專利名稱：人透明帶b細胞表位融合肽及其生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化學領域，特別是人透明帶B細胞表位融合肽，本發(fā)明還涉及該融合肽的生產方法。
透明帶是精卵識別和結合的基礎，利用抗透明帶抗體可以阻止精卵結合，透明帶疫苗能抑制受精，在受孕前避孕。
天然的人透明帶來源于育齡婦女的卵泡組織，可想而知，取材特別困難；用基因重組的人透明帶作抗原進行主動免疫會引起自身免疫卵巢炎等副作用；van Duin等(1994)用CHO細胞表達的人透明帶(rhZP3)，但Paterson等(1998)用rhZP3免疫獼猴，初次免疫產生1/10000的抗體滴度，但rhZP3引起的免疫反應也引起卵巢炎，卵泡發(fā)生抑制。這是由于透明帶引起的T細胞免疫導致的自身免疫反應所致。
發(fā)明人曾經設計了由人透明帶精子受體相關的B細胞表位和外源輔助T細胞表位串聯(lián)而成的嵌合肽，該嵌合肽可誘發(fā)抗體而不引起自身免疫反應。但由于該嵌合肽分子量小，通過基因工程方法表達以后與宿主細胞自分泌蛋白混在一起，不易鑒定和純化，特別是在大規(guī)模生產時增加生產成本。
原來的人透明帶B細胞表位嵌合肽由外源輔助T細胞表位14肽和人透明帶ZP3的334-360位的27肽串聯(lián)組成的41肽。Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys Lys Lys Ala ArgArg Gln Pro His Val Met Ser Gln Try Ser Arg Ser Ala SerArg Ash Arg Arg His Val Thr Glu Glu Ala Asp Val多肽鏈的分子量約為4.5kD，如果計算一定的O-糖鏈，分子量可達5-7kD。
當用基因工程方法表達生產這一短肽時，用常規(guī)的方法不易分離純化該短肽，特別是細胞培養(yǎng)液中往往含有其它的培養(yǎng)液蛋白和細胞自分泌蛋白等多種成分，一般要經過離子交換和凝膠過濾才能把該表達產物分離開來。而且，由于該表達產物分子量很小，需要選用適合小分子量的填料進行凝膠過濾才能有效地分離。
本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術存在的缺陷，設計一種人透明帶B細胞表位融合肽，在盡量不改變原嵌合肽的結構和功能的前提下對該嵌合肽進行小的分子修飾，使其基因表達產物能方便地鑒定和分離。
本發(fā)明的目的還在于提供該融合肽的生產方法。
本發(fā)明的人透明帶B細胞表位融合肽由兩段肽段串聯(lián)而成，一個肽段含人透明帶B細胞表位嵌合肽41肽序列，另一肽段是含有6個組氨酸表位的短肽，將它串聯(lián)在嵌合肽的C末端或N末端作特征性標記，既可保留原肽段的功能，又便于該融合肽的鑒定和分離。
如果把該組氨酸表位的短肽串聯(lián)在原嵌合肽的兩端，則不會影響原嵌合肽的結構和功能。分離后不必酶解去除6組氨酸短肽，直接使用可保留原嵌合肽的功能活性。
本發(fā)明的人透明帶B細胞表位融合肽可以用以下方式表達1、在含人透明帶(ZP3)B細胞表位嵌合肽41肽序列肽段的C末端串聯(lián)一段含有6個組氨酸表位的短肽作特征性標記 2、在含人透明帶(ZP3)B細胞表位嵌合肽41肽序列肽段的N末端串聯(lián)一段含有6個組氨酸表位的短肽作特征性標記 其中， 表示含有6個組氨酸表位的短肽； 表示含人透明帶(ZP3)的B細胞表位嵌合肽的肽段。人透明帶(ZP3)的B細胞表位嵌合肽(41肽)序列如下Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys Lys Lys AlaArg Arg Gln Pro His Val Met Ser Gln Try Ser Arg Ser AlaSer Arg Asn Arg Arg His Val Thr Glu Glu Ala Asp Val串聯(lián)一段含6個組氨酸的短肽后，則可利用該肽的抗體進行鑒定和分離。
現(xiàn)有商品化的分離純化柱，可通過一步純化法回收表達產物的融合蛋白。
本發(fā)明的人透明帶B細胞表位融合肽生產方法是采用基因工程方法生產該融合肽。
基因工程方法處理后得到的培養(yǎng)液離心取上清，透析，濃縮，過柱；用平衡緩沖液洗柱，勻速加樣，之后加入平衡緩沖液，再用洗脫緩沖液洗脫分離的樣品，收集各個組分分析鑒定。
回收的融合肽經透析，濃縮后保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點
1、本發(fā)明的人ZP3精子受體相關的B細胞表位融合肽可用于免疫抑制受精的表位抗原，可作為抗原用于發(fā)展避孕疫苗阻止受精。是透明帶避孕疫苗的新突破。
2、由于天然來源的人透明帶嚴重短缺，通過基因工程表達生產的人透明帶B細胞表位融合肽填補了這一空白，特別是本融合肽設計了含6個組氨酸表位的短肽，便于分離純化和產業(yè)化。因此對發(fā)展新型避孕疫苗有很好的前景。
下面通過實施例進一步敘述本發(fā)明。
實施例1在人透明帶B細胞表位嵌合肽的C末端串聯(lián)6個組氨酸構成融合肽ZPhis。 氨基酸序列如下(共49氨基酸殘基)Ala Asp Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys LysLys Ala Arg Arg Gln Pro His Val Met Ser Gln Try Ser ArgSer Ala Ser Arg Ash Arg Arg His Val Thr Glu Glu Ala AspVal HisHisHisHisHisHis利用桿狀病毒表達系統(tǒng)生產該融合肽1)、構建該融合肽基因的桿狀病毒表達載體該融合肽基因的DNA序列如下GGATCCTTCTGACAAGCACATCGAGCAATACTTGAAGAAGAAGGCTAGAAGACAGCCTCACGTGATGAGCCAGTGGTCTAGATCTGCTTCCAGAAACCGCAGACACGTGACTGAGGAGGCTGACGTGACTGTGGGACCACATCATCATCATCATCATTAAGAATTC將該DNA插入桿狀病毒表達載體pAcGP67A(PharMingen catalog#21223p)的BamHI和EcoRI間的克隆位點，篩選出重組質粒。
2)、制備重組病毒構建的重組質粒與線形化的桿狀病毒基因組DNA共轉染sf9昆蟲細胞，一周后一些細胞出現(xiàn)感染狀，表明發(fā)生同源重組產生重組病毒。收集病毒液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3)、在昆蟲細胞中表達該融合肽基因用無血清培養(yǎng)基27℃培養(yǎng)昆蟲細胞，對數(shù)生長期后，用制備的重組病毒感染昆蟲細胞，待出現(xiàn)明顯的感染狀后，取細胞懸液，2000g離心10分鐘，收集培養(yǎng)液上清，4℃透析20小時，中間換水3次。凍干濃縮備用。
4)、分離純化表達產物使用Roche公司的多組氨酸蛋白純化柱(Cat No.1817698)，經固化金屬親和層析法批量分離純化表達產物。先用20mL平衡緩沖液洗柱，加入適量樣品，封好柱之后水平轉動層析柱20min，垂直放置層析柱使凝膠下沉。
加入20mL平衡緩沖液洗柱，再依次分別用洗脫緩沖液1、2、3(分別為10mM、50mM和500mM的咪唑)洗柱，連續(xù)收集洗脫液，每管5mL，待OD280＝0時才換下一種洗脫緩沖液。分析鑒定各洗脫樣品。
5)、鑒定表達產物用Tricine-SDS-PAGE檢測收集的洗脫液成分，洗脫液1洗脫出來的主要是細胞的自分泌蛋白。融合肽主要分布在洗脫緩沖液2和3的收集液中，分子量約6-7kD。把只含融合肽的洗脫液收集起來，4℃透析20小時。冷凍干燥。
實施例2在人ZP3的B細胞表位嵌合肽的N端串聯(lián)一個6組氨酸短肽構成融合肽hisZP。 氨基酸序列(50個氨基酸殘基)如下Ala Asp Pro His His His His His His Pro Ser Asp Lys His Ile GluGln Tyr Leu Lys Lys Lys Ala Arg Arg Gln Pro His Val MetSer Gln Try Ser Arg Ser Ala Ser Arg Asn Arg Arg His ValThr Glu GluAla Asp Val該融合肽的DNA序列如下GGATCCACATCATCATCATCATCATGGATCCTTCTGACAAGCACATCGAGCAATACTTGAAGAAGAAGGCTAGAAGACAGCCTCACGTGATGAGCCAGTGGTCTAGATCTGCTTCCAGAAACCGCAGACACGTGACTGAGGAGGCTGACGTGACTGTGGGACCATAAGAATTC將該DNA插入桿狀病毒表達載體pAcGP67A的EcoRI和BamHI克隆位點，制備重組質粒，按實施例1的方法制備重組病毒，感染昆蟲細胞表達該融合肽基因。
通過基因工程表達生產該融合肽后，可利用現(xiàn)有的技術和試劑，方便地進行鑒定和分離純化該融合肽，不需要常規(guī)的離子交換和凝膠過濾，一次性特異分離出該融合肽，對產業(yè)化有重要的價值。
本發(fā)明設計的融合肽保持人透明帶ZP3的B細胞表位的基本結構功能，能誘發(fā)抗人透明帶抗體，抗體能與人透明帶結合。
取實施例1和2中分離純化的融合肽免疫小鼠，每組5只小鼠，編號為HZ1、2、3、4和5；ZH1、2、3、4和5。
免疫注射誘導抗血清，每次免疫的劑量約5μg，首次免疫兩周后，每周強化免疫一次，第35天后，眼眶取血制備血清。
雙向免疫擴散試驗用1％瓊脂在載玻片上鋪板，打梅花型孔，孔直徑約0.3cm。中央孔加入從培養(yǎng)液分離的表達產物濃縮品抗原，外周孔點不同的抗血清，將孔注滿，編號記錄。將瓊脂板放在密封潮濕盒中，37℃孵育24小時，觀察抗原抗體擴散相遇產生的白色沉淀線。ZH1、ZH3和HZ1號小鼠的抗血清出現(xiàn)陽性反應，結果見表1。
表1回收的融合肽的免疫抗血清的雙擴散試驗結果
人卵透明帶酶標免疫細胞化學分析。1.從臨床手術中取人卵泡組織，制備人卵細胞的切片分四組編號，置于新配置的2％H2O2/PBS溶液中處理30分鐘，抑制內源性的過氧化物酶。2.ZH1、ZH3和HZ1號鼠抗血清用1％BSA/PBS液稀釋10倍，對照小鼠的血清也同樣稀釋10倍。四組切片分別用實驗小鼠經稀釋的抗血清和對照血清孵育30分鐘。3.用1％的BSA/PBS稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG的二抗(IgG-HRP)25倍，用經稀釋的IgG-HRP室溫孵育30分鐘。4.DAB-H2O2液顯色。
發(fā)現(xiàn)經ZH1、ZH3和HZ1號小鼠血清免疫反應后染色的切片，在卵細胞和顆粒層細胞之間的透明帶有一條棕黃色的帶包繞卵細胞，周圍組織和卵細胞內很少或沒有棕色。而用對照鼠血清孵育后染色的切片，沒有發(fā)現(xiàn)卵巢組織和卵細胞透明帶區(qū)域有棕黃色。說明抗血清與人卵泡的透明帶有特異性結合，即融合肽ZPhis和hisZP能誘發(fā)抗人透明帶抗體。
權利要求
1.一種人透明帶B細胞表位融合肽，其特征在于由兩段肽段串聯(lián)而成，一個肽段含人透明帶(ZP3)B細胞表位嵌合肽41肽序列，再在該肽段的C末端或N末端串聯(lián)一段含有6個組氨酸表位的短肽，所述的人透明帶ZP3的B細胞表位嵌合肽(41肽)序列如下Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys Lys Lys AlaArg Arg Gln Pro His Val Met Ser Gln Try Ser Arg Ser AlaSer Arg Asn Arg Arg His Val Thr Glu GluAla Asp Val
2.根據權利要求1所述的人透明帶B細胞表位融合肽，其特征在于所述人透明帶B細胞表位融合肽氨基酸序列如下Ala Asp Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys LysLys Ala Arg Arg Gln Pro His Val Met Ser Gln Try Ser ArgSer Ala Ser Arg Asn Arg Arg His Val Thr Glu Glu Ala AspVal His His His His His His
3.根據權利要求1所述的人透明帶B細胞表位融合肽，其特征在于所述的人透明帶B細胞表位融合肽氨基酸序列如下Ala Asp Pro His His His His His His Pro Ser Asp Lys His Ile GluGln Tyr Leu Lys Lys Lys Ala Arg Arg Gln Pro His Val MetSer Gln Try Ser Arg Ser Ala Ser Arg Asn Arg Arg His ValThr Glu GluAla Asp Val
4.權利要求1所述的人透明帶B細胞表位融合肽的生產方法，其特征在于采用基因工程方法生產。
5.根據權利要求4述的人透明帶B細胞表位融合肽的生產方法，其特征在于基因工程方法處理后得到的培養(yǎng)液離心取上清，透析，濃縮，過柱；用平衡緩沖液洗柱，勻速加樣，之后加入平衡緩沖液，再用洗脫緩沖液洗脫分離的樣品，收集各個組分分析鑒定，回收融合肽。
6.根據權利要求4或5所述的人透明帶B細胞表位融合肽的生產方法，其特征在于利用桿狀病毒表達系統(tǒng)生產權利要求2所述的融合肽1)、構建桿狀病毒表達載體融合肽的DNA序列如下GGATCCTTCTGACAAGCACATCGAGCAATACTTGAAGAAGAAGGCTAGAAGACAGCCTCACGTGATGAGCCAGTGGTCTAGATCTGCTTCCAGAAACCGCAGACACGTGACTGAGGAGGCTGACGTGCATCATCATCATCATCATTAAGAATTC將該DNA插入桿狀病毒表達載體pAcGP67A(PharMingen catalog#21223p)的BamHI和EcoRI的克隆位點，篩選出重組質粒。2)、制備重組病毒構建的重組質粒與線形化的桿狀病毒基因組DNA共轉染sf9昆蟲細胞，一周后一些細胞出現(xiàn)感染狀，表明發(fā)生同源重組產生重組病毒。收集病毒液，-20℃保存?zhèn)溆谩?)、在昆蟲細胞中表達融合肽基因用無血清培養(yǎng)基27℃培養(yǎng)昆蟲細胞，對數(shù)生長期后，用制備的重組病毒感染昆蟲細胞，待出現(xiàn)明顯的感染狀后，取細胞懸液，2000g離心10分鐘，收集培養(yǎng)液上清，4℃透析20小時，中間換水3次。凍干濃縮備用。4)、分離純化表達產物使用Roche公司的多組氨酸蛋白純化柱(Cat No.1817698)，經固化金屬親和層析法批量分離純化表達產物。先用20mL平衡緩沖液洗柱，加入適量樣品，封好柱之后水平轉動層析柱20min，垂直放置層析柱使凝膠下沉。加入20mL平衡緩沖液洗柱，再依次分別用洗脫緩沖液1，2，3(分別為10mM，50mM和500mM的咪唑)洗柱，連續(xù)收集洗脫液，每管5mL，待OD280＝0時才換下一種洗脫緩沖液。分析鑒定各洗脫樣品。5)、鑒定表達產物用Tricine-SDS-PAGE檢測收集的洗脫液成分，而洗脫液1洗脫出來的主要是細胞的自分泌蛋白。融合肽主要分布在洗脫緩沖液2和3的收集液中，分子量約6-7kD。把只含融合肽的洗脫液收集起來，4℃透析20小時。冷凍干燥。
7.根據權利要求4或5所述的人透明帶B細胞表位融合肽的生產方法，其特征在于利用桿狀病毒表達系統(tǒng)生產權利要求3所述的融合肽將該DNA插入桿狀病毒表達載體pAcGP67A的EcoRI和BamHI間的克隆位點，制備重組質粒，按權利要求6所述的方法制備重組病毒，感染昆蟲細胞表達該嵌合肽基因。
全文摘要
一種人透明帶B細胞表位融合肽,由兩段肽段串聯(lián)而成,一個肽段含人透明帶(ZP3)B細胞表位嵌合肽41肽序列,再在該肽段的C末端或N末端串聯(lián)一段含有6個組氨酸表位的短肽。其生產方法是采用基因工程方法。本發(fā)明的融合肽可用于免疫抑制受精的表位抗原,可作為抗原用于發(fā)展避孕疫苗阻止受精。由于天然來源的人透明帶嚴重短缺,通過基因工程表達生產的人透明帶B細胞表位融合肽填補了這一空白,特別是本融合肽設計了含6個組氨酸表位的短肽,便于分離純化和產業(yè)化。
文檔編號C12N15/12GK1350003SQ0112986
公開日2002年5月22日 申請日期2001年11月6日 優(yōu)先權日2001年11月6日
發(fā)明者曹佐武 申請人:暨南大學