專利名稱：利用微生物生產(chǎn)物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用微生物生產(chǎn)一物質(zhì)的方法。在本發(fā)明中，微生物典型地選自屬于埃希氏桿菌屬或棒狀桿菌的細(xì)菌，通常將它們用于生產(chǎn)物質(zhì)。生產(chǎn)的物質(zhì)可以選自使用微生物按常規(guī)生產(chǎn)的那些，例如L-氨基酸、核酸、抗生素、維生素、生長(zhǎng)因子、生物活性物質(zhì)等。本發(fā)明公開了提高利用微生物生產(chǎn)物質(zhì)的方法中的最終靶物質(zhì)的生產(chǎn)能力的方法。
許多生物體通過呼吸獲取生命活力所需的能量。在微生物呼吸時(shí)，各種酶復(fù)合體通常根據(jù)種類或生長(zhǎng)環(huán)境起作用，并且能量獲取效率也大不相同。通過糖酵解、β-氧化等將碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪酸轉(zhuǎn)變成乙酰-輔酶A，并在檸檬酸循環(huán)中分解。將然后以NADH的形式貯藏的能量借助NADH脫氫酶(NDH)和接下來由氧化還原酶組成的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)用于從微生物細(xì)胞中排泄質(zhì)子，由此在胞質(zhì)膜的內(nèi)外之間形成一質(zhì)子濃度梯度。該質(zhì)子濃度梯度被用作三磷酸腺苷(ATP)合成的驅(qū)動(dòng)力。此時(shí)，顯示高質(zhì)子排泄能力的路徑和顯示低質(zhì)子排泄能力的路徑為電子轉(zhuǎn)移路徑的出口，這取決于NDH和氧化還原酶的組合?？紤]到高質(zhì)子排泄能力的路徑顯示高能效，低質(zhì)子排泄能力的路徑顯示低能量排泄效率。因此，一類微生物同時(shí)含有多個(gè)并聯(lián)的呼吸鏈電子轉(zhuǎn)移路徑，并且這些路徑包括高能效和低能效的那些。
在用于需氧條件的大腸埃希氏桿菌的呼吸鏈中有兩種NDH和兩種末端氧化酶。即，關(guān)于NDH，已知有高能效的NDH-I(由nuo操縱子編碼)和低能效的NDH-II(由ndh編碼)。而且，關(guān)于末端氧化酶，已知有細(xì)胞色素bo型氧化酶(由cyoABCD操縱子編碼)和顯示低能效的細(xì)胞色素bd型氧化酶(由cydAB編碼)，細(xì)胞色素bo型氧化酶分成SoxM型(Castresana，J.和Saraste，M.，《生物化學(xué)科學(xué)的趨勢(shì)》20，443-448(1995))并顯示出高的能效。盡管已知這些呼吸鏈酶的表達(dá)量響應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境而變化(Minagawa等人，《生物化學(xué)雜志》26511198-11203(1990)；Tseng等人，《細(xì)菌學(xué)雜志》1781094-1098(1996)；Green等人，《分子微生物學(xué)》12433 444(1994)；Bongaerts等人，《分子微生物學(xué)》16“521-534(1995))，關(guān)于其表達(dá)模式的生物方式仍然有許多未知點(diǎn)。
而且，在谷氨酸棒桿菌中，有一細(xì)胞色素bc1復(fù)合體，并證實(shí)有至少兩種末端氧化酶，SoxM型氧化酶和細(xì)胞色素bd型氧化酶，(新陳代謝工程第二次討論會(huì)，演講摘要，1999)。這說明，從醌集合體到氧分子的電子轉(zhuǎn)移路徑包括兩種路徑，一種路徑利用細(xì)胞色素bc1復(fù)合體和SoxM型氧化酶，一種路徑僅利用細(xì)胞色素bd型氧化酶?？紤]到前者為高能效的電子轉(zhuǎn)移路徑，其中用于轉(zhuǎn)移一個(gè)電子的質(zhì)子轉(zhuǎn)移值高，并且后者為低能效的電子轉(zhuǎn)移路徑，其中用于轉(zhuǎn)移一個(gè)電子的質(zhì)子轉(zhuǎn)移值低。
就大腸桿菌的末端氧化酶而言，如果比較僅有細(xì)胞色素bo型氧化酶的突變株、僅有細(xì)胞色素bd型氧化酶的突變株和具有兩者的野生株的好氧培養(yǎng)的生長(zhǎng)收率，在僅有細(xì)胞色素bd型氧化酶的突變株中的生長(zhǎng)收率最低，并且它取決于末端氧化酶的種類和能量獲取效率(日本發(fā)酵和生物工程協(xié)會(huì)的年會(huì)，1995，演講摘要，第357號(hào))。
而且，報(bào)道了一些呼吸鏈酶的缺失突變體的能效(Calhoun等人，《細(xì)菌學(xué)雜志》1753020-3925(1993))。
然而，通過擴(kuò)增具有高效率的呼吸鏈酶如用于NDH-I和SoxM型氧化酶的那些，沒有發(fā)現(xiàn)能效的變化，甚至不知道嘗試?yán)闷渖a(chǎn)物質(zhì)。而且，未曾嘗試?yán)玫托实暮粑溍溉鏝DH-II和細(xì)胞色素bd型氧化酶的缺失生產(chǎn)物質(zhì)。
在活體中生物合成例如L-氨基酸和核酸的物質(zhì)需要能量。所用的大多數(shù)能量由NADH、NADPH等的還原能組成并且能量以ATP貯藏。因此，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為，如果在利用微生物生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法中增加生產(chǎn)靶物質(zhì)所用的能量供應(yīng)，那么靶物質(zhì)的生產(chǎn)能力將提高?；谶@種觀點(diǎn)，本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種顯示提高的能效的微生物并提供了一種通過利用它生產(chǎn)一種靶物質(zhì)的方法。
本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為，顯示增加的能量供應(yīng)的微生物可以通過強(qiáng)化顯示高能量獲取效率的呼吸鏈路徑或使顯示低能量獲取效率的呼吸鏈路徑有缺陷來構(gòu)建。特別是，就大腸桿菌而言，認(rèn)為具有提高的能效的株的制備是將編碼細(xì)胞色素bo型氧化酶的基因作為高能效的呼吸鏈酶擴(kuò)增，或者使編碼NDH-II的基因作為低能效的呼吸鏈酶缺失。然后，使用它們生產(chǎn)L-氨基酸，并發(fā)現(xiàn)在能效得到提高的株中L-氨基酸的生產(chǎn)能力也提高。因此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了如下幾個(gè)方面。
(1)一種利用微生物生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，包括在一培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，從而在該培養(yǎng)基中生產(chǎn)并積聚該靶物質(zhì)，并將該靶物質(zhì)收集，其中該微生物由具有高能效呼吸鏈路徑和低能效呼吸鏈路徑作為呼吸鏈路徑的該微生物的親株構(gòu)建，并且該微生物為具有以下特征之一或兩者的突變株或基因重組株(A)高能效呼吸鏈路徑得到提高，(B)低能效呼吸鏈路徑有缺陷。
(2)如(1)的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中高能效呼吸鏈路徑通過增加編碼呼吸鏈中涉及的酶的基因的拷貝數(shù)或修飾該基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列得到提高。
(3)如(1)或(2)的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中通過破裂編碼呼吸鏈中所涉及的酶的基因使低能效呼吸鏈路徑有缺陷。
(4)如(1)-(3)任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中高能效呼吸鏈的酶包括SoxM型氧化酶、bc1復(fù)合體、NDH-I或其中兩種或三種。
(5)如(1)-(4)任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中低能效的呼吸鏈的酶包括細(xì)胞色素bd型氧化酶、NDH-II或其兩者。
(6)如(1)-(5)任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中在該微生物中使SoxM型氧化酶的活性提高并且使NDH-II有缺陷。
(7)如權(quán)利要求(1)-(6)任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中該SoxM型氧化酶為細(xì)胞色素bo型氧化酶。
(8)如(1)-(7)任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中該微生物為屬于埃希氏桿菌屬或棒狀桿菌的細(xì)菌。
(9)如(1)-(8)4任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中靶物質(zhì)為L(zhǎng)-氨基酸或核酸。
根據(jù)本發(fā)明，一種利用微生物生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，包括在一培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，從而在該培養(yǎng)基中生產(chǎn)并積聚該靶物質(zhì)，并將該靶物質(zhì)收集，靶物質(zhì)的生產(chǎn)能力可以與常規(guī)策略不同的原理為基礎(chǔ)提高。


圖1顯示了生產(chǎn)NDH-II基因破裂株用的質(zhì)粒pTS-Δndh的構(gòu)建。
圖2顯示了pMAN997的構(gòu)建。
下面詳細(xì)解釋本發(fā)明。
通過本發(fā)明的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的物質(zhì)沒有特別限制，只要它為可以通過微生物生產(chǎn)的物質(zhì)。其例子包括例如各種L-氨基酸如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L纈氨酸和L-苯丙氨酸；核酸如鳥苷酸和肌苷酸；維生素；抗生素；生長(zhǎng)因子；生物活性物質(zhì)等。
本發(fā)明所用的微生物為具有生產(chǎn)上述靶物質(zhì)的能力的微生物，它由具有高能效呼吸鏈路徑和低能效呼吸鏈路徑作為呼吸鏈路徑并具有以下特征之一或兩者的微生物親株構(gòu)建(A)高能效呼吸鏈路徑得到提高，(B)低能效呼吸鏈路徑有缺陷。
一般說來，包括大腸桿菌和棒狀桿菌的微生物同時(shí)含有許多并聯(lián)的呼吸鏈電子轉(zhuǎn)移路徑，并且這些路徑包括單位電子的高質(zhì)子轉(zhuǎn)移值的那些和低質(zhì)子轉(zhuǎn)移值的那些。在大腸桿菌中，例如就NADH的電子供體而言，有NDHI和NDHII作為NADH脫氫酶，它催化質(zhì)子從NADH轉(zhuǎn)移到醌集合體。其中，NDHI顯示高能效，NDHII顯示低能效。即，NDHII顯示用一個(gè)電子能夠排泄的質(zhì)子的分子數(shù)(質(zhì)子轉(zhuǎn)移值)為0，而NDHI的認(rèn)為是2。
在本發(fā)明中，如上所述顯示單位電子的高質(zhì)子轉(zhuǎn)移值的這種路徑，即高能效呼吸鏈路徑，得到提高，并且使低能效呼吸鏈路徑有缺陷。高能效呼吸鏈路徑可以通過提高呼吸鏈路徑中涉及的呼吸鏈酶的活性來提高。通過降低或消除呼吸鏈路徑中涉及的呼吸鏈酶的活性可以使低能效呼吸鏈路徑有缺陷。
對(duì)呼吸鏈路徑中涉及的呼吸鏈酶沒有特別的限制，只要其為構(gòu)建呼吸鏈路徑的酶。尤其是，其例子包括催化電子從電子供體轉(zhuǎn)移到醌集合體如泛醌、二甲基甲萘醌和甲萘醌的脫氫酶，以及催化電子從醌集合體向電子供體轉(zhuǎn)移的氧化酶。
催化通過從醌集合體轉(zhuǎn)移電子生產(chǎn)水分子的反應(yīng)的這些氧化酶分成SoxM型(bo型)和bd型。bo型的質(zhì)子轉(zhuǎn)移值為2，而bd型的為1。因此，bo型顯示高的能效。
在本發(fā)明中，用于能效的術(shù)語(yǔ)“高”和“低”其含義并不是絕對(duì)的，它們可以是如上所述的相對(duì)概念。
下面解釋提高高能效呼吸鏈酶的活性的方法和降低或消除低能效呼吸鏈酶的活性的方法。
為了提高高能效呼吸鏈酶的活性，例如，可以如下制備一重組DNA將編碼該酶的基因片段與在微生物細(xì)胞中起作用的載體，優(yōu)選一多拷貝型載體連接，并將其加入該微生物中，從而轉(zhuǎn)化該細(xì)胞。編碼該酶的基因在轉(zhuǎn)化株的細(xì)胞中的拷貝數(shù)因此增加，結(jié)果酶活性擴(kuò)增。下面通過作為高能效呼吸鏈酶基因的編碼細(xì)胞色素bo型氧化酶的cyo操縱子(cyoABCDE)為例解釋該步驟。
已報(bào)道了大腸桿菌的cyo操縱子的序列(Chepuri等人，《生物化學(xué)雜志》26511185-11192(1990))，因此可以其序列為基礎(chǔ)將該操縱子克隆。還可以使用埃希氏桿菌屬的細(xì)菌的基因、或者由其它生物體如棒狀桿菌獲得的基因作為該cyo操縱子。
作為基因克隆和基因加入微生物所用的載體，例如可以使用可以在大腸桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒。其具體例子包括pUC19、pUS18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pSTV29等。為了將該基因引入棒狀桿菌中，可以優(yōu)選使用可以在棒狀桿菌和大腸桿菌中自主復(fù)制的穿梭載體?？稍诎魻顥U菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒的例子列如下。
pAM330(參見日本專利未審公開(特開)58-67699)pHM1519(參見日本專利未審公開58-77895)pAJ655(參見日本專利未審公開58-192900)pAJ611(參見日本專利未審公開58-192900)pAJ1844(參見日本專利未審公開59-192900)pCG1(參見日本專利未審公開57-134500)pCG2(參見日本專利未審公開58-35197)pCG4(參見日本專利未審公開57-183799)pCG11(參見日本專利未審公開57-183799)pHK4(參見日本專利未審公開5-7491)為了將含有cyo操縱子的DNA片段與一載體連接形成一重組DNA，首先將該載體用適合cyo操縱子末端的限制酶消化。通常使用例如T4 DNA連接酶的連接酶進(jìn)行該連接。
為了將如上所述制備的重組DNA引入一微生物，可以使用任意己知的轉(zhuǎn)化法。例如，可以使用一種為了增加DNA滲透性而用氯化鈣處理受體細(xì)胞的方法，已報(bào)道該方法用于大腸桿菌K-12(Mandel，M.和Higa，A.《分子生物學(xué)雜志》53，159(1970))；和一種由處于生長(zhǎng)相的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞之后向其中引入DNA的方法，己報(bào)道該方法用于枯草桿菌(Duncan，C.H.、Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.，《基因》1,153(1977))。除了這些之外，還可以使用一種將DNA-感受態(tài)細(xì)胞制成原生質(zhì)體或原生質(zhì)球的方法，它可以容易地?cái)z取重組DNA，之后將該重組DNA引入這些細(xì)胞中，該方法已知可用于枯草桿菌、放線菌和酵母菌(Chang，S.和Choen，S.N.《分子基因工程》168，111(1979)；Bibb，M.J.、Ward，J.M.和Hopwood，O.A.《自然》274，398(1978)；Hinnen，A、Hicks，J.B.和Fink，G.R.《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》75，1929(1978))。通過電脈沖法可以使棒狀桿菌轉(zhuǎn)化(參見日本專利未審公開2-207791)。
細(xì)胞色素bo型氧化酶活性的擴(kuò)增也可以通過在宿主的細(xì)胞色素DNA上存在該cyo操縱子的多拷貝來獲得。為了將該cyo操縱子的多拷貝引入例如屬于埃希氏桿菌屬和棒狀桿菌的細(xì)菌的微生物的細(xì)胞色素DNA中，通過使用在作為靶子的細(xì)胞色素DNA中存在多拷貝的序列進(jìn)行同源重組。作為在細(xì)胞色素DNA中存在多拷貝的序列，可以使用重復(fù)DNA或者存在于轉(zhuǎn)座因子末端的反向重復(fù)。同樣，正如日本專利未審公開2-109985中公開的，還可以將該cyo操縱子引入轉(zhuǎn)座子，使其被轉(zhuǎn)移將該cyo操縱子的多拷貝引入到細(xì)胞色素DNA中。通過兩種方法之一，轉(zhuǎn)化株的細(xì)胞中的cyo操縱子的拷貝數(shù)增加，結(jié)果細(xì)胞色素bo型氧化酶活性得到提高。
除了以前述基因擴(kuò)增為基礎(chǔ)之外，細(xì)胞色素bo型氧化酶活性的提高還可以通過將cyo操縱子的表達(dá)調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng)子用更強(qiáng)的一個(gè)替換(參見日本專利未審公開1-215280)。例如，已知lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、λ噬菌體的PR啟動(dòng)子和PL啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、amyE啟動(dòng)子等為強(qiáng)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子的替換增強(qiáng)了cyo操縱子的表達(dá)，因此該細(xì)胞色素bo型氧化酶活性得到提高。表達(dá)調(diào)節(jié)序列的提高可以與該cyo操縱子的拷貝數(shù)的增加一起進(jìn)行。
通過引入如下突變高能效的呼吸鏈酶的胞內(nèi)活性應(yīng)通過微生物的誘變處理來增加，也可以達(dá)到提高該酶的活性。這種突變的例子包括增加酶的比活的編碼區(qū)的突變、增加基因的表達(dá)量的表達(dá)調(diào)節(jié)序列的突變等。作為這種誘變處理，可以利用的方法有紫外線輻照處理或用常用于突變處理的誘變劑如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和硝酸的處理。
為了降低或消除低能效呼吸鏈酶的活性，可以在該酶的基因中引入一突變，誘變將該酶的胞內(nèi)活性降低或消除，或者破壞微生物細(xì)胞色素的基因，誘變使該基因不正常作用。之后，以編碼NDH-II的ndh作為低能效呼吸鏈酶為例，解釋破壞該ndh基因的方法。
大腸桿菌的ndh序列已有報(bào)道(Young等人，《歐洲生物化學(xué)雜志》116165-170(1981))，因此可以該序列為基礎(chǔ)克隆該基因。也可以使用屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌的基因或者由其它微生物如棒狀桿菌獲得的基因作為ndh基因。
通過用含有經(jīng)內(nèi)部缺失修飾的ndh基因的DNA轉(zhuǎn)化一微生物，以便不產(chǎn)生正常作用的NDH-II(缺失型ndh基因)，并在缺失型ndh基因和細(xì)胞色素的ndh基因之間重組，可以破壞細(xì)胞色素的ndh基因。通過同源重組的這種基因破壞已經(jīng)建立，并且有利用線性DNA、含有溫度敏感的復(fù)制控制區(qū)的質(zhì)粒等的方法。在本發(fā)明中，優(yōu)選利用含有溫度敏感的復(fù)制控制區(qū)的方法。
宿主細(xì)胞色素的ndh基因可以用缺失型ndh基因按如下復(fù)制。即，通過插入溫度敏感的復(fù)制控制區(qū)、缺失型ndh基因和耐藥的標(biāo)記基因首先制備重組DNA，用該重組DNA轉(zhuǎn)化一微生物。而且，將所得轉(zhuǎn)化株在溫度敏感的復(fù)制控制區(qū)不作用的溫度下培養(yǎng)，然后可以將該轉(zhuǎn)化株在含有該藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而獲得重組DNA引入該細(xì)胞色素DNA中的轉(zhuǎn)化株。
在這種重組DNA引入細(xì)胞色素DNA中的菌株中，該缺失型ndh基因與最初存在于該細(xì)胞色素中的ndh基因重組，并將該細(xì)胞色素ndh基因和該缺失型ndh基因的這兩個(gè)融合基因插入該細(xì)胞色素中，這樣重組DNA的其它部分(載體片段、溫度敏感的復(fù)制控制區(qū)和耐藥標(biāo)記物)應(yīng)存在于兩個(gè)融合基因之間。由于在該狀態(tài)下正常ndh基因?yàn)轱@性，因此該轉(zhuǎn)化體報(bào)道NDH-II。
然后，為了僅將缺失型ndh基因留在細(xì)胞色素DNA上，一個(gè)拷貝的該ndh基因與載體片段(包括溫度敏感的復(fù)制控制區(qū)和耐藥標(biāo)記物)一起從細(xì)胞色素DNA中通過將這兩種ndh基因重組剔除。這種情況下，正常ndh基因留在該細(xì)胞色素DNA上，并且將該缺失型ndh基因從細(xì)胞色素DNA切除，或者與之相反，缺失型ndh基因留在細(xì)胞色素DNA上，將正常ndh基因從細(xì)胞色素DNA切除。在這兩種情況下，當(dāng)該細(xì)胞在溫度敏感的復(fù)制控制區(qū)可以作用的溫度下培養(yǎng)時(shí)，切除的DNA可以質(zhì)粒形式留在細(xì)胞中。之后，細(xì)胞在溫度敏感的復(fù)制控制區(qū)不能作用掉出質(zhì)粒DNA的溫度下培養(yǎng)，并且可以獲得ndh基因缺失突變體。
具有大腸桿菌的溫度敏感的復(fù)制起點(diǎn)的載體的例子包括例如國(guó)際專利公開WO99/03988中所示的質(zhì)粒pMAN997等，具有棒狀桿菌的溫度敏感的復(fù)制起點(diǎn)的載體的例子包括例如日本專利未審公開5-7491中所示的質(zhì)粒pHSC4等。然而，質(zhì)粒并不限于這些，也可以使用其它載體。
以上述方式獲得的這種微生物的特定例子包括SomM型氧化酶或NDH-I、或者它們兩者都提高的微生物、細(xì)胞色素bd型氧化酶或NDH-II的活性、或者兩者的活性都降低或消除的微生物、以及SomM型氧化酶或NDH-I、或者它們兩者都提高并且細(xì)胞色素bd型氧化酶或NDH-II的活性、或者兩者的活性都降低或消除的微生物。更具體地說，可以提到的有例如SomM型氧化酶的活性提高且使NDH-II有缺陷的大腸桿菌。SomM型氧化酶的例子包括細(xì)胞色素bd型氧化酶。
用于本發(fā)明的微生物沒有特別限制，只要其可以賦予前述性質(zhì)，其例子包括使用如大腸桿菌的埃希氏桿菌屬的細(xì)菌、如谷氨酸棒桿菌的棒狀桿菌、如枯草芽孢桿菌的芽孢桿菌、如粘質(zhì)沙雷氏菌的沙雷氏菌、如釀酒酵母的酵母菌等。
特別地，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物為L(zhǎng)-蘇氨酸時(shí)，可以提到的有大腸桿菌VKPM B-3996(RIA1867)(參見US3,175,107)谷氨酸棒桿菌AJ12318(FERM BP-1172)(參見US5,198,949)等；就L-賴氨酸而言，可以提到的有大腸桿菌AJ11442(NRRL B-12185，F(xiàn)ERM BP-1543)(參見US4346170)、大腸桿菌W3110(tyrA)(該菌株是通過從大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm(FERM BP-3653)中剔除質(zhì)粒pHATerm獲得的，參見國(guó)際專利公開WO95/16042)、谷氨酸棒桿菌AJ12435(FERM BP-2294)(US5,304,476)、棒桿菌AJ3990(ATCC31269)(參見US4,066,501)等；就L-谷氨酸而言，可以提到的有大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853)(參見法國(guó)專利未審公開2,680,178)、谷氨酸棒桿菌AJ12821(FERM BP-4172)(日本專利未審公開5-26811，法國(guó)專利未審公開2,701,489)、谷氨酸棒桿菌AJ12475(FERM BP-2922)(參見US5,272,067)、谷氨酸棒桿菌AJ13029(FERM BP-5189)(參見國(guó)際專利申請(qǐng)JP95/01586)等；就L-亮氨酸而言，可以提到的有大腸桿菌AJ11478(FERM P-5274)(參見日本專利公布(特許)62-34397)、谷氨酸棒桿菌AJ3718(FERMP-2516)(參見US3,970,519)等；就L-異亮氨酸而言，可以提到的有大腸桿菌KX141(VKPM B-4781)(參見歐洲專利未審公開519,113)、谷氨酸棒桿菌AJ12149(FERM BP-759)(參見US4,656,135)等；就L-纈氨酸而言，可以提到的有大腸桿菌VL1970(VKPM B-4411)(參見歐洲專利未審公開519,113)、谷氨酸棒桿菌AJ12341(FERM BP-1763)(參見US5,188,948)等；就L-苯丙氨酸而言，可以提到的有大腸桿菌AJ12604(FERM BP-3579)(日本專利未審公開5-236947，歐洲專利未審公開488,424)、谷氨酸棒桿菌AJ12637(FERM BP-4160)(參見法國(guó)專利未審公開2,686,898)等。
在用于本發(fā)明的這些微生物中，根據(jù)靶物質(zhì)，可以將靶物質(zhì)生物合成時(shí)涉及的酶的活性提高。而且，可以將不利于生產(chǎn)靶物質(zhì)的酶的活性降低或消除。
靶物質(zhì)的生產(chǎn)可以是將如上所述的這種微生物在一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而在該培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積聚該靶物質(zhì)，并收集該靶物質(zhì)。
用于生產(chǎn)靶物質(zhì)的培養(yǎng)基可以為常用的公知培養(yǎng)基，它可以根據(jù)所用的微生物進(jìn)行選擇。即，該培養(yǎng)基可以為含有碳源、氮源、無機(jī)離子、以及如果需要的話其它有機(jī)組分的常規(guī)培養(yǎng)基。不需要任意特定的培養(yǎng)基實(shí)施本發(fā)明。
作為碳源，可以使用糖，例如葡萄糖、乳糖、果糖或淀粉水解物；醇，例如甘油或山梨糖醇；有機(jī)酸，例如富馬酸、檸檬酸或琥珀酸等。
作為氮源，可以使用無機(jī)銨鹽，例如硫酸銨、氯化銨或磷酸銨；有機(jī)氮，例如大豆水解物；氨氣；氨水等。
理想地含有適宜量的作為有機(jī)痕量營(yíng)養(yǎng)素的所需物質(zhì)如維生素B1、L-高絲氨酸、L-酪氨酸或酵母浸出物。除了上述的之外，如果需要的話，加入少量的磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
可以在常用的公知條件下進(jìn)行培養(yǎng)，該條件可以根據(jù)所用的微生物進(jìn)行選擇。例如，優(yōu)選在需氧條件下培養(yǎng)16-120小時(shí)。培養(yǎng)溫度優(yōu)選控制在25-45℃，培養(yǎng)時(shí)pH優(yōu)選控制在5-8?？梢允褂脽o機(jī)或有機(jī)、酸性或堿性物質(zhì)以及氨氣等調(diào)節(jié)pH。
培養(yǎng)之后，為了從該培養(yǎng)基中收集代謝產(chǎn)品，本發(fā)明不需要任意特定方法。即，本發(fā)明可以使用常規(guī)公知的離子交換技術(shù)、沉淀技術(shù)和其它技術(shù)的組合進(jìn)行。
下面，參照以下實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明。實(shí)施例1克隆細(xì)胞色素bo型氧化酶基因用于編碼大腸桿菌的細(xì)胞色素bo型氧化酶的cyo操縱子的序列(cyoABCDE)已有報(bào)道(Chepuri等人，《生物化學(xué)雜志》26511185-11192(1990))，因此以該序列為基礎(chǔ)克隆該操縱子。
特別地，該靶cyo操縱子基因從含有該cyo操縱子的Kohara的噬菌體庫(kù)獲得(Kohara等人，《細(xì)胞》50495-508(1987))。噬菌體DNA由含有該操縱子的Kohara的噬菌體克隆147[2H5]使用Wizard lambda prep(Promega)獲得。所得噬菌體DNA147[2H5]用pshBI消化，獲得的5.5kb含有cyo操縱子的片段經(jīng)平端，并插入pMW119(Nippon基因)的SmaI位點(diǎn)，從而克隆含有一啟動(dòng)子區(qū)的cyo操縱子。在所得質(zhì)粒中，以與pMW119的乳糖操縱子啟動(dòng)子相反的方向?qū)⒃揷yo操縱子插入。該質(zhì)粒命名為pMW(CYO)B。
將該質(zhì)粒pMW(CYO)B引入大腸桿菌W3110菌株(從日本Shizuoka，Mishima全國(guó)基因?qū)W學(xué)會(huì)獲得)，從而獲得W3110/pMW(CYO)B。使用已知方法(Kita等人，《生物化學(xué)雜志》2593368-3374(1984))測(cè)定W3110和W3110/pMW(CYO)B菌株的細(xì)胞浸出物中存在的泛醇氧化酶活性作為最終氧化酶活性。結(jié)果示于表1。
表1泛醇?xì)浠富钚?
如表1所示，發(fā)現(xiàn)用pMW(CYO)B引入的菌株中最終氧化酶活性提高。最終氧化酶活性的這種提高被認(rèn)為是因細(xì)胞色素bo型氧化酶活性通過cyo操縱子的提高而提高引起的。實(shí)施例2NDH-II缺陷菌株的獲取為了生產(chǎn)NDH-II缺陷菌株，制備NDH-II的內(nèi)裂部分序列(破壞型NDH-II基因)。以用于編碼大腸桿菌的NDH-II的基因ndh的己知序列為基礎(chǔ)克隆NDH-II的該部分序列(Young等人，《歐洲生物化學(xué)雜志》116165-170(1981))。
特別地，破壞型NDH-II基因的制備如下(圖1)。首先，將約2.4kb的含有NDH-II的部分序列的DNA片段使用ndh-l(SEQ ID NO1)和ndh-2(SEQ IDNO2)作為引物通過PCR由大腸桿菌細(xì)胞色素DNA擴(kuò)增。將該片段克隆到pGEM-T載體(Promega)中，從而獲得pGEM-ndh。該pGEM-ndh用限制酶EcoRI和StuI消化，收集0.5kb所得DNA片段，并將其連接到用EcoRI和SmaI消化的pTWV229(Takara Shuzo)上，從而獲得pTWV-ndh。
然后，pGEM-ndh用限制酶StuI消化，收集到0.9kb所得DNA片段，并將其插入pTWV-ndh的HincII位點(diǎn)。因此，獲得在ndh的部分序列中含有pTWV229的部分多克隆位點(diǎn)的pTWVAndh。該質(zhì)粒pTWVΔndh含有在ndh部分序列中在StuI位點(diǎn)用由pTWV229獲得的17bp序列插入的ndh序列。接著，將通過用HindIII和EcoRI消化pTWVΔndh獲得的1.5kb片段插入溫度敏感的質(zhì)粒pMAN997的Hindm和EcoRI位點(diǎn)之間(參見國(guó)際專利公開W099/03988)，從而獲得pTS-Δndh。通過利用pTS-Δndh的溫度敏感性的常規(guī)同源重組技術(shù)就ndh在該質(zhì)粒pTS-Δndh和W3110菌株的基因組之間進(jìn)行同源重組(Matuyama等人，《細(xì)菌學(xué)雜志》1621196(1985))，由于在該基因組上在ndh的編碼區(qū)內(nèi)插入由pTWV229獲得的17bp序列，因此獲得不表達(dá)正常NDH-II蛋白質(zhì)的W3110(ndh)菌株。由W3110(tyrA)，使用四環(huán)素抗性作為標(biāo)己通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)將tyrA缺陷引入W3110(ndh)菌株，從而獲得W3110(ndh，tyrA)菌株。
通過交換pMAN031(《細(xì)菌學(xué)雜志》162， 1196(1985))和pUC19(Takara Shuzo)的VspI-HindIII片段獲得前述的pMRN997(圖2)。
而且，盡管歐洲專利未審公開488424/1992中詳述了該W3110(tyrA)菌株，但是其制備方法簡(jiǎn)單解釋如下。
該大腸桿菌W3110菌株由全國(guó)基因?qū)W會(huì)(Kishima，Shizuoka)獲得。將該菌株接種在含有鏈霉素的LB平皿上，選擇形成一菌落的菌株，從而獲得一耐鏈霉素的菌株。將所選的耐鏈霉素的菌株和大腸桿菌K-12 ME8424菌株混合，并在一完全培養(yǎng)基(L-Broth1％細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、0.5％NaCl)中于37℃下靜止培養(yǎng)15分鐘，從而誘導(dǎo)接合。該大腸桿菌K-12 ME8424菌株具有(HfrPO45、thi、relAl、tyrATn10、ung-1、nadB)的遺傳性狀，并且可以從全國(guó)基因?qū)W會(huì)獲得。之后，將該培養(yǎng)物接種在一含有鏈霉素、四環(huán)素和L-酪氨酸的完全培養(yǎng)基(L-Broth1％細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、0.5％NaCl、1.5％瓊脂)中，并選擇形成菌落的菌株。該菌株被命名為大腸桿菌W3110(tyrA)菌株。
歐洲專利未審公開488424/1992公開了通過將一質(zhì)粒引入上面菌株中獲得的許多菌株。例如，通過引入質(zhì)粒pHATerm獲得的菌株命名為大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm，于1991年11月16日將其保藏在國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部的產(chǎn)業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處的全國(guó)生物科學(xué)和人技術(shù)協(xié)會(huì)(1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，郵政編碼305)(目前為獨(dú)立管理公司，全國(guó)先進(jìn)產(chǎn)業(yè)科學(xué)和技術(shù)協(xié)會(huì)，國(guó)際專利生物體保藏處(Chue Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibarak-ken，日本，郵政編碼305-5466)，該處為布達(dá)佩斯條約規(guī)定的國(guó)際保藏處，并收到一登記號(hào)FERM BP-3653。大腸桿菌W3110(tyrA)菌株可以常規(guī)方式由上面菌株剔除質(zhì)粒pHATerm獲得。實(shí)施例3生產(chǎn)L-賴氨酸將實(shí)施例1中獲得的質(zhì)粒pMW(CYO)B引入實(shí)施例2獲得的W3110(tyrA)菌株和W3110(ndh，tyrA)菌株，從而分別獲得W3110(tyrA)/pMW(CYO)B和W3110(ndh，tyrA)/pMW(CYO)B。相似地，將pMW119引入W3110(tyrA)，從而獲得W3110(tyrA)/pMW119菌株。通過在燒瓶中培養(yǎng)評(píng)價(jià)這些W3110(tyrA)/pMW(CYO)B菌株、W3110(ndh，tyrA)/pMW(CYO)B菌株和作為對(duì)照的W3110(tyrA)/pMW119的L-賴氨酸生產(chǎn)能力。使用具有以下組成的培養(yǎng)基在37℃下邊攪拌邊培養(yǎng)24-48小時(shí)。結(jié)果示于表2。(培養(yǎng)基組成)葡萄糖 40g/LMgSO4.7H2O 1g/LKH2PO41g/LFeSO4.7H2O 0.01g/LMnSO4.5H2O 0.01g/L酵母浸出物(Difco)2g/LL-酪氨酸 0.1g/L或0.05g/L用KOH將該培養(yǎng)基調(diào)整至pH7.0，并在115℃下高壓滅菌10分鐘。但是，將葡萄糖MgSO4.7H2O分開滅菌。而且，在培養(yǎng)之前，將30g/L日本藥典的CaCO3在180℃下進(jìn)行干滅菌，并將100μg/L抗生素-氨芐青霉素加入該培養(yǎng)基。
表2L-賴氨酸的產(chǎn)量
發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌生產(chǎn)L-賴氨酸時(shí)通過提高細(xì)胞色素bo型氧化酶活性提高了L-賴氨酸生產(chǎn)能力。這被認(rèn)為是由于通過改善高能效呼吸鏈路徑提高了能量獲取效率，并將該能量用于該L-賴氨酸生產(chǎn)引起的。還發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌生產(chǎn)L-賴氨酸時(shí)通過使NDH-II缺陷型提高了L-賴氨酸生產(chǎn)能力。這被認(rèn)為是由于通過使低能效呼吸鏈路徑有缺陷提高了能量獲取效率，并將該能量用于L-賴氨酸生產(chǎn)引起的。實(shí)施例4生產(chǎn)L-蘇氨酸將通過前述方法獲得的質(zhì)粒pMW(CYO)B引入L-蘇氨酸生產(chǎn)菌-大腸桿菌VKPM B-3996(RIA1867)(參見US5,175,107，下文稱之為“B-3996”菌株)，從而獲得B-3996/pMW(CYO)B菌株。該B-3996菌株藏匿通過將該蘇氨酸操縱子插入含有耐鏈霉素的標(biāo)記的野生宿主載體質(zhì)粒pAYC32中獲得的質(zhì)粒pVIC40(國(guó)際專利公開WO90/04636)(參見Chistorerdov，A.Y.、Tsygankov，Y.D.《質(zhì)?！?986，16，161-167)。該B-3996菌株以登記號(hào)RIA1867保藏在USSR抗生素研究協(xié)會(huì)(VNIIA)。
作為對(duì)照，B-3996/pMW119是通過將pMW119引入B-3996獲得的。通過在燒瓶中培養(yǎng)評(píng)價(jià)這些B-3996/pMW(CYO)B和B-3996/pWW119的L-蘇氨酸的生產(chǎn)能力。使用表3中所述組成在37℃、114-116rpm的攪拌下培養(yǎng)38小時(shí)。將表3中所述的組分A、組分B和組分C分別制備并殺菌，然后將它們冷卻并以比例16/20體積的組分A、4/20體積的組分B和30g/L組分C混合。結(jié)果示于表4。
表3蘇氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基
表4L-蘇氨酸的產(chǎn)量
發(fā)現(xiàn)，通過提高細(xì)胞色素bo型氧化酶活性可以提高生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌的L-蘇氨酸生產(chǎn)能力。實(shí)施例5生產(chǎn)L-苯丙氨酸按照質(zhì)粒的常規(guī)提純方法從大腸桿菌W3110(tyrA)/pACMAB、pBR-aroG4菌株收集質(zhì)粒pACMAB該質(zhì)粒為在適宜的L-苯丙氨酸生物合成系統(tǒng)中在質(zhì)粒載體pACYC184(Apz)的BamUI和HindIII斷裂位點(diǎn)之間插入含有脫敏型分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶(CM-PDH)基因的DNA片段獲得的質(zhì)粒(參見國(guó)際專利公開WO97/08333)。1991年1月28日將該W3110(tyrA)/pACMAB、pBR-aroG4菌株(命名為AJ12604)保藏在國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部的產(chǎn)業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處的全國(guó)生物科學(xué)和人類技術(shù)協(xié)會(huì)(1-3Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，郵政編碼305)并收到一登記號(hào)FERM BP-11975。然后，在1991年9月26日將其轉(zhuǎn)移至布達(dá)佩斯條約規(guī)定的國(guó)際保藏處，并收到一登記號(hào)FERMBP-3579。
通過用SalI消化將該質(zhì)粒pACMAB平端。向其中插入通過PshBI消化從前述Kohara噬菌體DNA147[2H5]獲得的含5.5kb cyo操縱子的平端DNA片段。將獲得的質(zhì)粒pACWAB-cyo引入W3110(tyrA)/pBR-aroG4。獲得的轉(zhuǎn)化株在用于L-苯丙氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)基(在1L水中含20g葡萄糖、29.4g磷酸氫二鈉、6g磷酸二氫鉀、lg氯化鈉、2g氯化銨、10g檸檬酸鈉、0.4g谷氨酸鈉、3g七水硫酸鎂、0.23g氯化鈣、2mg鹽酸硫胺和100mg L-酪氨酸，pH7.0)中于37℃下培養(yǎng)40小時(shí)。該培養(yǎng)基中所含的L-苯丙氨酸通過高效液相色譜定量。結(jié)果示于表5。
表5L-苯丙氨酸的產(chǎn)量
發(fā)現(xiàn)，通過提高細(xì)胞色素bo型氧化酶活性提高了生產(chǎn)L-苯丙氨酸的大腸桿菌的L-苯丙氨酸生產(chǎn)能力。
序列表<110>Ajinomoto公司<120>利用微生物生產(chǎn)物質(zhì)的方法<130>OP1186<141>2000-07-05<150>JP2000-204252<151>2001-07-<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于擴(kuò)增NDH-II基因(ndh-1)的引物<400>1cgatggaagc ttccgcgatt atggg<210>2<211>27<212>DNA<213)人工序列<220><223>人工序列的描述用于擴(kuò)增NDH-II基因(ndh-2)的引物<400>2aagcgcggaa ttcgtccttc aatcatc
權(quán)利要求
1.一種利用微生物生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，包括以下步驟在一培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，從而在該培養(yǎng)基中生產(chǎn)并積聚該靶物質(zhì)，并將該靶物質(zhì)收集，其中該微生物由具有高能效呼吸鏈路徑和低能效呼吸鏈路徑作為呼吸鏈路徑的該微生物的親株構(gòu)建，并且該微生物為具有以下特征之一或兩者的突變株或基因重組株(A)高能效呼吸鏈路徑得到提高，(B)低能效呼吸鏈路徑有缺陷。
2.如權(quán)利要求1的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中高能效呼吸鏈路徑通過增加編碼呼吸鏈中涉及的酶的基因的拷貝數(shù)或修飾該基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列得到提高。
3.如權(quán)利要求1或2的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中通過破裂編碼呼吸鏈中所涉及的酶的基因使低能效呼吸鏈路徑有缺陷。
4.如權(quán)利要求1-3任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中高能效呼吸鏈的酶包括SoxM型氧化酶、bc1復(fù)合體、NDH-I或其中兩種或三種。
5.如權(quán)利要求1-4任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中低能效的呼吸鏈的酶包括細(xì)胞色素bd型氧化酶、NDH-II或其兩者。
6.如權(quán)利要求1-5任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中在該微生物中使SoxM型氧化酶的活性提高并且使NDH-H有缺陷。
7.如權(quán)利要求1-6任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中該SoxM型氧化酶為細(xì)胞色素bo型氧化酶。
8.如權(quán)利要求1-7任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中該微生物選自屬于埃希氏桿菌屬和棒狀桿菌的細(xì)菌。
9.如權(quán)利要求1-8任一的靶物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中靶物質(zhì)選自L-氨基酸和核酸。
全文摘要
一種利用微生物生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法,包括:在一培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物,從而在該培養(yǎng)基中生產(chǎn)并積聚該靶物質(zhì),并將該靶物質(zhì)收集,該微生物使用由具有高能效呼吸鏈路徑和低能效呼吸鏈路徑作為呼吸鏈路徑的該微生物的親株構(gòu)建的突變株或基因重組珠,并具有以下特征之一或兩者:(A)高能效呼吸鏈路徑得到提高,(B)低能效呼吸鏈路徑有缺陷。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1335401SQ0112595
公開日2002年2月13日 申請(qǐng)日期2001年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月5日
發(fā)明者中井勇太, 中西一夫, 河原義雄, 伊藤久生, 倉(cāng)橋修 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社