專利名稱：肝臟組織來源的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及從心臟停止跳動(dòng)的供體尸體的組織獲得包括祖細(xì)胞或干細(xì)胞的二倍體細(xì)胞。
背景技術(shù)：
從肝臟分離和鑒定未成熟的祖細(xì)胞具有極大的臨床和商業(yè)利益，因?yàn)樵摷?xì)胞群體在治療肝臟疾病中具有效果。在美國每年有大約300,000例因?yàn)楦闻K衰竭住院。肝移植對(duì)某些形式的肝衰竭具有療效，且在美國每年進(jìn)行大約4800例移植。肝臟移植中的一個(gè)限制性因素是供體肝臟的可得性，特別是受到器官移植的供體肝臟必須來自經(jīng)歷腦死亡但心跳未停止的病人的限制。盡管最近如果在死亡半小時(shí)內(nèi)獲得該肝臟時(shí)使用該供體的努力支持了使用它們的可能性，但是來自尸體(心搏停止)的供體肝臟尚未成功。
將細(xì)胞移植進(jìn)肝臟對(duì)于大多數(shù)肝臟疾病而言是一種有吸引力的治療選擇。細(xì)胞移植的手術(shù)操作相對(duì)于完整器官移植所需的那些操作較小，因此，可用于有各種手術(shù)危險(xiǎn)的病人，例如，老年人或衰弱病人。使用人肝細(xì)胞優(yōu)于來自其它哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞，因?yàn)闈撛诘牟≡w(如果有的話)是人類來源的，病人能更好地耐受且容易在用前篩選。
過去為獲得認(rèn)為是最多用的群體的肝臟祖細(xì)胞群體用于肝臟的細(xì)胞和基因治療已作出了嘗試。Reid等的美國專利號(hào)5,576,207和5,789,246使用細(xì)胞表面標(biāo)記和側(cè)面散射流式細(xì)胞術(shù)提供了肝臟中的限定亞群體。肝臟祖細(xì)胞是二倍體細(xì)胞，它們或其后代能分化成肝細(xì)胞。
肝臟祖細(xì)胞對(duì)于生長因子的生產(chǎn)也非常有用。這與其自身生長或肝臟中其它祖細(xì)胞(例如，造血或間充質(zhì)祖細(xì)胞)的生長相聯(lián)系且也可包括與將肝臟祖細(xì)胞供給特定譜系的早期步驟相關(guān)的尚未發(fā)現(xiàn)的生長因子。這些新生長因子在治療肝臟疾病或控制肝臟癌癥(現(xiàn)在認(rèn)為是肝臟祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化突變體)中具有潛力。
另外，肝臟祖細(xì)胞是基因治療的載體，其中遺傳插入轉(zhuǎn)化的或正常的肝臟祖細(xì)胞可促進(jìn)移植該肝臟祖細(xì)胞的個(gè)體的健康。
進(jìn)行肝細(xì)胞移植的嘗試?yán)昧宋捶蛛x的成熟肝細(xì)胞并顯示了一定程度的功效。然而，該成就需要注射大量細(xì)胞(100-200億個(gè))，因?yàn)樵摷?xì)胞在體內(nèi)的生長潛力有限。另外，導(dǎo)入大量的大型成熟肝細(xì)胞(平均細(xì)胞直徑25-50μm)伴隨著注射時(shí)形成大量聚集的傾向，導(dǎo)致潛在的致命栓塞。而且，這些細(xì)胞誘發(fā)顯著的免疫學(xué)排斥反應(yīng)，迫使病人靠免疫抑制藥物來維持余生。
成熟的，分化的肝細(xì)胞通過一些標(biāo)準(zhǔn)可與肝臟祖細(xì)胞區(qū)分開來。分化的細(xì)胞傾向于形成團(tuán)塊或聚集，如果注射進(jìn)病人，導(dǎo)致出現(xiàn)栓塞形成的危險(xiǎn)。分化的細(xì)胞特別耐冷藏且具有顯著的免疫原性。而且，由于分化細(xì)胞的增殖能力有限，用分化細(xì)胞移植與器官移植相比具有較小的優(yōu)勢(shì)(如果有的話)，且具有包括制備程序更精細(xì)的缺點(diǎn)。
需要供體組織的用于移植或其它醫(yī)學(xué)目的的重要器官，例如，心臟，肝臟，胰腺，肺和腎的短缺是由于仍然具有功能的器官的可獲得性有限。當(dāng)前，用于移植的器官從心臟仍在跳動(dòng)的腦死亡的供體取得。如果心跳停止，血液循環(huán)就停止(局部缺血)，它中斷了組織的氧合作用(缺氧)，因此，器官在極短的時(shí)間期間內(nèi)受到局部缺血損傷導(dǎo)致出現(xiàn)這樣一種幾乎確定的可能性，即移植時(shí)該器官不發(fā)揮功能。一般來說，不使用心跳停止后的器官，在實(shí)驗(yàn)上，沒有使用心跳停止或心搏停止時(shí)間超過1個(gè)半小時(shí)后的器官。通常，醫(yī)院只有1-2％的死亡滿足腦死亡有心跳的標(biāo)準(zhǔn)。然而，可獲得大量且尚未利用的器官來源用于移植，其中許多來自事故的遇難者，他們或者在受傷時(shí)死亡，或者具有較短的傷后存活時(shí)間。這些事故遇難者由于局部缺血損傷而未被用作器官供體。諸如肝臟，腦和心臟的器官屬于局部缺血最敏感的組織。例如，由于心跳停止的缺氧和局部缺血腦損傷在大約4分鐘后導(dǎo)致腦和有關(guān)神經(jīng)組織的損傷。心跳停止后心臟可完整存活達(dá)4小時(shí)。肝臟可有功能地存活不超過1小時(shí)，且來自無心跳的供體(NHBDs)的移植建議優(yōu)選在出現(xiàn)暖局部缺血的前35分鐘內(nèi)進(jìn)行[參見Ong HS，Soo KC，Joseph VT，Tan SY，Jeyaraj PR的文章(作為參考文獻(xiàn)引用)的摘要。Ann Acad Med Singapore 1999年1月；28(1)25-30，暖局部缺血延遲后用于移植的肝臟移植物的活力；Hong HQ，Yin HR，Zhu SL，Lin YT，來自選擇的無心跳尸體供體的移植肝臟的結(jié)果，Hiroshima J Med Sci，1991年9月；40(3)87-91]。在目前的醫(yī)學(xué)法規(guī)下，在可搶救潛在可移植器官的時(shí)間之前的時(shí)間通常被耽擱。這是因?yàn)闈撛诘墓w必須首先被帶到醫(yī)院或停尸室。然后家屬必須填寫器官捐贈(zèng)表格。只有在器官捐贈(zèng)程序完成后，才許可手術(shù)小組接近尸體以獲取器官。在許多場合下由于這些程序?qū)е聲r(shí)間流逝，器官已經(jīng)不可逆地受到損傷或者不再有活力。因此，現(xiàn)有技術(shù)提供了大量方法和程序用于防止供體器官局部缺血損傷。參見，例如美國專利號(hào)5,702,881；5,660,976；5,752,929；5,863,296；5,855,617；5,843,024；5,827,222；5,723,282；5,514,536；和4,723,939等并以參考文獻(xiàn)的形式在本文中引用。盡管大量的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)針對(duì)防止供體器官喪失功能的方法，但對(duì)于使用心跳停止超過不可逆時(shí)間點(diǎn)的尸體的情況現(xiàn)有技術(shù)沒有記載。只有3篇美國專利(5,843,024；5,702,881；4,723,939)似乎涉及無心跳的供體。但該現(xiàn)有技術(shù)沒有教導(dǎo)使用“不可修復(fù)的”器官用于從其中分離祖細(xì)胞。盡管分離肝臟前體細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如美國專利號(hào)5,576,207和5,789,246，本文作為參考文獻(xiàn)引用)，但直到本發(fā)明付諸實(shí)踐時(shí)還不知道可從現(xiàn)有技術(shù)認(rèn)為“無用”的器官分離前體肝臟細(xì)胞。
由本文所述的本發(fā)明的發(fā)明人開創(chuàng)的，從對(duì)人肝臟祖細(xì)胞及其分離和擴(kuò)增的認(rèn)識(shí)進(jìn)展建立的技術(shù)通過提供對(duì)細(xì)胞移植進(jìn)肝臟非常有用的新細(xì)胞群體產(chǎn)生對(duì)與肝臟疾病相關(guān)的發(fā)病率和死亡率的重要影響。
因此，對(duì)于使用來自血液循環(huán)停止或無心跳的尸體的器官作為醫(yī)學(xué)目的的器官或器官等同物來源的有效方法存在長期需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及提供具有至少一種二倍體細(xì)胞群體的組織作為二倍體細(xì)胞來源的方法。該方法包括(a)從獲取組織時(shí)無心跳的供體獲取組織，所獲取的組織被認(rèn)為具有至少一種二倍體細(xì)胞群體；(b)處理獲取的組織以獲得基本上富含二倍體細(xì)胞的一種細(xì)胞群體。優(yōu)選的是，供體不是胎兒且選自新生兒，嬰兒，兒童，少年人或成年人。從該方法獲得的二倍體細(xì)胞包括祖細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，處理步驟包括處理獲取的組織以提供基本上的單細(xì)胞懸液。經(jīng)過將基本上的單細(xì)胞懸液分成兩個(gè)或多個(gè)部分，一般三個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選4個(gè)或多個(gè)來進(jìn)一步處理該單細(xì)胞懸液。在該分離步驟中，將大細(xì)胞與小細(xì)胞分離，高密度細(xì)胞與低密度細(xì)胞分離，或兩種情況都分離?？墒褂帽绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的將細(xì)胞分成小部分的任何方法。一個(gè)方便的方法是離心，首先以較低速度，然后逐漸加快速率。進(jìn)一步處理基本上由小細(xì)胞，低密度細(xì)胞，或兩者組成的部分以提供基本上富含二倍體細(xì)胞的細(xì)胞群體。具體地說，所需的二倍體細(xì)胞的例子包括表達(dá)甲胎蛋白的祖細(xì)胞，特別是肝臟祖細(xì)胞。
本發(fā)明的優(yōu)選組織是在供體心跳停止后大約6小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選心跳停止后大約3小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選心跳停止后大約2小時(shí)內(nèi)，最優(yōu)選心跳停止后大約1小時(shí)內(nèi)獲取的那些組織。然而，供體心跳停止后獲取該組織的時(shí)間越早越好。因此，在供體心跳停止后大約45，30或15分鐘內(nèi)獲取的組織仍然是較優(yōu)選的。可獲取各種組織并進(jìn)行處理以獲得二倍體細(xì)胞，包括腎上腺，血管，骨髓，角膜，視網(wǎng)膜，胰島，膽管，晶狀體，肺，腎，心臟，腸，卵巢，胰腺，前列腺，甲狀旁腺，松果體，腦垂體，皮膚，睪丸，膀胱，腦，脊髓，脾臟，胸腺，甲狀腺或者肝臟。
本發(fā)明還涉及一種組合物，它含有一種基本上富含二倍體細(xì)胞的細(xì)胞群體，特別是用本發(fā)明的方法獲得的，表達(dá)甲胎蛋白的那些細(xì)胞。
本發(fā)明在獲得供體器官和組織的領(lǐng)域中取得了重要突破并提供了獲得祖細(xì)胞和二倍體成年細(xì)胞的組織來源的方法。本發(fā)明是完全意想不到的，因?yàn)樗幸阎默F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)都認(rèn)為局部缺血損傷的器官對(duì)于任何有意義的目的都是完全無用的。優(yōu)選的方法包括從供體獲取組織，其中該供體無心跳，并處理該組織以提供包括祖細(xì)胞或干細(xì)胞的二倍體細(xì)胞。
優(yōu)選的是，本發(fā)明包含提供包括祖細(xì)胞的肝臟二倍體細(xì)胞的組織來源的方法，它包括從供體獲取肝臟組織，其中該供體無心跳，并處理該組織以提供二倍體細(xì)胞和/或肝臟祖細(xì)胞。例如，該細(xì)胞可用于在需要的宿主中恢復(fù)損傷的肝臟實(shí)質(zhì)群體或重建肝臟。盡管任何動(dòng)物供體是同樣合適的，但優(yōu)選的供體是人類。諸如豬和靈長類的動(dòng)物是同樣合適的。
因此，本發(fā)明的目的是在心跳停止后大約24小時(shí)或更長的時(shí)間內(nèi)獲得該器官或組織。即使該時(shí)間限制不受約束，也優(yōu)選在心跳停止后大約16小時(shí)內(nèi)獲得該組織。更優(yōu)選的是在心跳停止后大約10小時(shí)內(nèi)獲得該組織。另外更優(yōu)選在心跳停止后大約6小時(shí)內(nèi)獲得該組織。甚至更優(yōu)選在心跳停止后大約3小時(shí)內(nèi)獲得該組織。另一優(yōu)選的時(shí)間期限是在心跳停止后大約1小時(shí)內(nèi)獲得該組織。盡管在該時(shí)間期限二倍體細(xì)胞和祖細(xì)胞耐局部缺血。獲取的組織或者用合適的灌流培養(yǎng)基灌流或者不作灌流而用于進(jìn)一步處理。
盡管優(yōu)選將組織冷卻到大約室溫，但將組織冷卻到大約4℃同樣是具有優(yōu)勢(shì)的。組織可在全部或部分局部缺血時(shí)間內(nèi)冷卻。即，對(duì)器官可進(jìn)行暖和冷局部缺血的組合。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，優(yōu)選供體是新生兒，嬰兒，兒童，少年或成年人。在本發(fā)明范圍內(nèi)也包括由于推測(cè)的局部缺血而認(rèn)為不合適的胎兒組織。盡管供體的年齡不是關(guān)鍵的，但需要供體在大約0歲至大約77歲之間，更優(yōu)選不超過大約50歲。
用于本發(fā)明的優(yōu)選組織包括腎上腺，血管，骨髓，角膜，胰島，晶狀體，肝臟，卵巢，胰腺，甲狀旁腺，松果體，腦垂體，皮膚，睪丸，胸腺，甲狀腺或者其組合。優(yōu)選的組織是肝臟。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是提供了導(dǎo)致從該組織產(chǎn)生基本上的單細(xì)胞懸液的處理方法。優(yōu)選的處理方法還包括壓實(shí)(debulking)的步驟，它大量減少了懸液中多倍體細(xì)胞或成熟細(xì)胞的數(shù)目以提供富含表現(xiàn)出與至少一種細(xì)胞譜系相關(guān)的至少一種標(biāo)記的二倍體細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的壓實(shí)的懸液。不作為對(duì)該方法的限制，處理步驟包括以大小或密度分離細(xì)胞。
優(yōu)選的處理還包括從懸液選擇那些表達(dá)與至少一種細(xì)胞譜系相關(guān)的至少一種標(biāo)記的細(xì)胞，其中至少一種細(xì)胞譜系包括至少一種肝臟，造血，或間充質(zhì)細(xì)胞譜系。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供具有發(fā)育成肝細(xì)胞，膽細(xì)胞，或其組合之能力的二倍體細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。
優(yōu)選的是本發(fā)明的供體細(xì)胞單獨(dú)或者以有益組合表達(dá)包括甲胎蛋白，白蛋白，骨唾液蛋白，CD14，CD34，CD38，CD90，CD45，CD117，ICAM-1，I型膠原蛋白，II型膠原蛋白，III型膠原蛋白，血型糖蛋白A，或骨橋蛋白的至少一種標(biāo)記。
作為本發(fā)明的另一目的，提供了一種治療方法，其中祖細(xì)胞用作細(xì)胞移植物，生物反應(yīng)器，人造器官等。優(yōu)選的醫(yī)學(xué)癥狀和需要包括克-納二氏綜合征，酪氨酸血癥，肝硬化，急性肝衰竭，糖尿病，和本領(lǐng)域已知的其它肝臟和肝臟相關(guān)性癥狀。一般來說，治療的患者可患有至少一種肝臟疾病，該疾病選自肝臟炎癥，病毒性肝炎，中毒性肝細(xì)胞損傷，肝臟纖維變性，肝硬化，肝充血，肝營養(yǎng)障礙，肝細(xì)胞脂肪變性，脂肪肝，解毒功能障礙，肝分泌功能障礙，肝接合功能障礙，由肝疾病引起的肝門高血壓合成功能障礙，或肝衰竭昏迷，蛋白降解產(chǎn)物或氨中毒。這些機(jī)能障礙導(dǎo)致諸如阿拉惹綜合征，酒精肝疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，自身免疫肝炎，膽閉鎖，膽管缺乏，骨髓衰竭，巴德-希阿里綜合征，Byler疾病，克-納二氏綜合征，Caroli疾病，膽汁郁積瘙癢癥，膽石病，接合高膽紅素血癥，慢性移植物與宿主疾病，原因不明性肝疾病，糖尿病，杜-約綜合征，紅細(xì)胞肝性原卟啉癥，肝外膽管癌，家族性高膽固醇血癥，半乳糖血癥，吉爾伯綜合征，糖原存儲(chǔ)疾病，血管瘤，血色病，肝腦病，肝膽管炎，肝軟化，肝大，肝癌，肝胚細(xì)胞瘤，遺傳性血色病，黃膽，肝內(nèi)膽汁郁積，肝囊腫，肝移植，與Bacillus cereus相關(guān)的肝衰竭，混合型冷球蛋白血癥，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲?；溉毕?，紫癜肝病，遲發(fā)性皮膚血卟啉病，原發(fā)性膽肝硬化，頑固性腹水，羅托綜合征，肉樣瘤病，硬化性膽管炎，皮脂腺病，Summerskill綜合征，血小板減少癥，酪氨酸血癥，靜脈曲張性出血，肝臟靜脈閉合疾病，和肝豆?fàn)詈俗冃缘鹊募膊?，且用本發(fā)明的方法和組合物治療是有益的。
不局限于上述實(shí)施方案，還包括基因治療的方法，它包括本領(lǐng)域熟知的方法，包括但不限于將載體導(dǎo)入二倍體細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，然后移植進(jìn)需要的宿主中。癥狀和靶基因可包含家族性高膽固醇血癥中的LDL受體基因，血友病中的因子VIII和IX的凝血因子基因，肺氣腫中的α-1-抗胰蛋白酶基因，苯丙酮酸尿中的苯丙氨酸羥化酶基因，血氨過多中的鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因，和在各種補(bǔ)體缺陷形式中的補(bǔ)體蛋白基因，可借助于基因治療進(jìn)行有益治療或治愈的其它醫(yī)學(xué)癥狀。
其它所需的實(shí)施方案包括編碼甲氨酰合成酶I，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，苯丙氨酸羥化酶，α-1-抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，低密度脂蛋白受體，膽色素原脫氨酶，甲氨酰合成酶I，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，因子VIII或IX，胱硫醚β-合成酶，支鏈酮酸脫羧酶，白蛋白，異戊酰-CoA脫氫酶，丙酰CoA羧化酶，甲基丙二酰CoA變位酶，戊二酰CoA脫氫酶，胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧化酶，肝臟磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脫羧酶，H-蛋白，T-蛋白，Menkes疾病蛋白，或肝豆?fàn)詈俗冃曰虍a(chǎn)物的基因。
本發(fā)明還涉及從人肝臟分離和冷藏二倍體細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的方法，包括(a)處理人肝臟組織以提供一種基本上的單細(xì)胞懸液，該懸液包括二倍體成年細(xì)胞，祖細(xì)胞和在人肝臟中發(fā)現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞譜系的非祖細(xì)胞；(b)對(duì)該懸液進(jìn)行壓實(shí)的步驟，它大量減少了懸液中非祖細(xì)胞的數(shù)目，以提供富含表現(xiàn)出與至少一種細(xì)胞譜系相關(guān)的一種或多種標(biāo)記的祖細(xì)胞的壓實(shí)的懸液；和(c)從壓實(shí)的懸液選擇那些其自身，其后代或其更成熟的形式表達(dá)與一些肝臟細(xì)胞譜系相關(guān)的一種或多種標(biāo)記的細(xì)胞；及(d)在對(duì)于冷藏最佳的條件下懸浮該細(xì)胞。更優(yōu)選的是選擇表達(dá)諸如甲胎蛋白的胞質(zhì)蛋白的肝臟祖細(xì)胞。本發(fā)明的處理或壓實(shí)的步驟優(yōu)選包括根據(jù)與具有低浮力密度的一個(gè)或多個(gè)梯度部分相聯(lián)系的其浮力密度和大小對(duì)肝細(xì)胞懸液進(jìn)行密度梯度離心以分離該細(xì)胞。
肝細(xì)胞懸液的非祖細(xì)胞包括成熟的肝臟，造血，和間充質(zhì)細(xì)胞。非祖細(xì)胞的負(fù)選擇包括使用諸如連接蛋白32的與成熟肝細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記，諸如血型糖蛋白A和CD45的與造血細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記，諸如視網(wǎng)膜樣蛋白(retinoids)或馮·維勒布蘭德氏因子的與成熟間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記。
本發(fā)明的另一方面提供了肝臟，造血，或間充質(zhì)來源的肝臟祖細(xì)胞。通過選自CD14，CD34，CD38，CD45，CD117，ICAM，血型糖蛋白A的抗原標(biāo)記，和/或諸如甲胎蛋白樣免疫反應(yīng)性，白蛋白樣免疫反應(yīng)性的胞質(zhì)標(biāo)記，或者兩者來選擇這些細(xì)胞譜系，其后代或其更成熟的形式。甲胎蛋白來自mRNA的變異體形式。其中的一些是肝臟祖細(xì)胞特有的且一些是造血祖細(xì)胞特有的。本發(fā)明的肝臟祖細(xì)胞可從胎兒，新生兒，嬰兒，兒童，少年或成年人肝臟中分離。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，分離的人肝臟祖細(xì)胞，即一種二倍體細(xì)胞的亞群以高度富集到基本上純的形式分離。該肝臟祖細(xì)胞含有肝臟，造血和間充質(zhì)祖細(xì)胞。肝臟祖細(xì)胞具有發(fā)育成肝細(xì)胞，膽細(xì)胞或其組合的能力；造血祖細(xì)胞具有發(fā)育成巨噬細(xì)胞，噬中性白細(xì)胞，粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，血小板，嗜中性白細(xì)胞，嗜曙紅細(xì)胞，嗜堿細(xì)胞或其組合的能力。間充質(zhì)祖細(xì)胞具有發(fā)育成內(nèi)皮細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，肝臟星形細(xì)胞(Ito cells)，軟骨細(xì)胞，骨細(xì)胞或其組合的能力。本發(fā)明的方法可用于選擇表達(dá)CD34，骨橋蛋白，骨唾液蛋白，I，II，或III型膠原蛋白或其組合的間充質(zhì)祖細(xì)胞。
本發(fā)明人克服了許多上述困難來制備包括祖細(xì)胞的二倍體細(xì)胞，理想地用于細(xì)胞和基因治療及用于人造生物器官。由于細(xì)胞較小，因此使大型栓塞的形成最小化。另外，該細(xì)胞具有廣泛的生長潛力，意味著在患者中重建肝臟組織需要較少的細(xì)胞。最后，祖細(xì)胞具有最少的可誘發(fā)免疫學(xué)排斥的抗原標(biāo)記，這給需要較小或沒有免疫抑制的藥物提供了希望。
本發(fā)明的另一方面提供了含有外源性核酸的肝臟祖細(xì)胞。該外源性核酸可編碼一個(gè)或多個(gè)目的多肽，或者可啟動(dòng)一個(gè)或多個(gè)目的多肽的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了經(jīng)過給遭受負(fù)效應(yīng)的個(gè)體施用有效量的分離的人二倍體肝細(xì)胞和/或祖細(xì)胞減輕一種或多種人類疾病或機(jī)能障礙的負(fù)效應(yīng)的方法。祖細(xì)胞可通過血管進(jìn)行腸胃外給藥，或者直接施用進(jìn)肝臟。直接施用可通過門靜脈，腸系膜靜脈，肝膽管，或其組合經(jīng)手術(shù)實(shí)現(xiàn)。另外，肝臟祖細(xì)胞可施用進(jìn)個(gè)體的異位位置，例如脾臟。
可用本發(fā)明的方法減輕的人類病癥或機(jī)能障礙包括肝膽管炎，肝軟化，肝大，肝硬化，纖維變性，肝炎，急性肝衰竭，慢性肝衰竭，或代謝先天錯(cuò)誤，肝癌，或肝胚細(xì)胞瘤。肝癌可以是癌的原發(fā)性部位或者是轉(zhuǎn)移進(jìn)肝臟的癌。轉(zhuǎn)移瘤可來自任意數(shù)量的原發(fā)性位點(diǎn)，包括腸，前列腺，胸部，腎，胰腺，皮膚，腦，肺或其組合?？捎迷摲椒ㄖ委煹母闻K疾病或機(jī)能障礙還包括與肝組織線粒體區(qū)室的損傷相關(guān)的肝臟疾病或機(jī)能障礙且可由慢性肝臟疾病，爆發(fā)性肝衰竭，病毒誘導(dǎo)的肝臟疾病，代謝型肝臟疾病和與膿毒癥或肝臟創(chuàng)傷相關(guān)的肝臟機(jī)能障礙組成。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種生物反應(yīng)器，它包括(i)含有(a)從人肝臟，其后代，其成熟中的或分化的后代，或其組合分離的祖細(xì)胞，(b)細(xì)胞外基質(zhì)，和(c)培養(yǎng)基的生物材料；(ii)容納所述生物材料的一個(gè)或多個(gè)區(qū)室或含有所述生物材料的組件；和(iii)一個(gè)或多個(gè)連接口。該生物反應(yīng)器的生物材料可任選還包括(d)激素，生長因子，或營養(yǎng)補(bǔ)充物，或(e)血漿，血清，淋巴，或由其產(chǎn)生的產(chǎn)品。
生物反應(yīng)器適用于將所述祖細(xì)胞維持在一種有活力的，有功能的狀態(tài)，且可維持肝臟祖細(xì)胞大約一周或更長的時(shí)期。具體地說，該生物反應(yīng)器適用于用作人造肝臟，用于產(chǎn)品生產(chǎn)，毒理學(xué)研究，或代謝研究，包括涉及細(xì)胞色素P450的活性，或其它類型的藥物代謝的研究。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了分離的人肝臟祖細(xì)胞的組合物，或從人類肝臟獲得的富含祖細(xì)胞的懸液。該細(xì)胞懸液在藥用上可接受的載體或稀釋劑中提供且施用給需要治療的受試者。本發(fā)明的組合物包含表現(xiàn)出與在人類肝臟中發(fā)現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞譜系中的至少一種相聯(lián)系的一種或多種標(biāo)記的肝臟祖細(xì)胞且基本上不含成熟細(xì)胞。更具體的說，分離的肝臟祖細(xì)胞來自一種或多種肝細(xì)胞譜系，包括肝臟，造血，或間充質(zhì)細(xì)胞譜系且它們自身，其后代，或該祖細(xì)胞的更成熟形式表達(dá)抗原標(biāo)記CD14，CD34，CD38，CD90，或CD117，CD45，血型糖蛋白A，和甲胎蛋白樣免疫反應(yīng)性，白蛋白樣免疫反應(yīng)性的胞質(zhì)標(biāo)記，或者兩者中的至少一種或多種。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了一種肝臟祖細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，它包括來自人肝臟的分離的祖細(xì)胞，其后代，其成熟中的或分化的后代，或其組合。該細(xì)胞培養(yǎng)物還包括細(xì)胞外基質(zhì)，該基質(zhì)包括一種或多種膠原蛋白，一種或多種粘連蛋白(層粘連蛋白，纖連蛋白)，和其它組分，例如蛋白聚糖(例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)；或獨(dú)特的基質(zhì)成分。所述基質(zhì)成分包括基質(zhì)成分的片斷；基質(zhì)模擬物，該模擬物可以是用來自一類細(xì)胞外基質(zhì)的一種或多種因子包裹的合成的和/或可生物降解的材料(即微球體)。細(xì)胞培養(yǎng)物還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和其它營養(yǎng)成分；激素和/或生長因子，含有或不含諸如血清，血漿或淋巴的生物學(xué)液體。另外，該培養(yǎng)基可含有一個(gè)或多個(gè)區(qū)室以容納諸如培養(yǎng)皿，瓶，轉(zhuǎn)瓶，轉(zhuǎn)移孔或其它這類容器的生物學(xué)材料。
本發(fā)明的培養(yǎng)物或生物反應(yīng)器可用于產(chǎn)生各種醫(yī)學(xué)上重要的細(xì)胞分泌因子，包括但不限于酶，激素，細(xì)胞因子，抗原，抗體，凝血因子，反義RNA，調(diào)控蛋白，核酶，融合蛋白等。該培養(yǎng)物適合于提供治療性蛋白，例如因子VIII，因子IX，因子VII，紅細(xì)胞生成素，α-1-抗胰蛋白酶，降鈣素，生長激素，胰島素，低密度脂蛋白，載脂蛋白E，IL-2受體和其拮抗劑，過氧化物歧化酶，免疫反應(yīng)修飾劑，甲狀旁腺激素，干擾素(IFNα，β，或γ)，神經(jīng)生長因子，葡糖腦苷脂酶，集落刺激因子，白介素(IL)1至15，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板產(chǎn)生的生長因子(PDGF)，腺苷脫氨酶，胰島素樣生長因子(IGF-1和IGF-2)，巨核細(xì)胞啟動(dòng)配體MPL，血小板生成素等。
作為本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了一種用于治療和預(yù)防肝臟疾病的藥物組合物。該組合物包含有效量的尸體肝臟祖細(xì)胞和藥用載體。目的肝臟疾病包括中毒性，代謝性，遺傳性，和/或傳染源性或變性性質(zhì)的急性或慢性肝臟疾病，或由于使用藥物或?qū)Ω闻K的物質(zhì)損傷引起的肝臟損傷。其中優(yōu)選的癥狀和疾病是肝臟炎癥，病毒性肝炎，中毒性肝細(xì)胞損傷，肝臟纖維變性，肝硬化，肝充血，肝營養(yǎng)障礙，肝細(xì)胞脂肪變性，脂肪肝，解毒功能障礙，肝分泌功能障礙，肝接合功能障礙，由肝疾病引起的肝門高血壓合成功能障礙，或肝衰竭昏迷，和蛋白降解產(chǎn)物或氨中毒。更具體的說，這些包括但不限于阿拉惹綜合征，酒精肝疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，自身免疫肝炎，膽管缺乏，骨髓衰竭，巴德-希阿里綜合征，膽閉鎖，Byler疾病，克-納二氏綜合征，Caroli疾病，膽汁郁積瘙癢癥，膽石病，接合高膽紅素血癥，慢性移植物與宿主疾病，原因不明性肝疾病，糖尿病，杜-約綜合征，紅細(xì)胞肝性原卟啉癥，肝外膽管癌，家族性高膽固醇血癥，半乳糖血癥，吉爾伯綜合征，糖原存儲(chǔ)疾病，血管瘤，血色病，肝腦病，肝膽管炎，肝軟化，肝大，肝癌，肝胚細(xì)胞瘤，遺傳性血色病，黃膽，肝內(nèi)膽汁郁積，肝囊腫，肝移植，與Bacillus cereus相關(guān)的肝衰竭，混合型冷球蛋白血癥，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲?；溉毕?，紫癜肝病，遲發(fā)性皮膚血卟啉病，原發(fā)性膽肝硬化，頑固性腹水，羅托綜合征，肉樣瘤病，硬化性膽管炎，皮脂腺病，Summerskill綜合征，血小板減少癥，酪氨酸血癥，靜脈曲張性出血，肝臟靜脈閉合疾病，和肝豆?fàn)詈俗冃约捌浣M合。
參照下面的詳細(xì)說明完成其它的主題對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的。
附圖的簡要描述

圖1a和1b顯示了暖局部缺血對(duì)具有小核和大核的分離細(xì)胞的比率的影響。
圖2a和2b顯示了對(duì)造血細(xì)胞中截短的甲胎蛋白(AFP)的PCR分析。
圖3顯示了在-170℃的貯存時(shí)間與復(fù)蘇的胎兒肝細(xì)胞活力之間的關(guān)系。
圖4a和4b顯示了以熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)分析的胎兒肝細(xì)胞懸液的典型單變量直方圖。
圖5顯示了在未分離的肝細(xì)胞懸液中表達(dá)表面標(biāo)記CD14，CD34，CD38，CD45和血型糖蛋白A(GA)的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
圖6顯示了在原始細(xì)胞懸液中表達(dá)甲胎蛋白和其它抗原標(biāo)記的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
圖7a，7b和7c顯示了在排除紅血細(xì)胞之前和之后的甲胎蛋白表達(dá)。
圖8a，8b，8c，8d，8e和8f顯示了胎兒肝細(xì)胞懸液中CD14，CD38和AFP共表達(dá)的FACS分析。
圖9顯示了AFP-陽性細(xì)胞的CD14和CD38富集。
圖10a，10b，10c和10d顯示了人肝臟祖細(xì)胞的熒光顯微鏡檢。
圖11a，11b，11c和11d顯示了用表達(dá)AFP選擇的代表性細(xì)胞。
圖12a，12b和12c顯示了在該視野中有兩個(gè)AFP陽性細(xì)胞。
圖13a和13b顯示了用鈣黃綠素(A)標(biāo)記的細(xì)胞以顯示所有細(xì)胞類型。
本發(fā)明的詳細(xì)描述在下面的描述中，使用了許多術(shù)語廣泛描述了本發(fā)明。為了提供對(duì)說明書和權(quán)利要求書的清楚和一致的理解，提供了下列定義。
甲胎蛋白樣免疫反應(yīng)性由甲胎蛋白引起的任何免疫反應(yīng)。甲胎蛋白由mRNA的變異體形式產(chǎn)生，其中一些變異體是肝臟祖細(xì)胞所特有的且有些是造血祖細(xì)胞所特有的。
定向祖細(xì)胞具有單一命運(yùn)的未成熟細(xì)胞，例如肝細(xì)胞定向祖細(xì)胞(產(chǎn)生肝細(xì)胞)或膽定向祖細(xì)胞(產(chǎn)生膽管)。定向過程在分子水平上尚不清楚。而且，認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞命運(yùn)從其祖先命運(yùn)變窄時(shí)僅以經(jīng)驗(yàn)發(fā)生該定向過程。
肝細(xì)胞肝臟細(xì)胞的亞群體，包括肝細(xì)胞和膽細(xì)胞。
肝臟細(xì)胞本文使用的術(shù)語“肝臟細(xì)胞”是指正常肝臟中存在的所有類型的細(xì)胞，不論其起源或命運(yùn)。
干細(xì)胞本文所用的術(shù)語“干細(xì)胞”是指可產(chǎn)生具有一種以上命運(yùn)的子代細(xì)胞的未成熟細(xì)胞。一些子代細(xì)胞與親代相同且一些“定型”為一種特定的命運(yùn)。全能干細(xì)胞具有自我更新(自我維持)能力，而定向干細(xì)胞的自我更新能力有問題。干細(xì)胞在再生性增殖過程期間更新。
肝祖細(xì)胞這些細(xì)胞產(chǎn)生肝細(xì)胞和膽細(xì)胞。肝祖細(xì)胞包括三種亞群體“肝干細(xì)胞”，“定向肝細(xì)胞的祖細(xì)胞”，和“定向膽祖細(xì)胞”，后兩種細(xì)胞是未成熟細(xì)胞，它們是肝干細(xì)胞的后代且具有單一命運(yùn)，即或者肝細(xì)胞或者膽細(xì)胞，而不是兩者。
肝干細(xì)胞肝祖細(xì)胞的一種亞群體。
肝臟祖細(xì)胞一種來自肝臟的細(xì)胞群體，包括肝祖細(xì)胞，造血祖細(xì)胞和間充質(zhì)祖細(xì)胞。
卵形細(xì)胞具有卵形核的小細(xì)胞(＜15微米)，在動(dòng)物接觸致癌損傷時(shí)增殖。據(jù)認(rèn)為這些細(xì)胞來源于肝臟祖細(xì)胞且部分或完全轉(zhuǎn)化。
“肝臟”是位于腹部最前部位的大型器官，安置在腹腔和胸腔之間的肌肉隔膜上。肝臟是生命所必需的且完成100種以上的重要功能，例如解毒毒物和藥物，代謝脂肪，存儲(chǔ)糖類，生產(chǎn)膽汁，血漿蛋白和其它物質(zhì)，并輔助凝血。肝臟疾病通常難以檢測(cè)，直到形成嚴(yán)重疾病，因?yàn)榇嬖谶^多的肝臟組織，且肝臟能部分自我再生。肝臟疾病的征兆隨損害的程度和位置而變化。各種血液化驗(yàn)對(duì)發(fā)現(xiàn)肝臟損傷的程度和性質(zhì)是必須的。
本文使用的術(shù)語“生長因子”是指調(diào)節(jié)發(fā)育事件所需的或者調(diào)節(jié)編碼可參與細(xì)胞通信和發(fā)育協(xié)調(diào)的其它分泌蛋白的基因表達(dá)所需的那些因子，且包括但不限于肝細(xì)胞生長因子(HGF)，胰島素樣生長因子-I和II(IGF-I和II)，表皮生長因子(EGF)，a型和b型轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α和TGF-β)，神經(jīng)生長因子(NGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(PDGF)，肉瘤生長因子(SGF)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激生長因子(GM-CSF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，催乳激素和生長激素釋放因子(GHRF)和各種造血生長因子，例如白介素(IL)IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，等，紅細(xì)胞分化因子(EDF)或促卵泡激素釋放蛋白(FRP)，抑制素，干細(xì)胞增殖因子(SCPF)及這些蛋白質(zhì)的活性片斷，亞基，衍生物和其組合等本領(lǐng)域已知的許多其它因子。一般來說，下文所用的生長因子是指選自細(xì)胞因子，淋巴因子，白介素，集落刺激因子，激素，趨化因子，抗趨化因子，凝血因子，溶栓蛋白，補(bǔ)體蛋白，酶，免疫球蛋白和抗原的分泌蛋白。
血細(xì)胞生成產(chǎn)生具有淋巴細(xì)胞(B和T)，血小板，巨噬細(xì)胞，嗜中性白細(xì)胞和粒細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)的血細(xì)胞。
間充質(zhì)形成產(chǎn)生具有內(nèi)皮細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，甚至骨細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)的間充質(zhì)衍生物(僅在疾病狀態(tài)下在肝臟中出現(xiàn)后兩種)。
細(xì)胞治療本文所用的術(shù)語“細(xì)胞治療”是指體內(nèi)或離開體內(nèi)轉(zhuǎn)移限定的細(xì)胞群體用作自身或同種異體材料并移植到患者特定靶細(xì)胞或其附近。細(xì)胞可在任何合適的的培養(yǎng)基，載體或稀釋劑，或者包括微載體，珠，微粒體，微球體，囊泡等的任何類型的藥物傳遞系統(tǒng)中移植。
基因治療本文所用的術(shù)語“基因治療”是指將確定的遺傳材料體內(nèi)或離開體內(nèi)轉(zhuǎn)移到需要它的患者的特定靶細(xì)胞，從而改變基因型，且在大多數(shù)情況下，改變那些靶細(xì)胞的表型達(dá)到預(yù)防或改變特定疾病狀態(tài)的最終目的。按照這一定義規(guī)定，隱含的前提是設(shè)計(jì)這些治療性遺傳操作最終預(yù)防，治療或改變明顯的或隱蔽的病理學(xué)狀態(tài)。在大多數(shù)情況下，基因治療操作的最終治療目的是改變特定靶細(xì)胞群體的表型。
CD“分化簇”或“共有決定簇”在本文中用于指被單克隆抗體識(shí)別的細(xì)胞表面分子。一些CDs的表達(dá)對(duì)于特定譜系或成熟途徑的細(xì)胞是特異性的，其它CD的表達(dá)根據(jù)激活的狀態(tài)，位置，或相同細(xì)胞的分化而變化。
倍性細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)。
二倍體每個(gè)細(xì)胞兩組染色體。
四倍體每個(gè)細(xì)胞4組染色體。
八倍體每個(gè)細(xì)胞8組染色體。
多倍體每個(gè)細(xì)胞有兩組以上的染色體。
正常胎兒或新生兒肝臟的細(xì)胞是二倍體。到青年時(shí)期，肝臟是二倍體和多倍體細(xì)胞的混合物。在嚙齒類中，肝臟大約90％是多倍體且僅有大約10％是二倍體細(xì)胞。在人類，青年人的肝臟由大約50％的二倍體和50％的多倍體細(xì)胞組成。
不限于肝臟，本發(fā)明公開并要求保護(hù)來自各種尸體組織的其它祖細(xì)胞。下文所用的術(shù)語“尸體組織”不包括來自經(jīng)過手術(shù)方法以諸如成熟前終止妊娠的方式獲得的死亡胎兒的組織。以自然或協(xié)助分娩生產(chǎn)的人類認(rèn)為是新生兒或嬰兒而不是胎兒。因此，人類的年齡在分娩或生產(chǎn)時(shí)開始為“0”，而不是從受孕時(shí)開始。因此在分娩時(shí)死亡的新生兒認(rèn)為是尸體而不是胎兒。剛獲得的胎兒組織已被用作一些祖細(xì)胞的來源且因此它們被排除在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍之外。然而，由于推測(cè)的局部缺血效應(yīng)而被認(rèn)為不適合于進(jìn)一步的醫(yī)療用途的胎兒組織仍然適合于本發(fā)明的目的。
當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“一”時(shí)，是指“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”，除非另有說明。
圖2a和2b顯示了在造血細(xì)胞中截短的AFP的PCR分析。使用引物組合hAFP1，hAFP2，hAFP3，和hAFP4進(jìn)行RT-PCR。泳道1-3相應(yīng)于Hep3B-細(xì)胞；泳道10-12相應(yīng)于STO細(xì)胞；泳道13-15沒有RNA或cDNA。注意，在泳道2，5，和8中有一條共有帶，即截短的AFP同種型。在泳道1和4中明顯有一條肝臟細(xì)胞特有的截短的AFP同種型。在泳道3和6中觀察到完整的AFP種類。
圖3顯示了在-170℃下貯存時(shí)間與復(fù)蘇的胎兒肝臟細(xì)胞活力之間的關(guān)系。數(shù)據(jù)表示為在處理時(shí)與復(fù)蘇時(shí)測(cè)量的活力的改變百分?jǐn)?shù)。這些數(shù)據(jù)表示冷藏方法不明顯影響細(xì)胞的活力。貯存時(shí)間延長到550天時(shí)活力無明顯改變。
圖4a和4b顯示了以熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)分析的胎兒肝臟細(xì)胞懸液的典型單變量直方圖。制備細(xì)胞懸液用于免疫熒光分析，使用與紅色染料，Cy5偶連的抗體分析甲胎蛋白(AFP)，使用偶連到藍(lán)色染料(AMCA)上的抗體分析白蛋白。篩選了3萬個(gè)細(xì)胞的紅色(AFP)和藍(lán)色(白蛋白)熒光。結(jié)果顯示了清楚的各蛋白質(zhì)陽性的細(xì)胞組。進(jìn)一步分析表明大約80％的各蛋白質(zhì)的陽性群體是相同的細(xì)胞(即，共表達(dá)兩種蛋白質(zhì))。
圖5顯示了在未分離的肝臟細(xì)胞懸液中表達(dá)表面標(biāo)記CD14，CD34，CD38，CD45和血型糖蛋白A(GA)的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。注意GA數(shù)據(jù)在右軸上繪圖以保護(hù)刻度。
圖6顯示了在原始細(xì)胞懸液中表達(dá)甲胎蛋白和其它抗原標(biāo)記的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。平均值±SEM表示甲胎蛋白(AFP)和特異性細(xì)胞表面標(biāo)記(CD14，34，38，45和血型糖蛋白A)陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
圖7a，7b和7c顯示了去掉紅血細(xì)胞之前和之后的甲胎蛋白表達(dá)。圖7a顯示了使用Percoll分離法選擇性去掉紅細(xì)胞或者沒有去掉紅細(xì)胞的胎兒肝臟細(xì)胞懸液中的甲胎蛋白的表達(dá)且圖7b顯示了白蛋白的表達(dá)。圖7c顯示了表達(dá)甲胎蛋白和白蛋白兩者的細(xì)胞比例，表示為AFP或白蛋白陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。顯示了使用Percoll分離法去掉紅細(xì)胞的細(xì)胞的數(shù)據(jù)。
圖8a，8b，8c，8d，8e和8f顯示了胎兒肝臟細(xì)胞懸液CD14，CD38和AFP共表達(dá)的FACS分析。雙變量散點(diǎn)圖(8a)顯示了TriColor染色的CD14(縱坐標(biāo))與FITC染色的CD38(橫坐標(biāo))的分布。根據(jù)CD14和CD38信號(hào)產(chǎn)生通道以選擇特異性細(xì)胞分組。然后用于顯示各亞組中AFP染色的強(qiáng)度(圖8b，8c，8d和8e)。AFP結(jié)果表明通過選擇CD38或者CD14陽性的細(xì)胞產(chǎn)生了AFP的高水平富集。全部細(xì)胞懸液(30，000個(gè)細(xì)胞)產(chǎn)生的AFP信號(hào)在圖8f中顯示。
圖9顯示了AFP-陽性細(xì)胞的CD14和CD38富集。通過選擇具有陽性表面標(biāo)記的細(xì)胞的標(biāo)記CD38和CD14可顯著增大從胎兒肝臟制備的細(xì)胞懸液中AFP-陽性細(xì)胞的比例。兩種標(biāo)記的組合產(chǎn)生的含有AFP的細(xì)胞的富集比用單一標(biāo)記獲得的富集明顯更好。
圖10a，10b，10c和10d顯示了人肝祖細(xì)胞的熒光顯微鏡檢。
來自胎兒肝臟的代表性肝祖細(xì)胞的AFP成分被染色。細(xì)胞大小表示同時(shí)存在早期的祖細(xì)胞和更進(jìn)化的肝祖細(xì)胞。
圖11a，11b，11c和11d顯示了以表達(dá)AFP選擇的代表性細(xì)胞。CD14染色陽性的細(xì)胞(11b和11d)是成肝細(xì)胞的特征。表面標(biāo)記染色陰性的細(xì)胞(圖11a和11c)較小且大小和形態(tài)與早期肝祖細(xì)胞一致。
圖12a到12c是相同的視野且顯示了在該視野中有兩個(gè)AFP陽性細(xì)胞。圖12a顯示了一個(gè)聚焦相的圖像。圖12b顯示了用AFP抗體的免疫熒光。圖12c顯示了(a)和(b)的覆蓋圖，顯示了在肝臟細(xì)胞組中AFP陽性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。發(fā)現(xiàn)不論從胎兒還是從成年肝臟中分離的AFP陽性細(xì)胞都具有相似的細(xì)胞大小和形態(tài)學(xué)。
圖13a和13b顯示了用鈣黃綠素標(biāo)記的細(xì)胞(a)以顯示所有細(xì)胞類型。圖13(b)由共表達(dá)AFP的相同細(xì)胞組成并顯示了只有兩個(gè)細(xì)胞為AFP-陽性。細(xì)胞大小不是AFP陽性的要素。
肝臟的再生能力是廣泛公認(rèn)的，且通常通過正常情況下增殖靜息的肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期來實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。然而，當(dāng)肝細(xì)胞再生受損時(shí)，小膽管增生并侵入相鄰的肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)中。在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，這些管細(xì)胞稱為卵形細(xì)胞，其與缺陷型再生的聯(lián)系導(dǎo)致相信它們是轉(zhuǎn)化的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。這些細(xì)胞具有極大的生物學(xué)益處，因?yàn)槠湔Ｏ鄳?yīng)細(xì)胞，即肝祖細(xì)胞可用作肝臟移植的替代選擇且它們也可用作基因治療以矯正先天性代謝錯(cuò)誤的載體。盡管已經(jīng)明確地證實(shí)了祖細(xì)胞分化成肝細(xì)胞的能力，但是由于供體肝臟組織的缺乏，對(duì)所述細(xì)胞的要求還不能滿足所需的供應(yīng)。
正如本文所公開的，從人尸體肝臟分離肝臟祖細(xì)胞是新的且是意想不到的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域流行的觀點(diǎn)是由于局部缺血肝臟喪失了其實(shí)用性。
通過應(yīng)用本發(fā)明人首次用于從尸體獲得本發(fā)明的獨(dú)特細(xì)胞群體的獨(dú)特方法，標(biāo)記和參數(shù)的組合獲得了從本文所述的尸體供體分離人肝祖細(xì)胞。
甲胎蛋白和白蛋白這兩種胞質(zhì)蛋白質(zhì)認(rèn)為是肝細(xì)胞譜系特別可靠的標(biāo)記。它們已成為從肝臟中的其它細(xì)胞類型鑒定肝細(xì)胞亞群體的策略的基礎(chǔ)。在肝細(xì)胞的鑒定中兩者都是關(guān)鍵性向?qū)?，但甲胎蛋白尤其是在?jīng)過流式細(xì)胞術(shù)純化后的肝祖細(xì)胞的鑒定特征。甲胎蛋白，即AFP也已經(jīng)被用于在任何類型的分離策略后評(píng)估肝祖細(xì)胞的純度。
然而，在證實(shí)這兩種標(biāo)記在鑒定肝細(xì)胞譜系中的有效性的嚴(yán)格對(duì)照中，進(jìn)行了PCR分析以檢測(cè)在肝臟組織中已知的多種細(xì)胞類型中的表達(dá)。PCR分析是檢測(cè)即使微量的特定mRNA種類的表達(dá)時(shí)最敏感的測(cè)定法。本文公開的本發(fā)明證實(shí)了在造血祖細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)AFP和白蛋白兩者mRNA的具體同種型意味著當(dāng)使用該敏感測(cè)定法時(shí)，必須使用其它標(biāo)準(zhǔn)，例如使用AFP的外顯子1探針用于從造血細(xì)胞群體限定肝細(xì)胞。盡管PCR分析揭示了造血祖細(xì)胞可表達(dá)AFP和白蛋白mRNA種類，但mRNA表達(dá)水平極低。事實(shí)上，當(dāng)在蛋白質(zhì)水平上測(cè)量AFP和白蛋白時(shí)，在造血祖細(xì)胞中不能發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)的AFP或白蛋白。因此，對(duì)于常規(guī)蛋白測(cè)定法(免疫熒光，Western印跡等)和高水平表達(dá)mRNA的測(cè)定法(Northern印跡)，AFP和白蛋白仍然是確定肝細(xì)胞譜系的有價(jià)值的標(biāo)記。
本發(fā)明還公開了RT-PCR特異性引物的設(shè)計(jì)和制備以測(cè)定肝細(xì)胞與造血細(xì)胞群體中AFP mRNA同種型的表達(dá)方式。人AFP RT-PCR引物的三種不同組合用于區(qū)別肝細(xì)胞和造血細(xì)胞譜系中AFP mRNA的表達(dá)。為了檢測(cè)造血細(xì)胞中AFP的表達(dá)，如實(shí)施例1所舉例，本發(fā)明人篩選了肝細(xì)胞與造血細(xì)胞來源的一些細(xì)胞系中AFP的完全與截短形式。在這些試驗(yàn)中使用RT-PCR，它是已知鑒定特定RNA模板時(shí)最敏感的技術(shù)。迄今的數(shù)據(jù)表明人AFP在來自肝祖細(xì)胞的兩個(gè)人細(xì)胞系(HepG2和Hep3B)中以完全形式存在，在來自造血祖細(xì)胞的人細(xì)胞系K562中以截短形式存在。外顯子1是肝祖細(xì)胞亞群體所特有的事實(shí)使得人們能夠使用它作為鑒定肝細(xì)胞與造血祖細(xì)胞類型的探針。該試驗(yàn)用于鑒定本發(fā)明的肝臟祖細(xì)胞中的特定亞群體。
因此，為了檢測(cè)肝臟祖細(xì)胞中人AFP mRNA的存在，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了9個(gè)PCR引物。所有的引物組合檢測(cè)人肝細(xì)胞系HepG2和Hep3B中的AFP mRNA。然而，除了用于全長hAFP mRNA的一個(gè)外所有的引物組合在人紅白血病細(xì)胞系K562中都擴(kuò)增AFP mRNA的部分。如上推測(cè)，這證實(shí)了在K562中表達(dá)AFP的一種截短形式，而不是全長形式。該結(jié)果表明鑒定肝細(xì)胞的有用引物僅僅是檢測(cè)全長AFP的那些引物，更多證明其表達(dá)以組織特異性方式受到限制。篩選肝細(xì)胞與造血細(xì)胞來源的一些細(xì)胞系和原始組織中AFP的完全與截短形式。盡管在一些造血組織中發(fā)現(xiàn)了AFP的截短形式，但組織中哪一種細(xì)胞類型表達(dá)它仍是未知的。
由于在造血細(xì)胞的一些亞群體中發(fā)現(xiàn)了AFP的截短形式，所以也分析了肝細(xì)胞和造血細(xì)胞中的白蛋白。白蛋白的引物以類似于AFP(見上文)的方式形成并用于評(píng)估肝細(xì)胞與造血細(xì)胞系中白蛋白的表達(dá)(見圖4)。對(duì)于AFP，在造血細(xì)胞系K562中發(fā)現(xiàn)了一種截短的形式，一種可被外顯子12-14的引物檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄子。
在本文所述的研究之前，在關(guān)于造血祖細(xì)胞的大量文獻(xiàn)中，沒有一個(gè)曾報(bào)道在人的正常造血祖細(xì)胞中成熟的或截短的AFP或白蛋白的表達(dá)。
人肝臟祖細(xì)胞的處理和冷藏為了最理想地從胎兒或成年肝臟產(chǎn)生分離的人肝臟祖細(xì)胞，本文公開的方案使用密度梯度的上面部分并去掉沉淀。本文所公開的密度梯度離心的新變化是棄去沉淀并保留具有低浮力密度的細(xì)胞(即在梯度頂部收集的細(xì)胞)并用于進(jìn)一步研究。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在Percoll密度梯度內(nèi)或其頂部存在年幼的細(xì)胞(即，二倍體)和對(duì)于冷藏更健康的細(xì)胞。
本文所述的培養(yǎng)方法學(xué)是特有的且被進(jìn)一步改良用于人和/或嚙齒類肝臟細(xì)胞。另外，培養(yǎng)基可包括用純化的細(xì)胞外基質(zhì)成分包裹的可生物降解珠，然后可用于接種結(jié)合到珠上的細(xì)胞以用于生物反應(yīng)器。
本發(fā)明的冷藏方法學(xué)是特有的且不同于現(xiàn)有技術(shù)中使用的方法。主要區(qū)別是由于使用了不同的緩沖液且冷藏包括祖細(xì)胞群體的二倍體肝細(xì)胞群體，該細(xì)胞密度低，因此在梯度離心中上浮。
成熟的人肝臟細(xì)胞的成功冷藏是非常需要的，但在本領(lǐng)域中從未實(shí)現(xiàn)。一般來說，成功冷藏定義為在液氮溫度(-160℃到180℃)下冷凍細(xì)胞，然后復(fù)蘇它們并獲得＞75％的活力的能力且具有附著到培養(yǎng)皿上的能力。任何來源的細(xì)胞系，例如精子和卵子和來自胎兒組織的細(xì)胞可在含水緩沖液(即，諸如DME，Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基，或RPMI 1640的培養(yǎng)基)并補(bǔ)充10％血清+冷凍保護(hù)劑(最常見的是二甲基亞砜DMSO)中成功冷凍并在復(fù)蘇時(shí)70-90％有活力且具有極好的貼壁能力。
本發(fā)明的特殊冷藏方法學(xué)通過使用新緩沖液，新細(xì)胞群體和包括以細(xì)胞外基質(zhì)的形式包埋細(xì)胞的改變來實(shí)現(xiàn)。該方法學(xué)首次實(shí)現(xiàn)了復(fù)蘇時(shí)的活力與冷凍前細(xì)胞分散后立即測(cè)量的活力沒有不同(參見圖3)。實(shí)際活力由于到達(dá)時(shí)組織的狀況而可變，在本試驗(yàn)中胎兒尸體肝臟細(xì)胞平均為77％。該冷藏方法學(xué)導(dǎo)致冷凍過程后的活力和復(fù)蘇后離開體內(nèi)的可貼壁和增殖的細(xì)胞不明顯損失。
細(xì)胞標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)使用我們現(xiàn)在的定義，即肝臟祖細(xì)胞是表達(dá)甲胎蛋白且表達(dá)或不表達(dá)白蛋白的未成熟細(xì)胞群體，評(píng)價(jià)了特異性選擇這些細(xì)胞的標(biāo)記。一個(gè)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是許多作為造血祖細(xì)胞傳統(tǒng)標(biāo)記的標(biāo)記(即CD34)也可鑒定肝祖細(xì)胞亞群體。因此，對(duì)CD34的單一顏色分選導(dǎo)致明顯富集(至少9-倍)表達(dá)AFP的細(xì)胞。然而，不是所有的這些AFP陽性細(xì)胞都被證實(shí)是肝祖細(xì)胞。根據(jù)白蛋白陽性的百分?jǐn)?shù)，大約80-90％的細(xì)胞是肝祖細(xì)胞，其它是未成熟以致尚未表達(dá)白蛋白的肝祖細(xì)胞或者可能是表達(dá)甲胎蛋白的造血亞群體。
本發(fā)明使用了獨(dú)特的流式細(xì)胞分選策略。使用AFP和白蛋白表達(dá)的組合作為肝祖細(xì)胞的兩個(gè)獨(dú)特限定特征，鑒定了限定肝祖細(xì)胞的抗原標(biāo)記和其它流式細(xì)胞術(shù)參數(shù)。目前的分選策略包括分選小細(xì)胞(通過前向散射測(cè)量為＜15微米)，它是二倍體(使用Hoechst染料33342產(chǎn)生的熒光)，側(cè)面散射無顆粒，且對(duì)某些造血細(xì)胞抗原(即血型糖蛋白A，紅血細(xì)胞抗原和CD45)為陰性，接著是肝細(xì)胞亞群體和造血細(xì)胞亞群體共有的標(biāo)記(即CD14和/或CD38)為陽性。
在本文所述的實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人通過分選高度表達(dá)甲胎蛋白，表達(dá)已知是特異性造血干細(xì)胞標(biāo)記的CD34，和任選微弱表達(dá)白蛋白的那些細(xì)胞來鑒定肝祖細(xì)胞。本文還描述了造血細(xì)胞也可表達(dá)AFP，盡管是一種截短形式的證據(jù)。本發(fā)明人描述了一種新細(xì)胞群體和分離、鑒定、培養(yǎng)的方法，以及使用該細(xì)胞群體的方法。本發(fā)明的特定細(xì)胞群體的分離、鑒定和培養(yǎng)的成功部分通過先進(jìn)的分離方法，親和壓實(shí)，具有更大速度和精確度的高速熒光激活細(xì)胞分選，和改進(jìn)的冷藏和培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
設(shè)計(jì)流式細(xì)胞分選策略從新分離的細(xì)胞懸液或從復(fù)蘇的冷藏肝臟細(xì)胞中純化肝臟祖細(xì)胞，它包括1)用一些抗特異性細(xì)胞表面標(biāo)記的熒光探針標(biāo)記的抗體染色細(xì)胞和2)在多參數(shù)流式細(xì)胞技術(shù)中使用陰性和陽性分選的聯(lián)合。從人肝細(xì)胞群體純化特定譜系階段的方法可用于來自任何年齡供體的肝臟，因?yàn)樵摌?biāo)記似乎是譜系-位置特異性的。
改進(jìn)的標(biāo)記細(xì)胞的方法，和相對(duì)于過去使用的流式細(xì)胞儀(Becton Dickenson’s FACSTAR PLUS，以2000-6000個(gè)細(xì)胞/秒分選細(xì)胞且進(jìn)行2-4種顏色分選)顯著改進(jìn)的流式細(xì)胞儀(來自Cytomation的“a MoFlo”流式細(xì)胞儀，以40,000個(gè)細(xì)胞/秒分選細(xì)胞且進(jìn)行8種顏色分選)幫助成功分離，和鑒定了這一新的細(xì)胞群體。
在細(xì)胞懸液中完全確定了AFP和白蛋白樣免疫反應(yīng)性的表達(dá)，有清楚的一群細(xì)胞與背景信號(hào)表現(xiàn)出明顯的區(qū)別(圖6)。在未分離的細(xì)胞懸液中6.9±0.86％的細(xì)胞表達(dá)甲胎蛋白，而在7.7±1.1％中存在白蛋白。在AFP陽性細(xì)胞中，75.6±4.9％共表達(dá)白蛋白，而80±5.5％的白蛋白陽性細(xì)胞也表達(dá)AFP。因此，大約25％的表達(dá)甲胎蛋白的細(xì)胞不表達(dá)白蛋白且20％的表達(dá)白蛋白的細(xì)胞不表達(dá)甲胎蛋白。
完全細(xì)胞懸液(即包括紅細(xì)胞)中帶有本研究中使用的原則性表面標(biāo)記的細(xì)胞比例在表1中顯示(其中GA是血型糖蛋白A，紅血細(xì)胞上的一種表面標(biāo)記)表1原始肝臟細(xì)胞懸液中CD陽性群體的百分?jǐn)?shù)和AFP陽性的百分?jǐn)?shù)CD14 CD34 CD38 CD45 GA未分離的懸液占群體％ 3.7±0.8(8) 2.8±0.5 2.2±0.4 2.6±0.5 36.8±5AFP陽性％ 81.7±2.272.6±4.2 57.6±4.6 22.2±4.4 2.3±0.6很明顯，血型糖蛋白A(GA)陽性細(xì)胞(即紅細(xì)胞)是細(xì)胞群體的主要組分，但AFP-陽性細(xì)胞是微小部分。因此，當(dāng)通過Percoll分離法去掉細(xì)胞懸液中的紅細(xì)胞時(shí)，表達(dá)AFP的細(xì)胞比例顯著增加到12.9±1.9％且表達(dá)白蛋白的那些細(xì)胞增加到12.1±2.3％。共表達(dá)白蛋白的AFP陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)也增加到80.5+8.2％且共表達(dá)AFP的白蛋白陽性細(xì)胞比例增加到89+3.1％，盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的改變。該操作對(duì)攜帶表面標(biāo)記的細(xì)胞比例的結(jié)果與顯示AFP染色陽性的各亞組的比例一起在表2中顯示。
表2去掉紅細(xì)胞后肝臟細(xì)胞懸液中CD陽性群體的百分?jǐn)?shù)和AFP陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)CD14 CD34 CD38 CD45 GA去掉紅細(xì)胞％占群體 7.4±1.3 3.4±0.5 4.8±0.9 8.2±0.3 27.5±4.7％AFP陽性89.8±1.3 77.1±2.9 53.5±7.2 32.5±1.3 1.8±0.9在大多數(shù)情況下，在以細(xì)胞表面標(biāo)記選擇的亞組中AFP的存在連續(xù)分布，顯示出染色強(qiáng)度在陽性范圍內(nèi)的細(xì)胞明顯占優(yōu)勢(shì)。然而，對(duì)于共表達(dá)AFP的CD38陽性細(xì)胞的分布是獨(dú)特的。在CD38-陽性細(xì)胞中，AFP共表達(dá)明顯呈雙峰分布，其中明顯有兩個(gè)不同組的細(xì)胞，一個(gè)為AFP陽性組，另一個(gè)為陰性。這點(diǎn)在圖8a中顯示，它顯示了表達(dá)CD14和CD38的染色細(xì)胞的散點(diǎn)圖以及在CD14和/或CD38陽性細(xì)胞中甲胎蛋白表達(dá)的單變量直方圖。
結(jié)果表明甲胎蛋白(AFP)在胎兒肝臟組織的單細(xì)胞懸液(即原始細(xì)胞懸液)中的7％的細(xì)胞中存在。發(fā)現(xiàn)抗血型糖蛋白A(在紅血細(xì)胞，即紅細(xì)胞上的一種抗原)的抗體鑒定出不表達(dá)AFP的細(xì)胞亞群體。因此，從打算鑒定肝祖細(xì)胞的細(xì)胞中排除表達(dá)該抗原的細(xì)胞(即，紅細(xì)胞)。CD38抗原鑒定了一群細(xì)胞，它們表現(xiàn)出AFP陽性細(xì)胞的比例顯著提高(即，比未分離樣品中的比例高7倍)。兩種抗原都具有許多同種型，取決于是否有剪接變異體編碼的分子片斷存在。鑒定各種同種型的抗體是可獲得的。
造血祖細(xì)胞的傳統(tǒng)標(biāo)記，即CD34存在于許多也表達(dá)AFP的細(xì)胞上。CD34陽性細(xì)胞的分選導(dǎo)致AFP陽性細(xì)胞的富集比原始細(xì)胞懸液中發(fā)現(xiàn)的高至少9倍(在CD34-陽性細(xì)胞中的67％與在原始細(xì)胞懸液中的7％)。然而，富集AFP陽性細(xì)胞最有效的單一抗體是CD14，它導(dǎo)致這些細(xì)胞的比例比原始群體增加11倍(81％相對(duì)于7％)。
因此，通過使用表面標(biāo)記的組合提高了AFP陽性細(xì)胞的產(chǎn)率。因此，測(cè)定AFP與表面標(biāo)記的選定組合共表達(dá)的程度以建立增加細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的選擇程度。該數(shù)據(jù)表示為表達(dá)表面標(biāo)記的AFP陽性細(xì)胞的比例(稱為AFP陽性細(xì)胞的“產(chǎn)率”)和在表面標(biāo)記限定的群體中出現(xiàn)的所有AFP陽性細(xì)胞的比例(稱為AFP陽性細(xì)胞的“富集”系數(shù))。CD14，CD34與CD38組合的結(jié)果以及用于比較的單個(gè)結(jié)果在表3中表示。
表3.
CD14 CD34 CD38 CD14±CD38 CD14±CD34富集80.6±2.6 66.7±4.7 53.8±4.5 66.9±3.5 68.2±3.9產(chǎn)率39.8±2.6 26.9±4.4 22.0±2.7 50.6±2.7 52.2±5.5富集表達(dá)任一(或兩種)表面標(biāo)記且同時(shí)為AFP陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
產(chǎn)率同時(shí)表達(dá)一種或兩種表面標(biāo)記組合的AFP陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
對(duì)于CD14/CD38標(biāo)記組合的這些數(shù)據(jù)還顯示在圖9中。
AFP染色陽性的細(xì)胞形態(tài)學(xué)是可變的且包含來自胎兒肝臟而不是成人肝臟的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞大小和形狀的全部范圍。最大的AFP-陽性細(xì)胞大約12-15微米，比大小范圍為20-50微米的成熟肝細(xì)胞小得多。這點(diǎn)在圖10中顯示，該圖顯示了一些AFP-陽性細(xì)胞選擇表達(dá)特異性抗體。
在所有情況下一定比例的AFP-陽性細(xì)胞顯示出不表達(dá)在本研究中使用的任何表面抗體。這些AFP陽性“裸”細(xì)胞的外觀在圖11a和11c中表示，其中將它們與從相同懸液分選的CD14陽性/AFP陽性細(xì)胞的外觀(圖11b和11d)進(jìn)行了比較。圖11a和11b是微分干涉相差顯微鏡照片，圖11c和11d是AFP免疫熒光。很明顯盡管兩種細(xì)胞類型都是AFP陽性，但表面抗原染色陰性的細(xì)胞比CD14陽性細(xì)胞更小且復(fù)雜度更低。
總之，分選肝祖細(xì)胞的標(biāo)記是血型糖蛋白A-，CD45-，ICAM+，CD14+和/或CD38+，或者除了ICAM+外所有這些標(biāo)記都無，且是二倍體，無顆粒(側(cè)向散射)，不超過15微米(前向散射)。這些分選細(xì)胞的表型是小細(xì)胞(＜15微米)，細(xì)胞質(zhì)較小(核/胞質(zhì)比率高)，白蛋白和/或AFP+++。該細(xì)胞的形態(tài)學(xué)見圖10-12。
胎兒和成人肝臟中表達(dá)甲胎蛋白的細(xì)胞的聚焦鑒定使用聚焦顯微鏡以獲得表達(dá)甲胎蛋白的人胎兒，小兒，或成人細(xì)胞的圖像。該方法學(xué)允許觀察這些細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和大小并直接顯示諸如AFP和ALB的細(xì)胞內(nèi)蛋白的位置和諸如CD34和CD38的膜表面標(biāo)記的位置。表達(dá)AFP的細(xì)胞在胎兒，小兒，和成人肝臟中都有發(fā)現(xiàn)(圖12a)。正如預(yù)期，胎兒肝臟具有最高百分?jǐn)?shù)(6-7％)而成人肝臟具有小百分?jǐn)?shù)(青年＜4％)且在中年人中隨年齡減少到＜1％。在年齡超過57歲的供體肝臟中沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)AFP的細(xì)胞。通過Percoll分離過程顯著富集在尸體肝臟中發(fā)現(xiàn)的少量肝祖細(xì)胞使得在供體肝臟的Percoll餾分1和2中得到2％的細(xì)胞(表4)。
表4顯示了來自Percoll-添加緩沖液的餾分的細(xì)胞大小和活力。在相同條件下分離后較小的細(xì)胞(餾分1-3)比較大的細(xì)胞(餾分4)具有更高的活力。
表4Percoll餾分 活力(％)細(xì)胞大小(μm)％AFP+細(xì)胞餾分1 82 ＜12 0.5-1％餾分2 84 10-152％餾分3 85 15-25＜0.2％餾分4 56 25-50＜0.01％這些結(jié)果表明優(yōu)選用于肝臟細(xì)胞治療以及器官移植的供體器官包括來自年齡達(dá)到45歲的青年供體的器官且該肝臟優(yōu)選從心跳停止的前30小時(shí)內(nèi)分離。來自老年病人(年齡＞71歲)的肝臟對(duì)于細(xì)胞治療且也許對(duì)于完全器官移植，特別是對(duì)于兒童不是合適的供體，因?yàn)樗鼈兙哂休^小(如果有的話)的來自肝祖細(xì)胞的再生能力且僅具有最小的已知從成熟細(xì)胞獲得的再生能力。
成熟譜系本發(fā)明的發(fā)明人顯示了局部缺血損傷的肝臟含有在正常和疾病狀態(tài)下都能生長并分化成肝細(xì)胞和膽細(xì)胞的肝祖細(xì)胞群體。本發(fā)明支持了這樣的觀點(diǎn)，即肝臟譜系中的每一位置是不同的成熟階段且在肝臟中有多種干細(xì)胞群體。
令人驚奇的是本發(fā)明的肝臟提供了3種不同的成熟譜系一種負(fù)責(zé)肝生成，產(chǎn)生肝臟組織且具有肝細(xì)胞和膽細(xì)胞(膽管)的細(xì)胞命運(yùn)；另一種負(fù)責(zé)造血，產(chǎn)生血細(xì)胞，具有淋巴細(xì)胞(B和T)，血小板，巨噬細(xì)胞，嗜中性白細(xì)胞和粒細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)；第三種負(fù)責(zé)間充質(zhì)形成，產(chǎn)生間充質(zhì)衍生物且具有內(nèi)皮細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，甚至是骨細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)。
本發(fā)明分離的細(xì)胞群體具有作為成功地肝臟定向細(xì)胞治療和/或基因治療的巨大潛力。如實(shí)施例所述，本發(fā)明在非人靈長類以及人肝祖細(xì)胞可成功進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和維持同時(shí)仍保留其完全分化或成熟的能力的條件鑒定方面取得了巨大進(jìn)展。按照本文公開的教導(dǎo)，可以從尸體分離并在培養(yǎng)基中維持未分化的肝祖細(xì)胞，然后更換成分化相關(guān)培養(yǎng)基用于移植。
由于其明顯的體外擴(kuò)增能力，本發(fā)明的細(xì)胞群體相似于造血譜系中的細(xì)胞，可用作細(xì)胞種子用于離開體內(nèi)的擴(kuò)增。這可消除對(duì)病人肝臟的主要侵入性手術(shù)切除術(shù)的必要性。
一旦在培養(yǎng)基中建立人肝祖細(xì)胞，可進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。這可用許多不同基因傳遞載體系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)(見下文提供的實(shí)施例)。在這點(diǎn)上的一個(gè)重要考慮因素是一些形式的基因轉(zhuǎn)移需要迅速生長的細(xì)胞，由于本發(fā)明的人二倍體細(xì)胞和/或祖細(xì)胞在正常生理學(xué)條件下有效分裂，因此這些細(xì)胞是將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)肝臟的理想候選者。另外，本發(fā)明的細(xì)胞群體的生長特征允許用于離開體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移，其中使用的某些基因傳遞病毒載體需要細(xì)胞增殖以便有效插入和表達(dá)基因。
本發(fā)明的祖細(xì)胞群體也適合于自體或同種異體肝臟定向細(xì)胞或基因治療。很明顯，使用自體肝祖細(xì)胞可消除有關(guān)移植細(xì)胞排斥的重要顧慮。本發(fā)明的細(xì)胞群體對(duì)于同種異體細(xì)胞轉(zhuǎn)移特別有吸引力，因?yàn)槠淇乖植记闆r表明它具有最小的免疫排斥現(xiàn)象。而且，已知具有高度免疫原性的諸如血細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，肝巨噬細(xì)胞的其它細(xì)胞成分通過該純化過程基本上被剔除。
一旦分離和純化了該自體或同種異體肝祖細(xì)胞，可對(duì)它們進(jìn)行遺傳修飾或原樣使用，如果需要可進(jìn)行增殖，然后移植回宿主。如果需要遺傳修飾，在遺傳修飾后和移植前，可擴(kuò)增那些遺傳修飾的細(xì)胞和/或根據(jù)顯性選擇標(biāo)記的插入和表達(dá)進(jìn)行選擇?？梢浦不馗问一虍愇晃稽c(diǎn)。為了移植進(jìn)肝室中，可使用門靜脈輸注或脾內(nèi)注射。脾內(nèi)注射是可選擇的施用途徑，因?yàn)榻?jīng)脾內(nèi)注射移植的大多數(shù)肝祖細(xì)胞可移動(dòng)進(jìn)肝臟。一旦在肝室中，移植的，遺傳修飾的肝祖細(xì)胞成熟成正常肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
另一醫(yī)學(xué)方法可促進(jìn)移植的肝祖細(xì)胞移入肝的效力。動(dòng)物模型證實(shí)在部分肝切除術(shù)中，施用血管形成因子和其它生長因子幫助移植的肝細(xì)胞移入和有活力。一個(gè)替代方法是將遺傳修飾的肝細(xì)胞移植進(jìn)異位位點(diǎn)。
至今對(duì)于肝臟的細(xì)胞治療方法僅顯示出平常的效力。這可能是由于這樣的事實(shí)，即使用的供體細(xì)胞主要是成人肝臟細(xì)胞且分離和再注射后壽命短。另外，使用成人細(xì)胞導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫排斥。在本案例中，肝祖細(xì)胞提供了更大的效力，因?yàn)槠湔T發(fā)免疫學(xué)排斥現(xiàn)象的能力有限且因?yàn)樗鼈兙哂袕V泛的再生潛力。
對(duì)于基因治療，正在進(jìn)行的努力使用了“定向可注射載體”，它是開發(fā)中的用于臨床治療的最流行途徑。這些方法的效力有限，因?yàn)槊庖邔W(xué)問題和載體的瞬時(shí)表達(dá)都存在。用祖細(xì)胞進(jìn)行離開體內(nèi)的基因治療(或者使用可注射載體以某種方式靶向那些祖細(xì)胞群體)可證實(shí)更有效，因?yàn)樵撦d體可導(dǎo)入離開體內(nèi)的祖細(xì)胞的純化亞群體；選擇修飾的細(xì)胞并重新導(dǎo)入體內(nèi)。祖細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)是它們有巨大的擴(kuò)增潛力，最小的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)力(如果有的話)，和分化產(chǎn)生全部譜系的成熟細(xì)胞的能力。
共同或相互依賴的譜系改進(jìn)的方法學(xué)使得本發(fā)明人能夠更嚴(yán)密地研究和鑒定肝祖細(xì)胞。這些研究揭示了肝祖細(xì)胞與造血祖細(xì)胞之間特別密切的關(guān)系，表明這兩個(gè)譜系之間有近親關(guān)系。事實(shí)上，這些研究表明肝祖細(xì)胞和造血譜系共有許多抗原標(biāo)記(CD14，CD34，CD38，c-kit，卵形細(xì)胞抗原)，共有生化特性(即，轉(zhuǎn)鐵蛋白，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，和甲胎蛋白的截短同種型)，且在用于離開體內(nèi)的擴(kuò)增的培養(yǎng)要求(細(xì)胞外基質(zhì)的形式和特定激素要求)上有廣泛的重疊。兩個(gè)譜系的祖細(xì)胞位于肝臟腺泡內(nèi)的相同位點(diǎn)。最后，兩個(gè)成熟譜系的細(xì)胞中存在旁分泌信號(hào)；它是由各譜系產(chǎn)生的調(diào)節(jié)另一譜系的細(xì)胞的信號(hào)。事實(shí)上，可推斷在肝細(xì)胞和造血細(xì)胞之間有一個(gè)共同的譜系或至少是相互依賴的譜系。
可純化本文公開的細(xì)胞群體并用于根據(jù)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)條件產(chǎn)生骨髓造血細(xì)胞或肝細(xì)胞衍生物。因此，如果細(xì)胞被再導(dǎo)入體內(nèi)進(jìn)入血液中，它們可有效地產(chǎn)生骨髓造血細(xì)胞衍生物；如果被導(dǎo)入肝臟，它們會(huì)產(chǎn)生肝臟細(xì)胞。在離開體內(nèi)維持的細(xì)胞中應(yīng)出現(xiàn)相似的現(xiàn)象。因此，用同時(shí)限定肝和造血祖細(xì)胞的一組抗原(即，CD38+，c-kit+，CD45-)分選的細(xì)胞群體接種的生物反應(yīng)器系統(tǒng)可導(dǎo)致細(xì)胞群體具有多種命運(yùn)。
本發(fā)明的細(xì)胞群體的另一重要方面是群體中的一些細(xì)胞展示出特異性的祖細(xì)胞表面抗原CD34。CD34已被用作骨髓造血干細(xì)胞的方便的陽性選擇標(biāo)記。本文公開的本發(fā)明顯示了純化任何祖細(xì)胞群體的更好方法，例如隨后可用于臨床和臨床前期程序的造血和肝祖細(xì)胞群體。
人肝祖細(xì)胞的用途有許多且變化多樣。它們包括1)對(duì)人細(xì)胞的研究；2)產(chǎn)生疫苗或抗病毒劑；3)毒理學(xué)研究；4)藥品開發(fā)；5)蛋白質(zhì)生產(chǎn)(使用該細(xì)胞作為各種人特異性因子的宿主)；6)肝臟細(xì)胞治療；7)肝臟基因治療；8)可用于研究，毒理學(xué)和抗微生物試驗(yàn)，蛋白質(zhì)生產(chǎn)，或者臨床上用作肝臟輔助系統(tǒng)的人造生物肝臟?？紤]到正如本發(fā)明的發(fā)明人所預(yù)言的，在造血和肝生成之間有共同譜系的可能性，相同的細(xì)胞可同時(shí)適合于肝細(xì)胞或者造血細(xì)胞命運(yùn)，這取決于它們所放置的微環(huán)境。
高度純化的人肝祖細(xì)胞的可獲得性允許對(duì)人細(xì)胞進(jìn)行更加廣泛的研究，且肯定會(huì)幫助建立肝臟細(xì)胞治療和基因治療的成功方式，并允許建立人的人造生物肝臟用于研究和作為臨床輔助裝置。目前，健康人體組織的供應(yīng)有限妨礙了在肝臟細(xì)胞治療或人的人造生物肝臟中的臨床計(jì)劃。從尸體獲得的包括其祖細(xì)胞群體的二倍體細(xì)胞具有足夠的擴(kuò)增潛力以極大地緩解這種有限的供應(yīng)。
下面的實(shí)施例是舉例性的且不打算進(jìn)行限制性。
實(shí)施例來自尸體的肝臟獲取來自尸體的肝臟經(jīng)門靜脈，腔靜脈，或兩者插入導(dǎo)管，用緩沖液灌流以清除血液；然后用含有膠原酶/蛋白酶的緩沖液灌流以酶促解離細(xì)胞。根據(jù)肝臟的大小通常進(jìn)行15-30分鐘的消化后，將組織擠壓通過干酪包布或尼龍濾膜或用梳子耙過以機(jī)械完成細(xì)胞解離過程。用含有血清的緩沖液清洗解離的細(xì)胞以滅活膠原酶和在灌流過程中使用的其它酶。
灌流緩沖液P1和P2放在37℃水浴中。在Miller型灌流盒中進(jìn)行灌流，該灌流盒在整個(gè)灌流過程中維持在37℃。灌流期間給緩沖液充氧。盒中的所有管道用70％的乙醇清洗，接著用蒸餾水清洗，然后用P1清洗以保證從系統(tǒng)中去掉空氣。對(duì)于大塊肝臟(100-300g)使用在肝臟的切口表面可利用的各種血管，使用配置在60ml注射器上的16號(hào)針頭的Teflon插管進(jìn)行肝臟插管以便用冰冷的P1緩沖液流過肝臟。對(duì)于可獲得完整肝葉的情況，可對(duì)殘留的腔靜脈做插管。試驗(yàn)大塊肝臟中的各種血管以獲悉哪一條血管可提供最佳的組織灌流。該操作也從肝臟中去掉了任何剩余的血液。對(duì)選定的血管做插管并使用醫(yī)療級(jí)粘合劑(例如，醫(yī)療級(jí)“超級(jí)膠(superglue)”)密封固定。使用醫(yī)療級(jí)粘合劑密封所有其它的大血管和表面開口，且如果需要，使用帶粘合劑的Q-滴頭幫助密封開口。一旦粘合劑干燥，將肝臟樣品放在合適大小的玻璃杯內(nèi)的尼龍網(wǎng)上。將P1緩沖液加入杯中，并將肝臟浸沒在緩沖液。將裝有肝臟的杯子放在灌流盒內(nèi)，并連接上插管的輸出管道。用可接受的反壓開始以大約24mls/分鐘的低速，然后緩慢增加到58ml/分鐘和90ml/分鐘之間以優(yōu)化流速將P1緩沖液再循環(huán)15分鐘。必須確認(rèn)沒有過多的灌流液從肝臟泄露。15分鐘后，從杯中取出P1緩沖液并用含有膠原酶的P2緩沖液代替。再循環(huán)P2緩沖液直到肝臟被充分消化(通過肝臟從深色微紅棕色向淡棕色的顏色轉(zhuǎn)變和通過獲得肝臟的軟糊狀結(jié)構(gòu)來評(píng)估)。P2緩沖液再循環(huán)不超過20-25分鐘。一旦結(jié)束灌流，從杯中排出P2緩沖液并將肝臟在杯中轉(zhuǎn)移到生物學(xué)包布上。
向杯中加入細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)，去掉插管和粘合劑以及肝臟的任何未消化區(qū)。使用組織鑷子和剪刀破壞肝臟被膜(肝被膜)。這允許將消化的組織釋放進(jìn)培養(yǎng)基中，剩下結(jié)締組織和任何未消化的材料。將消化的材料放入DMEM中，然后通過一系列不同大小的濾膜過濾。濾膜放在大型漏斗的內(nèi)側(cè)以幫助過濾。消化的材料首先用單層干酪包布過濾，接著用400μ的尼龍濾膜過濾，然后通過70μ的特氟隆濾膜。將濾液平分進(jìn)離心管并以70g離心4分鐘。
離心后，在加入Percoll前，上清稱為餾分1(F1)。向細(xì)胞沉淀中加入DMEM和等滲的Percoll以得到分別為3∶1的最終比率。例如，5ml體積的堆積細(xì)胞的小團(tuán)懸浮于30ml的DMEM和10ml的等滲Percoll中。將樣品以100g離心5分鐘以產(chǎn)生稱為F4餾分的沉淀。上清以200至400g再離心5分鐘以獲得稱為F3餾分的沉淀?，F(xiàn)在上清再以600-800g離心以獲得稱為F2餾分的沉淀。以1200-1800g進(jìn)行最后的離心以獲得稱為F1餾分的沉淀。懸浮不同餾分的細(xì)胞并使用錐蟲藍(lán)染料排斥試驗(yàn)評(píng)估其活力。不同餾分的活力在表4中提供。
保留肝臟灌流后與肝臟組織的血管或膽管樹保持結(jié)合的細(xì)胞。這些細(xì)胞在酶灌流后獲得的原始細(xì)胞懸液中發(fā)現(xiàn)，且一般在懸液中的細(xì)胞通過后留在濾網(wǎng)(例如，干酪包布)的上部。用酶再次處理血管和膽管樹的這些殘留物，所得的細(xì)胞與其它細(xì)胞合并在一起。
大多數(shù)研究者在肝臟灌流中通常使用Percoll分餾法以排除他們認(rèn)為是碎片和死亡細(xì)胞的成分；但這些研究者僅保留了最終的細(xì)胞沉淀。本文所公開的對(duì)常規(guī)灌流的新變化是，這里稱為F4的第一細(xì)胞沉淀含有發(fā)現(xiàn)對(duì)局部缺血，無論是暖或冷局部缺血最敏感的細(xì)胞，且具有較低浮力密度的細(xì)胞(即，從以較高速度離心獲得的沉淀收集的細(xì)胞)對(duì)局部缺血敏感性較小。在F1，F(xiàn)2，和F3餾分中的這些細(xì)胞較小，可能是年幼的實(shí)質(zhì)細(xì)胞且具有更大的冷凍適應(yīng)性(見冷藏部分)。而且，這些細(xì)胞基本上是二倍體細(xì)胞，而來自成人F4餾分中的細(xì)胞含有大量多倍體細(xì)胞。多倍體細(xì)胞可以是雙核或單核的，且可以是四倍體或八倍體，或者甚至是更高水平的倍性。
倍性與細(xì)胞群體的分餾相關(guān)發(fā)現(xiàn)上述成人肝臟細(xì)胞的餾分(F1-F4)含有不同的細(xì)胞群體F1含有碎片，紅血細(xì)胞，肝星形細(xì)胞，和含有祖細(xì)胞群體(肝譜系或造血譜系的祖細(xì)胞)的小肝細(xì)胞(＜12μm)；F2餾分含有是二倍體，小實(shí)質(zhì)細(xì)胞的較大肝細(xì)胞(12-15μm)；F3餾分含有更大型的實(shí)質(zhì)細(xì)胞(15-25μm)且由二倍體和四倍體細(xì)胞的混合物組成；F4餾分(所有其它研究者使用的餾分)由最大的實(shí)質(zhì)細(xì)胞(25-50μm)組成且?guī)缀跞渴嵌啾扼w(例如，四倍體和八倍體)。
一般來說，F(xiàn)1-F3餾分中的實(shí)質(zhì)細(xì)胞冷凍后79-95％具有活力；F4餾分中的實(shí)質(zhì)細(xì)胞冷凍后具有50-80％的活力(依賴于到達(dá)時(shí)肝臟的狀態(tài))。鑒定的影響F4餾分中實(shí)質(zhì)細(xì)胞活力的變量是1)供體的年齡(供體的年齡越大，細(xì)胞的預(yù)后越差)；2)心跳停止到交付到實(shí)驗(yàn)室之間的時(shí)間(越短越好)。這些因素是相互影響的以致于迅速交付的年長供體的組織比花費(fèi)太長運(yùn)輸時(shí)間的年輕病人的組織更有吸引力。
局部缺血對(duì)細(xì)胞分餾的影響檢查由于局部缺血時(shí)間和溫度的影響細(xì)胞活力的結(jié)果。肝臟保持在環(huán)境或以上溫度的情況稱為暖局部缺血。肝臟保持在環(huán)境溫度以下的情況稱為冷局部缺血。在通常實(shí)踐中，暖局部缺血相應(yīng)于活體溫度與室溫之間的溫度，而冷局部缺血相應(yīng)于室溫以下的任何溫度，例如，大約10℃或大約4℃。
在暖局部缺血中，肝臟保持在環(huán)境溫度以上，然后灌流肝臟。在暖局部缺血的另一形式中，肝臟保持在環(huán)境以上溫度一定時(shí)間，然后冷卻，隨后用暖解離溶液灌流。處理各灌流產(chǎn)生的單細(xì)胞懸液以提供具有不同比例的二倍體和多倍體細(xì)胞的細(xì)胞餾分。祖細(xì)胞是二倍體細(xì)胞的亞群體。而且，觀察到分化的多倍體細(xì)胞對(duì)環(huán)境以上溫度的局部缺血敏感。在下表中，經(jīng)過用染色死細(xì)胞的細(xì)胞核的碘化丙錠(PI)染色區(qū)分活的大鼠肝臟細(xì)胞與死細(xì)胞。在以流式細(xì)胞術(shù)分選的活的和死亡細(xì)胞餾分中在固定，透化，以及用PI復(fù)染之后觀察所有細(xì)胞中的細(xì)胞核來計(jì)數(shù)單核或雙核細(xì)胞。
表5暖局部缺血時(shí)間 活細(xì)胞雙核％ 死細(xì)胞雙核％無 32 302小時(shí) 27 47使用大鼠作為模型測(cè)量了由于暖局部缺血時(shí)間的影響來自肝臟灌流的總細(xì)胞產(chǎn)量。使用大約8周齡，各250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠。測(cè)量無局部缺血的動(dòng)物每個(gè)肝臟產(chǎn)生＞400×106個(gè)分離的細(xì)胞。暖局部缺血時(shí)間不超過1小時(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)總細(xì)胞產(chǎn)量迅速下降到每個(gè)肝臟提供150到250×106個(gè)細(xì)胞。時(shí)間在大約1小時(shí)到5小時(shí)之間時(shí)發(fā)現(xiàn)總細(xì)胞產(chǎn)量相對(duì)穩(wěn)定在每個(gè)肝臟產(chǎn)生50到150×106個(gè)之間的細(xì)胞。暖局部缺血時(shí)間不超過1小時(shí)時(shí)活細(xì)胞產(chǎn)量迅速下降，大于1小時(shí)時(shí)穩(wěn)定在每個(gè)肝臟大約10×106個(gè)細(xì)胞。因此，發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞的比例與暖局部缺血呈雙峰。在不超過1小時(shí)時(shí)，活細(xì)胞和死細(xì)胞都急劇降低以致于活力比不變。在大于1小時(shí)和達(dá)到5小時(shí)時(shí)觀察到穩(wěn)定的活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
使用上述大鼠模型測(cè)量由于暖局部缺血時(shí)間的影響肝臟細(xì)胞核的投射區(qū)。灌流肝臟，細(xì)胞分離為單細(xì)胞懸液，并用碘化丙錠染色。以流式細(xì)胞術(shù)收集活細(xì)胞(PI-陰性)，然后附著到顯微鏡載玻片上，固定，透化并用PI復(fù)染以觀察細(xì)胞核。對(duì)于無局部缺血灌流的對(duì)照動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核面積具有雙峰分布，相應(yīng)于單核和雙核活的肝臟細(xì)胞都存在。暖局部缺血1小時(shí)后和2小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)雙核細(xì)胞的比例降低。由于雙核細(xì)胞必定是多倍體，認(rèn)為這些數(shù)據(jù)表明多倍體細(xì)胞比二倍體細(xì)胞對(duì)局部缺血更敏感。
通過分析單核細(xì)胞中細(xì)胞核的大小進(jìn)一步支持了二倍體細(xì)胞對(duì)局部缺血的抗性。單核細(xì)胞可以是二倍體或者是多倍體，二倍體細(xì)胞具有比多倍體細(xì)胞更小的細(xì)胞核。上述大鼠模型用于制備測(cè)量細(xì)胞核面積的活細(xì)胞。圖1a中提供了總細(xì)胞核的百分?jǐn)?shù)，表明具有小核的細(xì)胞對(duì)局部缺血具有相對(duì)抗性。由于多倍體核傾向于比二倍體核更大，發(fā)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)表明了二倍體細(xì)胞對(duì)暖局部缺血具有相對(duì)的抗性。發(fā)現(xiàn)在對(duì)照肝臟和局部缺血2小時(shí)后的肝臟中細(xì)胞核大小之間的改變無區(qū)別，如圖1b所示。
也有利地檢查了由于低溫局部缺血時(shí)間的影響細(xì)胞的活力，見表6和7。在該實(shí)施方案中，肝臟基本上在死后立即迅速冷凍到大約10℃。甚至更有利的是，肝臟基本上在死后立即迅速冷凍到大約4℃。通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的一些任何方法可實(shí)現(xiàn)冷凍，包括但不限于在供體尸體腹部堆積冰塊或冰冷的液體袋的簡單權(quán)宜之計(jì)。肝臟保持在一種上述環(huán)境溫度以下，然后在時(shí)間達(dá)到大約30小時(shí)，或更有利的是在時(shí)間達(dá)到20小時(shí)時(shí)按所述進(jìn)行灌流。處理灌流產(chǎn)生的單細(xì)胞懸液以提供祖細(xì)胞。觀察到多倍體細(xì)胞對(duì)即使溫度維持在環(huán)境溫度以下和甚至在4℃的局部缺血敏感。
表6人胎兒肝臟
表7小兒和成年人肝臟
按一種或多種上述方法所述從供體肝臟制備的祖細(xì)胞適用于冷藏，流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞染色，細(xì)胞分選，肝臟再生，生物反應(yīng)器，人造肝臟和按下文上述作為治療性療法。
在人供體中的暖局部缺血樣品Ren#200是1999年5月21日接受的男性成年供體。該供體被宣告腦死亡且評(píng)估為用于器官移植的供體。然而，在移植的外科醫(yī)生能獲取器官前，供體心跳停止。外科醫(yī)生能在心跳停止的30-60分鐘內(nèi)取出肝臟，該時(shí)期構(gòu)成“暖局部缺血時(shí)間”。交叉夾緊的時(shí)間是1999年5月20日2119。用運(yùn)輸緩沖液(Viaspan)沖洗肝臟并放在冰上運(yùn)回UNC。UNC在第二天上午11點(diǎn)收到(構(gòu)成13小時(shí)41分鐘的冷局部缺血)并立即處理。發(fā)現(xiàn)該處理產(chǎn)生了具有所示活力的下列細(xì)胞懸液表8餾分活力％總產(chǎn)量，活細(xì)胞數(shù)細(xì)胞，總數(shù)％F1 69％ 1.5×1087.8F2 65％ 3.6×10818.8F3 81％ 5.5×10828.8F4 83％ 8.5×10844.5總計(jì) 19.1×10899.9因此，對(duì)經(jīng)歷暖局部缺血以致于導(dǎo)致其不適合于器官移植的人肝臟組織進(jìn)行的處理發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生含有二倍體細(xì)胞的分離細(xì)胞餾分。
在從人肝臟分離的二倍體細(xì)胞中甲胎蛋白的表達(dá)車輛碰撞后沖擊創(chuàng)傷單位(Shock Trauma Unit)收到且宣告DOA的男性病人，37歲，估計(jì)在沖擊創(chuàng)傷單位接受前25分鐘死于心跳停止。經(jīng)過外部消毒準(zhǔn)備供體尸體用于器官捐贈(zèng)。無菌取出肝臟，包裝進(jìn)無菌袋中，冷卻用于轉(zhuǎn)移到附近的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室中。通過使用無菌表面溫度探針測(cè)量供體肝臟核心溫度。在估計(jì)的死亡時(shí)間后45分鐘記錄到10℃的溫度。開始用暖解離溶液(見上文)灌流肝臟。按上文所述制備供體肝臟細(xì)胞懸液，經(jīng)過按上文所述在補(bǔ)充了Percoll的緩沖液中離心來分離活的二倍體細(xì)胞。將分離的細(xì)胞分成等分試樣用于冷藏，用于包括抗原定型的進(jìn)一步鑒定，和用于在移植進(jìn)抗原匹配的受體前在細(xì)胞培養(yǎng)基中的擴(kuò)增。
第二例男性病人，34歲，在交通事故后急診室收到且宣告DOA，死于內(nèi)部撕裂引起的失血且因此估計(jì)在急診室收到前45分鐘時(shí)心搏停止。經(jīng)過外部消毒準(zhǔn)備供體尸體用于器官捐贈(zèng)。無菌取出肝臟，包裝進(jìn)無菌袋中，冷卻用于轉(zhuǎn)移到附近的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室中。通過使用無菌表面溫度探針測(cè)量供體肝臟的溫度。在估計(jì)的死亡時(shí)間后80分鐘記錄到10℃的溫度。開始用溶液(見上文)灌流肝臟。按上文所述制備供體肝臟細(xì)胞懸液，經(jīng)過按上文所述在補(bǔ)充了Percoll的緩沖液中離心來分離活的二倍體細(xì)胞。將分離的細(xì)胞分成等分試樣用于冷藏，用于包括抗原定型的進(jìn)一步鑒定，和用于在移植進(jìn)抗原匹配的受體前在細(xì)胞培養(yǎng)基中的擴(kuò)增。
按上述從兩個(gè)供體制備分離細(xì)胞的樣品用于以抗甲胎蛋白的抗體染色，和經(jīng)過在FACStar細(xì)胞計(jì)數(shù)器上的細(xì)胞分選進(jìn)行分析。將相應(yīng)于基本上是二倍體細(xì)胞的具有小核的單核實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞亞餾分與相應(yīng)于多倍體細(xì)胞，即具有大核的單核細(xì)胞和雙核細(xì)胞的細(xì)胞亞餾分進(jìn)行比較。來自經(jīng)歷不同時(shí)間的暖局部缺血的年齡和性別匹配的供體的細(xì)胞比較用于評(píng)估二倍體和多倍體肝臟細(xì)胞對(duì)暖局部缺血影響的相對(duì)敏感性。表達(dá)甲胎蛋白的肝祖細(xì)胞是肝臟二倍體細(xì)胞的亞群體。評(píng)估出表達(dá)甲胎蛋白的細(xì)胞在冷或暖局部缺血中存活的能力等于或好于其它二倍體肝臟細(xì)胞群體。
用于PCR研究的引物形成在肝細(xì)胞與其它細(xì)胞類型中差別表達(dá)的甲胎蛋白(AFP)同種型分析。細(xì)胞系兩種人肝細(xì)胞瘤，Hep3B和HepG2，在補(bǔ)充了1mM丙酮酸鈉，2mM L-谷酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，0.1mMMEM非必需氨基酸溶液，5μg/ml胰島素和10％FBS的Eagle’s MEM中維持。人紅白血病細(xì)胞系，K562和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系，STO在補(bǔ)充了2mM L-谷酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，5×10-5M2-ME和10％FBS的DMEM/F12中維持。
RT-PCR用標(biāo)準(zhǔn)方法從Hep3B，HepG2，和STO中提取總RNAs。經(jīng)過寡聚-dT引發(fā)合成cDNA并使用本發(fā)明人設(shè)計(jì)和制備的用于人甲胎蛋白(AFP)的引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下，hAFP15’-ACCATGAAGTGGGTGGAATC-3’，hAFP25’-CCTGAAGACTGTTCATCTCC-3’，hAFP35’-TAAACCCTGGTGTTGGCCAG-3’，hAFP45’-ATTTAAACTCCCAAAGCAGCAC-3’，hAFP外顯子25’-CTTCCATATTGGATTCTTACCAATG-3’，hAFP外顯子35’-GGCTACCATATTTTTTGCCCAG’，hAFP外顯子45’-CTACCTGCCTTTCTGGAAGAAC-3’，
hAFP外顯子55’-GAGATAGCAAGAAGGCATCCC-3’，和hAFP外顯子65’-AAAGAATTAAGAGAAAGCAGCTTG-3’，引物的組合如下hAFP1和hAFP2，hAFP3和hAFP4，hAFP1和hAFP4，hAFP外顯子2和hAFP4，hAFP外顯子3和hAFP4，hAFP外顯子4和hAFP4，hAFP外顯子5和hAFP4，和hAFP外顯子6和hAFP4。
在由1μM各引物，200μM各dNTP，50mM KC1，1.5mM MgCl2，10mMTris HC1，pH8.3，和1.25U Amplitaq聚合酶(Cetus Corp)組成的50μl總體積中進(jìn)行PCR。樣品加熱到94℃3分鐘，接著94℃下2分鐘，62℃下2分鐘，72℃下3分鐘擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，在72℃進(jìn)行最后的延伸步驟7分鐘。然后在Tris-醋酸鹽EDTA緩沖液中含有5μg/ml溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠上對(duì)5μl的各PCR反應(yīng)液走電泳。人AFP基因由15個(gè)外顯子組成。為了區(qū)分截短的轉(zhuǎn)錄子與功能性完全的AFP mRNA，選擇AFP cDNA序列的兩個(gè)不同部分作為RT-PCR的靶分子。hAFP1和hAFP2的引物組合用于擴(kuò)增含有起始MET的外顯子1至外顯子3，而hAFP3和hAFP4的組合擴(kuò)增外顯子12至含有終止密碼子的外顯子14。PCR的結(jié)果是兩種引物組合都導(dǎo)致在來自Hep3B和HepG2的RNA中檢測(cè)到強(qiáng)烈的擴(kuò)增帶(泳道1，2，4，和5)。相反，用hAFP3和hAFP4引物組在來自K562的RNA中僅檢測(cè)到C-末端部分的特異性帶(泳道7和8)。該結(jié)果表明紅白血病細(xì)胞系K562僅表達(dá)無N-末端的AFP的截短形式。為支持該假設(shè)，使用hAFP1和hAFP4引物進(jìn)行了AFP全編碼區(qū)的PCR。正如所預(yù)期的，Hep3B和HepG2 cDNA的PCR顯示出2.1Kb的單一顯著帶(泳道3和6)，而在K562中沒有帶(泳道9)。對(duì)照是無RNA的樣品和來自小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(STO)的樣品。兩者都沒有顯示出任何可檢測(cè)的帶型。接著，構(gòu)建了從外顯子2至外顯子6的一系列5’引物以觀察在hAFP mRNA的正常和變異體形式之間的區(qū)別。結(jié)果表明K562中hAFP的變異體形式具有除了外顯子1外所有的編碼區(qū)。用于人AFP RT-PCR的hAFP1和hAFP4引物的組合適合于檢測(cè)含有完全AFP mRNA種類的肝細(xì)胞譜系中的AFP mRNA表達(dá)。使用該特異性引物組合的RT-PCR分析可排除在肝細(xì)胞或非肝細(xì)胞中表達(dá)任何截短形式的可能性。該試驗(yàn)用于鑒定肝臟祖細(xì)胞的特異性亞群體或區(qū)分共有表面標(biāo)記的肝細(xì)胞或造血細(xì)胞群體。
供體肝臟的處理尸體肝臟在死后不同時(shí)間，但優(yōu)選在至少24小時(shí)，最多在30小時(shí)內(nèi)獲得的肝臟。使用酶消化和機(jī)械解離的組合處理肝臟，胎兒“尸體”肝臟首先通過機(jī)械解離制備，而成人尸體肝臟首先通過酶消化解離。各種處理的描述在下面給出。胎兒和成人肝臟都在酶緩沖液中消化不同的時(shí)間長度，該酶緩沖液用于解離將組織中的細(xì)胞結(jié)合在一起的細(xì)胞外基質(zhì)。混合用于分離肝臟細(xì)胞的膠原酶是由Boehringer-Mannheim生產(chǎn)的高純度的“釋放酶(Liberase)”的酶制品，它由純化的膠原酶和彈性蛋白酶的混合物組成。該酶混合物以小得多的濃度使用且有害的“副作用”更小。
酶溶液膠原酶溶液，60-70mg/100ml緩沖液(Sigma的IV型膠原酶，目錄號(hào)#C5138或Worthington的B型膠原酶，目錄號(hào)#LS005273；兩者都是富含膠原酶但具有許多酶雜質(zhì)的細(xì)菌制品)或者在P2緩沖液(見下文)中制備且以0.23mg/ml使用的釋放酶(Boehringer-Mannheim的純化膠原酶/彈性蛋白酶制品，目錄號(hào)1814184)。
細(xì)胞洗滌溶液補(bǔ)充了胰島素(5μg/ml)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(5μg/ml)，與純化的?；蛉搜灏椎鞍滓?∶1的摩爾比結(jié)合的游離脂肪酸混合物(見下文)的RPMI 1640(Gibco)。
游離脂肪酸的混合物未成熟的細(xì)胞群體和損傷的老年肝臟細(xì)胞需要脂類維持和合成其細(xì)胞膜。盡管完全成熟的肝細(xì)胞可從單一脂肪酸來源(亞油酸)合成其細(xì)胞膜，但幼年實(shí)質(zhì)細(xì)胞不能，因此需要許多不同脂肪酸的混合物來實(shí)現(xiàn)其脂類需要。我們提供了一種復(fù)雜的混合物，然后與高度純化的牛血清白蛋白或高度純化的人白蛋白以1∶1的摩爾比結(jié)合。一般來說，優(yōu)選人白蛋白以避免與“瘋牛病”或牛海綿型腦病相關(guān)的問題。因此，游離脂肪酸的混合物在細(xì)胞培養(yǎng)基中以大約7.6μeq/L(7.6μM)的終濃度使用。
組合的總共100mM的游離脂肪酸的貯液制備如下
棕櫚酸 31.0mM油酸 13.4mM棕櫚油酸 2.8mM 亞油酸35.6mM硬脂酸 11.6 mM 亞麻酸5.6mM單個(gè)脂肪酸成分的制備按如下將單個(gè)成分分別溶于100％的乙醇中棕櫚酸 1M貯液，溶于熱乙醇中棕櫚油酸1M貯液，易溶于乙醇硬脂酸 151mM貯液，以1g/21ml溶于熱乙醇中油酸1M貯液，易溶于乙醇亞油酸 1M貯液，易溶于乙醇亞麻酸 1M貯液，易溶于乙醇然后混合這些單個(gè)貯液以獲得100mM的FFA混合物。使用通氮?dú)庵苽鋯蝹€(gè)FFA和FFA混合物的等分試樣以減少氧化和增加穩(wěn)定性。貯液冷凍在-20℃。
P1灌流緩沖液-無鈣和鎂的灌流緩沖液(pH7.2)，對(duì)下列各成分的終濃度限定為118mM NaCl，4.7mM KC1，1.2mM KPO4，pH7.4，2.5mM NaHCO3，0.5mM EDTA，5.5mM葡萄糖，0.5％牛血清白蛋白(BSA)，抗壞血酸(50μg/ml)，胰島素(4μg/ml)，和地塞米松(1μM)。
P2灌流緩沖液-Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基或補(bǔ)充了0.5％BSA，抗壞血酸(50μg/ml)，胰島素(4μg/ml)和地塞米松(1μM)的RPMI 1640。
DMEM-含有葡萄糖，丙酮酸鈉和L-谷酰胺且進(jìn)一步補(bǔ)充了5％胎牛血清，胰島素(4μg/ml)和地塞米松(1μM)的Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(Gibco)。補(bǔ)充了ITS+TM培養(yǎng)基添加劑(5mls/500mls)和地塞米松(0.1μM)的Chee’s培養(yǎng)基。Percoll(Pharmacia)用10XDulbecco’s磷酸鹽緩沖液以9∶1稀釋。
冷藏實(shí)驗(yàn)用于冷藏方法的肝臟來自尸體供體，年幼的如胎兒肝臟(妊娠期12周至25周)，年老的如77歲。新的冷藏緩沖液使用如下補(bǔ)充2％人血清(Gibco)或胎牛血清(Biowhittaker)，專用于成熟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的10％冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜(Sigma目錄號(hào)#D5879或D8779)或用于祖細(xì)胞的二甲基亞砜或甘油(Sigma目錄號(hào)#G6279)的Viaspan(Dupont目錄號(hào)#1000-46-06)。緩沖液還添加了抗生素(青霉素200U/ml；鏈霉素100μg/ml)。緩沖液還補(bǔ)充了激素和生長因子胰島素(5μg/ml)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(5μg/ml)，表皮生長因子(50μg/ml)，F(xiàn)GF(10ng/ml)，IGF II(10ng/ml)。緩沖液還添加了與牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)結(jié)合的脂類游離脂肪酸(7.6μM)和高密度脂蛋白(10μg/ml)。緩沖液還進(jìn)一步添加了微量元素(硒(10-9M)，銅(10-7M)，鋅(5×10-11M)和抗氧化劑，AEOL 10112(一種專賣抗氧化劑，porphorin是過氧化物歧化酶模擬物，以10μg/ml使用)，它是一種由Incara的子公司AEOLUS制備的產(chǎn)品。
在本文所述的組合物中的改變是將鑒定為肝臟細(xì)胞特制的無血清激素限定的培養(yǎng)基的組成部分的主要營養(yǎng)成分，脂類，激素和生長因子組合起來。新緩沖液導(dǎo)致F4餾分中肝臟細(xì)胞的活力從低到大約10％或更低(在死后大約30小時(shí)的上限時(shí)間收集的狀態(tài)極差的樣品)到高達(dá)80％(在接近1小時(shí)或以上的早期時(shí)間期間收集的好樣品)。F1-F3餾分的活力穩(wěn)定在40％以上，該事實(shí)支持這些餾分是具有倍性狀態(tài)和代謝活力更有益于合成細(xì)胞外基質(zhì)成分和/或?yàn)榛盍蜕L所需的其它細(xì)胞因子的“幼年”細(xì)胞；因此它們很可能更易于冷凍。在緩沖液中使用過氧化物歧化酶模擬物將細(xì)胞的活力提高了5-10％。
上述組合物的另一選擇是使用一種改良的緩沖液，其中去掉Viaspan且在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如RPMI 1640)中補(bǔ)充胰島素(5μg/ml)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(5μg/ml)，與BSA結(jié)合的游離脂肪酸(7.6μM)，高密度脂蛋白(10μg/ml)，微量元素[硒(10-9M)，銅(10-7M)，鋅(5×10-11M)]，和AEOL 10112。以諸如與層粘連蛋白混合的IV型膠原蛋白或與纖連蛋白混合的III型膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)的形式包裹細(xì)胞。
按上述處理的胎兒“尸體”肝臟細(xì)胞懸浮于冷藏緩沖液(上述)中，以5-10×106個(gè)細(xì)胞/ml等分進(jìn)3ml的冷凍小瓶中并在該條件下維持1-2小時(shí)。然后使用計(jì)算機(jī)控制速率的冷凍庫(Forma Cryomed)將細(xì)胞冷凍到-160℃的液氮溫度，然后貯存在大型蒸發(fā)相的液氮(-160℃)貯存罐中。細(xì)胞在該過程中存活良好且在50-270天的貯存期間不出現(xiàn)明顯的活力損失(見圖4)。
處理和冷凍后F4餾分活力的最大范圍隨著實(shí)驗(yàn)室“夾緊時(shí)間”和接受樣品之間的時(shí)間長度的改變而改變，也隨著肝臟狀態(tài)(纖維變性，局部缺血等)的不同而改變。一般來說，F(xiàn)4餾分對(duì)肝臟的處理變化和組織的一般健康狀況最敏感。明顯的是，F(xiàn)2和F3餾分通常是有活力的且容易冷凍保存，即使它從狀況較差的肝臟樣品獲得。F1餾分是更易變的，它含有大量碎片，脂肪小滴以及包括小實(shí)質(zhì)細(xì)胞(假定包括肝祖細(xì)胞)和各種造血亞群體(即，紅細(xì)胞)的許多小細(xì)胞。
表9.冷藏胎兒肝臟處理后的平均活力75-85％處理后的平均活力相當(dāng)于處理后。
表10.冷藏成人肝臟活力(冷凍后)F1-F3＞75％，具有較好的貼壁能力F4＜60％具有較差的貼壁能力流式細(xì)胞術(shù)下面的分選方法是任選的。細(xì)胞以單個(gè)排列通過流動(dòng)室，在其中細(xì)胞暴露于激光中。通過“前向散射”，或者由于光束交錯(cuò)折射的光量來測(cè)定各細(xì)胞的近似體積。散射光，即來自諸如細(xì)胞核，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體，囊泡等的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的“側(cè)向散射”用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜性的量(即，活細(xì)胞和更成熟的細(xì)胞含有比靜息細(xì)胞或年幼細(xì)胞更多的細(xì)胞內(nèi)組分)。通過高度特異性，特征性抗原與細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合獲得更多關(guān)于細(xì)胞特征的選擇性信息。這些抗體可共價(jià)結(jié)合到熒光分子上，例如，異硫氰酸熒光素(FITC)，藻紅蛋白(PE)，和PE的串連偶合物和細(xì)胞色素，它們被激光束激發(fā)，各熒光團(tuán)以特定的波長產(chǎn)生發(fā)射光。通過選擇一組與特定的抗體偶連的區(qū)別性發(fā)色團(tuán)，可選擇感興趣的細(xì)胞群體。
根據(jù)其參數(shù)輸入分析細(xì)胞。使用各種收集裝置以每秒達(dá)到40,000次或更高的速度收集所需細(xì)胞，包括使用Eppendorf管和錐形管，和任意大小的多孔板。
表11.染色程序中使用的抗體和試劑抗體 供應(yīng)商，Cat#， Lot山羊抗人AFP Chemicon， AB635，C4P168單克隆小鼠抗人ThyChemicon， MAB1294，293CCD單克隆小鼠抗人AFP-PE偶連物 Chromaprobe， P41020，A45P7生物素標(biāo)記的兔抗山羊 Vector Laboratories， BA-5000，J0313生物素標(biāo)記的兔抗山羊， Jackson Immunochemicals 200-152-096，25985鏈霉抗生物素蛋白/AMCA偶連物，Jackson Imnunochemicals， 016-150-084，40001驢抗綿羊AMCA偶連物， Jackson Immunochemicals， 713-156-4732202驢抗山羊CY5偶連物， Jackson Immunochemicals， 705-156-147，38756山羊IgG，Jackson Immunochemicals， 005-000-002，38837綿羊IgG，Jackson Immunochemicals， 013-000-002，39945綿羊抗人白蛋白， Serotec， ABP102，210498小鼠單克隆抗人CD14/TriColor偶連物 PharmingenICAM PharmingenCD34/FITC偶連物 Pharmingen 34374XCD38/PE偶連物Pharmingen 31015XCD38/FITC偶連物Pharmingen 31014X血型糖蛋白A PE偶連物 Pharmingen 32591ACD 45/PE偶連物 Pharmingen 31255XCD 45/FITC偶連物 Pharmingen 31254X同種型對(duì)照IgGl PE Pharmingen 33815XIgG2 FITC Pharmingen 33814XKit PE偶連物 Caltag MHCK04兔抗人AFP-FITC偶連物Accurate未偶連的山羊抗人AFP ″ AXL625 0617氨基放線菌素D(7AAD)Mol Probes A-1310，4981-1在用于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞制品中使用的主要溶液BSA牛血清白蛋白(Pentex V)PBS＝磷酸鹽緩沖液；FBS＝胎牛血清；AFP＝甲胎蛋白含激素的Dulbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基HC_DMEM500mL DMEM，高葡萄糖無酚紅25mL胎牛血清(FBS)20mL 5mM EGTA胰島素(5μg/ml)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(5μg/ml)微量元素[硒(10-9M)，銅(10-7M)，鋅(5×10-11M)]抗生素(青霉素-100μg/ml，鏈霉素-100μg/ml)500mg牛血清白蛋白(BSA)30mg DNase38μl與BSA結(jié)合的游離脂肪酸溶液。通過帶0.2μm孔的Nalgene過濾器過濾滅菌。Hanks緩沖鹽溶液-改良型HBSS-mod50mL 10X HBSS10mL 1M Hepes青霉素-100μg/ml/鏈霉素-100μg/ml500mg BSA30mg DNase定容到400mLpH調(diào)到7.3最終定容到500mL0.2μm的無菌過濾用于免疫化學(xué)的封閉緩沖液100ml的HBSS_mod2.2mL 45％硬骨魚膠和0.8BSA0.5mL 1％皂苷溶于HBSS用于免疫熒光顯微鏡的固定介質(zhì)0.5mL 2X PBS0.25g n-丙基沒食子酸5.7g甘油冷凍肝臟組織制品用于流式細(xì)胞術(shù)的方法在37℃下迅速復(fù)蘇冷凍的肝臟組織。用HC-DMEM在冰上以每分鐘1mL的速度將各肝臟的冷凍小瓶(各含大約3mL的含5～10×106個(gè)細(xì)胞/mL的緩沖液)定容到10mL。然后在4℃下將樣品以1200RPM離心5分鐘。棄去上清，細(xì)胞沉淀重懸于5mL HC-DMEM中。反復(fù)洗滌細(xì)胞直到上清清澈。然后計(jì)數(shù)細(xì)胞并使用錐蟲藍(lán)染料排斥試驗(yàn)以血細(xì)胞計(jì)數(shù)器評(píng)估活力。按照實(shí)驗(yàn)方案將細(xì)胞分成多份。制備標(biāo)準(zhǔn)管用作含1～2×106個(gè)細(xì)胞之間的對(duì)照數(shù)據(jù)，通常通過從5～10×106/mL的細(xì)胞懸液中各取200μl實(shí)現(xiàn)。需要下列標(biāo)準(zhǔn)管1)OCS.由未染色的對(duì)照細(xì)胞組成的原始細(xì)胞懸液。
2)單獨(dú)的FITC用于補(bǔ)償調(diào)節(jié)。將5μL FITC-標(biāo)記的抗血型糖蛋白A加入200μl細(xì)胞懸液中。另一選擇是將FITC-標(biāo)記的CD34，CD38和CD45各7μl加入200μl細(xì)胞中的混合物。
3)單獨(dú)的PE用于補(bǔ)償調(diào)節(jié)。使用血型糖蛋白-PE(2μl到1mL的HC-DMEM且將其30μL加入200μL細(xì)胞中)。
4)單獨(dú)的7AAD用于補(bǔ)償。通過用2％低聚甲醛固定200μL細(xì)胞懸液并然后將5μl的100μM 7AAD和5μL去污劑(1％皂苷)加入在HBSS-mod中的1mL這些細(xì)胞懸液中可產(chǎn)生良好的信號(hào)。7AAD強(qiáng)烈染色透化處理的細(xì)胞。
5)單獨(dú)的Cy5用于補(bǔ)償。200μL固定的細(xì)胞(2％低聚甲醛)在2％山羊血清中培養(yǎng)40分鐘以便用綿羊IgG標(biāo)記細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞用Cy5偶連的驢抗山羊IgG(1∶800)培養(yǎng)40分鐘。
6)單獨(dú)的AMCA用于補(bǔ)償。與7AAD一樣，產(chǎn)生人工強(qiáng)信號(hào)用于補(bǔ)償調(diào)節(jié)。將200μL固定細(xì)胞(2％低聚甲醛)在2％綿羊血清中培養(yǎng)40分鐘以便用綿羊IgG標(biāo)記細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞用AMCA偶連的驢抗綿羊IgG(1∶800)培養(yǎng)90分鐘。
7)AMCA/Cy5對(duì)照。用AMCA-偶連的驢抗綿羊IgG和Cy5偶連的驢抗山羊IgG培養(yǎng)固定(2％低聚甲醛)和透化處理(0.05％皂苷)的細(xì)胞90分鐘。
8)單克隆同種型對(duì)照。用小鼠IgG1 PE偶連物和小鼠IgG2 FITC偶連物培養(yǎng)細(xì)胞。濃度應(yīng)與用于標(biāo)記分析和分選管的濃度匹配。
9)細(xì)胞內(nèi)同種型對(duì)照。用未免疫的綿羊IgG和山羊IgG培養(yǎng)固定(2％低聚甲醛)和透化處理(0.05％皂苷)的細(xì)胞90分鐘作為用于鑒定白蛋白和甲胎蛋白的抗體的對(duì)照。用Cy5偶連的驢抗山羊IgG和AMCA-偶連的驢抗綿羊IgG繼續(xù)培養(yǎng)90分鐘。
制備分選管用于獲得表達(dá)特定組合的CD標(biāo)記的選定細(xì)胞群體。正常情況下這些管含有50～70×106個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于1mL含有HC_DMEM+1％BSA+500 pM 7AAD(5μL的100μM貯液)的染色緩沖液中。根據(jù)細(xì)胞數(shù)將各15到25μL之間的CD 34 FITC，CD38 PE，或CD 45 PE加入染色緩沖液中(正常情況下每10×106個(gè)細(xì)胞3μL的Pharmingen抗體)。以1∶60的稀釋度加入抗c-Kit抗體，血型糖蛋白A以1∶500的稀釋度使用。在黑暗中在冰上染色40分鐘。染色后用HBSS-mod洗滌細(xì)胞兩次并用在PBS中的2％低聚甲醛在冰上固定30分鐘。
細(xì)胞內(nèi)染色用于細(xì)胞分選為了進(jìn)行細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)染色用于以流式細(xì)胞術(shù)分析甲胎蛋白(AFP)，將細(xì)胞懸液用在HBSS mod中的皂苷(Sigma S4521)0.05％的溶液在冰上透化處理10分鐘。然后將細(xì)胞在含有1％硬骨魚膠和0.8％BS和0.005％皂苷的HBSS_mod溶液中封閉20分鐘，接著用山羊抗人AFP和綿羊抗人白蛋白(均在封閉緩沖液中以1∶800稀釋)在黑暗中在室溫下培養(yǎng)90分鐘。細(xì)胞用含有0.01％皂苷的HBSS_mod洗滌兩次，接著用Cy5-偶連的驢抗山羊IgG和AMCA-偶連的驢抗綿羊IgG培養(yǎng)90分鐘。
另一選擇是，在第一抗體之后，細(xì)胞用生物素標(biāo)記的兔抗山羊IgG(在含有2％人血清和0.01％皂苷的封閉緩沖液中1∶500稀釋，在黑暗中室溫下培養(yǎng)90分鐘)培養(yǎng)。接著用含有0.01％皂苷的HBSS_mod洗滌兩次，然后用在0.01％皂苷/HBSS_mod中的9μg/mL鏈霉抗生物素蛋白/Cy5偶連物黑暗中室溫下培養(yǎng)90分鐘。最后，細(xì)胞用HBSS_mod洗滌兩次并重懸于HBSS_mod中，通過50μm的篩子過濾以去掉細(xì)胞團(tuán)塊用于在流式細(xì)胞器上分析和分選。
如果打算選擇肝祖細(xì)胞，免疫選擇包括去掉是多倍體和/或表達(dá)與肝臟成熟造血細(xì)胞相關(guān)的諸如紅血細(xì)胞上的血型糖蛋白A的標(biāo)記的細(xì)胞。另外展示出在所有成熟造血細(xì)胞上表達(dá)的CD45的細(xì)胞；展示出與成熟肝細(xì)胞相關(guān)的諸如在所有肝細(xì)胞和膽細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的連接蛋白32的標(biāo)記的細(xì)胞；和表達(dá)與成熟間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的諸如在肝星形細(xì)胞中的視網(wǎng)膜樣蛋白(retinoids)或馮.維勒布蘭德氏因子或內(nèi)皮中的因子8的標(biāo)記的細(xì)胞都被去掉。
分選的細(xì)胞群體的免疫組織化學(xué)染色流式細(xì)胞器分析和分選后染色細(xì)胞的甲胎蛋白。在含有1％BSA的0.3％HBSS-mod中收集分選的細(xì)胞餾分?；氐綄?shí)驗(yàn)室時(shí)，調(diào)節(jié)所收集的樣品的體積以提供0.5×106個(gè)細(xì)胞/mL且用Shandon細(xì)胞旋轉(zhuǎn)(Cytospin)器將200μL等分試樣旋轉(zhuǎn)到顯微鏡玻片上。細(xì)胞旋轉(zhuǎn)玻片標(biāo)本空氣干燥并貯存用于后來染色甲胎蛋白和/或白蛋白。用橡皮障圈住顯微鏡玻片上的附著細(xì)胞“盤”以產(chǎn)生一個(gè)“井”用于使用免疫組織化學(xué)試劑。玻片在含有0.3％Triton X的tris緩沖液(“低鹽”的含0.9％NaCl的10mM Tris，pH7.4)中浸泡10分鐘，接著在單獨(dú)的低鹽Tris中浸泡10分鐘。
然后細(xì)胞在上述含10％兔血清的硬骨魚膠封閉溶液中室溫下封閉90分鐘。在低鹽Tris中洗滌兩次后，細(xì)胞用在含有2％兔血清的封閉緩沖液中以1∶100稀釋的山羊抗人AFP抗體4℃下培養(yǎng)過夜。在Tris緩沖液中洗滌兩次后，接著用在封閉緩沖液中的生物素標(biāo)記的兔抗山羊IgG(1∶200)室溫下培養(yǎng)90分鐘。用鏈霉抗生物素蛋白/AMCA復(fù)合物(以9μg/mL存在于低鹽Tris緩沖液中)的最終培養(yǎng)用于通過AMCA熒光染料與生物素標(biāo)記的兔抗體的結(jié)合定位AFP-樣免疫反應(yīng)。用Tris緩沖液洗滌兩次后，使得細(xì)胞制品接近干燥，之后在抗褪色封固培養(yǎng)基(0.25g n-丙基沒食子酸在含1mL PBS的5.7g甘油中)上蓋上蓋玻片。當(dāng)復(fù)染合適細(xì)胞的白蛋白時(shí)，使用包括德克薩斯紅偶連的兔抗人抗白蛋白抗體與第一抗甲胎蛋白抗體。
通過刪去第一或第二抗體制備對(duì)照玻片以證實(shí)在沒有抗甲胎蛋白的抗體或生物素標(biāo)記的第二抗體時(shí)細(xì)胞沒有AMCA標(biāo)記。使用紫外激發(fā)發(fā)射藍(lán)光(450nm)區(qū)光的AMCA染料用表面熒光顯微鏡術(shù)檢查玻片。
借助于細(xì)胞和/或基因治療的肝臟再生本發(fā)明具有治療諸如下列疾病的直接實(shí)踐應(yīng)用克-納二氏綜合征，杜-約(Dubin-Johnson)綜合征，酪氨酸血癥，肝硬化，纖維變性，脂肪肝，肝炎，急性肝臟衰竭，慢性肝臟衰竭，肝膽管炎，肝軟化，肝大，肝癌，肝胚細(xì)胞瘤，或其組合。本實(shí)施例的其它肝臟疾病和肝臟疾病的其它相關(guān)例子同樣適合作為本療法的候選者且包括阿拉惹綜合征，酒精肝疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，自身免疫肝炎，巴德-希阿里綜合征，膽閉鎖，Byler疾病，諸如肝外膽管癌和肝細(xì)胞癌的癌癥，Caroli疾病，半乳糖血癥，吉爾伯綜合征，糖原存儲(chǔ)疾病，血管瘤，血色病，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，戊型肝炎，庚型肝炎，肝臟移植，遲發(fā)性皮膚血卟啉病，原發(fā)性膽肝硬化，原卟啉癥，紅細(xì)胞肝病，羅托綜合征，硬化膽管炎，和肝豆?fàn)詈俗冃?。肝臟的先天性遺傳疾病也是可矯正的。例如，遺傳性疾病苯丙酮酸尿(PKU)由嬰兒不能使用氨基酸苯丙氨酸引起。如果早期不治療，PKU會(huì)導(dǎo)致大腦和神經(jīng)損傷和智力遲鈍。在生命的前幾周開始特別低蛋白的飲食是目前唯一可能的治療方法?？蛇m用這種形式的療法的其它靶基因及其相關(guān)肝臟疾病的例子包括，但不限于，家族性高膽固醇血癥中的LDL受體基因，血友病中的因子VIII和IX的凝血因子基因，肺氣腫中的α-1-抗胰蛋白酶基因，苯丙酮酸尿中的苯丙氨酸羥化酶基因，血氨過多中的鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因，和在各種補(bǔ)體缺陷形式中的補(bǔ)體蛋白基因。
由于人尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)可激活跨種的纖溶酶原，因此為了誘導(dǎo)肝臟再生可構(gòu)建從RSV-LTR啟動(dòng)子表達(dá)人尿激酶的重組腺病毒載體Ad-RSV-uPA。僅僅以例證的方式選擇了該基因，因?yàn)榘ǖ幌抻谙铝谢虻娜魏纹渌康幕蛲瑯邮呛线m的甲氨酰合成酶I，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，苯丙氨酸羥化酶，α-1-抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，低密度脂蛋白受體，膽色素原脫氨酶，因子VIII，因子IX，胱硫醚β-合成酶，支鏈酮酸脫羧酶，白蛋白，異戊酰-CoA脫氫酶，丙酰CoA羧化酶，甲基丙二酰CoA變位酶，戊二酰CoA脫氫酶，胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧化酶，肝臟磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脫羧酶，H-蛋白，T-蛋白，Menkes疾病蛋白，或肝豆?fàn)詈俗冃曰騪WD的產(chǎn)物，和/或CFTR。
為了構(gòu)建和產(chǎn)生重組腺病毒載體，按如下方法制備人uPA的cDNA。將含有該蛋白質(zhì)編碼序列的1.326kb HindIII/Asp718 uPA片斷插入pXCJL.1中在Rous肉瘤病毒LTR(RSV)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的且在牛生長激素多聚腺苷化信號(hào)上游的HindIII/Asp718位點(diǎn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇肝臟細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，例如乙肝啟動(dòng)子，甲肝啟動(dòng)子，丙肝啟動(dòng)子，白蛋白啟動(dòng)子，α-1-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子，丙酮酸激酶啟動(dòng)子，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子，運(yùn)甲狀腺素蛋白啟動(dòng)子，甲胎蛋白啟動(dòng)子，α-纖維蛋白原啟動(dòng)子，和β-纖維蛋白原啟動(dòng)子等許多其它合適的啟動(dòng)子。
在用pJMI7和命名為Ad-RSV-uPA的載體共轉(zhuǎn)染后制備病毒。通過在293細(xì)胞中擴(kuò)增單個(gè)噬菌斑進(jìn)行Ad-RSV-uPA的篩選。感染3天后以ELISA檢測(cè)上清的免疫學(xué)反應(yīng)性u(píng)PA和以纖維蛋白噬斑試驗(yàn)檢測(cè)纖維蛋白裂解活性證實(shí)Ad-RSVuPA感染時(shí)產(chǎn)生uPA的催化活性。純化的病毒以等分試樣貯存在-80℃并在注射前用HgDMEM培養(yǎng)基立即稀釋。通過OD測(cè)量和標(biāo)準(zhǔn)噬斑試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度。載體的構(gòu)建基本上按美國專利號(hào)5,980,886所述進(jìn)行，本文引用以供參考。病毒在208F細(xì)胞中滴定。
年齡為5至6周的C57BL/6雌性小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)在無特定病原體的環(huán)境中圈養(yǎng)。從安樂死的小鼠獲得各種時(shí)間期限的局部缺血肝臟樣品且按上文所述分離肝臟祖細(xì)胞。對(duì)于門靜脈插管，通過腹膜內(nèi)施用0.5ml 20mg/ml的2，2，2-三溴乙醇麻醉受體小鼠。做一個(gè)腹部中線切口并分離皮膚與腹膜以產(chǎn)生一個(gè)皮下袋。打開腹膜并暴露門靜脈。在門靜脈中插入硅氧烷管(0.02″I.D.，0.037″O.D.，S/P Medical Grade，Baxter，III.)并用含肝素的鹽水灌流。之后將插管穿過腹膜并用4.0絲縫合固定。3cm長的插管在末端結(jié)扎并放在皮下以前產(chǎn)生的袋中。在不早于24小時(shí)之后給小鼠提供病毒感染的祖細(xì)胞。在一些小鼠中門靜脈插管與2/3肝切除術(shù)一起進(jìn)行。然后進(jìn)行部分肝切除術(shù)。為了灌流門靜脈，麻醉小鼠，在已存在的腹部切口的鄰近位置打開皮膚。暴露插管并連接到注射器泵上。為了進(jìn)行病毒灌注，將在DMEM中的腺病毒制品在5到10分鐘內(nèi)通過插管注射進(jìn)門靜脈。為達(dá)到細(xì)胞治療的目的，可使用任何細(xì)胞群體作為自體或同種異體材料并移植進(jìn)諸如本實(shí)施例的情況的患者的特定靶器官或其附近。細(xì)胞可在任意合適的培養(yǎng)基，載體或稀釋劑或包括微載體，珠，微粒體，微球體，囊泡等的任何類型的藥物傳遞系統(tǒng)中移植。
在腺病毒感染的肝祖細(xì)胞通過插管注射進(jìn)門靜脈后進(jìn)行所有生物化學(xué)和組織學(xué)分析。對(duì)uPA的ELISA試驗(yàn)以針對(duì)uPA的催化結(jié)構(gòu)域和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)不同單克隆抗體為基礎(chǔ)。一個(gè)單克隆抗體用過氧化物酶標(biāo)記。在臨床病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室中以常規(guī)自動(dòng)方法分析血清總蛋白和白蛋白。已知腺病毒灌注進(jìn)C57BI/6小鼠的門靜脈導(dǎo)致100％的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，每個(gè)細(xì)胞有超過1拷貝的腺病毒DNA。相同劑量的Ad-RSV-uPA導(dǎo)致90％的死亡率，至少部分與出血相關(guān)。當(dāng)使用較低劑量的Ad-RSV-uPA時(shí)，死亡率不超過5％且選擇該劑量用于肝臟再生實(shí)驗(yàn)。灌注Ad-RSV-uPA導(dǎo)致血清尿激酶瞬時(shí)升高，在4天后達(dá)到大約350ng/ml的峰值(比內(nèi)源性水平高70到100倍)，到第12天下降到背景濃度。uPA的升高也與血清SGPT濃度的升高相關(guān)。在腺病毒灌注后不同的時(shí)間時(shí)，用3H-胸苷灌注動(dòng)物，并測(cè)定摻入肝臟DNA的放射性量作為定量細(xì)胞增殖的方法。用AdRSV-uPA處理的動(dòng)物胸苷攝入的增加時(shí)期在第3天開始且持續(xù)8天。因此，用Ad-RSV-uPA/卵形細(xì)胞處理時(shí)肝臟3H-胸苷攝入的時(shí)期比用只有部分肝切除術(shù)獲得的長得多。陰性對(duì)照腺病毒的受體顯示出在第4天達(dá)到肝臟3H-胸苷攝入峰值，其在24小時(shí)后回到基線水平且在第11天3H-胸苷攝入增加最小。總之，通過SGPT水平測(cè)量肝臟反應(yīng)且3H-胸苷攝入的高速率歸功于肝內(nèi)尿激酶生產(chǎn)表明發(fā)生了明顯的肝臟生物合成性再生。無uPA灌注的肝祖細(xì)胞比無uPA插入的腺病毒更好。
用重組腺病毒/來自無心跳的尸體供體的祖細(xì)胞處理的動(dòng)物的顯微鏡組織學(xué)發(fā)現(xiàn)表明到第3天，處理的小鼠具有含有巨噬細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞的中度炎癥性浸潤。肝細(xì)胞中的退化改變包括空泡形成，致密且較少有絲分裂的細(xì)胞核。施用Ad-RSV-uPA/卵形細(xì)胞8至10天后，有肝臟恢復(fù)的證據(jù)，包括存在多病灶再生，異源性大小的細(xì)胞核和大量減少的炎癥反應(yīng)以及較少的退化肝細(xì)胞。到3至4周，浸潤消散且肝臟出現(xiàn)正常。
總之，這些研究表明尿激酶表達(dá)與肝祖細(xì)胞結(jié)合誘導(dǎo)明顯的肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞再生。
生物反應(yīng)器使用高效生物反應(yīng)器(HPBR)培養(yǎng)從尸體供體分離的人肝細(xì)胞祖細(xì)胞。該方法可提供大量細(xì)胞進(jìn)一步用于醫(yī)學(xué)目的或生物反應(yīng)器，該生物反應(yīng)器自身可用作生物學(xué)上有用的細(xì)胞分泌蛋白和因子的生產(chǎn)裝置，該因子可包括但不限于肝細(xì)胞生長因子(HGF)，胰島素樣生長因子-I和II(IGF-I和II)，表皮生長因子(EGF)，a型和b型轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α和TGF-β)，神經(jīng)生長因子(NGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(PDGF)，肉瘤生長因子(SGF)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激生長因子(GM-CSF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，催乳激素和生長激素釋放因子(GHRF)和各種造血生長因子，例如白介素(IL)IL-1，IL2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，等，紅細(xì)胞分化因子(EDF)或促卵泡激素釋放蛋白(FRP)，抑制素，干細(xì)胞增殖因子(SCPF)及這些蛋白質(zhì)的活性片斷，亞基，衍生物和其組合等本領(lǐng)域已知的許多其它因子。一般來說，本文所用的這些細(xì)胞因子是指選自細(xì)胞因子，淋巴因子，白介素，集落刺激因子，激素，趨化因子，抗趨化因子，凝血因子，溶栓蛋白，補(bǔ)體蛋白，酶，免疫球蛋白和抗原的分泌蛋白。在該生物學(xué)活性蛋白中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇因子VIII，因子IX，因子VII，紅細(xì)胞生成素，α-1-抗胰蛋白酶，降鈣素，生長激素，胰島素，低密度脂蛋白，載脂蛋白E，IL-2受體和其拮抗劑，過氧化物歧化酶，免疫反應(yīng)修飾劑，甲狀旁腺激素，干擾素(IFNα，β，或γ)，神經(jīng)生長因子，葡糖腦苷脂酶，集落刺激因子，白介素(IL)1至15，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板產(chǎn)生的生長因子(PDGF)，腺苷脫氨酶，胰島素樣生長因子(IGF-1和IGF-2)，巨核細(xì)胞啟動(dòng)配體MPL，血小板生成素，或其組合。
不局限于在生物反應(yīng)器中生長細(xì)胞的該具體方案，在本領(lǐng)域的方法中其它已知的方案是同樣合適的且可容易地從公開的美國專利號(hào)6,001,585；5,998,184；5,846,817；5,622,857；5,571,720；5,563,068；5,512,474；5,443,985；5,342,781；5,330,915；5,320,963；5,202,254；4,833,083；和4,760,028中采用，本文引用以供參考。
本裝置含有450 10kD的纖維素纖維和540聚丙烯纖維，其它參數(shù)的詳情參見，例如美國專利號(hào)5,622,857，本文引用以供參考。按上述分離細(xì)胞。所有必須材料從Sigma Chemical Co.或者LifeTechnologies獲得。長期培養(yǎng)基的附著培養(yǎng)基如下RPMI 1640(500mL)；50mL(10％)FBS；4mM L-谷酰胺；1x青霉素/鏈霉素；慶大霉素；15mM HEPES；10mU/mL胰島素；10mU/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白；硒；在使用附著培養(yǎng)基前用培養(yǎng)基沖洗HPBr系統(tǒng)1天。將500mg預(yù)先膨脹的Cytodex 3微載體接種到HPBr的內(nèi)部環(huán)形空間。充氧器纖維作為微載體的支架且防止它們分布在整個(gè)ECS中。將活的人肝細(xì)胞祖細(xì)胞也接種進(jìn)內(nèi)部環(huán)形空間，用手搖動(dòng)和旋轉(zhuǎn)裝置以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與微載體的均勻混合。假定肝細(xì)胞直徑在10-20μm之間，細(xì)胞與微載體的接種量比率為大約500。細(xì)胞和微載體的表觀粘稠度迅速增加，表明細(xì)胞與微載體和細(xì)胞與細(xì)胞的附著正迅速且正常地進(jìn)行著。在該混合2-3分鐘內(nèi)，在內(nèi)部環(huán)形空間形成細(xì)胞與微載體的離散型凝膠。在附著培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)(以靜止?fàn)顟B(tài))過夜后，將培養(yǎng)基換成長期培養(yǎng)基(2L)。不以任何方式局限于這些體積，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地按比例確定生產(chǎn)以達(dá)到所需水平。肝細(xì)胞培養(yǎng)5周，每周給系統(tǒng)更換新鮮培養(yǎng)基。通過每天檢測(cè)樣品監(jiān)測(cè)細(xì)胞的代謝功能。5周后，通過下列程序獲得大于90％的活細(xì)胞和載體回收率使用與0.44mL(0.23M)EDTA混合的在PBS中的0.1％膠原酶沖洗培養(yǎng)的ECS和HPBr10分鐘；用注射筒的無菌空氣排出ECS的內(nèi)含物；用長期培養(yǎng)基重復(fù)該過程且洗滌和分離所收集的材料。
HPBr同樣適合于細(xì)胞的培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化(例如，HGF基因表達(dá))。下面是用于固著依賴型細(xì)胞(例如，SW 480 P3；ATCC#CCL228)的遺傳無病毒方案，該方案可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員從使用培養(yǎng)孔和培養(yǎng)皿的公開方法適當(dāng)改良和優(yōu)化。在HPBr中優(yōu)選具有10kD性質(zhì)的培養(yǎng)纖維。按上文所述以幾乎相同的方式操作該生物反應(yīng)器。Cytodex 1微載體(Pharmacia，Sigma Chemical Co.銷售)廣泛用于培養(yǎng)固著依賴型細(xì)胞?？蓪⒋蠓秶募?xì)胞密度接種進(jìn)HPBr的ECS中，密度范圍為按需要從1×104到1×1015個(gè)細(xì)胞或更高。推薦的細(xì)胞與微載體的接種量比率是大約10的范圍，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員可按需要進(jìn)行修改。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中以大約10cpm(或更大)輕輕旋轉(zhuǎn)該裝置。培養(yǎng)細(xì)胞大約1天(或者更長，取決于具體細(xì)胞)后，達(dá)到最佳匯合以獲得有效轉(zhuǎn)染?？烧{(diào)節(jié)細(xì)胞與微載體接種量的比率以明確影響為治療和經(jīng)濟(jì)效率進(jìn)行的時(shí)間設(shè)計(jì)。在轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，制備DNA質(zhì)粒溶液(例如，pCMV)和陽離子脂類溶液(例如，LIPOFECTIN試劑，LifeTechnologies)。這些試劑必須是無血清的，即使總體過程需要存在血清?；旌虾线m量的DNA和脂類溶液，然后將混合物注射進(jìn)裝置的ECS中。轉(zhuǎn)染大約幾個(gè)(和甚至好幾個(gè))小時(shí)后，如果合適，可恢復(fù)使用血清，且繼續(xù)按以前培養(yǎng)大約幾天。當(dāng)擴(kuò)增永久轉(zhuǎn)化的細(xì)胞時(shí)可使用更長的時(shí)間。按與前面所述相似的方式收獲細(xì)胞。
人造肝臟作為上面實(shí)施例的延伸，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地采用該生物反應(yīng)器作為體外肝臟支持系統(tǒng)。異種移植(種間器官移植)通過使用動(dòng)物器官可幫助緩解供體肝臟短缺。然而將動(dòng)物器官移植進(jìn)人類的潛在危險(xiǎn)是感染供體動(dòng)物的病毒可能會(huì)感染受體。由于器官移植受體可能服用藥物以抑制免疫系統(tǒng)和防止器官排斥，因此他們不能抵抗感染的動(dòng)物病毒。另外，動(dòng)物病毒可在感染的宿主中變異成可感染具有正常免疫系統(tǒng)的人類的形式。結(jié)果，可能產(chǎn)生一種新的致病性人類病毒。體外肝臟支持系統(tǒng)可克服這些缺點(diǎn)。用于人類器官移植的優(yōu)選動(dòng)物種類是豬和靈長類。然而，很明顯如果可獲得以人細(xì)胞為基礎(chǔ)的人造肝臟，它會(huì)優(yōu)于動(dòng)物肝臟。
在培養(yǎng)所需時(shí)間后，獲得來自尸體肝臟祖細(xì)胞的成熟肝細(xì)胞。按常規(guī)獲得20至50億個(gè)高(超過80％)活力的細(xì)胞。一般來說，使用的培養(yǎng)基是補(bǔ)充了激素的Waymouth培養(yǎng)基。為了供應(yīng)20到50億個(gè)細(xì)胞，生物反應(yīng)器按比例擴(kuò)充到兩個(gè)節(jié)制容器，每個(gè)具有40mm的內(nèi)部直徑和100mm的高度。在該具體情況下每個(gè)節(jié)制容器使用直徑大約2mm且總體積250ml的玻璃珠。以360ml/分鐘的循環(huán)速率供應(yīng)培養(yǎng)基。以穩(wěn)定的耗氧率證實(shí)肝細(xì)胞的高活力。然后將該生物反應(yīng)器固著在由于全部肝臟衰竭而通過手術(shù)去掉了肝臟的無肝臟的人類受體上。另外，可以不去掉肝臟，但該生物反應(yīng)器會(huì)幫助機(jī)能障礙的肝臟更好地恢復(fù)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)知道作為體外肝臟支持系統(tǒng)的生物反應(yīng)器的固著方法或者會(huì)知道本領(lǐng)域已知的替代方法，例如在美國專利號(hào)6,008,049；5,981,211；5,976,870；5,891,713；5,827,729；5,643,794；5,622,857；5,605,835；和5,270,192中所述，本文分別引用其各自的全文以供參考。根據(jù)這些參考文獻(xiàn)很明顯供體人造肝臟的細(xì)胞不必局限于人類，該細(xì)胞的跨種使用現(xiàn)在是可能的。例如，來自豬或靈長類的肝臟細(xì)胞同樣適合于人類使用。
將來自左股動(dòng)脈的血液導(dǎo)入Minntech血濃縮器中。將12 fringeelecath插管插入股動(dòng)脈中并以1/4″PVC管道連接到血濃縮器上。血濃縮器將血液分成無細(xì)胞的超濾液部分和血細(xì)胞部分。血細(xì)胞部分通過相似的管道返回股靜脈。超濾液通過1/4″PVC管道流出血濃縮器并使用滾動(dòng)泵調(diào)到40ml/分鐘的流速進(jìn)入肝細(xì)胞生物反應(yīng)器系統(tǒng)。灌流通過生物反應(yīng)器后，超濾液經(jīng)過左頸靜脈返回病人。為了證實(shí)體外肝臟代謝的提供，在生物反應(yīng)器的入口向超濾液中施加已知被肝臟代謝的兩種不同化學(xué)品7-乙氧基香豆素和利多卡因。在超濾液返回病人前在生物反應(yīng)器的出口測(cè)量各自的代謝物，7-OH-香豆素和monoethylglycinexylidide(MEGX)。觀察到7-乙氧基香豆素和利多卡因都被明顯代謝。因此該結(jié)果證實(shí)使用生物反應(yīng)器作為支持系統(tǒng)可提供體外肝臟代謝。分離血細(xì)胞與血漿使受體對(duì)外源性肝細(xì)胞的免疫學(xué)反應(yīng)最小化。因此，來自人類供體的肝細(xì)胞，如在我們的例子中從尸體獲得的肝臟細(xì)胞和諸如豬的非人來源可用于生物反應(yīng)器以提供體外肝臟支持。
非肝臟細(xì)胞的尸體祖細(xì)胞本發(fā)明還涉及從非肝臟的組織獲得富含祖細(xì)胞的細(xì)胞群體的方法。該組織的例子包括但不限于腎上腺，血管，骨髓，角膜，胰島，膽管，晶狀體，肺，腎，心臟，腸，卵巢，胰腺，甲狀旁腺，松果體，腦垂體，皮膚，睪丸，膀胱，腦，脊髓，胸腺，或甲狀腺。
提供了下列實(shí)施例作為一般性策略，可根據(jù)具體需要對(duì)其進(jìn)行修改而不改變本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)。在一個(gè)舉例性的實(shí)施方案中，提供受試者祖細(xì)胞用于患有任何胰島素缺陷疾病的病人。
在這些研究中使用了胎兒和非胎兒尸體。放血后，原位鑒定總膽管(CBD)，取出并放入Dulbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)溶液中。然后通過用鑷子解剖取出相連的胰腺腺泡和胰島出口以及附著的血管。然后將CBD，與其相連的分支，主要胰腺管一起橫切成大約300μm長的微器官外植塊或逐個(gè)分散的單細(xì)胞。然后將這些樣品在添加了生長因子，含有或不含1型膠原蛋白或基質(zhì)膠作為生長底物的DMEM中培養(yǎng)。通過響應(yīng)細(xì)胞將溴化脫氧尿苷(BrdU)摻入DNA來判斷生長因子刺激增生的效力。使用抗BrdU的抗體來觀察和鑒定短期反應(yīng)(24-48小時(shí))。通過作為特定生長因子添加的結(jié)果這些細(xì)胞群體在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長和增殖的能力來判斷長期反應(yīng)。以1ng/ml，10ng/ml和100ng/ml的濃度使用三種不同的生長因子(EGF，TGF-α，和bFGF)來區(qū)分祖細(xì)胞。通過BrdU標(biāo)記評(píng)估到的增殖激活在施用10ng/ml生長因子EGF時(shí)在24小時(shí)的時(shí)間長度內(nèi)出現(xiàn)。在10和100ng/ml劑量之間沒有觀察到區(qū)別。向CBD組織外植塊中加入EGF導(dǎo)致不同細(xì)胞的增殖和這些細(xì)胞的聚簇。初步的長期生長實(shí)驗(yàn)表明CBD尸體組織內(nèi)確實(shí)存在較大的增殖潛力且可在培養(yǎng)基中維持至少21天。
用于治療肝臟疾病的祖細(xì)胞d-半乳糖胺是一種能誘導(dǎo)相似于人類病毒性肝炎損害的損傷的化合物并用于誘導(dǎo)肝炎模型。四氯化碳通過肝臟細(xì)胞中藥物代謝酶系統(tǒng)的作用產(chǎn)生具有極高反應(yīng)性的游離基團(tuán)，且這些游離基團(tuán)通過與肝臟細(xì)胞膜蛋白結(jié)合強(qiáng)烈抑制細(xì)胞活性或可引起細(xì)胞器膜脂類的過氧化作用，從而導(dǎo)致肝臟細(xì)胞的壞死和肝臟脂肪的累積。因此，這些化合物廣泛用作急性藥物誘導(dǎo)的諸如脂肪肝，慢性肝炎和肝硬化的人類肝炎的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 因此，在本實(shí)施例中，本發(fā)明人按照美國專利號(hào)4,898,890(本文引用以供參考)中詳細(xì)報(bào)道的方法進(jìn)行了試驗(yàn)以證實(shí)根據(jù)本發(fā)明的尸體祖細(xì)胞的效力。每千克體重250mg的d-半乳糖胺溶于每千克體重5ml的生理鹽溶液中經(jīng)過腹膜內(nèi)注射各重180至200g的Wistar品系的雄性大鼠。通過以自動(dòng)分析器測(cè)量谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)，谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)，和ALP來檢查血液樣品的血清。除了安慰劑組中的大鼠用培養(yǎng)基安慰劑溶液代替祖細(xì)胞懸液給藥外，以完全相同于將大約1-5×104-107個(gè)肝臟尸體祖細(xì)胞直接施用到損傷肝臟的小組的方式處理誘導(dǎo)肝臟損傷的安慰劑對(duì)照組。在另一系列的實(shí)驗(yàn)中，用四氯化碳代替來損傷大鼠肝臟。當(dāng)與未損傷的對(duì)照組相比時(shí)誘導(dǎo)肝臟損傷的動(dòng)物顯示出GOT，GPT，和ALP明顯增加。當(dāng)與未用肝祖細(xì)胞處理的誘導(dǎo)肝臟損傷的對(duì)照相比時(shí)，用祖細(xì)胞處理的大鼠證實(shí)GOT，GPT，和ALP的增加受到顯著抑制。該結(jié)果表明祖細(xì)胞抑制或甚至逆轉(zhuǎn)且肯定防止d-半乳糖胺和四氯化碳誘導(dǎo)的肝臟損傷。
一個(gè)11歲的女孩患有肝臟疾病高膽紅素血癥，引起一種由肝臟產(chǎn)生的物質(zhì)膽紅素在其血液中過量積聚，作為治療，她每天需要在紫外光下度過12至15小時(shí)，一種稱為光線療法的過程。將來自尸體供體的肝細(xì)胞直接移植進(jìn)其肝臟(門靜脈)后，注意到其膽紅素水平顯著下降，盡管她仍然需要花費(fèi)大約4到6小時(shí)進(jìn)行光線療法，但她現(xiàn)在已起作用。
因此，這種尸體肝祖細(xì)胞的應(yīng)用可用于預(yù)防和治療包括但不限于病毒性肝炎，脂肪肝，慢性肝炎，纖維變性和肝硬化的肝臟機(jī)能障礙和損傷。另外很清楚本方法允許預(yù)防和/或治療由諸如化學(xué)療法，或藥物濫用，或者酗酒的其它原因引起的肝臟代謝機(jī)能障礙和/或損傷。有許多藥物和物質(zhì)具有引起肝臟損傷的傾向，它們包括但不限于止痛劑，退熱劑，消炎藥物，和抗風(fēng)濕病藥物，例如，對(duì)乙酰氨基酚，阿斯匹林，保泰松，舒林酸，異丁芬酸，金化合物等?？股匕被疹?，多肽，頭孢菌素，青霉素，四環(huán)素等?；焺┗前匪幬铮悷熾碌?。抗癌藥絲裂霉素C，順式鉑氨，6-MP，亞硝基脲等。麻醉劑鹵烷，甲氧氟烷等。治療精神病藥物氯丙嗪，安定，巴比妥等。利尿劑噻嗪類等。
這些及其它有用的應(yīng)用對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的?？深A(yù)見的肝臟疾病的具體例子包括但不限于阿拉惹綜合征，酒精肝疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，自身免疫肝炎，膽閉鎖，膽管缺乏，骨髓衰竭，巴德-希阿里綜合征，Byler疾病，克-納二氏綜合征，Caroli疾病，膽汁郁積瘙癢癥，膽石病，接合高膽紅素血癥，慢性移植物與宿主疾病，原因不明性肝疾病，糖尿病，杜-約綜合征，紅細(xì)胞肝性原卟啉癥，肝外膽管癌，家族性高膽固醇血癥，半乳糖血癥，吉爾伯綜合征，糖原存儲(chǔ)疾病，血管瘤，血色病，肝腦病，肝膽管炎，肝軟化，肝大，肝癌，肝胚細(xì)胞瘤，遺傳性血色病，黃膽，肝內(nèi)膽汁郁積，肝囊腫，肝移植，與Bacillus cereus相關(guān)的肝衰竭，混合型冷球蛋白血癥，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲?；溉毕?，紫癜肝病，遲發(fā)性皮膚血卟啉病，原發(fā)性膽肝硬化，頑固性腹水，羅托綜合征，肉樣瘤病，硬化性膽管炎，皮脂腺病，Summerskill綜合征，血小板減少癥，酪氨酸血癥，靜脈曲張性出血，肝臟靜脈閉合疾病，和肝豆?fàn)詈俗冃浴?br> 祖細(xì)胞的制備本實(shí)施例提供了分離定向和未定向肝臟祖細(xì)胞的步驟。盡管各種技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，但仍然詳細(xì)公開了一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案且應(yīng)明白其它的制備技術(shù)同樣是適合的，只要它們與所需目標(biāo)相適應(yīng)。例如，優(yōu)選的非限制性技術(shù)參見美國專利號(hào)5,807,686，5,916,743，5,672,346，5,681,559，5,665,557，5,672,346，和5,663,051，本文引用以供參考。
使用Percoll或者諸如Histopaque的其它合適的密度梯度可初步分離多能或定型肝細(xì)胞，即低密度的肝臟細(xì)胞，離心后用培養(yǎng)基洗滌兩次且重懸于10ml淘洗培養(yǎng)基中。對(duì)于逆流淘洗，經(jīng)過將取樣位點(diǎn)偶連到裝配有JE-5轉(zhuǎn)子和標(biāo)準(zhǔn)室的Beckman J6M/E離心機(jī)的入口液流上注射洗滌的低密度單核細(xì)胞。然而，可使用任何商品連續(xù)流動(dòng)的離心機(jī)和淘洗機(jī)，優(yōu)選采用包括室裝置的一次性塑料插管以利于以密度為基礎(chǔ)的分離，例如，使用Deerfield，IL的BaxterInternational Inc.銷售的“Fenwal Models CS 3000”和“Autopheresis C”；Cobe manufacturing of Lakewood，CO.銷售的“IBM Model 2997”。儀器的選擇取決于本領(lǐng)域的技術(shù)人員。蠕動(dòng)泵(Cole Palmer Instruments，Chicago，IL)提供了淘洗培養(yǎng)基的連續(xù)流動(dòng)，該培養(yǎng)基是含有100mg/dl D-葡萄糖，0.3mM乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉和50mg/dl牛血清白蛋白且pH調(diào)到7.2的0.9％生理鹽溶液。用前滅菌該培養(yǎng)基。以15ml/分鐘的總體流速，900g的轉(zhuǎn)速室溫下傳遞細(xì)胞。收集100ml的洗脫物后，流速增加到25ml/分鐘。轉(zhuǎn)速保持恒定，流速依次增加到29ml/分鐘，33ml/分鐘，和37ml/分鐘，每次增加時(shí)收集200ml。通過卸下轉(zhuǎn)子并用100ml淘洗培養(yǎng)基沖洗室捕獲室中保留的細(xì)胞。洗滌各細(xì)胞餾分并以300g離心10分鐘。收集合適的餾分，以錐蟲藍(lán)染料排斥法測(cè)定活力并用細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Coulter Electronics，Hialeah，F(xiàn)L)測(cè)定細(xì)胞回收率。
作為選擇，肝臟細(xì)胞可不通過密度梯度分離處理并懸浮于含有5％胎牛血清，0.01％EDTA重量/體積，1.0g/1 D-葡萄糖的磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.4中，且使用JA-17轉(zhuǎn)子和標(biāo)準(zhǔn)分離室(BeckmanInstruments)在10℃下以1,950rpm的轉(zhuǎn)速直接注射進(jìn)Beckman逆流離心淘洗系統(tǒng)中，樣品以12到14ml/分鐘之間的流速洗脫。因此該方法是通用的且不必依賴于密度梯度分離。
在合適餾分中獲得的祖細(xì)胞一般具有8.0到9.4微米范圍的細(xì)胞直徑；大多數(shù)細(xì)胞具有落入8.3至9.2微米范圍內(nèi)的直徑。這些直徑根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)測(cè)量。如果需要，可進(jìn)一步進(jìn)行基于細(xì)胞標(biāo)記的陽性或陰性選擇。
可單獨(dú)使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種其它抗體或與上述肝臟祖細(xì)胞標(biāo)記結(jié)合使用。該選擇取決于需要分離或富集的細(xì)胞類型且包括但不限于，對(duì)造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞抗原特異性的抗體，例如，對(duì)T-細(xì)胞特異性的抗-CD2，抗-CD2R，抗-CD3，抗-CD4，抗-CD5和抗-CD8；對(duì)T-細(xì)胞亞群和B-細(xì)胞亞群特異性的抗-CD6；對(duì)大多數(shù)T-細(xì)胞亞群特異性的抗-CD7；對(duì)B-細(xì)胞特異性的抗-CD12，抗-CD19和抗-CD20，抗-CD72，抗-CDw78；對(duì)單核細(xì)胞特異性的抗-CD13和抗-CD14；對(duì)天然殺傷細(xì)胞特異性的抗-CD16和抗-CD56；對(duì)血小板特異性的抗CD41；對(duì)皮質(zhì)胸腺細(xì)胞和胰島細(xì)胞特異性的抗-CD1a，CD1b和CD1c；對(duì)前體B-細(xì)胞，單核細(xì)胞和血小板特異性的抗-CD9；對(duì)淋巴祖細(xì)胞，C-A11和粒細(xì)胞特異性的抗-CD10；白細(xì)胞特異性的抗-CD11a；粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞特異性的抗-CD11b；對(duì)單核細(xì)胞，粒細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞和多毛細(xì)胞白血病特異性的抗-CD11c；粒細(xì)胞特異性的抗-CD15；粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和血小板特異性的抗-CDw17；白細(xì)胞特異性的抗-CD18；成熟B-細(xì)胞特異性的抗-CD21；B-細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和成熟B-細(xì)胞特異性的抗-CD22；激活的B-細(xì)胞特異性的抗-CD23；B-細(xì)胞和粒細(xì)胞特異性的抗-CD24；激活的T-細(xì)胞和B-細(xì)胞和激活的巨噬細(xì)胞特異性的抗-CD25和抗-CD26；主要T-細(xì)胞亞群特異性的抗-CD27和抗-CD28；激活的T-細(xì)胞和B-細(xì)胞和Sternberg Reed細(xì)胞特異性的抗-CD30；血小板，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞和B-細(xì)胞特異性的抗-CD31；巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞，B-細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞特異性的抗-CDw32；單核細(xì)胞，骨髓祖細(xì)胞和骨髓白血病特異性的抗-CD33；造血前體細(xì)胞特異性的抗-CD34；粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，B-細(xì)胞，一些NK細(xì)胞，和紅細(xì)胞特異性的抗-CD35；單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和血小板特異性的抗-CD36；成熟B-細(xì)胞特異性的抗-CD37；血漿細(xì)胞，胸腺細(xì)胞和激活的T-細(xì)胞特異性的抗-CD38；成熟B-細(xì)胞特異性的抗-CD39；B-細(xì)胞和癌特異性的抗-CD40；血小板和巨核細(xì)胞特異性的抗-CD42和42b；除循環(huán)B-細(xì)胞外的白細(xì)胞特異性的抗-CD43；白細(xì)胞和紅細(xì)胞特異性的抗-CD44；白細(xì)胞特異性的抗-CD45；T-細(xì)胞，B-細(xì)胞亞群，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特異性的抗-CD45RO；B-細(xì)胞，單核細(xì)胞和T-細(xì)胞亞群特異性的抗-CD45RA；B-細(xì)胞，T-細(xì)胞亞群，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞特異性的抗-CD45RB；造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞特異性的抗-CD46，CD55，CD58和CD59；所有細(xì)胞類型特異性的抗-CD47；白細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞特異性的抗-CD48；血小板，激活的和長期培養(yǎng)的T-細(xì)胞特異性的抗-CDw49b；對(duì)單核細(xì)胞，T-細(xì)胞和B-細(xì)胞特異性的抗-CDw49d；血小板和巨核細(xì)胞特異性的抗-CDw49f；白細(xì)胞特異性的抗-CDw50和CDw52；血小板特異性的抗-CD51；包括正常和腫瘤血漿細(xì)胞的白細(xì)胞特異性的抗-CD53；內(nèi)皮細(xì)胞特異性的抗-CD54；T-細(xì)胞亞群和血小板特異性的抗-CDw60；血小板和巨核細(xì)胞特異性的抗-CD61；激活的血小板特異性的抗-CD62；激活的血小板，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性的抗-CD63；單核細(xì)胞(上調(diào)干擾素γ)特異性的抗-CD64；粒細(xì)胞和與單核細(xì)胞的異源性反應(yīng)特異性的抗-CDw65；粒細(xì)胞特異性的抗-CD66和67；單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特異性的抗-CD68；激活的B-細(xì)胞和T-細(xì)胞，激活的巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞特異性的抗-CD69；激活的T-細(xì)胞和B-細(xì)胞，Sternberg-Reed細(xì)胞，和退行發(fā)育的大細(xì)胞淋巴瘤特異性的抗-CDw70；激活的T-細(xì)胞B-細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，增生細(xì)胞特異性的抗-CD71；B-細(xì)胞亞群和T-細(xì)胞亞群特異性的抗-CD73；B-細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性的抗-CD74；成熟B-細(xì)胞特異性的抗-CDw75；成熟B-細(xì)胞和T-細(xì)胞亞群特異性的抗-CD76；濾泡中心B-細(xì)胞特異性的抗-CD77；抗細(xì)胞因子和生長因子的抗體(例如，IL1-IL13，EGF，IGFI和II，TGF-α和β，TNF-α和β，F(xiàn)GF，NGF，CIF，IFN-α和β，CSF的抗體)；病毒抗原(例如，乙型肝炎包膜蛋白或HIV包膜蛋白)，激素，細(xì)胞或腫瘤相關(guān)抗原或標(biāo)記，粘連分子，止血分子和內(nèi)皮細(xì)胞。本領(lǐng)域已知的其它標(biāo)記和富集方法同樣合適，例如在作為參考文獻(xiàn)引用的美國專利號(hào)5,840,502中所公開的。
所有上面引證的參考文獻(xiàn)和出版物分別以其各自的整體在本文中引用以供參考。
盡管已經(jīng)舉例說明和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但可預(yù)料到可對(duì)其作出各種修改而不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，或者使用不超過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)?zāi)艽_定，許多與本文所述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案等同的方案。
權(quán)利要求
1.一種處理非胎兒供體組織以獲得富集的祖細(xì)胞群體的方法，所述方法包括(a)提供認(rèn)為不適合于器官移植的非胎兒供體組織；和(b)處理所述的非胎兒供體組織以獲得富集的祖細(xì)胞群體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中認(rèn)為不適合于器官移植的非胎兒供體組織從心跳停止的供體獲得。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述供體組織在心跳停止后大約6小時(shí)內(nèi)獲得。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述供體組織在心跳停止后大約3小時(shí)內(nèi)獲得。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述供體組織在心跳停止后大約1小時(shí)內(nèi)獲得。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體組織是冷卻的。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體組織冷卻到大約4℃。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述供體是新生兒，嬰兒，兒童，少年或成人。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述供體是豬或靈長類。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體組織選自腎上腺，血管，骨髓，角膜，視網(wǎng)膜，胰島，膽管，晶狀體，肺，腎，心臟，腸，卵巢，胰腺，前列腺，甲狀旁腺，松果體，腦垂體，皮膚，睪丸，膀胱，腦，脊髓，脾臟，胸腺，或甲狀腺。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述組織是肝臟。
12.權(quán)利要求2的方法，其中所述處理步驟提供了基本上的單細(xì)胞懸液或外植塊。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述處理步驟還包括從懸液中選擇那些表達(dá)與至少一種祖細(xì)胞譜系陽性或陰性相關(guān)的至少一種標(biāo)記的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述處理步驟還包括壓實(shí)的步驟以提供富集表現(xiàn)出與至少一種祖細(xì)胞譜系相關(guān)的至少一種標(biāo)記的祖細(xì)胞的壓實(shí)的細(xì)胞懸液。
15.權(quán)利要求13的方法，其中至少一種祖細(xì)胞譜系包括肝細(xì)胞，造血細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞譜系中的至少一種。
16.一種獲取肝臟祖細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)提供無心跳的供體作為肝臟組織來源；和(b)處理肝臟組織以獲得祖細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述供體是哺乳動(dòng)物。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述祖細(xì)胞具有形成肝細(xì)胞，膽細(xì)胞或其組合的能力。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述供體的細(xì)胞表達(dá)甲胎蛋白，白蛋白，骨唾液蛋白，CD14，CD34，CD38，CD90，CD45，CD117，ICAM-1，I型膠原蛋白，II型膠原蛋白，III型膠原蛋白，血型糖蛋白A，或骨橋蛋白中的至少一種。
21.一種提供具有至少一種祖細(xì)胞群體的組織作為祖細(xì)胞來源的方法，所述方法包括(a)提供無心跳的供體；(b)從該供體收獲組織，所述組織具有至少一種祖細(xì)胞群體；和(c)進(jìn)一步處理收獲的組織以獲得祖細(xì)胞。
22.一種處理人胎兒組織以獲得富集人肝臟祖細(xì)胞群體的方法，所述方法包括(a)提供認(rèn)為不適合于細(xì)胞或器官移植的人胎兒組織；和(b)處理所述的人胎兒組織以獲得富集的肝臟祖細(xì)胞的群體。
23.一種提供具有至少一種二倍體細(xì)胞群體的組織作為二倍體細(xì)胞來源的方法，所述方法包括(a)從收獲組織時(shí)無心跳的供體收獲組織，所收獲的組織推測(cè)具有至少一種二倍體細(xì)胞群體；(b)處理收獲的組織以獲得基本上富含二倍體細(xì)胞的細(xì)胞群體。
24.權(quán)利要求23的的方法，其中所述供體不是胎兒。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述供體是新生兒，嬰兒，兒童，少年或成人。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述二倍體包括祖細(xì)胞。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述處理步驟包括處理收獲的組織以提供基本上的單細(xì)胞懸液。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述處理步驟還包括將基本上的單細(xì)胞懸液分成2個(gè)或多個(gè)餾分。
29.權(quán)利要求28的方法，其中分離步驟將較大的細(xì)胞與較小的細(xì)胞分離，較高密度的細(xì)胞與較低密度的細(xì)胞分離，或者兩者都分離。
30.權(quán)利要求29的方法，其中進(jìn)一步處理基本上由較小細(xì)胞，較低密度的細(xì)胞，或兩者組成的一個(gè)或多個(gè)餾分以提供基本上富集二倍體細(xì)胞的細(xì)胞群體。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述二倍體細(xì)胞包括表達(dá)甲胎蛋白的祖細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述祖細(xì)胞包括肝臟祖細(xì)胞。
33.權(quán)利要求23的方法，其中所述組織在心跳停止后大約6小時(shí)內(nèi)收獲。
34.權(quán)利要求23的方法，其中所述組織在心跳停止后大約3小時(shí)內(nèi)收獲。
35.權(quán)利要求23的方法，其中所述組織在心跳停止后大約2小時(shí)內(nèi)收獲。
36.權(quán)利要求23的方法，其中所述組織在心跳停止后大約1小時(shí)內(nèi)收獲。
37.權(quán)利要求23的方法，其中所述組織選自腎上腺，血管，骨髓，角膜，視網(wǎng)膜，胰島，膽管，晶狀體，肺，腎，心臟，腸，卵巢，胰腺，前列腺，甲狀旁腺，松果體，腦垂體，皮膚，睪丸，膀胱，腦，脊髓，脾臟，胸腺，或甲狀腺。
38.權(quán)利要求23的方法，其中所述組織是肝臟。
39.一種組合物，它含有以權(quán)利要求23的方法獲得的基本上富集二倍體細(xì)胞的細(xì)胞群體。
40.權(quán)利要求39的組合物，其中所述二倍體細(xì)胞包括表達(dá)甲胎蛋白的祖細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明首次提供了來自心臟停止跳動(dòng)的供體尸體器官作為用于各種醫(yī)學(xué)目的的諸如祖細(xì)胞或干細(xì)胞的功能性細(xì)胞來源的用途，更具體的說，公開了通過其獲得祖細(xì)胞的組織來源的方法，包括從供體獲得組織，其中供體心臟停止跳動(dòng)長達(dá)大約死后30小時(shí)并處理尸體組織以提供祖細(xì)胞，該祖細(xì)胞作為細(xì)胞治療，基因治療，人造器官，生物反應(yīng)器，器官再生等的工具用于各種醫(yī)療目的。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1411504SQ01806108
公開日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2001年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月19日
發(fā)明者洛拉·里德, 愛德華·L·萊克羅茲 申請(qǐng)人:查珀?duì)栂?北卡羅萊納大學(xué)