專利名稱：肝臟組織來(lái)源的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及從心臟停止跳動(dòng)的供體尸體的組織獲得包括祖細(xì)胞或干細(xì)胞的 二倍體細(xì)胞。
背景技術(shù)：
從肝臟分離和鑒定未成熟的祖細(xì)胞具有極大的臨床和商業(yè)利益，因?yàn)樵摷?xì)胞群體 在治療肝臟疾病中具有效果。在美國(guó)每年有大約300，000例因?yàn)楦闻K衰竭住院。肝移值對(duì) 某些形式的肝衰竭具有療效，且在美國(guó)每年進(jìn)行大約4800例移植。肝臟移植中的一個(gè)限制 性因素是供體肝臟的可得性，特別是受到器官移植的供體肝臟必須來(lái)自經(jīng)歷腦死亡但心跳 未停止的病人的限制。盡管最近如果在死亡半小時(shí)內(nèi)獲得該肝臟時(shí)使用該供體的努力支持 了使用它們的可能性，但是來(lái)自尸體(心搏停止)的供體肝臟尚未成功。將細(xì)胞移植進(jìn)肝臟對(duì)于大多數(shù)肝臟疾病而言是一種有吸引力的治療選擇。細(xì)胞移 植的手術(shù)操作相對(duì)于完整器官移植所需的那些操作較小，因此，可用于有各種手術(shù)危險(xiǎn)的 病人，例如，老年人或衰弱病人。使用人肝細(xì)胞優(yōu)于來(lái)自其它哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞，因?yàn)闈撛?的病原體(如果有的話)是人類來(lái)源的，病人能更好地耐受且容易在用前篩選。過(guò)去為獲得認(rèn)為是最多用的群體的肝臟祖細(xì)胞群體用于肝臟的細(xì)胞和基因治療 已作出了嘗試。Reid等的美國(guó)專利號(hào)5，576，207和5，789，246使用細(xì)胞表面標(biāo)記和側(cè)面散 射流式細(xì)胞術(shù)提供了肝臟中的限定亞群體。肝臟祖細(xì)胞是二倍體細(xì)胞，它們或其后代能分 化成肝細(xì)胞。肝臟祖細(xì)胞對(duì)于生長(zhǎng)因子的生產(chǎn)也非常有用。這與其自身生長(zhǎng)或肝臟中其它祖細(xì) 胞(例如，造血或間充質(zhì)祖細(xì)胞)的生長(zhǎng)相聯(lián)系且也可包括與將肝臟祖細(xì)胞供給特定譜系 的早期步驟相關(guān)的尚未發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子。這些新生長(zhǎng)因子在治療肝臟疾病或控制肝臟癌癥 (現(xiàn)在認(rèn)為是肝臟祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化突變體)中具有潛力。另外，肝臟祖細(xì)胞是基因治療的載體，其中遺傳插入轉(zhuǎn)化的或正常的肝臟祖細(xì)胞 可促進(jìn)移植該肝臟祖細(xì)胞的個(gè)體的健康。進(jìn)行肝細(xì)胞移植的嘗試?yán)昧宋捶蛛x的成熟肝細(xì)胞并顯示了一定程度的功效。然 而，該成就需要注射大量細(xì)胞(100-200億個(gè))，因?yàn)樵摷?xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)潛力有限。另外， 導(dǎo)入大量的大型成熟肝細(xì)胞(平均細(xì)胞直徑25-50 μ m)伴隨著注射時(shí)形成大量聚集的傾 向，導(dǎo)致潛在的致命栓塞。而且，這些細(xì)胞誘發(fā)顯著的免疫學(xué)排斥反應(yīng)，迫使病人靠免疫抑 制藥物來(lái)維持余生。成熟的，分化的肝細(xì)胞通過(guò)一些標(biāo)準(zhǔn)可與肝臟祖細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。分化的細(xì)胞傾向 于形成團(tuán)塊或聚集，如果注射進(jìn)病人，導(dǎo)致出現(xiàn)栓塞形成的危險(xiǎn)。分化的細(xì)胞特別耐冷藏且 具有顯著的免疫原性。而且，由于分化細(xì)胞的增殖能力有限，用分化細(xì)胞移植與器官移植相 比具有較小的優(yōu)勢(shì)(如果有的話)，且具有包括制備程序更精細(xì)的缺點(diǎn)。
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需要供體組織的用于移植或其它醫(yī)學(xué)目的的重要器官，例如，心臟，肝臟，胰腺，肺 和腎的矩缺是由于仍然具有功能的器官的可獲得性有限。當(dāng)前，用于移植的器官?gòu)男呐K仍 在跳動(dòng)的腦死亡的供體取得。如果心跳停止，血液循環(huán)就停止(局部缺血)，它中斷了組織 的氧合作用(缺氧)，因此，器官在極短的時(shí)間期間內(nèi)受到局部缺血損傷導(dǎo)致出現(xiàn)這樣一 種幾乎確定的可能性，即移植時(shí)該器官不發(fā)揮功能。一般來(lái)說(shuō)，不使用心跳停止后的器官， 在實(shí)驗(yàn)上，沒(méi)有使用心跳停止或心搏停止時(shí)間超過(guò)1個(gè)半小時(shí)后的器官。通常，醫(yī)院只有 1-2%的死亡滿足腦死亡有心跳的標(biāo)準(zhǔn)。然而，可獲得大量且尚未利用的器官來(lái)源用于移 植，其中許多來(lái)自事故的遇難者，他們或者在受傷時(shí)死亡，或者具有較短的傷后存活時(shí)間。 這些事故遇難者由于局部缺血損傷而未被用作器官供體。諸如肝臟，腦和心臟的器官屬于 局部缺血最敏感的組織。例如，由于心跳停止的缺氧和局部缺血腦損傷在大約4分鐘后導(dǎo) 致腦和有關(guān)神經(jīng)組織的損傷。心跳停止后心臟可完整存活達(dá)4小時(shí)。肝臟可有功能地存 活不超過(guò)1小時(shí)，且來(lái)自無(wú)心跳的供體(NHBDs)的移植建議優(yōu)選在出現(xiàn)暖局部缺血的前35 分鐘內(nèi)進(jìn)行[參見(jiàn)Ong HS, Soo KC, Joseph VT, Tan SY, Jeyaraj PR的文章(作為參考文 獻(xiàn)引用)的摘要。Ann Acad Med Singapore 1999年1月；28(1) :25_30，暖局部缺血延遲 后用于移植的肝臟移植物的活力；Hong HQ, Yin HR, Zhu SL, Lin YT，來(lái)自選擇的無(wú)心跳尸 體供體的移植肝臟的結(jié)果，Hiroshima J Med Sci，1991年9月；40(3) :87_91]。在目前的 醫(yī)學(xué)法規(guī)下，在可搶救潛在可移植器官的時(shí)間之前的時(shí)間通常被耽擱。這是因?yàn)闈撛诘墓?體必須首先被帶到醫(yī)院或停尸室。然后家屬必須填寫(xiě)器官捐贈(zèng)表格。只有在器官捐贈(zèng)程序 完成后，才許可手術(shù)小組接近尸體以獲取器官。在許多場(chǎng)合下由于這些程序?qū)е聲r(shí)間流逝， 器官已經(jīng)不可逆地受到損傷或者不再有活力。因此，現(xiàn)有技術(shù)提供了大量方法和程序用于 防止供體器官局部缺血損傷。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5, 702,881 ；5, 660, 976 ；5, 752,929 ； 5，863，296 ；5，855，617 ；5，843，024 ；5，827，222 ；5，723，282 ；5，514，536 ；和 4，723，939 等并 以參考文獻(xiàn)的形式在本文中引用。盡管大量的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)針對(duì)防止供體器官喪失功能的 方法，但對(duì)于使用心跳停止超過(guò)不可逆時(shí)間點(diǎn)的尸體的情況現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有記載。只有3篇 美國(guó)專利(5，843，024 ；5, 702，881 ；4, 723，939)似乎涉及無(wú)心跳的供體。但該現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有 教導(dǎo)使用“不可修復(fù)的”器官用于從其中分離祖細(xì)胞。盡管分離肝臟前體細(xì)胞的方法在本 領(lǐng)域是已知的(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5，576，207和5，789，246，本文作為參考文獻(xiàn)引用)， 但直到本發(fā)明付諸實(shí)踐時(shí)還不知道可從現(xiàn)有技術(shù)認(rèn)為“無(wú)用”的器官分離前體肝臟細(xì)胞。由本文所述的本發(fā)明的發(fā)明人開(kāi)創(chuàng)的，從對(duì)人肝臟祖細(xì)胞及其分離和擴(kuò)增的認(rèn)識(shí) 進(jìn)展建立的技術(shù)通過(guò)提供對(duì)細(xì)胞移植進(jìn)肝臟非常有用的新細(xì)胞群體產(chǎn)生對(duì)與肝臟疾病相 關(guān)的發(fā)病率和死亡率的重要影響。因此，對(duì)于使用來(lái)自血液循環(huán)停止或無(wú)心跳的尸體的器官作為醫(yī)學(xué)目的的器官或 器官等同物來(lái)源的有效方法存在長(zhǎng)期需要。發(fā)明概述本發(fā)明涉及提供具有至少一種二倍體細(xì)胞群體的組織作為二倍體細(xì)胞來(lái)源的方 法。該方法包括(a)從獲取組織時(shí)無(wú)心跳的供體獲取組織，所獲取的組織被認(rèn)為具有至 少一種二倍體細(xì)胞群體；(b)處理獲取的組織以獲得基本上富含二倍體細(xì)胞的一種細(xì)胞群 體。優(yōu)選的是，供體不是胎兒且選自新生兒，嬰兒，兒童，少年人或成年人。從該方法獲得的 二倍體細(xì)胞包括祖細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，處理步驟包括處理獲取的組織以提供基本上的 單細(xì)胞懸液。經(jīng)過(guò)將基本上的單細(xì)胞懸液分成兩個(gè)或多個(gè)部分，一般三個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選4個(gè) 或多個(gè)來(lái)進(jìn)一步處理該單細(xì)胞懸液。在該分離步驟中，將大細(xì)胞與小細(xì)胞分離，高密度細(xì)胞 與低密度細(xì)胞分離，或兩種情況都分離。可使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的將細(xì)胞分成 小部分的任何方法。一個(gè)方便的方法是離心，首先以較低速度，然后逐漸加快速率。進(jìn)一步 處理基本上由小細(xì)胞，低密度細(xì)胞，或兩者組成的部分以提供基本上富含二倍體細(xì)胞的細(xì) 胞群體。具體地說(shuō)，所需的二倍體細(xì)胞的例子包括表達(dá)甲胎蛋白的祖細(xì)胞，特別是肝臟祖細(xì) 胞。本發(fā)明的優(yōu)選組織是在供體心跳停止后大約6小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選心跳停止后大約3小 時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選心跳停止后大約2小時(shí)內(nèi)，最優(yōu)選心跳停止后大約1小時(shí)內(nèi)獲取的那些組織。 然而，供體心跳停止后獲取該組織的時(shí)間越早越好。因此，在供體心跳停止后大約45，30或 15分鐘內(nèi)獲取的組織仍然是較優(yōu)選的?？色@取各種組織并進(jìn)行處理以獲得二倍體細(xì)胞，包 括腎上腺，血管，骨髓，角膜，視網(wǎng)膜，胰島，膽管，晶狀體，肺，腎，心臟，腸，卵巢，胰腺，前列 腺，甲狀旁腺，松果體，腦垂體，皮膚，睪丸，膀胱，腦，脊髓，脾臟，胸腺，甲狀腺或者肝臟。本發(fā)明還涉及一種組合物，它含有一種基本上富含二倍體細(xì)胞的細(xì)胞群體，特別 是用本發(fā)明的方法獲得的，表達(dá)甲胎蛋白的那些細(xì)胞。本發(fā)明在獲得供體器官和組織的領(lǐng)域中取得了重要突破并提供了獲得祖細(xì)胞和 二倍體成年細(xì)胞的組織來(lái)源的方法。本發(fā)明是完全意想不到的，因?yàn)樗幸阎默F(xiàn)有技術(shù) 文獻(xiàn)都認(rèn)為局部缺血損傷的器官對(duì)于任何有意義的目的都是完全無(wú)用的。優(yōu)選的方法包括 從供體獲取組織，其中該供體無(wú)心跳，并處理該組織以提供包括祖細(xì)胞或干細(xì)胞的二倍體 細(xì)胞。優(yōu)選的是，本發(fā)明包含提供包括祖細(xì)胞的肝臟二倍體細(xì)胞的組織來(lái)源的方法，它 包括從供體獲取肝臟組織，其中該供體無(wú)心跳，并處理該組織以提供二倍體細(xì)胞和/或肝 臟祖細(xì)胞。例如，該細(xì)胞可用于在需要的宿主中恢復(fù)損傷的肝臟實(shí)質(zhì)群體或重建肝臟。盡 管任何動(dòng)物供體是同樣合適的，但優(yōu)選的供體是人類。諸如豬和靈長(zhǎng)類的動(dòng)物是同樣合適 的。因此，本發(fā)明的目的是在心跳停止后大約24小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)獲得該器官或 組織。即使該時(shí)間限制不受約束，也優(yōu)選在心跳停止后大約16小時(shí)內(nèi)獲得該組織。更優(yōu)選 的是在心跳停止后大約10小時(shí)內(nèi)獲得該組織。另外更優(yōu)選在心跳停止后大約6小時(shí)內(nèi)獲得 該組織。甚至更優(yōu)選在心跳停止后大約3小時(shí)內(nèi)獲得該組織。另一優(yōu)選的時(shí)間期限是在心 跳停止后大約1小時(shí)內(nèi)獲得該組織。盡管在該時(shí)間期限二倍體細(xì)胞和祖細(xì)胞耐局部缺血。 獲取的組織或者用合適的灌流培養(yǎng)基灌流或者不作灌流而用于進(jìn)一步處理。盡管優(yōu)選將組織冷卻到大約室溫，但將組織冷卻到大約4°C同樣是具有優(yōu)勢(shì)的。組 織可在全部或部分局部缺血時(shí)間內(nèi)冷卻。即，對(duì)器官可進(jìn)行暖和冷局部缺血的組合。在本發(fā)明范圍內(nèi)，優(yōu)選供體是新生兒，嬰兒，兒童，少年或成年人，在本發(fā)明范圍內(nèi) 也包括由于推測(cè)的局部缺血而認(rèn)為不合適的胎兒組織。盡管供體的年齡不是關(guān)鍵的，但需 要供體在大約0歲至大約77歲之間，更優(yōu)選不超過(guò)大約50歲。用于本發(fā)明的優(yōu)選組織包括腎上腺，血管，骨髓，角膜，胰島，晶狀體，肝臟，卵巢， 胰腺，甲狀旁腺，松果體，腦垂體，皮膚，睪丸，胸腺，甲狀腺或者其組含。優(yōu)選的組織是肝臟。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是提供了導(dǎo)致從該組織產(chǎn)生基本上的單細(xì)胞懸液的處理 方法。優(yōu)選的處理方法還包括壓實(shí)(debulking)的步驟，它大量減少了懸液中多倍體細(xì)胞 或成熟細(xì)胞的數(shù)目以提供富含表現(xiàn)出與至少一種細(xì)胞譜系相關(guān)的至少一種標(biāo)記的二倍體 細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的壓實(shí)的懸液。不作為對(duì)該方法的限制，處理步驟包括以大小或密度分 離細(xì)胞。優(yōu)選的處理還包括從懸液選擇那些表達(dá)與至少一種細(xì)胞譜系相關(guān)的至少一種標(biāo) 記的細(xì)胞，其中至少一種細(xì)胞譜系包括至少一種肝臟，造血，或間充質(zhì)細(xì)胞譜系。本發(fā)明還 有一個(gè)目的是提供具有發(fā)育成肝細(xì)胞，膽細(xì)胞，或其組合之能力的二倍體細(xì)胞和/或祖細(xì) 胞。優(yōu)選的是本發(fā)明的供體細(xì)胞單獨(dú)或者以有益組合表達(dá)包括甲胎蛋白，白蛋白，骨 唾液蛋白，⑶14，⑶34，⑶38，⑶90，⑶45，CD 117，ICAM-1，I型膠原蛋白，II型膠原蛋白， III型膠原蛋白，血型糖蛋白A，或骨橋蛋白的至少一種標(biāo)記。作為本發(fā)明的另一目的，提供了一種治療方法，其中祖細(xì)胞用作細(xì)胞移植物，生物 反應(yīng)器，人造器官等。優(yōu)選的醫(yī)學(xué)癥狀和需要包括克_納二氏綜合征，酪氨酸血癥，肝硬化， 急性肝衰竭，糖尿病，和本領(lǐng)域已知的其它肝臟和肝臟相關(guān)性癥狀。一般來(lái)說(shuō)，治療的患者 可患有至少一種肝臟疾病，該疾病選自肝臟炎癥，病毒性肝炎，中毒性肝細(xì)胞損傷，肝臟纖 維變性，肝硬化，肝充血，肝營(yíng)養(yǎng)障礙，肝細(xì)胞脂肪變性，脂肪肝，解毒功能障礙，肝分泌功能 障礙，肝接合功能障礙，由肝疾病引起的肝門高血壓合成功能障礙，或肝衰竭昏迷，蛋白降 解產(chǎn)物或氨中毒。這些機(jī)能障礙導(dǎo)致諸如阿拉惹綜合征，酒精肝疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺 陷，自身免疫肝炎，膽閉鎖，膽管缺乏，骨髓衰竭，巴德-希阿里綜合征，Byler疾病，克-納二 氏綜合征，Caroli疾病，膽汁郁積瘙癢癥，膽石病，接合高膽紅素血癥，慢性移植物與宿主疾 病，原因不明性肝疾病，糖尿病，杜-約綜合征，紅細(xì)胞肝性原卟啉癥，肝外膽管癌，家族性 高膽固醇血癥，半乳糖血癥，吉爾伯綜合征，糖原存儲(chǔ)疾病，血管瘤，血色病，肝腦病，肝膽管 炎，肝軟化，肝大，肝癌，肝胚細(xì)胞瘤，遺傳性血色病，黃膽，肝內(nèi)膽汁郁積，肝囊腫，肝移植， 與Bacillus cereus相關(guān)的肝衰竭，混合型冷球蛋白血癥，鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲?；溉毕?，紫癜 肝病，遲發(fā)性皮膚血卟啉病，原發(fā)性膽肝硬化，頑固性腹水，羅托綜合征，肉樣瘤病，硬化性 膽管炎，皮脂腺病，Summer ski 11綜合征，血小板減少癥，酪氨酸血癥，靜脈曲張性出血，肝臟 靜脈閉合疾病，和肝豆?fàn)詈俗冃缘鹊募膊。矣帽景l(fā)明的方法和組合物治療是有益的。不局限于上述實(shí)施方案，還包括基因治療的方法，它包括本領(lǐng)域熟知的方法，包括 但不限于將載體導(dǎo)入二倍體細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，然后移植進(jìn)需要的宿主中。癥狀和靶基因 可包含家族性高膽固醇血癥中的LDL受體基因，血友病中的因子VIII和IX的凝血因子基 因，肺氣腫中的α-1-抗胰蛋白酶基因，苯丙酮酸尿中的苯丙氨酸羥化酶基因，血氨過(guò)多中 的鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因，和在各種補(bǔ)體缺陷形式中的補(bǔ)體蛋白基因，可借助于基因治療 進(jìn)行有益治療或治愈的其它醫(yī)學(xué)癥狀。其它所需的實(shí)施方案包括編碼甲氨酰合成酶1，鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，精氨琥珀酸合 成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，苯丙氨酸羥化酶，α "I"抗 胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，低密度脂蛋白受體，膽色素原脫氨酶，甲氨酰合成酶I，鳥(niǎo)氨 酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，因子VIII或IX，胱硫醚 β -合成酶，支鏈酮酸脫羧酶，白蛋白，異戊酰-CoA脫氫酶，丙酰CoA羧化酶，甲基丙二酰CoA變位酶，戊二酰CoA脫氫酶，胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，β -葡萄糖苷酶，丙酮酸羧化酶，肝臟磷 酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脫羧酶，H-蛋白，T-蛋白，Menkes疾病蛋白，或肝豆?fàn)詈俗冃?基因產(chǎn)物的基因。本發(fā)明還涉及從人肝臟分離和冷藏二倍體細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的方法，包括(a)處 理人肝臟組織以提供一種基本上的單細(xì)胞懸液，該懸液包括二倍體成年細(xì)胞，祖細(xì)胞和在 人肝臟中發(fā)現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞譜系的非祖細(xì)胞；(b)對(duì)該懸液進(jìn)行壓實(shí)的步驟，它大量 減少了懸液中非祖細(xì)胞的數(shù)目，以提供富含表現(xiàn)出與至少一種細(xì)胞譜系相關(guān)的一種或多種 標(biāo)記的祖細(xì)胞的壓實(shí)的懸液；和(c)從壓實(shí)的懸液選擇那些其自身，其后代或其更成熟的 形式表達(dá)與一些肝臟細(xì)胞譜系相關(guān)的一種或多種標(biāo)記的細(xì)胞；及(d)在對(duì)于冷藏最佳的條 件下懸浮該細(xì)胞。更優(yōu)選的是選擇表達(dá)諸如甲胎蛋白的胞質(zhì)蛋白的肝臟祖細(xì)胞。本發(fā)明的 處理或壓實(shí)的步驟優(yōu)選包括根據(jù)與具有低浮力密度的一個(gè)或多個(gè)梯度部分相聯(lián)系的其浮 力密度和大小對(duì)肝細(xì)胞懸液進(jìn)行密度梯度離心以分離該細(xì)胞。肝細(xì)胞懸液的非祖細(xì)胞包括成熟的肝臟，造血，和間充質(zhì)細(xì)胞。非祖細(xì)胞的負(fù)選擇 包括使用諸如連接蛋白32的與成熟肝細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記，諸如血型糖蛋白A和CD45的與造 血細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記，諸如視網(wǎng)膜樣蛋白(retinoids)或馮·維勒布蘭德氏因子的與成熟間 充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記。本發(fā)明的另一方面提供了肝臟，造血，或間充質(zhì)來(lái)源的肝臟祖細(xì)胞。通過(guò)選自 ⑶14，⑶34，⑶38，⑶45，⑶117，ICAM，血型糖蛋白A的抗原標(biāo)記，和/或諸如甲胎蛋白樣免 疫反應(yīng)性，白蛋白樣免疫反應(yīng)性的胞質(zhì)標(biāo)記，或者兩者來(lái)選擇這些細(xì)胞譜系，其后代或其更 成熟的形式。甲胎蛋白來(lái)自mRNA的變異體形式。其中的一些是肝臟祖細(xì)胞特有的且一些 是造血祖細(xì)胞特有的。本發(fā)明的肝臟相細(xì)胞可從胎兒，新生兒，嬰兒，兒童，少年或成年人肝 臟中分離。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，分離的人肝臟祖細(xì)胞，即一種二倍體細(xì)胞的亞群以高度 富集到基本上純的形式分離。該肝臟祖細(xì)胞含有肝臟，造血和間充質(zhì)祖細(xì)胞。肝臟祖細(xì)胞 具有發(fā)育成肝細(xì)胞，膽細(xì)胞或其組合的能力；造血祖細(xì)胞具有發(fā)育成巨噬細(xì)胞，噬中性白細(xì) 胞，粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，血小板，嗜中性白細(xì)胞，嗜曙紅細(xì)胞，嗜堿細(xì)胞或其組合的能力。間充 質(zhì)祖細(xì)胞具有發(fā)育成內(nèi)皮細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，肝臟星形細(xì)胞(Ito cells)，軟骨細(xì)胞，骨細(xì)胞或 其組合的能力。本發(fā)明的方法可用于選擇表達(dá)⑶34，骨橋蛋白，骨唾液蛋白，I，II，或III 型膠原蛋白或其組合的間充質(zhì)祖細(xì)胞。本發(fā)明人克服了許多上述困難來(lái)制備包括祖細(xì)胞的二倍體細(xì)胞，理想地用于細(xì)胞 和基因治療及用于人造生物器官。由于細(xì)胞較小，因此使大型栓塞的形成最小化。另外，該 細(xì)胞具有廣泛的生長(zhǎng)潛力，意味著在患者中重建肝臟組織需要較少的細(xì)胞。最后，祖細(xì)胞 具有最少的可誘發(fā)免疫學(xué)排斥的抗原標(biāo)記，這給需要較小或沒(méi)有免疫抑制的藥物提供了希望。本發(fā)明的另一方面提供了含有外源性核酸的肝臟祖細(xì)胞。該外源性核酸可編碼一 個(gè)或多個(gè)目的多肽，或者可啟動(dòng)一個(gè)或多個(gè)目的多肽的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了經(jīng)過(guò)給遭受負(fù)效應(yīng)的個(gè)體施用有效量的分離的人 二倍體肝細(xì)胞和/或祖細(xì)胞減輕一種或多種人類疾病或機(jī)能障礙的負(fù)效應(yīng)的方法。祖細(xì)胞 可通過(guò)血管進(jìn)行腸胃外給藥，或者直接施用進(jìn)肝臟。直接施用可通過(guò)門靜脈，腸系膜靜脈，肝膽管，或其組合經(jīng)手術(shù)實(shí)現(xiàn)。另外，肝臟祖細(xì)胞可施用進(jìn)個(gè)體的異位位置，例如脾臟?？捎帽景l(fā)明的方法減輕的人類病癥或機(jī)能障礙包括肝膽管炎，肝軟化，肝大，肝 硬化，纖維變性，肝炎，急性肝衰竭，慢性肝衰竭，或代謝先天錯(cuò)誤，肝癌，或肝胚細(xì)胞瘤。肝 癌可以是癌的原發(fā)性部位或者是轉(zhuǎn)移進(jìn)肝臟的癌。轉(zhuǎn)移瘤可來(lái)自任意數(shù)量的原發(fā)性位點(diǎn)， 包括腸，前列腺，胸部，腎，胰腺，皮膚，腦，肺或其組合?？捎迷摲椒ㄖ委煹母闻K疾病或機(jī)能 障礙還包括與肝組織線粒體區(qū)室的損傷相關(guān)的肝臟疾病或機(jī)能障礙且可由慢性肝臟疾病， 爆發(fā)性肝衰竭，病毒誘導(dǎo)的肝臟疾病，代謝型肝臟疾病和與膿毒癥或肝臟創(chuàng)傷相關(guān)的肝臟 機(jī)能障礙組成。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種生物反應(yīng)器，它包括(i)含有(a)從人肝臟， 其后代，其成熟中的或分化的后代，或其組合分離的祖細(xì)胞，(b)細(xì)胞外基質(zhì)，和(c)培養(yǎng) 基的生物材料；(ii)容納所述生物材料的一個(gè)或多個(gè)區(qū)室或含有所述生物材料的組件；和 (iii) 一個(gè)或多個(gè)連接口。該生物反應(yīng)器的生物材料可任選還包括(d)激素，生長(zhǎng)因子，或 營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物，或(e)血漿，血清，淋巴，或由其產(chǎn)生的產(chǎn)品。生物反應(yīng)器適用于將所述祖細(xì)胞維持在一種有活力的，有功能的狀態(tài)，且可維持 肝臟祖細(xì)胞大約一周或更長(zhǎng)的時(shí)期。具體地說(shuō)，該生物反應(yīng)器適用于用作人造肝臟，用于產(chǎn) 品生產(chǎn)，毒理學(xué)研究，或代謝研究，包括涉及細(xì)胞色素P450的活性，或其它類型的藥物代謝 的研究。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了分離的人肝臟祖細(xì)胞的組合物，或從人類肝臟獲 得的富含祖細(xì)胞的懸液。該細(xì)胞懸液在藥用上可接受的載體或稀釋劑中提供且施用給需要 治療的受試者。本發(fā)明的組合物包含表現(xiàn)出與在人類肝臟中發(fā)現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞譜系中 的至少一種相聯(lián)系的一種或多種標(biāo)記的肝臟祖細(xì)胞且基本上不含成熟細(xì)胞。更具體的說(shuō)， 分離的肝臟祖細(xì)胞來(lái)自一種或多種肝細(xì)胞譜系，包括肝臟，造血，或間充質(zhì)細(xì)胞譜系且它們 自身，其后代，或該祖細(xì)胞的更成熟形式表達(dá)抗原標(biāo)記⑶14，⑶34，⑶38，⑶90，或⑶117， CD45，血型糖蛋白A，和甲胎蛋白樣免疫反應(yīng)性，白蛋白樣免疫反應(yīng)性的胞質(zhì)標(biāo)記，或者兩者 中的至少一種或多種。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了一種肝臟祖細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，它包括來(lái)自 人肝臟的分離的祖細(xì)胞，其后代，其成熟中的或分化的后代，或其組合。該細(xì)胞培養(yǎng)物還包 括細(xì)胞外基質(zhì)，該基質(zhì)包括一種或多種膠原蛋白，一種或多種粘連蛋白(層粘連蛋白，纖連 蛋白)，和其它組分，例如蛋白聚糖(例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)；或獨(dú)特的基質(zhì)成分。所 述基質(zhì)成分包括基質(zhì)成分的片斷；基質(zhì)模擬物，該模擬物可以是用來(lái)自一類細(xì)胞外基質(zhì)的 一種或多種因子包裹的合成的和/或可生物降解的材料(即微球體)。細(xì)胞培養(yǎng)物還包括 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和其它營(yíng)養(yǎng)成分；激素和/或生長(zhǎng)因子，含有或不含諸如血清，血漿或淋巴的生 物學(xué)液體。另外，該培養(yǎng)基可含有一個(gè)或多個(gè)區(qū)室以容納諸如培養(yǎng)皿，瓶，轉(zhuǎn)瓶，轉(zhuǎn)移孔或其 它這類容器的生物學(xué)材料。本發(fā)明的培養(yǎng)物或生物反應(yīng)器可用于產(chǎn)生各種醫(yī)學(xué)上重要的細(xì)胞分泌因子，包 括但不限于酶，激素，細(xì)胞因子，抗原，抗體，凝血因子，反義PNA，調(diào)控蛋白，核酶，融合蛋白 等。該培養(yǎng)物適合于提供治療性蛋白，例如因子VIII，因子IX，因子VII，紅細(xì)胞生成素， α-1-抗胰蛋白酶，降鈣素，生長(zhǎng)激素，胰島素，低密度脂蛋白，載脂蛋白E，IL-2受體和其拮 抗劑，過(guò)氧化物歧化酶，免疫反應(yīng)修飾劑，甲狀旁腺激素，干擾素(IFNci，β，或Υ)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，葡糖腦苷脂酶，集落刺激因子，白介素(IL)I至15，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)， 粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(FGF)，血小板產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子(PDGF)，腺苷脫氨酶，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1和 IGF-2)，巨核細(xì)胞啟動(dòng)配體MPL，血小板生成素等。作為本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了一種用于治療和預(yù)防肝臟疾病的藥物組合 物。該組合物包含有效量的尸體肝臟祖細(xì)胞和藥用載體。目的肝臟疾病包括中毒性，代謝 性，遺傳性，和/或傳染源性或變性性質(zhì)的急性或慢性肝臟疾病，或由于使用藥物或?qū)Ω闻K 的物質(zhì)損傷引起的肝臟損傷。其中優(yōu)選的癥狀和疾病是肝臟炎癥，病毒性肝炎，中毒性肝細(xì) 胞損傷，肝臟纖維變性，肝硬化，肝充血，肝營(yíng)養(yǎng)障礙，肝細(xì)胞脂肪變性，脂肪肝，解毒功能障 礙，肝分泌功能障礙，肝接合功能障礙，由肝疾病引起的肝門高血壓合成功能障礙，或肝衰 竭昏迷，和蛋白降解產(chǎn)物或氨中毒。更具體的說(shuō)，這些包括但不限于阿拉惹綜合征，酒精肝 疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，自身免疫肝炎，膽管缺乏，骨髓衰竭，巴德-希阿里綜合征，膽 閉鎖，Byler疾病，克-納二氏綜合征，Caroli疾病，膽汁郁積瘙癢癥，膽石病，接合高膽紅素 血癥，慢性移植物與宿主疾病，原因不明性肝疾病，糖尿病，杜-約綜合征，紅細(xì)胞肝性原卟 啉癥，肝外膽管癌，家族性高膽固醇血癥，半乳糖血癥，吉爾伯綜合征，糖原存儲(chǔ)疾病，血管 瘤，血色病，肝腦病，肝膽管炎，肝軟化，肝大，肝癌，肝胚細(xì)胞瘤，遺傳性血色病，黃膽，肝內(nèi) 膽汁郁積，肝囊腫，肝移植，與Bacillus cereus相關(guān)的肝衰竭，混合型冷球蛋白血癥，鳥(niǎo)氨 酸轉(zhuǎn)氨甲酰基酶缺陷，紫癜肝病，遲發(fā)性皮膚血卟啉病，原發(fā)性膽肝硬化，頑固性腹水，羅托 綜合征，肉樣瘤病，硬化性膽管炎，皮脂腺病，Summerskill綜合征，血小板減少癥，酪氨酸血 癥，靜脈曲張性出血，肝臟靜脈閉合疾病，和肝豆?fàn)詈俗冃约捌浣M合。參照下面的詳細(xì)說(shuō)明完成其它的主題對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的。附圖的簡(jiǎn)要描述圖Ia和Ib顯示了暖局部缺血對(duì)具有小核和大核的分離細(xì)胞的比率的影響。圖2a和2b顯示了對(duì)造血細(xì)胞中截短的甲胎蛋白(AFP)的PCR分析。圖3顯示了在-170°C的貯存時(shí)間與復(fù)蘇的胎兒肝細(xì)胞活力之間的關(guān)系。圖4a和4b顯示了以熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)分析的胎兒肝細(xì)胞懸液的典型
單變量直方圖。圖5顯示了在未分離的肝細(xì)胞懸液中表達(dá)表面標(biāo)記⑶14，⑶34，⑶38，⑶45和血 型糖蛋白A(GA)的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。圖6顯示了在原始細(xì)胞懸液中表達(dá)甲胎蛋白和其它抗原標(biāo)記的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。圖7a，7b和7c顯示了在排除紅血細(xì)胞之前和之后的甲胎蛋白表達(dá)。圖8￡1，8比8(3，8(1，86和8€顯示了胎兒肝細(xì)胞懸液中0)14，CD38和AFP共表達(dá)的 FACS分析。圖9顯示了 AFP-陽(yáng)性細(xì)胞的⑶14和⑶38富集。

圖10a，10b, IOc和IOd顯示了人肝臟祖細(xì)胞的熒光顯微鏡檢。圖11a，11b，Ilc和Ild顯示了用表達(dá)AFP選擇的代表性細(xì)胞。圖12a，12b和12c顯示了在該視野中有兩個(gè)AFP陽(yáng)性細(xì)胞。圖13a和13b顯示了用鈣黃綠素㈧標(biāo)記的細(xì)胞以顯示所有細(xì)胞類型。本發(fā)明的詳細(xì)描述
在下面的描述中，使用了許多術(shù)語(yǔ)廣泛描述了本發(fā)明。為了提供對(duì)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利 要求書(shū)的清楚和一致的理解，提供了下列定義。甲胎蛋白樣免疫反應(yīng)性由甲胎蛋白引起的任何免疫反應(yīng)。甲胎蛋白由mRNA的變 異體形式產(chǎn)生，其中一些變異體是肝臟祖細(xì)胞所特有的且有些是造血祖細(xì)胞所特有的。定向祖細(xì)胞具有單一命運(yùn)的未成熟細(xì)胞，例如肝細(xì)胞定向祖細(xì)胞(產(chǎn)生肝細(xì)胞) 或膽定向祖細(xì)胞(產(chǎn)生膽管)。定向過(guò)程在分子水平上尚不清楚。而且，認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞命運(yùn)從 其祖先命運(yùn)變窄時(shí)僅以經(jīng)驗(yàn)發(fā)生該定向過(guò)程。肝細(xì)胞肝臟細(xì)胞的亞群體，包括肝細(xì)胞和膽細(xì)胞。肝臟細(xì)胞本文使用的術(shù)語(yǔ)“肝臟細(xì)胞”是指正常肝臟中存在的所有類型的細(xì)胞， 不論其起源或命運(yùn)。干細(xì)胞本文所用的術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是指可產(chǎn)生具有一種以上命運(yùn)的子代細(xì)胞的未 成熟細(xì)胞。一些子代細(xì)胞與親代相同且一些“定型”為一種特定的命運(yùn)。全能干細(xì)胞具有 自我更新(自我維持)能力，而定向干細(xì)胞的自我更新能力有問(wèn)題。干細(xì)胞在再生性增殖 過(guò)程期間更新。肝祖細(xì)胞這些細(xì)胞產(chǎn)生肝細(xì)胞和膽細(xì)胞。肝祖細(xì)胞包括三種亞群體“肝干細(xì) 胞”，“定向肝細(xì)胞的祖細(xì)胞”，和“定向膽祖細(xì)胞”，后兩種細(xì)胞是未成熟細(xì)胞，它們是肝干細(xì) 胞的后代且具有單一命運(yùn)，即或者肝細(xì)胞或者膽細(xì)胞，而不是兩者。肝干細(xì)胞肝祖細(xì)胞的一種亞群體。肝臟祖細(xì)胞一種來(lái)自肝臟的細(xì)胞群體，包括肝祖細(xì)胞，造血祖細(xì)胞和問(wèn)充質(zhì)祖細(xì) 胞。卵形細(xì)胞具有卵形核的小細(xì)胞(< 15微米)，在動(dòng)物接觸致癌損傷時(shí)增殖。據(jù) 認(rèn)為這些細(xì)胞來(lái)源于肝臟祖細(xì)胞且部分或完全轉(zhuǎn)化?！案闻K”是位于腹部最前部位的大型器官，安置在腹腔和胸腔之間的肌肉隔膜上。 肝臟是生命所必需的且完成100種以上的重要功能，例如解毒毒物和藥物，代謝脂肪，存儲(chǔ) 糖類，生產(chǎn)膽汁，血漿蛋白和其它物質(zhì)，并輔助凝血。肝臟疾病通常難以檢測(cè)，直到形成嚴(yán)重 疾病，因?yàn)榇嬖谶^(guò)多的肝臟組織，且肝臟能部分自我再生。肝臟疾病的征兆隨損害的程度和 位置而變化。各種血液化驗(yàn)對(duì)發(fā)現(xiàn)肝臟損傷的程度和性質(zhì)是必須的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)因子”是指調(diào)節(jié)發(fā)育事件所需的或者調(diào)節(jié)編碼可參與細(xì)胞 通信和發(fā)育協(xié)調(diào)的其它分泌蛋白的基因表達(dá)所需的那些因子，且包括但不限于肝細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(HGF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和IKIGF-I和II)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，a型和b型轉(zhuǎn) 化生長(zhǎng)因子(TGF-α和TGF-β)，種經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，血小板 衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，肉瘤生長(zhǎng)因子(SGF)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激生長(zhǎng)因子(GM-CSF)， 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，催乳激素和生長(zhǎng)激素釋放因子(GHRF)和各種造血生長(zhǎng)因子，例 如白介素(IL)IL-I, IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-T, IL-8，IL-10，IL-11，等，紅細(xì)胞分 化因子(EDF)或促卵泡激素釋放蛋白(FRP)，抑制素，干細(xì)胞增殖因子(SCPF)及這些蛋白質(zhì) 的活性片斷，亞基，衍生物和其組合等本領(lǐng)域已知的許多其它因子。一般來(lái)說(shuō)，下文所用的 生長(zhǎng)因子是指選自細(xì)胞因子，淋巴因子，自介素，集落刺激因子，激素，趨化因子，抗趨化因 子，凝血因子，溶栓蛋白，補(bǔ)體蛋白，酶，免疫球蛋白和抗原的分泌蛋白。血細(xì)胞生成產(chǎn)生具有淋巴細(xì)胞(B和T)，血小板，巨噬細(xì)胞，嗜中性白細(xì)胞和粒細(xì)
11胞的細(xì)胞命運(yùn)的血細(xì)胞。間充質(zhì)形成產(chǎn)生具有內(nèi)皮細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，甚至骨細(xì)胞的細(xì) 胞命運(yùn)的間充質(zhì)衍生物(僅在疾病裝態(tài)下在肝臟中出現(xiàn)后兩種)。細(xì)胞治療本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞治療”是指體內(nèi)或離開(kāi)體內(nèi)轉(zhuǎn)移限定的細(xì)胞群體 用作自身或同種異體材料并移植到患者特定靶細(xì)胞或其附近。細(xì)胞可在任何合適的的培養(yǎng) 基，載體或稀釋劑，或者包括微載體，珠，微粒體，微球體，囊泡等的任何類型的藥物傳遞系 統(tǒng)中移植?；蛑委煴疚乃玫男g(shù)語(yǔ)“基因治療”是指將確定的遺傳材料體內(nèi)或離開(kāi)體內(nèi)轉(zhuǎn) 移到需要它的患者的特定靶細(xì)胞，從而改變基因型，且在大多數(shù)情況下，改變那些靶細(xì)胞的 表型達(dá)到預(yù)防或改變特定疾病狀態(tài)的最終目的。按照這一定義規(guī)定，隱含的前提是設(shè)計(jì)這 些治療性遺傳操作最終預(yù)防，治療或改變明顯的或隱蔽的病理學(xué)狀態(tài)。在大多數(shù)情況下，基 因治療操作的最終治療目的是改變特定靶細(xì)胞群體的表型。CD: “分化簇”或“共有決定簇”在本文中用于指被單克隆抗體識(shí)別的細(xì)胞表面分 子。一些⑶s的表達(dá)對(duì)于特定譜系或成熟途徑的細(xì)胞是特異性的，其它⑶的表達(dá)根據(jù)激活 的狀態(tài)，位置，或相同細(xì)胞的分化而變化。倍性；細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)。二倍體每個(gè)細(xì)胞兩組染色體。四倍體每個(gè)細(xì)胞4組染色體。八倍體每個(gè)細(xì)胞8組染色體。多倍體每個(gè)細(xì)胞有兩組以上的染色體。正常胎兒或新生兒肝臟的細(xì)胞是二倍體。到青年時(shí)期，肝臟是二倍體和多倍體細(xì) 胞的混合物。在嚙齒類中，肝臟大約90%是多倍體且僅有大約10%是二倍體細(xì)胞。在人類， 青年人的肝臟由大約50%的二倍體和50%的多倍體細(xì)胞組成。不限于肝臟，本發(fā)明公開(kāi)并要求保護(hù)來(lái)自各種尸體組織的其它祖細(xì)胞。下文所用 的術(shù)語(yǔ)“尸體組織”不包括來(lái)自經(jīng)過(guò)手術(shù)方法以諸如成熟前終止妊娠的方式獲得的死亡胎 兒的組織。以自然或協(xié)助分娩生產(chǎn)的人類認(rèn)為是新生兒或嬰兒而不是胎兒。因此，人類的 年齡在分娩或生產(chǎn)時(shí)開(kāi)始為“0”，而不是從受孕的開(kāi)始。因此在分娩時(shí)死亡的新生兒認(rèn)為是 尸體而不是胎兒。剛獲得的胎兒組織已被用作一些祖細(xì)胞的來(lái)源且因此它們被排除在本發(fā) 明的權(quán)利要求的范圍之外。然而，由于推測(cè)的局部缺血效應(yīng)而被認(rèn)為不適合于進(jìn)一步的醫(yī) 療用途的胎兒組織仍然適合于本發(fā)明的目的。當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)中使用術(shù)語(yǔ)“一”時(shí)，是指“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”，除非另有說(shuō)明。圖2a和2b顯示了在造血細(xì)胞中截短的AFP的PCR分析。使用引物組合hAFPl， hAFP2，hAFP3，和hAFP4進(jìn)行RT-PCR。泳道1-3相應(yīng)于H印3B-細(xì)胞；泳道10-12相應(yīng)于STO 細(xì)胞；泳道13-15沒(méi)有RNA或cDNA。注意，在泳道2，5，和8中有一條共有帶，即截短的AFP 同種型。在泳道1和4中明顯有一條肝臟細(xì)胞特有的截短的AFP同種型。在泳道3和6中 觀察到完整的AFP種類。圖3顯示了在-170°C下貯存時(shí)間與復(fù)蘇的胎兒肝臟細(xì)胞活力之間的關(guān)系。數(shù)據(jù)表 示為在處理時(shí)與復(fù)蘇時(shí)測(cè)量的活力的改變百分?jǐn)?shù)。這些數(shù)據(jù)表示冷藏方法不明顯影響細(xì)胞
12的活力。貯存時(shí)間延長(zhǎng)到550天時(shí)活力無(wú)明顯改變。圖4a和4b顯示了以熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)分析的胎兒肝臟細(xì)胞懸液的典 型單變量直方圖。制備細(xì)胞懸液用于免疫熒光分析，使用與紅色染料，Cy5偶連的抗體分析 甲胎蛋白(AFP)，使用偶連到藍(lán)色染料(AMCA)上的抗體分析白蛋白。篩選了 3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的 紅色(AFP)和藍(lán)色(白蛋白)熒光。結(jié)果顯示了清楚的各蛋白質(zhì)陽(yáng)性的細(xì)胞組。進(jìn)一步分 析表明大約80%的各蛋白質(zhì)的陽(yáng)性群體是相同的細(xì)胞(即，共表達(dá)兩種蛋白質(zhì))。圖5顯示了在未分離的肝臟細(xì)胞懸液中表達(dá)表面標(biāo)記⑶14，⑶34，⑶38，⑶45和 血型糖蛋白A(GA)的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。注意GA數(shù)據(jù)在右軸上繪圖以保護(hù)刻度。圖6顯示了在原始細(xì)胞懸液中表達(dá)甲胎蛋白和其它抗原標(biāo)記的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。平均 值士SFM表示甲胎蛋白(AFP)和特異性細(xì)胞表面標(biāo)記(⑶14，34，38，45和血型糖蛋白A) 陽(yáng)性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。圖7a，7b和7c顯示了去掉紅血細(xì)胞之前和之后的甲胎蛋白表達(dá)。圖7a顯示了使 用Percoll分離法選擇性去掉紅細(xì)胞或者沒(méi)有去掉紅細(xì)胞的胎兒肝臟細(xì)胞懸液中的甲胎 蛋白的表達(dá)且圖7b顯示了白蛋白的表達(dá)。圖7c顯示了表達(dá)甲胎蛋白和白蛋白兩者的細(xì)胞 比例，表示為AFP或白蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。顯示了使用Percoll分離法去掉紅細(xì)胞的細(xì) 胞的數(shù)據(jù)。圖8 813，8(3，8(1，86和8€顯示了胎兒肝臟細(xì)胞懸液0)14，CD38和AFP共表達(dá)的 FACS分析。雙變量散點(diǎn)圖(8a)顯示了 Tricolor染色的⑶14(縱坐標(biāo))與FITC染色的 ⑶38 (橫坐標(biāo))的分布。根據(jù)⑶14和⑶38信號(hào)產(chǎn)生通道以選擇特異性細(xì)胞分組。然后用 于顯示各亞組中AFP染色的強(qiáng)度(圖8b，8c，8d和8e)。AFP結(jié)果表明通過(guò)選擇⑶38或者 ⑶14陽(yáng)性的細(xì)胞產(chǎn)生了 AFP的高水平富集。全部細(xì)胞懸液(30，000個(gè)細(xì)胞)產(chǎn)生的AFP信 號(hào)在圖8f中顯示。圖9顯示了 AFP-陽(yáng)性細(xì)胞的⑶14和⑶38富集。通過(guò)選擇具有陽(yáng)性表面標(biāo)記的 細(xì)胞的標(biāo)記CD38和CD14可顯著增大從胎兒肝臟制備的細(xì)胞懸液中AFP-陽(yáng)性細(xì)胞的比例。 兩種標(biāo)記的組合產(chǎn)生的含有AFP的細(xì)胞的富集比用單一標(biāo)記獲得的富集明顯更好。圖10a，10b, IOc和IOd顯示了人肝祖細(xì)胞的熒光顯微鏡檢。來(lái)自胎兒肝臟的代表性肝祖細(xì)胞的AFP成分被染色。細(xì)胞大小表示同時(shí)存在早期 的祖細(xì)胞和更進(jìn)化的肝祖細(xì)胞。圖11a，11b，Ilc和Ild顯示了以表達(dá)AFP選擇的代表性細(xì)胞。⑶14染色陽(yáng)性的細(xì) 胞(lib和lid)是成肝細(xì)胞的特征。表面標(biāo)記染色陰性的細(xì)胞(圖Ila和lie)較小且大 小和形態(tài)與早期肝祖細(xì)胞一致。圖12a到12c是相同的視野且顯示了在該視野中有兩個(gè)AFP陽(yáng)性細(xì)胞。圖12a顯 示了一個(gè)聚焦相的圖像。圖12b顯示了用AFP抗體的免疫熒光。圖12c顯示了(a)和(b) 的覆蓋圖，顯示了在肝臟細(xì)胞組中AFP陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。發(fā)現(xiàn)不論從胎兒還是從成年肝 臟中分離的AFP陽(yáng)性細(xì)胞都具有相似的細(xì)胞大小和形態(tài)學(xué)。圖13a和13b顯示了用鈣黃綠素標(biāo)記的細(xì)胞(a)以顯示所有細(xì)胞類型。圖13(b) 由共表達(dá)AFP的相同細(xì)胞組成并顯示了只有兩個(gè)細(xì)胞為AFP-陽(yáng)性。細(xì)胞大小不是AFP陽(yáng) 性的要素。肝臟的再生能力是廣泛公認(rèn)的，且通常通過(guò)正常情況下增殖靜息的肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期來(lái)實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。然而，當(dāng)肝細(xì)胞再生受損時(shí)，小膽管增生并侵入相鄰的肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)中。 在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，這些管細(xì)胞稱為卵形細(xì)胞，其與缺陷型再生的聯(lián)系導(dǎo)致相信它們是 轉(zhuǎn)化的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。這些細(xì)胞具有極大的生物學(xué)益處，因?yàn)槠湔Ｏ鄳?yīng)細(xì)胞，即肝祖細(xì) 胞可用作肝臟移植的替代選擇且它們也可用作基因治療以矯正先天性代謝錯(cuò)誤的載體。盡 管已經(jīng)明確地證實(shí)了祖細(xì)胞分化成肝細(xì)胞的能力，但是由于供體肝臟組織的缺乏，對(duì)所述 細(xì)胞的要求還不能滿足所需的供應(yīng)。正如本文所公開(kāi)的，從人尸體肝臟分離肝臟祖細(xì)胞是新的且是意想不到的，因?yàn)?本領(lǐng)域流行的觀點(diǎn)是由于局部缺血肝臟喪失了其實(shí)用性。通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明人首次用于從尸體獲得本發(fā)明的獨(dú)特細(xì)胞群體的獨(dú)特方法，標(biāo)記 和參數(shù)的組合獲得了從本文所述的尸體供體分離人肝祖細(xì)胞。甲胎蛋白和白蛋白這兩種胞質(zhì)蛋白質(zhì)認(rèn)為是肝細(xì)胞譜系特別可靠的標(biāo)記。它們已 成為從肝臟中的其它細(xì)胞類型鑒定肝細(xì)胞亞群體的策略的基礎(chǔ)。在肝細(xì)胞的鑒定中兩者都 是關(guān)鍵性向?qū)?，但甲胎蛋白尤其是在?jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)純化后的肝祖細(xì)胞的鑒定特征。甲胎 蛋白，即AFP也已經(jīng)被用于在任何類型的分離策略后評(píng)估肝祖細(xì)胞的純度。然而，在證實(shí)這兩種標(biāo)記在鑒定肝細(xì)胞譜系中的有效性的嚴(yán)格對(duì)照中，進(jìn)行了 PCR 分析以檢測(cè)在肝臟組織中已知的多種細(xì)胞類型中的表達(dá)。PCR分析是檢測(cè)即使微量的特定 mRNA種類的表達(dá)時(shí)最敏感的測(cè)定法。本文公開(kāi)的本發(fā)明證實(shí)了在造血祖細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)AFP 和白蛋白兩者mRNA的具體同種型意味著當(dāng)使用該敏感測(cè)定法時(shí)，必須使用其它標(biāo)準(zhǔn)，例如 使用AFP的外顯子1探針用于從造血細(xì)胞群體限定肝細(xì)胞。盡管PCR分析揭示了造血祖細(xì) 胞可表達(dá)AFP和白蛋白mRNA種類，但mRNA表達(dá)水平極低。事實(shí)上，當(dāng)在蛋白質(zhì)水平上測(cè)量 AFP和白蛋白時(shí)，在造血祖細(xì)胞中不致發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)的AFP或白蛋白。因此，對(duì)于常規(guī)蛋白測(cè) 定法(免疫熒光，Western印跡等)和高水平表達(dá)mRNA的測(cè)定法(Northern印跡)，AFP和 白蛋白仍然是確定肝細(xì)胞譜系的有價(jià)值的標(biāo)記。本發(fā)明還公開(kāi)了 RT-PCR特異性引物的設(shè)計(jì)和制備以測(cè)定肝細(xì)胞與造血細(xì)胞群體 中AFP mRNA同種型的表達(dá)方式。人AFP RT-PCR引物的三種不同組合用于區(qū)別肝細(xì)胞和造 血細(xì)胞譜系中AFP mRNA的表達(dá)。為了檢測(cè)造血細(xì)胞中AFP的表達(dá)，如實(shí)施例1所舉例，本 發(fā)明人篩選了肝細(xì)胞與造血細(xì)胞來(lái)源的一些細(xì)胞系中AFP的完全與截短形式。在這些試驗(yàn) 中使用RT-PCR，它是已知鑒定特定RNA模板時(shí)最敏感的技術(shù)。迄今的數(shù)據(jù)表明人AFP在來(lái) 自肝祖細(xì)胞的兩個(gè)人細(xì)胞系(HepG2和H印3B)中以完全形式存在，在來(lái)自造血祖細(xì)胞的人 細(xì)胞系K562中以截短形式存在。外顯子1是肝祖細(xì)胞亞群體所特有的事實(shí)使得人們能夠 使用它作為鑒定肝細(xì)胞與造血祖細(xì)胞類型的探針。該試驗(yàn)用于鑒定本發(fā)明的肝臟祖細(xì)胞中 的特定亞群體。因此，為了檢測(cè)肝臟祖細(xì)胞中人AFP mRNA的存在，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了 9個(gè)PCR引物。 所有的引物組合檢測(cè)人肝細(xì)胞系H印G2和H印3B中的AFP mRNA。然而，除了用于全長(zhǎng)hAFP mRNA的一個(gè)外所有的引物組合在人紅白血病細(xì)胞系K562中都擴(kuò)增AFP mRNA的部分。如 上推測(cè)，這證實(shí)了在K562中表達(dá)AFP的一種截短形式，而不是全長(zhǎng)形式。該結(jié)果表明鑒定 肝細(xì)胞的有用引物僅僅是檢測(cè)全長(zhǎng)AFP的那些引物，更多證明其表達(dá)以組織特異性方式受 到限制。篩選肝細(xì)胞與造血細(xì)胞來(lái)源的一些細(xì)胞系和原始組織中AFP的完全與截短形式。 盡管在一些造血組織中發(fā)現(xiàn)了 AFP的截短形式，但組織中哪一種細(xì)胞類型表達(dá)它仍是未知的。由于在造血細(xì)胞的一些亞群體中發(fā)現(xiàn)了 AFP的截短形式，所以也分析了肝細(xì)胞和 造血細(xì)胞中的白蛋白。白蛋白的引物以類似于AFP(見(jiàn)上文)的方式形成并用于評(píng)估肝細(xì) 胞與造血細(xì)胞系中白蛋白的表達(dá)(見(jiàn)圖4)。對(duì)于AFP，在造血細(xì)胞系K562中發(fā)現(xiàn)了一種截 短的形式，一種可被外顯子12-14的引物檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄子。在本文所述的研究之前，在關(guān)于造血祖細(xì)胞的大量文獻(xiàn)中，沒(méi)有一個(gè)曾報(bào)道在人 的正常造血祖細(xì)胞中成熟的或截矩的AFP或白蛋白的表達(dá)。人肝臟祖細(xì)胞的處理和冷藏為了最理想地從胎兒或成年肝臟產(chǎn)生分離的人肝臟祖細(xì)胞，本文公開(kāi)的方案使用 密度梯度的上面部分并去掉沉淀。本文所公開(kāi)的密度梯度離心的新變化是棄去沉淀并保留 具有低浮力密度的細(xì)胞(即在梯度頂部收集的細(xì)胞)并用于進(jìn)一步研究。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 在Percoll密度梯度內(nèi)或其頂部存在年幼的細(xì)胞(S卩，二倍體)和對(duì)于冷藏更健康的細(xì)胞。本文所述的培養(yǎng)方法學(xué)是特有的且被進(jìn)一步改良用于人和/或嚙齒類肝臟細(xì)胞。 另外，培養(yǎng)基可包括用純化的細(xì)胞外基質(zhì)成分包裹的可生物降解珠，然后可用于接種結(jié)合 到珠上的細(xì)胞以用于生物反應(yīng)器。本發(fā)明的冷藏方法學(xué)是特有的且不同于現(xiàn)有技術(shù)中使用的方法。主要區(qū)別是由于 使用了不同的緩沖液且冷藏包括祖細(xì)胞群體的二倍體肝細(xì)胞群體，該細(xì)胞密度低，因此在 梯度離心中上浮。成熟的人肝臟細(xì)胞的成功冷藏是非常需要的，但在本領(lǐng)域中從未實(shí)現(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)， 成功冷藏定義為在液氮溫度(-160°C到180°C)下冷凍細(xì)胞，然后復(fù)蘇它們并獲得>75%的 活力的能力且具有附著到培養(yǎng)皿上的能力。任何來(lái)源的細(xì)胞系，例如精子和卵子和來(lái)自胎 兒組織的細(xì)胞可在含水緩沖液(即，諸如DME，DulbeCC0’s改良的Eagle's培養(yǎng)基，或RPMI 1640的培養(yǎng)基)并補(bǔ)充10%血清+冷凍保護(hù)劑(最常見(jiàn)的是二甲基亞砜DMS0)中成功冷 凍并在復(fù)蘇時(shí)70-90%有活力且具有極好的貼壁能力。本發(fā)明的特殊冷藏方法學(xué)通過(guò)使用新緩沖液，新細(xì)胞群體和包括以細(xì)胞外基質(zhì)的 形式包埋細(xì)胞的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)。該方法學(xué)首次實(shí)現(xiàn)了復(fù)蘇時(shí)的活力與冷凍前細(xì)胞分散后立即 測(cè)量的活力沒(méi)有不同(參見(jiàn)圖3)。實(shí)際活力由于到達(dá)時(shí)組織的狀況而可變，在本試驗(yàn)中胎 兒尸體肝臟細(xì)胞平均為77%。該冷藏方法學(xué)導(dǎo)致冷凍過(guò)程后的活力和復(fù)蘇后離開(kāi)體內(nèi)的可 貼壁和增殖的細(xì)胞不明顯損失。細(xì)胞標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)使用我們現(xiàn)在的定義，即肝臟祖細(xì)胞是表達(dá)甲胎蛋白且表達(dá)或不表達(dá)白蛋白的未 成熟細(xì)胞群體，評(píng)價(jià)了特異性選擇這些細(xì)胞的標(biāo)記。一個(gè)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是許多作為造血 祖細(xì)胞傳統(tǒng)標(biāo)記的標(biāo)記(即CD34)也可鑒定肝祖細(xì)胞亞群體。因此，對(duì)CD34的單一顏色分 選導(dǎo)致明顯富集(至少9-倍)表達(dá)AFP的細(xì)胞。然而，不是所有的這些AFP陽(yáng)性細(xì)胞都被 證實(shí)是肝祖細(xì)胞。根據(jù)白蛋白陽(yáng)性的百分?jǐn)?shù)，大約80-90%的細(xì)胞是肝祖細(xì)胞，其它是未成 熟以致尚未表達(dá)白蛋白的肝祖細(xì)胞或者可能是表達(dá)甲胎蛋白的造血亞群體。本發(fā)明使用了獨(dú)特的流式細(xì)胞分選策略。使用AFP和白蛋白表達(dá)的組合作為肝祖 細(xì)胞的兩個(gè)獨(dú)特限定特征，鑒定了限定肝祖細(xì)胞的抗原標(biāo)記和其它流式細(xì)胞術(shù)參數(shù)。目前 的分選策略包括分選小細(xì)胞(通過(guò)前向散射測(cè)量為< 15微米)，它是二倍體(使用Hoechst染料33342產(chǎn)生的熒光)，側(cè)面散射無(wú)顆粒，且對(duì)某些造血細(xì)胞抗原(即血型糖蛋白A，紅血 細(xì)胞抗原和CD45)為陰性，接著是肝細(xì)胞亞群體和造血細(xì)胞亞群體共有的標(biāo)記(即CD14和 /或⑶38)為陽(yáng)性。在本文所述的實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人通過(guò)分選高度表達(dá)甲胎蛋白，表達(dá)已知是特異性 造血干細(xì)胞標(biāo)記的CD34，和任選微弱表達(dá)白蛋白的那些細(xì)胞來(lái)鑒定肝祖細(xì)胞。本文還描述 了造血細(xì)胞也可表達(dá)AFP，盡管是一種截短形式的證據(jù)。本發(fā)明人描述了一種新細(xì)胞群體和 分離、鑒定、培養(yǎng)的方法，以及使用該細(xì)胞群體的方法。本發(fā)明的特定細(xì)胞群體的分離、鑒定 和培養(yǎng)的成功部分通過(guò)先進(jìn)的分離方法，親和壓實(shí)，具有更大速度和精確度的高速熒光激 活細(xì)胞分選，和改進(jìn)的冷藏和培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。設(shè)計(jì)流式細(xì)胞分選策略從新分離的細(xì)胞懸液或從復(fù)蘇的冷藏肝臟細(xì)胞中純化肝 臟祖細(xì)胞，它包括1)用一些抗特異性細(xì)胞表面標(biāo)記的熒光探針標(biāo)記的抗體染色細(xì)胞和2) 在多參數(shù)流式細(xì)胞技術(shù)中使用陰性和陽(yáng)性分選的聯(lián)合。從人肝細(xì)胞群體純化特定譜系階段 的方法可用于來(lái)自任何年齡供體的肝臟，因?yàn)樵摌?biāo)記似乎是譜系-位置特異性的。改進(jìn)的標(biāo)記細(xì)胞的方法，和相對(duì)于過(guò)去使用的流式細(xì)胞儀(Becton Dickenson' s FACSTAR PLUS,以2000-6000個(gè)細(xì)胞/秒分選細(xì)胞且進(jìn)行2_4種顏色分選)顯著改進(jìn)的流 式細(xì)胞儀(來(lái)自Cytomation的“aMoFlo”流式細(xì)胞儀，以40，000個(gè)細(xì)胞/秒分選細(xì)胞且進(jìn) 行8種顏色分選)幫助成功分離，和鑒定了這一新的細(xì)胞群體。在細(xì)胞懸液中完全確定了 AFP和白蛋白樣免疫反應(yīng)性的表達(dá)，有清楚的一群細(xì)胞 與背景信號(hào)表現(xiàn)出明顯的區(qū)別(圖6)。在未分離的細(xì)胞懸液中6. 9士0.86%的細(xì)胞表達(dá)甲 胎蛋白，而在7.7士 1. 中存在白蛋白。在AFP陽(yáng)性細(xì)胞中，75. 6士4. 9%共表達(dá)白蛋白，而 80 士 5. 5 %的白蛋白陽(yáng)性細(xì)胞也表達(dá)AFP。因此，大約25 %的表達(dá)甲胎蛋白的細(xì)胞不表達(dá)白 蛋白且20 %的表達(dá)白蛋白的細(xì)胞不表達(dá)甲胎蛋白。完全細(xì)胞懸液(即包括紅細(xì)胞)中帶有本研究中使用的原則性表面標(biāo)記的細(xì)胞比 例在表1中顯示(其中GA是血型勝蛋白A，紅血細(xì)胞上的一種表面標(biāo)記)表1 原始肝臟細(xì)胞懸液中CD陽(yáng)性群體的百分?jǐn)?shù)和AFP陽(yáng)性的百分?jǐn)?shù)CD14CD34CD38CD45GA未分離的懸液占群體％ 3. 7士0.8(8) 2. 8士0.5 2. 2士0.4 2. 6士0.5 36. 8士5AFP 陽(yáng)性％ 81. 7士2. 2 72. 6士4. 2 57. 6士4. 6 22. 2士4. 4 2. 3士0.6很明顯，血型糖蛋白A(GA)陽(yáng)性細(xì)胞(即紅細(xì)胞)是細(xì)胞群體的主要組分，但 AFP-陽(yáng)性細(xì)胞是微小部分。因此，當(dāng)通過(guò)Percoll分離法去掉細(xì)胞懸液中的紅細(xì)胞時(shí)，表 達(dá)AFP的細(xì)胞比例顯著增加到12. 9士 1.9%且表達(dá)白蛋白的那些細(xì)胞增加到12. 1 士2. 3%。 共表達(dá)白蛋白的AFP陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)也增加到80. 5+8. 2%且共表達(dá)AFP的白蛋白陽(yáng)性細(xì)胞 比例增加到89+3. 1%，盡管沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的改變。該操作對(duì)攜帶表面標(biāo)記的細(xì)胞比例 的結(jié)果與顯示AFP染色陽(yáng)性的各亞組的比例一起在表2中顯示。表2 去掉紅細(xì)胞后肝臟細(xì)胞懸液中CD陽(yáng)性群體的百分?jǐn)?shù)和AFP陽(yáng)性的細(xì)胞百分 數(shù)CD14CD34CD38CD45GA去掉紅細(xì)胞
% 占群體 7. 4 士 1.3 3. 4 士 0.5 4. 8 士 0.9 8. 2 士 0. 3 27. 5 士 4. 7% AFP 陽(yáng)性 89. 8士 1.3 77. 1 士2. 9 53. 5士7. 2 32. 5士 1.3 1.8士0.9在大多數(shù)情況下，在以細(xì)胞表面標(biāo)記選擇的亞組中AFP的存在連續(xù)分布，顯示出 染色強(qiáng)度在陽(yáng)性范圍內(nèi)的細(xì)胞明顯占優(yōu)勢(shì)。然而，對(duì)于共表達(dá)AFP的CD38陽(yáng)性細(xì)胞的分布 是獨(dú)特的。在⑶38-陽(yáng)性細(xì)胞中，AFP共表達(dá)明顯呈雙峰分布，其中明顯有兩個(gè)不同組的細(xì) 胞，一個(gè)為AFP陽(yáng)性組，另一個(gè)為陰性。這點(diǎn)在圖8a中顯示，它顯示了表達(dá)CD14和CD38的 染色細(xì)胞的散點(diǎn)圖以及在CD14和/或CD38陽(yáng)性細(xì)胞中甲胎蛋白表達(dá)的單變量直方圖。結(jié)果表明甲胎蛋白(AFP)在胎兒肝臟組織的單細(xì)胞懸液(即原始細(xì)胞懸液)中 的7%的細(xì)胞中存在。發(fā)現(xiàn)抗血型糖蛋白A(在紅血細(xì)胞，即紅細(xì)胞上的一種抗原)的抗體 鑒定出不表達(dá)AFP的細(xì)胞亞群體。因此，從打算鑒定肝祖細(xì)胞的細(xì)胞中排除表達(dá)該抗原的 細(xì)胞(即，紅細(xì)胞)。CD38抗原鑒定了一群細(xì)胞，它們表現(xiàn)出AFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著提高 (即，比未分離樣品中的比例高7倍)。兩種抗原都具有許多同種型，取決于是否有剪接變 異體編碼的分子片斷存在。鑒定各種同種型的抗體是可獲得的。造血祖細(xì)胞的傳統(tǒng)標(biāo)記，即⑶34存在于許多也表達(dá)AFP的細(xì)胞上。⑶34陽(yáng)性細(xì) 胞的分選導(dǎo)致AFP陽(yáng)性細(xì)胞的富集比原始細(xì)胞懸液中發(fā)現(xiàn)的高至少9倍(在CD34-陽(yáng)性細(xì) 胞中的67%與在原始細(xì)胞懸液中的7% )。然而，富集AFP陽(yáng)性細(xì)胞最有效的單一抗體是 ⑶14，它導(dǎo)致這些細(xì)胞的比例比原始群體增加11倍(81%相對(duì)于7%)。因此，通過(guò)使用表面標(biāo)記的組合提高了 AFP陽(yáng)性細(xì)胞的產(chǎn)率。因此，測(cè)定AFP與表 面標(biāo)記的選定組合共表達(dá)的程度以建立增加細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的選擇程度。該數(shù)據(jù)表示為表達(dá)表 面標(biāo)記的AFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例(稱為AFP陽(yáng)性細(xì)胞的“產(chǎn)率”)和在表面標(biāo)記限定的群體中 出現(xiàn)的所有AFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例(稱為AFP陽(yáng)性細(xì)胞的“富集”系數(shù))。⑶14，⑶34與⑶38 組合的結(jié)果以及用于比較的單個(gè)結(jié)果在表3中表示。表3.CD14CD34CD38CD14 士 CD38 CD14 士 CD34富集 80. 6 士 2. 6 66. 7 士 4. 7 53. 8 士 4. 5 66. 9 士 3. 5 68. 2 士 3. 9產(chǎn)率39. 8 士 2. 6 26. 9 士4. 4 22. 0 士 2. 7 50. 6 士 2. 7 52. 2 士 5. 5富集表達(dá)任一(或兩種)表面標(biāo)記且同時(shí)為AFP陽(yáng)性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。產(chǎn)率同時(shí)表達(dá)一種或兩種表面標(biāo)記組合的AFP陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。對(duì)于⑶14/⑶38標(biāo)記組合的這些數(shù)據(jù)還顯示在圖9中。AFP染色陽(yáng)性的細(xì)胞形態(tài)學(xué)是可變的且包含來(lái)自胎兒肝臟而不是成人肝臟的細(xì)胞 懸液中的細(xì)胞大小和形狀的全部范圍。最大的AFP-陽(yáng)性細(xì)胞大約12-15微米，比大小范圍 為20-50微米的成熟肝細(xì)胞小得多。這點(diǎn)在圖10中顯示，該圖顯示了一些AFP-陽(yáng)性細(xì)胞 選擇表達(dá)特異性抗體。在所有情況下一定比例的AFP-陽(yáng)性細(xì)胞顯示出不表達(dá)在本研究中使用的任何表 面抗體。這些AFP陽(yáng)性“裸”細(xì)胞的外觀在圖Ila和Ilc中表示，其中將它們與從相同懸液 分選的⑶14陽(yáng)性/AFP陽(yáng)性細(xì)胞的外觀(圖lib和lid)進(jìn)行了比較。圖Ila和lib是微 分干涉相差顯微鏡照片，圖Ilc和Ild是AFP免疫熒光。很明顯盡管兩種細(xì)胞類型都是AFP 陽(yáng)性，但表面抗原染色陰性的細(xì)胞比CD14陽(yáng)性細(xì)胞更小且復(fù)雜度更低?？傊?，分選肝祖細(xì)胞的標(biāo)記是血型糖蛋白A_，⑶45_，ICAM+,⑶14+和/或⑶38+，或
17者除了 ICAM+外所有這些標(biāo)記都無(wú)，且是二倍體，無(wú)顆粒(側(cè)向散射)，不超過(guò)15微米(前 向散射)。這些分選細(xì)胞的表型是小細(xì)胞(< 15微米)，細(xì)胞質(zhì)較小(核/胞質(zhì)比率高)， 白蛋白和/或AFP’”。該細(xì)胞的形態(tài)學(xué)見(jiàn)圖10-12。胎兒和成人肝臟中表達(dá)甲胎蛋白的細(xì)胞的聚焦鑒定使用聚焦顯微鏡以獲得表達(dá)甲胎蛋白的人胎兒，小兒，或成人細(xì)胞的圖像。該方法 學(xué)允許現(xiàn)察這些細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和大小并直接顯示諸如AFP和ALB的細(xì)胞內(nèi)蛋白的位置和諸 如CD34和CD38的膜表面標(biāo)記的位置。表達(dá)AFP的細(xì)胞在胎兒，小兒，和成人肝臟中都有發(fā) 現(xiàn)(圖12a)。正如預(yù)期，胎兒肝臟具有最高百分?jǐn)?shù)(6-7% )而成人肝臟具有小百分?jǐn)?shù)(青 年< 4% )且在中年人中隨年齡減少到< 1%。在年齡超過(guò)57歲的供體肝臟中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表 達(dá)AFP的細(xì)胞。通過(guò)Percoll分離過(guò)程顯著富集在尸體肝臟中發(fā)現(xiàn)的少量肝祖細(xì)胞使得在 供體肝臟的Percoll餾分1和2中得到2%的細(xì)胞(表4)。表4顯示了來(lái)自Percoll-添加緩沖液的餾分的細(xì)胞大小和活力。在相同條件下 分離后較小的細(xì)胞(餾分1-3)比較大的細(xì)胞(餾分4)具有更高的活力。表4
Percoll
餾分活力(％ )細(xì)胞大小(μπι)%AFP+細(xì)胞
餾分182< 120. 5-1%
餾分28410-152%
餾分38515-25< 0. 2%
餾分45625-50< 0. 01%
這些結(jié)果表明優(yōu)選用于肝臟細(xì)胞治療以及器官移植的供體器官包括來(lái)自年齡達(dá)
到45歲的青年供體的器官且該肝臟優(yōu)選從心跳停止的前30小時(shí)內(nèi)分離。來(lái)自老年病人 (年齡> 71歲)的肝臟對(duì)于細(xì)胞治療且也許對(duì)于完全器官移植，特別是對(duì)于兒童不是合適 的供體，因?yàn)樗鼈兙哂休^小(如果有的話)的來(lái)自肝祖細(xì)胞的再生能力且僅具有最小的已 知從成熟細(xì)胞獲得的再生能力。成熟譜系本發(fā)明的發(fā)明人顯示了局部缺血損傷的肝臟含有在正常和疾病狀態(tài)下都能生長(zhǎng) 并分化成肝細(xì)胞和膽細(xì)胞的肝祖細(xì)胞群體。本發(fā)明支持了這樣的觀點(diǎn)，即肝臟譜系中的每 一位置是不同的成熟階段且在肝臟中有多種干細(xì)胞群體。令人驚奇的是本發(fā)明的肝臟提供了 3種不同的成熟譜系一種負(fù)責(zé)肝生成，產(chǎn)生 肝臟組織且具有肝細(xì)胞和膽細(xì)胞(膽管)的細(xì)胞命運(yùn)；另一種負(fù)責(zé)造血，產(chǎn)生血細(xì)胞，具有 淋巴細(xì)胞(B和T)，血小板，巨噬細(xì)胞，嗜中性白細(xì)胞和粒細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)；第三種負(fù)責(zé)間充 質(zhì)形成，產(chǎn)生間充質(zhì)衍生物且具有內(nèi)皮細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，甚至是骨細(xì)胞 的細(xì)胞命運(yùn)。本發(fā)明分離的細(xì)胞群體具有作為成功地肝臟定向細(xì)胞治療和/或基因治療的巨 大潛力。如實(shí)施例所述，本發(fā)明在非人靈長(zhǎng)類以及人肝祖細(xì)胞可成功進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和維持 同時(shí)仍保留其完全分化或成熟的能力的條件鑒定方面取得了巨大進(jìn)展。按照本文公開(kāi)的教 導(dǎo)，可以從尸體分離并在培養(yǎng)基中維持未分化的肝祖細(xì)胞，然后更換成分化相關(guān)培養(yǎng)基用 于移植。
由于其明顯的體外擴(kuò)增能力，本發(fā)明的細(xì)胞群體相似于造血譜系中的細(xì)胞，可用 作細(xì)胞種子用于離開(kāi)體內(nèi)的擴(kuò)增。這可消除對(duì)病人肝臟的主要侵入性手術(shù)切除術(shù)的必要 性。一旦在培養(yǎng)基中建立人肝祖細(xì)胞，可進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。這可用許多不同基因傳遞載 體系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)(見(jiàn)下文提供的實(shí)施例)。在這點(diǎn)上的一個(gè)重要考慮因素是一些形式的基因 轉(zhuǎn)移需要迅速生長(zhǎng)的細(xì)胞，由于本發(fā)明的人二倍體細(xì)胞和/或祖細(xì)胞在正常生理學(xué)條件下 有效分裂，因此這些細(xì)胞是將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)肝臟的理想候選者。另外，本發(fā)明的細(xì)胞群體的生 長(zhǎng)特征允許用于離開(kāi)體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移，其中使用的某些基因傳遞病毒載體需要細(xì)胞增殖以 便有效插入和表達(dá)基因。本發(fā)明的祖細(xì)胞群體也適合于自體或同種異體肝臟定向細(xì)胞或基因治療。很明 顯，使用自體肝祖細(xì)胞可消除有關(guān)移植細(xì)胞排斥的重要顧慮。本發(fā)明的細(xì)胞群體對(duì)于同種 異體細(xì)胞轉(zhuǎn)移特別有吸引力，因?yàn)槠淇乖植记闆r表明它具有最小的免疫排斥現(xiàn)象。而且， 已知具有高度免疫原性的諸如血細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，肝巨噬細(xì)胞的其它細(xì)胞成分通過(guò)該純化 過(guò)程基本上被剔除。一旦分離和純化了該自體或同種異體肝祖細(xì)胞，可對(duì)它們進(jìn)行遺傳修飾或原樣使 用，如果需要可進(jìn)行增殖，然后移植回宿主。如果需要遺傳修飾，在遺傳修飾后和移植前，可 擴(kuò)增那些遺傳修飾的細(xì)胞和/或根據(jù)顯性選擇標(biāo)記的插入和表達(dá)進(jìn)行選擇?？梢浦不馗问?或異位位點(diǎn)。為了移植進(jìn)肝室中，可使用門靜脈輸注或脾內(nèi)注射。脾內(nèi)注射是可選擇的施 用途徑，因?yàn)榻?jīng)脾內(nèi)注射移植的大多數(shù)肝祖細(xì)胞可移動(dòng)進(jìn)肝臟。一旦在肝室中，移植的，遺 傳修飾的肝祖細(xì)胞成熟成正常肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)。另一醫(yī)學(xué)方法可促進(jìn)移植的肝祖細(xì)胞移入肝的效力。動(dòng)物模型證實(shí)在部分肝切除 術(shù)中，施用血管形成因子和其它生長(zhǎng)因子幫助移植的肝細(xì)胞移入和有活力。一個(gè)替代方法 是將遺傳修飾的肝細(xì)胞移植進(jìn)異位位點(diǎn)。至今對(duì)于肝臟的細(xì)胞治療方法僅顯示出平常的效力。這可能是由于這樣的事實(shí)， 即使用的供體細(xì)胞主要是成人肝臟細(xì)胞且分離和再注射后壽命短。另外，使用成人細(xì)胞導(dǎo) 致強(qiáng)烈的免疫排斥。在本案例中，肝祖細(xì)胞提供了更大的效力，因?yàn)槠湔T發(fā)免疫學(xué)排斥現(xiàn)象 的能力有限且因?yàn)樗鼈兙哂袕V泛的再生潛力。對(duì)于基因治療，正在進(jìn)行的努力使用了“定向可注射載體”，它是開(kāi)發(fā)中的用于臨 床治療的最流行途徑。這些方法的效力有限，因?yàn)槊庖邔W(xué)問(wèn)題和載體的瞬時(shí)表達(dá)都存在。用 祖細(xì)胞進(jìn)行離開(kāi)體內(nèi)的基因治療(或者使用可注射載體以某種方式靶向那些祖細(xì)胞群體) 可證實(shí)更有效，因?yàn)樵撦d體可導(dǎo)入離開(kāi)體內(nèi)的祖細(xì)胞的純化亞群體；選擇修飾的細(xì)胞并重 新導(dǎo)入體內(nèi)。祖細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)是它們有巨大的擴(kuò)增潛力，最小的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)力(如果有的 話)，和分化產(chǎn)生全部譜系的成熟細(xì)胞的能力。共同或相互依賴的譜系改進(jìn)的方法學(xué)使得本發(fā)明人能夠更嚴(yán)密地研究和鑒定肝祖細(xì)胞。這些研究揭示了 肝祖細(xì)胞與造血祖細(xì)胞之間特別密切的關(guān)系，表明這兩個(gè)譜系之間有近親關(guān)系。事實(shí)上，這 些研究表明肝祖細(xì)胞和造血譜系共有許多抗原標(biāo)記(⑶14，⑶34，⑶38，c-kit，卵形細(xì)胞抗 原)，共有生化特性(即，轉(zhuǎn)鐵蛋白，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，和甲胎蛋白的截短同種型)，且在 用于離開(kāi)體內(nèi)的擴(kuò)增的培養(yǎng)要求(細(xì)胞外基質(zhì)的形式和特定激素要求)上有廣泛的重疊。兩個(gè)譜系的祖細(xì)胞位于肝臟腺泡內(nèi)的相同位點(diǎn)。最后，兩個(gè)成熟譜系的細(xì)胞中存在旁分泌 信號(hào)；它是由各譜系產(chǎn)生的調(diào)節(jié)另一譜系的細(xì)胞的信號(hào)。事實(shí)上，可推斷在肝細(xì)胞和造血細(xì) 胞之間有一個(gè)共同的譜系或至少是相互依賴的譜系。可純化本文公開(kāi)的細(xì)胞群體并用于根據(jù)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)條件產(chǎn)生骨髓造血細(xì) 胞或肝細(xì)胞衍生物。因此，如果細(xì)胞被再導(dǎo)入體內(nèi)進(jìn)入血液中，它們可有效地產(chǎn)生骨髓造血 細(xì)胞衍生物；如果被導(dǎo)入肝臟，它們會(huì)產(chǎn)生肝臟細(xì)胞。在離開(kāi)體內(nèi)維持的細(xì)胞中應(yīng)出現(xiàn)相似 的現(xiàn)象。因此，用同時(shí)限定肝和造血祖細(xì)胞的一組抗原(即，⑶38+，c-kit+，⑶45_)分選的 細(xì)胞群體接種的生物反應(yīng)器系統(tǒng)可導(dǎo)致細(xì)胞群體具有多種命運(yùn)。本發(fā)明的細(xì)胞群體的另一重要方面是群體中的一些細(xì)胞展示出特異性的祖細(xì)胞 表面抗原⑶34。⑶34已被用作骨髓造血干細(xì)胞的方便的陽(yáng)性選擇標(biāo)記。本文公開(kāi)的本發(fā) 明顯示了純化任何祖細(xì)胞群體的更好方法，例如隨后可用于臨床和臨床前期程序的造血和 肝祖細(xì)胞群體。人肝祖細(xì)胞的用途有許多且變化多樣。它們包括1)對(duì)人細(xì)胞的研究；2)產(chǎn)生疫 苗或抗病毒劑；3)毒理學(xué)研究；4)藥品開(kāi)發(fā)；5)蛋白質(zhì)生產(chǎn)(使用該細(xì)胞作為各種人特異 性因子的宿主)；6)肝臟細(xì)胞治療7)肝臟基因治療；8)可用于研究，毒理學(xué)和抗微生物試 驗(yàn)，蛋白質(zhì)生產(chǎn)，或者臨床上用作肝臟輔助系統(tǒng)的人造生物肝臟?？紤]到正如本發(fā)明的發(fā)明 人所預(yù)言的，在造血和肝生成之間有共同譜系的可能性，相同的細(xì)胞可同時(shí)適合于肝細(xì)胞 或者造血細(xì)胞命運(yùn)，這取決于它們所放置的微環(huán)境。高度純化的人肝祖細(xì)胞的可獲得性允許對(duì)人細(xì)胞進(jìn)行更加廣泛的研究，且肯定會(huì) 幫助建立肝臟細(xì)胞治療和基因治療的成功方式，并允許建立人的人造生物肝臟用于研究和 作為臨床輔助裝置。目前，健康人體組織的供應(yīng)有限妨礙了在肝臟細(xì)胞治療或人的人造生 物肝臟中的臨床計(jì)劃。從尸體獲得的包括其祖細(xì)胞群體的二倍體細(xì)胞具有足夠的擴(kuò)增潛力 以極大地緩解這種有限的供應(yīng)。下面的實(shí)施例是舉例性的且不打算進(jìn)行限制性。實(shí)施例來(lái)自尸體的肝臟獲取來(lái)自尸體的肝臟經(jīng)門靜脈，腔靜脈，或兩者插入導(dǎo)管，用緩沖液灌流以清除血液； 然后用含有膠原酶/蛋白酶的緩沖液灌流以酶促解離細(xì)胞。根據(jù)肝臟的大小通常進(jìn)行 15-30分鐘的消化后，將組織擠壓通過(guò)干酪包布或尼龍濾膜或用梳子耙過(guò)以機(jī)械完成細(xì)胞 解離過(guò)程。用含有血清的緩沖液清洗解離的細(xì)胞以滅活膠原酶和在灌流過(guò)程中使用的其它 酶。灌流緩沖液Pl和P2放在37°C水浴中。在Miller型灌流盒中進(jìn)行灌流，該灌流 盒在整個(gè)灌流過(guò)程中維持在37°C。灌流期間給緩沖液充氧。盒中的所有管道用70%的 乙醇清洗，接著用蒸餾水清洗，然后用Pl清洗以保證從系統(tǒng)中去掉空氣。對(duì)于大塊肝臟 (100-300g)使用在肝臟的切口表面可利用的各種血管，使用配置在60ml注射器上的16號(hào) 針頭的Teflon插管進(jìn)行肝臟插管以便用冰冷的Pl緩沖液流過(guò)肝臟。對(duì)于可獲得完整肝葉 的情況，可對(duì)殘留的腔靜脈做插管。試驗(yàn)大塊肝臟中的各種血管以獲悉哪一條血管可提供 最佳的組織灌流。該操作也從肝臟中去掉了任何剩余的血液。對(duì)選定的血管做插管并使用 醫(yī)療級(jí)粘合劑(例如，醫(yī)療級(jí)“超級(jí)膠(superglue)”)密封固定。使用醫(yī)療級(jí)粘合劑密封所有其它的大血管和表面開(kāi)口，且如果需要，使用帶粘合劑的Q-滴頭幫助密封開(kāi)口。一旦 粘合劑干燥，將肝臟樣品放在合適大小的玻璃杯內(nèi)的尼龍網(wǎng)上。將Pl緩沖液加入杯中，并 將肝臟浸沒(méi)在緩沖液。將裝有肝臟的杯子放在灌流盒內(nèi)，并連接上插管的輸出管道。用可 接受的反壓開(kāi)始以大約24mls/分鐘的低速，然后緩慢增加到58ml/分鐘和90ml/分鐘之間 以優(yōu)化流速將Pl緩沖液再循環(huán)15分鐘。必須確認(rèn)沒(méi)有過(guò)多的灌流液從肝臟泄露。15分鐘 后，從杯中取出Pl緩沖液并用含有膠原酶的P2緩沖液代替。再循環(huán)P2緩沖液直到肝臟被 充分消化(通過(guò)肝臟從深色微紅棕色向淡棕色的顏色轉(zhuǎn)變和通過(guò)獲得肝臟的軟糊狀結(jié)構(gòu) 來(lái)評(píng)估)。P2緩沖液再循環(huán)不超過(guò)20-25分鐘。一旦結(jié)束灌流，從杯中排出P2緩沖液并將 肝臟在杯中轉(zhuǎn)移到生物學(xué)包布上。向杯中加入細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)，去掉插管和粘合劑以及肝臟的任何未消化區(qū)。使 用組織鑷子和剪刀破壞肝臟被膜(肝被膜)。這允許將消化的組織釋放進(jìn)培養(yǎng)基中，剩下結(jié) 締組織和任何未消化的材料。將消化的材料放入DMEM中，然后通過(guò)一系列不同大小的濾膜 過(guò)濾。濾膜放在大型漏斗的內(nèi)側(cè)以幫助過(guò)濾。消化的材料首先用單層干酷包布過(guò)濾，接著 用400μ的尼龍濾膜過(guò)濾，然后通過(guò)70 μ的特氟隆濾膜。將濾液平分進(jìn)離心管并以70g離 心4分鐘。離心后，在加入Percoll前，上清稱為餾分I(Fl)。向細(xì)胞沉淀中加入DMEM和等滲 的Percoll以得到分別為3 1的最終比率。例如，5ml體積的堆積細(xì)胞的小團(tuán)懸浮于30ml 的DMEM和IOml的等滲Percoll中。將樣品以IOOg離心5分鐘以產(chǎn)生稱為F4餾分的沉淀。 上清以200至400g再離心5分鐘以獲得稱為F3餾分的沉淀。現(xiàn)在上清再以600_800g離 心以獲得稱為F2餾分的沉淀。以1200-1800g進(jìn)行最后的離心以獲得稱為Fl餾分的沉淀。 懸浮不同餾分的細(xì)胞并使用錐蟲(chóng)藍(lán)染料排斥試驗(yàn)評(píng)估其活力。不同餾分的活力在表4中提 {共。保留肝臟灌流后與肝臟組織的血管或膽管樹(shù)保持結(jié)合的細(xì)胞。這些細(xì)胞在酶灌流 后獲得的原始細(xì)胞懸液中發(fā)現(xiàn)，且一般在懸液中的細(xì)胞通過(guò)后留在濾網(wǎng)(例如，干酪包布) 的上部。用酶再次處理血管和膽管樹(shù)的這些殘留物，所得的細(xì)胞與其它細(xì)胞合并在一起。大多數(shù)研究者在肝臟灌流中通常使用Percoll分餾法以排除他們認(rèn)為是碎片和 死亡細(xì)胞的成分；但這些研究者僅保留了最終的細(xì)胞沉淀。本文所公開(kāi)的對(duì)常規(guī)灌流的新 變化是，這里稱為F4的第一細(xì)胞沉淀含有發(fā)現(xiàn)對(duì)局部缺血，無(wú)論是暖或冷局部缺血最敏感 的細(xì)胞，且具有較低浮力密度的細(xì)胞(即，從以較高速度離心獲得的沉淀收集的細(xì)胞)對(duì)局 部缺血敏感性較小。在Fl，F(xiàn)2，和F3餾分中的這些細(xì)胞較小，可能是年幼的實(shí)質(zhì)細(xì)胞且具 有更大的冷凍適應(yīng)性(見(jiàn)冷藏部分)。而且，這些細(xì)胞基本上是二倍體細(xì)胞，而來(lái)自成人F4 餾分中的細(xì)胞含有大量多倍體細(xì)胞。多倍體細(xì)胞可以是雙核或單核的，且可以是四倍體或 八倍體，或者甚至是更高水平的倍性。倍性與細(xì)胞群體的分餾相關(guān)發(fā)現(xiàn)上述成人肝臟細(xì)胞的餾分(F1-F4)含有不同的細(xì)胞群體；Fl含有碎片， 紅血細(xì)胞，肝星形細(xì)胞，和含有祖細(xì)胞群體(肝譜系或造血譜系的祖細(xì)胞)的小肝細(xì)胞 (< 12 μ m) ；F2餾分含有是二倍體，小實(shí)質(zhì)細(xì)胞的較大肝細(xì)胞(12-15 μ m) ；F3餾分含有更 大型的實(shí)質(zhì)細(xì)胞(15-25 μ m)且由二倍體和四倍體細(xì)胞的混合物組成；F4餾分(所有其它 研究者使用的餾分)由最大的實(shí)質(zhì)細(xì)胞(25-50μπι)組成且?guī)缀跞渴嵌啾扼w(例如，四倍體和八倍體)。一般來(lái)說(shuō)，F(xiàn)1-F3餾分中的實(shí)質(zhì)細(xì)胞冷凍后79-95%具有活力；F4餾分中的實(shí)質(zhì)細(xì) 胞冷凍后具有50-80%的活力(依賴于到達(dá)時(shí)肝臟的狀態(tài))。鑒定的影響F4餾分中實(shí)質(zhì)細(xì) 胞活力的變量是1)供體的年齡(供體的年齡越大，細(xì)胞的預(yù)后越差)；2)心跳停止到交付 到實(shí)驗(yàn)室之間的時(shí)間(越短越好)。這些因素是相互影響的以致于迅速交付的年長(zhǎng)供體的 組織比花費(fèi)太長(zhǎng)運(yùn)輸時(shí)間的年輕病人的組織更有吸引力。局部缺血對(duì)細(xì)胞分餾的影響檢查由于局部缺血時(shí)間和溫度的影響細(xì)胞活力的結(jié)果。肝臟保持在環(huán)境或以上溫 度的情況稱為暖局部缺血。肝臟保持在環(huán)境溫度以下的情況稱為冷局部缺血。在通常實(shí)踐 中，暖局部缺血相應(yīng)于活體溫度與室溫之間的溫度，而冷局部缺血相應(yīng)于室溫以下的任何 溫度，例如，大約10°c或大約4°C。在暖局部缺血中，肝臟保持在環(huán)境溫度以上，然后灌流肝臟。在暖局部缺血的另一 形式中，肝臟保持在環(huán)境以上溫度一定時(shí)間，然后冷卻，隨后用暖解離溶液灌流。處理各灌 流產(chǎn)生的單細(xì)胞懸液以提供具有不同比例的二倍體和多倍體細(xì)胞的細(xì)胞餾分。祖細(xì)胞是二 倍體細(xì)胞的亞群體。而且，觀察到分化的多倍體細(xì)胞對(duì)環(huán)境以上溫度的局部缺血敏感。在下 表中，擇過(guò)用染色死細(xì)胞的細(xì)胞核的碘化丙錠(PI)染色區(qū)分活的大鼠肝臟細(xì)胞與死細(xì)胞。 在以流式細(xì)胞術(shù)分選的活的和死亡細(xì)胞餾分中在固定，透化，以及用PI復(fù)染之后觀察所有 細(xì)胞中的細(xì)胞核來(lái)計(jì)數(shù)單核或雙核細(xì)胞。表 5暖局部缺血時(shí)間 活細(xì)胞雙核％ 死細(xì)胞雙核％無(wú)32302 小時(shí)2747使用大鼠作為模型測(cè)量了由于暖局部缺血時(shí)間的影響來(lái)自肝臟灌流的總細(xì)胞產(chǎn) 量。使用大約8周齡，各250_300g的雄性Sprague-Dawley大鼠。測(cè)量無(wú)局部缺血的動(dòng)物 每個(gè)肝臟產(chǎn)生> 400xl06個(gè)分離的細(xì)胞。暖局部缺血時(shí)間不超過(guò)1小時(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)總細(xì)胞產(chǎn)量 迅速下降到每個(gè)肝臟提供150到250xl06個(gè)細(xì)胞。時(shí)間在大約1小時(shí)到5小時(shí)之間時(shí)發(fā)現(xiàn) 總細(xì)胞產(chǎn)量相對(duì)穩(wěn)定在每個(gè)肝臟產(chǎn)生50到150xl06個(gè)之間的細(xì)胞。暖局部缺血時(shí)間不超過(guò) 1小時(shí)時(shí)活細(xì)胞產(chǎn)量迅速下降，大于1小時(shí)時(shí)穩(wěn)定在每個(gè)肝臟大約IOxlO6個(gè)細(xì)胞。因此，發(fā) 現(xiàn)活細(xì)胞的比例與暖局部缺血呈雙峰。在不超過(guò)1小時(shí)時(shí)，活細(xì)胞和死細(xì)胞都急劇降低以 致于活力比不變。在大于1小時(shí)和達(dá)到5小時(shí)時(shí)觀察到穩(wěn)定的活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。使用上述大鼠模型測(cè)量由于暖局部缺血時(shí)間的影響肝臟細(xì)胞核的投射區(qū)。灌流肝 臟，細(xì)胞分離為單細(xì)胞懸液，并用碘化丙錠染色。以流式細(xì)胞術(shù)收集活細(xì)胞(PI-陰性)，然 后附著到顯微鏡載玻片上，固定，透化并用PI復(fù)染以觀察細(xì)胞核。對(duì)于無(wú)局部缺血灌流的 對(duì)照動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核面積具有雙峰分布，相應(yīng)于單核和雙核活的肝臟細(xì)胞都存在。暖局部 缺血1小時(shí)后和2小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)雙核細(xì)胞的比例降低。由于雙核細(xì)胞必定是多倍體，認(rèn)為這 些數(shù)據(jù)表明多倍體細(xì)胞比二培體細(xì)胞對(duì)局部缺血更敏感。通過(guò)分析單核細(xì)胞中細(xì)胞核的大小進(jìn)一步支持了二倍體細(xì)胞對(duì)局部缺血的抗性。 單核細(xì)胞可以是二倍體或者是多倍體，二倍體細(xì)胞具有比多倍體細(xì)胞更小的細(xì)胞核。上述 大鼠模型用于制備測(cè)量細(xì)胞核面積的活細(xì)胞。圖Ia中提供了總細(xì)胞核的百分?jǐn)?shù)，表明具有小核的細(xì)胞對(duì)局部缺血具有相對(duì)抗性。由于多倍體核傾向于比二倍體核更大，發(fā)現(xiàn)這些數(shù) 據(jù)表明了二倍體細(xì)胞對(duì)暖局部缺血具有相對(duì)的抗性。發(fā)現(xiàn)在對(duì)照肝臟和局部缺血2小時(shí)后 的肝臟中細(xì)胞核大小之間的改變無(wú)區(qū)別，如圖Ib所示。也有利地檢查了由于低溫局部缺血時(shí)間的影響細(xì)胞的活力，見(jiàn)表6和7。在該實(shí)施 方案中，肝臟基本上在死后立即迅速冷凍到大約10°C。甚至更有利的是，肝臟基本上在死后 立即迅速冷凍到大約4°C。通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的一些任何方法可實(shí)現(xiàn)冷凍，包括但 不限于在供體尸體腹部堆積冰塊或冰冷的液體袋的簡(jiǎn)單權(quán)宜之計(jì)。肝臟保持在一種上述環(huán) 境溫度以下，然后在時(shí)間達(dá)到大約30小時(shí)，或更有利的是在時(shí)間達(dá)到20小時(shí)時(shí)按所述進(jìn)行 灌流。處理灌流產(chǎn)生的單細(xì)胞懸液以提供祖細(xì)胞。觀察到多倍體細(xì)胞對(duì)即使溫度維持在環(huán) 境溫度以下和甚至在4°C的局部缺血敏感。表6人胎兒肝臟
權(quán)利要求
一種處理局部缺血性損傷的非胎兒供體組織以獲得富集的祖細(xì)胞群體的方法，所述方法包括(a)提供死后約2小時(shí)到30小時(shí)之間的非胎兒供體組織，所述的供體組織在這期間保持在活體溫度和室溫之間的溫度；和(b)處理所述的非胎兒供體組織以獲得富集的祖細(xì)胞群體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體組織在心跳停止后大約2-6小時(shí)內(nèi)獲得。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體組織在心跳停止后大約2-3小時(shí)內(nèi)獲得。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體組織是冷卻的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體組織冷卻到大約4°C。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體是新生兒，嬰兒，兒童，少年或成人。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述供體是豬或靈長(zhǎng)類。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述組織是肝臟。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述處理步驟提供了基本上的單細(xì)胞懸液或外植塊。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述處理步驟還包括從懸液中選擇那些表達(dá)與至少一種 祖細(xì)胞譜系陽(yáng)性或陰性相關(guān)的至少一種標(biāo)記的細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述處理步驟還包括壓實(shí)的步驟以提供富集表現(xiàn)出與至 少一種祖細(xì)胞譜系相關(guān)的至少一種標(biāo)記的祖細(xì)胞的壓實(shí)的細(xì)胞懸液。
12.權(quán)利要求10的方法，其中至少一種祖細(xì)胞譜系包括肝細(xì)胞，造血細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞或 間充質(zhì)細(xì)胞譜系中的至少一種。
13.—種從缺血性損傷的非胎兒肝臟中獲取肝臟祖細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)提供非胎兒無(wú)心跳供體作為肝臟組織來(lái)源；(b)從死亡約2-30小時(shí)后的所述非胎兒供體中獲得肝臟組織，所述的供體組織在這期 間保持在活體溫度和室溫之間的溫度；以及(c)處理肝臟組織以獲得肝臟祖細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述供體是哺乳動(dòng)物。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述祖細(xì)胞具有形成肝細(xì)胞，膽細(xì)胞或其組合的能力。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述供體的細(xì)胞表達(dá)甲胎蛋白，白蛋白，骨唾液蛋白， ⑶14，⑶34，⑶38，⑶90，⑶45，⑶117，ICAM-1，I型膠原蛋白，II型膠原蛋白，III型膠原蛋 白，血型糖蛋白A，或骨橋蛋白中的至少一種。
18.—種處理具有至少一種祖細(xì)胞群體的組織作為祖細(xì)胞來(lái)源的方法，所述方法包括(a)提供死后約2-30小時(shí)的無(wú)心跳非胎兒供體，所述的供體組織在這期間保持在活體 溫度和室溫之間的溫度；(b)從該非胎兒供體收獲組織，所述組織具有至少一種祖細(xì)胞群體；和(c)進(jìn)一步處理收獲的組織以獲得祖細(xì)胞。
19.一種處理缺血性損傷的非胎兒組織以獲得富集二倍體細(xì)胞的細(xì)胞群體方法，所述 方法包括(a)收獲組織時(shí)從無(wú)心跳的非胎兒供體中提供組織，所收獲的組織死后約2-30小時(shí)，推測(cè)具有至少一種二倍體細(xì)胞群體，所述的供體組織在這期間保持在活體溫度和室溫之間 的溫度；(b)處理收獲的組織以獲得富含二倍體細(xì)胞的細(xì)胞群體。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述供體是新生兒，嬰兒，少年或成人。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述二倍體包括祖細(xì)胞。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述處理步驟包括處理收獲的組織以提供單細(xì)胞懸液。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述處理步驟還包括將單細(xì)胞懸液分成2個(gè)或多個(gè)餾分。
24.權(quán)利要求23的方法，其中分離步驟將較大的細(xì)胞與較小的細(xì)胞分離，較高密度的 細(xì)胞與較低密度的細(xì)胞分離，或者兩者都分離。
25.權(quán)利要求24的方法，其中進(jìn)一步處理基本上由較小細(xì)胞，較低密度的細(xì)胞，或兩者 組成的一個(gè)或多個(gè)餾分以提供富集二倍體細(xì)胞的細(xì)胞群體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述二倍體細(xì)胞包括表達(dá)甲胎蛋白的祖細(xì)胞。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述祖細(xì)胞包括肝臟祖細(xì)胞。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述組織在心跳停止大約2-6小時(shí)之間收獲。
29.權(quán)利要求19的方法，其中所述組織在心跳停止后大約2-3小時(shí)之間收獲。
30.權(quán)利要求19的方法，其中所述組織是肝臟。
全文摘要
本發(fā)明首次提供了來(lái)自心臟停止跳動(dòng)的供體尸體器官作為用于各種醫(yī)學(xué)目的的諸如祖細(xì)胞或干細(xì)胞的功能性細(xì)胞來(lái)源的用途。更具體的說(shuō)，公開(kāi)了通過(guò)其獲得祖細(xì)胞的組織來(lái)源的豐富，包括從供體獲得組織，其中供體心臟停止跳動(dòng)長(zhǎng)達(dá)大約死后30小時(shí)并處理尸體組織以提供祖細(xì)胞，該祖細(xì)胞作為細(xì)胞治療、基因治療、人造器官、生物反應(yīng)器、器官再生等的工具用于各種醫(yī)療目的。
文檔編號(hào)C12N5/00GK101955906SQ20101013431
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2001年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月19日
發(fā)明者洛拉·里德, 愛(ài)德華·L·萊克羅茲 申請(qǐng)人:查珀?duì)栂?北卡羅萊納大學(xué)