙東公司)一次，噴鼻接種量為說明書疫苗的接種量。接種前采集一次咽拭子(免前標本)，接種后三天再采集一次咽拭子(免后標本)。另一組為干擾素組先連續(xù)使用重組人干擾素a2b噴霧劑(北京遠策藥業(yè)有限責任公司)噴鼻10天，第二天接種同樣劑量的麻風腮三聯(lián)減毒活疫苗。接種前采集一次咽拭子(免前標本)，接種后三天再采集一次咽拭子(免后標本)。
2.重組人干擾素a2b噴霧劑由北京遠策藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)。每瓶3.65毫升，每毫升含300萬國際單位重組人干擾素a2b。干擾素組每日噴鼻、咽2次，每次左右鼻腔和咽部各1下，每噴霧1下為0.1毫升。
3.病毒RNA的提取病毒RNA提取采用Invitrogen公司的TRIZOL提取試劑盒，具體操作根據(jù)試劑盒說明書。
4.病毒標準品RNA的確定用分光光度計測定疫苗中的麻疹病毒RNA的純度和濃度，共測定五次，求出平均值。通過一定的數(shù)學公式，將病毒的濃度換算成病毒的拷貝數(shù)。再將標準品病毒RNA進行一系列的10倍稀釋，用于real-timePCR中標準曲線的確定。
5.Real-time PCR法靶序列的選擇在麻疹病毒保守的matrix基因區(qū)。正鏈引物序列為5’-ATAGTTGTTAGACGTACAGCAGGG-3’；負鏈引物序列為5’-ACCGC ATTGC ACACT TGGTT-3’。One-stepRT-PCR試劑盒為QIGEN公司產(chǎn)品。SYBR Green I(20×Concentration，用于real-time PCR)購自上海開放科技公司。實驗步驟按試劑盒說明書進行，包括10ul的水、5ul的buffer、1ul的Enzyme Mixture、1uldNTP、引物各為1ul、1ul的SYBR Green I、5ul的樣品RNA，共25ul體系。反應條件為反轉錄50℃30min，95℃ 15min，1個循環(huán)；PCR 94℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 15s，40個循環(huán)；在50℃-99℃做溶解曲線，最后降溫至37℃保存。所用儀器為Rotergene公司RG-3000熒光定量PCR儀。
6.定量結果的統(tǒng)計學方法應用Rotergene Version 4.6軟件對實驗結果進行分析，采用對數(shù)平均值計算病毒的拷貝數(shù)。
結果一、麻疹病毒標準品的測定和標準曲線的建立用分光光度計測定病毒RNA的濃度后，將其進行一系列的10倍稀釋將其換算為病毒的拷貝數(shù)。在real-time PCR完成后，以每個稀釋度熒光的對數(shù)值(y軸)對出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)(x軸)作圖，如圖29。圖中的水平線位于熒光背景之上，與曲線的交點可以確定每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值。
通過圖29，利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值，如圖30。標準曲線的相關系數(shù)為0.9937，表明相關性非常高。標準曲線在107-104copies/reaction這一很大的范圍內(nèi)有很好的線性關系。并且最小可以檢測到100個病毒拷貝。
二、樣品中陽性樣本的判斷將兩組免疫前和免疫后的標本進行real-time PCR檢測，在對標本結果的判斷中，采用是否存在Ct值，并且結合擴增產(chǎn)物的Tm值進行判斷。因為在實驗中，使用的是SYBR Green I，它能非特異性的嵌合于雙鏈DNA雙螺旋結構的小溝中，但是存在的缺陷是SYBR Green I能與所有的雙鏈DNA結合，包括擴增的產(chǎn)物、非特異產(chǎn)物、引物二聚體?？梢酝ㄟ^溶解曲線分析來確定擴增產(chǎn)物的特異性。在PCR完成后，在50℃-99℃之間作溶解曲線，溫度每秒上升0.2℃直到99℃，并且持續(xù)的進行熒光記錄，得出溶解曲線，如圖31。某一特定的PCR產(chǎn)物的Tm值由其片段長度和GC含量決定的，可以通過Tm值的不同來區(qū)分非特異產(chǎn)物、引物二聚體和特異性產(chǎn)物。麻疹病毒引物二聚體的Tm值在83.1-84.0℃之間，而特異性產(chǎn)物的Tm值在85.6-86.4℃之間。
三、對照組和干擾素組病毒基因拷貝數(shù)的比較對照組共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標本共7份，4份檢測為陽性；陽性率為57.1％；干擾素組也共有7人，在鼻腔免疫后每人取咽拭子標本共7份，3份標本檢測結果陽性，陽性率為42.9％。由于樣本數(shù)量小，無統(tǒng)計學意義。但是，在病毒基因陽性標本中，兩組病毒基因的拷貝數(shù)的比較卻有明顯的差別，見圖31和下表對照組與干擾素組免疫后陽性標本的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

所以，從對照組與干擾素組免疫后陽性標本的麻疹病毒基因拷貝數(shù)的比較上，有限樣本初步說明，干擾素組麻疹病毒基因拷貝數(shù)比對照組的病毒基因拷貝數(shù)要低4.4倍，可以初步看出本發(fā)明噴霧劑在一定程度上可以抑制麻疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細胞內(nèi)的繁殖。
實驗例11本實驗例的目的是評估本發(fā)明噴霧劑在人群中對風疹病毒減毒活疫苗的干預作用。
方法通過實時定量PCR的方法，對干擾素組和對照組所采集的減毒活疫苗免疫后的咽拭子樣本進行檢測，判斷風疹病毒陽性標本并得出陽性標本的病毒拷貝數(shù)。結果有限樣本數(shù)的初步結果表明，干擾素組的風疹病毒陽性標本中病毒基因拷貝數(shù)比對照組要低兩個數(shù)量級。結論人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上可以抑制風疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細胞內(nèi)的繁殖。
風疹病毒(rubella virus，RUV)是一種能引起人類疾病的披膜病毒科風疹病毒屬的單鏈RNA病毒。在大多數(shù)情況下，風疹病毒的感染屬于一過性和無臨床癥狀的亞臨床型感染，僅有少數(shù)被感染者會發(fā)生較嚴重的并發(fā)癥。但孕婦感染風疹病毒后，特別是懷孕3個月以內(nèi)的孕婦，可以引起胎兒畸形。而且孕婦感染風疹病毒的時間越早，致畸的可能性越大。血清學研究表明，感染過風疹病毒的育齡婦女即使再被感染，懷孕后也會對胎兒造成危害[1]。風疹病毒的實驗室檢測包括病毒分離、病毒特異性IgM的檢測、分子雜交直接檢測病毒RNA、RT-PCR、RT-nested PCR(RT-nPCR)等等。
重組人干擾素-α2b噴霧劑是干擾素-α2b鼻給藥的一種劑型。干擾素是一種具有廣譜抗病毒、抗細胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)，在經(jīng)過近半個世紀的臨床研究和應用，說明它是一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物。并且有研究表明干擾素a2b在細胞水平上抑制病毒的復制。
實時定量PCR技術是體外酶促核酸擴增的一項技術革命，在近年來發(fā)展迅速。特別是在微生物的檢測上，具有高靈敏度、高特異性、高效快速、防污染以及易于標準化的特點。它可以分為探針法和熒光摻入法，其中探針方面可供選擇的有TaqMan探針、FRET探針以及分子信標(molecular beacon)，這種方法存在特異性高的優(yōu)點，但是設計合成困難、成本高、價格貴。而熒光摻入法是利用DNA結合染料SYBR GreenI可以特異性結合雙鏈DNA的特性進行熒光檢測，它價格低廉，可以發(fā)展成一種能廣泛應用于臨床檢測價格低廉的病毒定量診斷方法。
本研究的目的是評估人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對風疹病毒減毒活疫苗的干預作用。材料與方法1.群選擇和臨床方案江蘇省徐州市唯唯豆奶集團20-25歲的初次篩選風疹病毒抗體低下的人群，共30人，分為兩組對照組噴鼻接種風疹減毒活疫苗(北京天壇生物制品股份有限公司)一次，噴鼻接種量為說明書疫苗的接種量。接種前采集一次咽拭子(免前標本)，接種后三天再采集一次咽拭子(免后標本)。另一組為干擾素組，先連續(xù)使用重組人干擾素a2b噴霧劑(北京遠策藥業(yè)有限責任公司)噴鼻10天，第二天接種風疹減毒活疫苗。接種前采集一次咽拭子(免前標本)，接種后三天再采集一次咽拭子(免后標本)。
2.重組人干擾素a2b噴霧劑由北京遠策藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)。每瓶3.65毫升，每毫升含300萬國際單位重組人干擾素a2b。干擾素組每日噴鼻、咽2次，每次左右鼻腔和咽部各1下，每噴霧1下為0.1毫升。
3.病毒RNA的提取病毒RNA提取采用Invitrogen公司的TRIZOL提取試劑盒，具體操作根據(jù)試劑盒說明書。
4.病毒標準品RNA的確定用分光光度劑測定風疹減毒活疫苗中的風疹病毒減毒活疫苗的RNA純度和濃度，共測定五次，求出平均值。通過一定的數(shù)學公式，將病毒RNA的濃度換算成病毒基因的拷貝數(shù)。再將標準品病毒RNA進行一系列的10倍稀釋，用于real-time PCR中標準曲線的確定。
5.Real-time PCR法靶序列的選擇在風疹病毒保守的E1基因區(qū)。正鏈引物序列為5’-CAACACGCCGCACGGACAAC-3’；負鏈引物序列為5’-GGACTGCTGATTGCCGGTGTAATT-3’。One-step RT-PCR試劑盒為QIGEN公司產(chǎn)品。SYBR Green I(20×Concentration，用于real-time PCR)購自上海開放科技公司。實驗步驟按試劑盒說明書進行，包括10ul的水、5ul的buffer、1ul的EnzymeMixture、1ul dNTP、引物各為1ul、1ul的SYBR Green I、5ul的樣品RNA，共25ul體系。反應條件為反轉錄50℃ 30min，95℃ 15min，1個循環(huán)；PCR 94℃1 5s，60℃ 15s，72℃ 15s，40個循環(huán)；在50℃-99℃做溶解曲線，最后降溫至37℃保存。所用儀器為Rotergene公司RG-3000熒光定量PCR儀。
6.定量結果的統(tǒng)計學方法應用Rotergene Version 4.6軟件對實驗結果進行分析，采用對數(shù)平均值計算病毒基因的拷貝數(shù)。
結果一、風疹病毒標準品的測定和標準曲線的建立用分光光度計測定的病毒RNA的濃度后，進行一系列的10倍稀釋，將其換算為病毒基因的拷貝數(shù)。在real-time PCR完成后，以每個稀釋度熒光的對數(shù)值(y軸)對出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)(x軸)作圖，如圖32。圖中的水平線位于熒光背景之上，與曲線的交點可以確定每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值。
通過圖32，利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值，如圖33，標準曲線的相關系數(shù)為0.99885，表明相關性非常高。標準曲線在1010-106copies/reaction這一很大的范圍內(nèi)有很好的線性關系。并且最小可以檢測到100個病毒基因拷貝。
二、樣品中陽性樣本的判斷將兩組免疫前和免疫后的標本進行real-time PCR檢測，在對標本結果的判斷中，采用是否存在Ct值，并且結合擴增產(chǎn)物的Tm值進行判斷。因為在實驗中，使用的是SYBR Green I，它能非特異性的嵌合于雙鏈DNA雙螺旋結構的小溝中，但是存在的缺陷是SYBR Green I能與所有的雙鏈DNA結合，包括擴增的產(chǎn)物、非特異產(chǎn)物、引物二聚體?？梢酝ㄟ^溶解曲線分析來確定擴增產(chǎn)物的特異性。在PCR完成后，在50℃-99℃之間作溶解曲線，溫度每秒上升0.2℃直到99℃，并且持續(xù)的進行熒光記錄，得出溶解曲線，如圖34。某一特定的PCR產(chǎn)物的Tm值由其片段長度和GC含量決定的，可以通過Tm值的不同來區(qū)分非特異產(chǎn)物、引物二聚體和特異性產(chǎn)物。風疹病毒引物二聚體的Tm值在86.1-86.6℃之間，而特異性產(chǎn)物的Tm值在87.6-88.6℃之間。
三、對照組和干擾素組風疹病毒基因拷貝數(shù)的比較對照組共有22人，其中男5人、女17人，平均年齡19.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時每人采集咽拭子標本共22份，僅3份檢測為陽性；干擾素組共有8人，全為女性，平均年齡為21.4歲，疫苗鼻腔免疫后72小時每人采集咽拭子標本共8份，僅2份檢測為陽性。兩組陽性標本中病毒基因拷貝數(shù)的比較見圖34和下表對照組與干擾素組免疫后陽性標本的風疹病毒基因拷貝數(shù)的比較

從上表和圖34中，可以發(fā)現(xiàn)干擾素組病毒拷貝數(shù)比對照組的要低兩個數(shù)量級，初步說明人重組干擾素a2b在一定程度上是可以抑制風疹病毒的擴增的。
討論實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，因為普通PCR在擴增完成后，必須打開試管進行樣品檢測，增加了污染的可能；而實時定量PCR反應和結果分析在密閉的一個試管中進行，可以減少污染，準確性更高。近年來，實時定量PCR在病毒的臨床的檢測上發(fā)展迅速，如HBV、SARS、HCV、HIV、細小病毒B19等等。
SYBR Green I是一種不對稱的箐類熒光素，它能非特異性的嵌合于雙鏈DNA雙螺旋結構的小溝中，結合狀態(tài)的熒光強度較游離狀態(tài)的熒光增強千倍。與TaqMan探針和分子信標相比，其具有價格低廉、操作簡便的特點。因為TaqMan探針和分子信標需要針對待測病毒設計特異性的探針，并且需要熒光標記，不僅操作麻煩，而且價格昂貴，而SYBR Green I只需在擴增體系中直接加入，即可進行實時定量檢測，避免了設計、標記探針，適用任何擴增體系。非常適用于發(fā)展成一種能廣泛應用于臨床檢測價格低廉的病毒定量診斷方法[11]。但是存在的缺陷是SYBR Green I能與所有的雙鏈DNA結合，包括擴增的產(chǎn)物、非特異產(chǎn)物、引物二聚體?？梢酝ㄟ^兩種方法來克服這種缺陷，一、使用熱啟動的Taq酶進行熱啟動擴增，減少非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)。二、通過溶解曲線分析來確定擴增產(chǎn)物的特異性，來避免假陽性結果的出現(xiàn)[8]。在實驗中我們使用的QIGEN公司的One-step RT-PCR試劑盒含有熱啟動Taq酶；并且通過溶解曲線可以很好的區(qū)分非特異產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴增產(chǎn)物。
人重組干擾素a2b噴霧劑在人群中對風疹病毒減毒活疫苗的抑制的研究中，由于所選取的人群均為低抗體人群，所以活疫苗接種后72小時，PCR檢測出的病毒陽性率很低，雖在統(tǒng)計學上無意義，但是在有限的病毒基因陽性的標本中，我們發(fā)現(xiàn)干擾素組病毒基因拷貝數(shù)比對照組的要低兩個數(shù)量級，初步說明人重組干擾素a2b噴霧劑在一定程度上是可以抑制風疹病毒減毒活疫苗在上呼吸道上皮細胞內(nèi)的繁殖。
權利要求
1.一種由人干擾素制備的藥物組合物在制備預防或/和治療呼吸道病毒感染藥物方面的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的呼吸道病毒可以是濾泡性口腔炎病毒VSV、副流感病毒、流感病毒、禽流感病毒、SARS冠狀病毒、鼻病毒、麻疹病毒、腸道病毒、腺病毒、皰疹病毒、漢坦病毒。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的禽流感病毒是低致病性禽流感H9H2或高致病性禽流感H5N1。
4.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的鼻病毒是鼻病毒14型。
5.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的皰疹病毒是單純皰疹病毒-1或單純皰疹病毒-2。
6.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的腸道病毒是腸道病毒CoxB1。
7.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的腺病毒是腺病毒7型。
8.根據(jù)權利要求1-7任意一項所述的應用，其特征在于，所述的組合物含有如下重量份的組分人干擾素1-99其它輔料1-99。
9.根據(jù)權利要求8所述的組合物，其特征在于，所述的人干擾素為人干擾素α2b、α1b、β及干擾素ω、干擾素κ、干擾素λ、干擾素ε等其它I型干擾素。
10.根據(jù)權利要求3-6所述的組合物，其特征在于，所述的人干擾素為人干擾素α2b或重組人干擾素α2b。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由人干擾素制備的藥物組合物在制備預防或/和治療呼吸道病毒感染藥物方面的應用，屬于醫(yī)藥領域。上述組合物含有如下重量份的組分人干擾素1－99其它輔料1－99。上述的人干擾素可以是人干擾素α2b、α1b、β及干擾素ω、干擾素κ、干擾素λ、干擾素ε等其它I型干擾素，所述的人干擾素為重組人干擾素或/和用其他方法制備的人干擾素。上述輔料可以是磷酸緩沖液、人白蛋白、甘露醇、氯化鈉、聚糖、苯甲醇其中的全部或任意部分的組合，用量為藥劑學上的有效劑量，以實現(xiàn)緩沖、穩(wěn)定、防腐作用。上述藥物組合物在制備預防或/和治療呼吸道病毒感染藥物，特別是SARS病毒、副流感病毒、流感病毒等引起的呼吸道感染的藥物方面有很好的應用。
文檔編號A61P31/16GK1927389SQ20051010243
公開日2007年3月14日 申請日期2005年9月9日 優(yōu)先權日2004年9月10日
發(fā)明者候云德 申請人:北京金迪克生物技術研究所, 北京遠策藥業(yè)有限責任公司