一種借助細(xì)胞穿透肽和小孢子培養(yǎng)建立大白菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種在小孢子培養(yǎng)過程中結(jié)合細(xì)胞穿透肽的穿膜功能建立大白菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大白菜是我國(guó)最重要的蔬菜作物之一。隨著大白菜的基因組序列的釋放，對(duì)于其功能基因組學(xué)的研宄越來越引起人們的重視，構(gòu)建大白菜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系在大白菜基因功能驗(yàn)證方面具有重要作用。
[0003]在轉(zhuǎn)基因大白菜的研宄方面，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者借助于組織培養(yǎng)等手段已經(jīng)建立起了大白菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系。但是此類轉(zhuǎn)化方法存在著轉(zhuǎn)化效率低、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等不足。
[0004]細(xì)胞穿透肽是一類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的短肽(一般不超過30個(gè)氨基酸)，其跨膜能力不依賴經(jīng)典的胞吞作用，被認(rèn)為是一種理想的運(yùn)載工具。它具有一些其他運(yùn)載工具無法比擬的優(yōu)點(diǎn):低濃度條件下，可以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并且不會(huì)對(duì)膜造成明顯破壞和損傷；能介導(dǎo)各種物質(zhì)包括小分子、核酸、蛋白多肽以及納米粒子等入胞；高效、低毒。如果將細(xì)胞穿透肽和小孢子培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來，就能夠避免農(nóng)桿菌侵染的環(huán)節(jié)，直接可以利用細(xì)胞穿透肽將目的基因?qū)氚鸦蚪M，省卻了很多的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。這類滲透肽的分子量非常小，很多的商業(yè)公司可提供合成業(yè)務(wù)。同時(shí)，它又巧妙利用了植物的小孢子培養(yǎng)技術(shù)，在游離小孢子加倍之前，將目的基因?qū)?，借助游離小孢子的自然加倍現(xiàn)象，直接獲得純合穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是創(chuàng)建一種借助細(xì)胞穿透肽和小孢子培養(yǎng)建立大白菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，將細(xì)胞穿透肽和小孢子培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，快速獲得純合的大白菜轉(zhuǎn)化植株。
[0007]本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
過程包括:
(1)進(jìn)行分離純化小孢子:在大白菜開花期，選取其長(zhǎng)度為2-4mm的未開放花蕾(小孢子發(fā)育期為單核晚期至二核早期)，花蕾在超凈工作臺(tái)內(nèi)經(jīng)75%乙醇溶液，0.1% HgCl2S液消毒后，再用無菌水沖洗3次；將消毒后的花蕾在蔗糖濃度為130g.Ι^，ΡΗ值為5.8的B5培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化，收集得到的沉淀物即為純凈小孢子；將純化后的小孢子用NLN-13培養(yǎng)基稀釋后分裝入直徑60 mm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，置入33°C恒溫箱中，熱激預(yù)處理24h ;
其中，NLN-13培養(yǎng)基為含130g.L—1蔗糖，添加激素0.05mg.L ―1 6-BA ( 6-芐氨基腺嘌呤)和0.05mg.L4 NAA ( α -萘乙酸)，PH值為5.8的NLN-13培養(yǎng)基；
(2)轉(zhuǎn)染小孢子的基因表達(dá)組件的獲得:將載體pBI221-GFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，并在添加相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；以2PL菌液為模板，用引物 pi GATGGTTAGAGAGGCTTACGCAG,p2 CACAATAAAGTGACAGATAGCTGGG，p3 AGT T CA CCTTGA TGC CGTTC和p4 GTG CTT CA G CCG CTACCC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照鑒定；使用天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取，將質(zhì)粒DNA利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)；采用天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收用于轉(zhuǎn)染的目的DNA表達(dá)片段;
(3)獲取用于小孢子轉(zhuǎn)染的體外復(fù)合物:將目的DNA表達(dá)片段與細(xì)胞穿透肽按照1:4的比例混合，室溫反應(yīng)15min后再加入4PL無RNase的DNaseI反應(yīng)15min，立即放置冰上終止反應(yīng)；以未加CPP的DNA片段作為空白對(duì)照；然后用DNA純化試劑盒回收反應(yīng)產(chǎn)物，用
I%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。
[0008](4)小孢子轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)過程:目的DNA表達(dá)片段與細(xì)胞穿透肽按照1:4的比例混合反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物添加到經(jīng)熱激預(yù)處理的小孢子懸浮液中，再置于33°C恒溫箱中繼續(xù)熱激處理24h，最后轉(zhuǎn)移至25°C培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。將得到的胚狀體轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng)獲得小孢子再生植株。
[0009]誘導(dǎo)再生植株的MS培養(yǎng)基為含30g.L—1蔗糖，7.5g.L ―1瓊脂，pH值為5.8，未添加任何激素的MS培養(yǎng)基；誘導(dǎo)再生植株生根的MS培養(yǎng)基為含30g.L—1蔗糖，5.5g.L ―1瓊脂，0.1mg.L-1 NAA，pH 值為 5.8 的 MS 培養(yǎng)基；
(5 )對(duì)再生植株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定:在再生植株繼代培養(yǎng)的過程中，于超凈工作臺(tái)中取出再生植株的葉片，利用新型植物基因組DNA提取試劑盒提取大白菜轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化植株的基因組總 DNA，然后通過 1PL 的 PCR反應(yīng)體系(0.5μ?模板DNA，?μ?ΙΟΧ buffer，0.8PLdNTPs，0.5μ?引物plp2或p3p4，0.2PLTaq DNA聚合酶)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)I %的瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)；
于超凈工作臺(tái)中，從三角瓶里取PCR陽性再生植株的嫩葉，采用新型植物RNA提取試劑盒提取大白菜基因組總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。
[0010]于超凈工作臺(tái)中取出陽性與非轉(zhuǎn)化再生植株的幼葉，用Fluor Cam便攜式ChI/GFP熒光儀和激光共聚焦顯微鏡對(duì)PCR陽性轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行檢測(cè)；
采用羅氏地高辛標(biāo)記試劑盒II對(duì)陽性植株進(jìn)行Southern Blot檢測(cè)；
(6)利用流式細(xì)胞儀對(duì)再生植株進(jìn)行倍性鑒定:取直徑為l_2cm大小的新鮮嫩葉放入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入2.0 mL Chopping Buffer緩沖液(15 mmol.L—1三羥甲基氨基甲烷，2mmol.L—1乙二胺四乙酸二鈉，0.5 mmol.L ―1精胺，80 mmol.L勺氯化鉀，20 mmol.L-1氯化鈉，0.1% [v/v]聚乙二醇辛基苯基醚和15 mmol.L—1 二巰基乙醇，pH 7.5)，用手術(shù)剪刀將葉片剪碎，吸取上清液，用300目篩網(wǎng)將樣品過濾到離心管內(nèi)，100rpm離心lOmin，離心后棄上清，沉淀加ImL PI (碘化丙啶)染液，混勻避光染色15min后，將樣品用500目篩網(wǎng)過濾到上樣管中，混勻上機(jī)檢測(cè)，約20s后分析儀自動(dòng)形成代表該樣品倍性的DNA含量峰值圖；以已知二倍體的材料為對(duì)照，使對(duì)照的DNA吸收峰處在200道(X軸)位置，每個(gè)待測(cè)植株分別測(cè)定3次，DNA吸收峰值處在200道的樣本即為二倍體，而峰值處在100為單倍體，既有200峰值也有400峰值或者既有400峰值也有800峰值的則為嵌合體。
[0011]本發(fā)明的積極效果:
(I)游離小孢子培養(yǎng)本身具有快速獲得目標(biāo)性狀、縮短育種年限、降低育種成本等優(yōu)點(diǎn)。將其與細(xì)胞穿透肽相結(jié)合，獲得的后代群體大，基因型純合，將會(huì)提高轉(zhuǎn)化頻率。
[0012](2)所用的轉(zhuǎn)化材料為小孢子DH系，是遺傳意義上的純系。如果獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化植株之間遺傳背景完全一致，且完全純合，便于后代的檢測(cè)，進(jìn)而進(jìn)行基因功能的驗(yàn)證。
[0013](3)細(xì)胞穿透肽和質(zhì)粒DNA之間通過一定的比例就可以結(jié)合從而形成一種復(fù)合物，向游離小孢子懸浮液中添加這些復(fù)合物后，胚胎發(fā)生基本不受影響。
[0014](4)本發(fā)明獲得高效的大白菜遺傳轉(zhuǎn)化體系，不僅為大白菜育種研宄提供了新的研宄平臺(tái)，也為大白菜功能基因組學(xué)的研宄提供了良好的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0015]圖1:DNase I保護(hù)分析檢測(cè)結(jié)果。
[0016]圖中:ck:陰性對(duì)照；1: DNA(6F乃；2:DNA與細(xì)胞穿透肽的復(fù)合物；M: D5000 圖2:轉(zhuǎn)染后的小孢子培養(yǎng)過程。
[0017]圖中:Α:轉(zhuǎn)染后得到的胚狀體；B:胚狀體轉(zhuǎn)入固體MS培養(yǎng)基進(jìn)行成苗；C:再生植株的繼代培養(yǎng)；D:再生植株的生根情況
圖3:大白菜基因組總DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0018]圖4:轉(zhuǎn)化再生植株的部分PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。
[0019]圖中:η:非轉(zhuǎn)化植株；P:質(zhì)粒DNA
圖5:大白菜基因組總RN