專利名稱：小鼠Kif19A蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的蛋白編碼序列，特別是一種小鼠 Kifl9A蛋白編碼序列。
背景技術(shù)：
卵巢發(fā)育是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)重要事件，而其中的卵泡發(fā)育又是這關(guān)鍵中的 關(guān)鍵。它對(duì)于生物體的生殖發(fā)育以及后代繁衍有著極其重要的作用。目前一般認(rèn) 為，卵泡發(fā)育主要經(jīng)歷四個(gè)時(shí)期原始卵泡階段，初級(jí)卵泡階段、次級(jí)卵泡階段， 以及成熟卵泡階段。對(duì)于嚙齒動(dòng)物而言，15日齡個(gè)體的卵巢中，最早的一批有腔
卵泡已經(jīng)開(kāi)始形成，這一階段的卵泡發(fā)育經(jīng)歷著其他顯著的變化如卵母細(xì)胞體
積急劇增大、顆粒細(xì)胞數(shù)目急劇增多等。此時(shí)卵泡內(nèi)的細(xì)胞中進(jìn)行著活躍的新陳 代謝活動(dòng)，如蛋白質(zhì)的合成與運(yùn)輸，基因的表達(dá)與調(diào)控、細(xì)胞的分裂與增生等，
大量參與細(xì)胞分裂的蛋白質(zhì)因子在此階段合成;另外伴隨著卵母細(xì)胞體積的增大，
如何滿足細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題，許多參與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)牡鞍?質(zhì)分子也在此階段大量表達(dá)。
Kinesin超家族(Kifs)是一類公認(rèn)的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力分子，它們負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的 沿著微管方向進(jìn)行的主動(dòng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。Kifs蛋白的共同點(diǎn)是蛋白中都含有一個(gè)由 大約360個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的高度球狀保守區(qū)。保守區(qū)內(nèi)部含有兩個(gè)特定的結(jié)構(gòu) 域，分別負(fù)責(zé)水解ATP以獲得物質(zhì)運(yùn)輸所需能量以及同微管相結(jié)合的功能，這兩 種功能是Kifs的體內(nèi)運(yùn)輸功能所不可缺少的。Kifs所參與的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸是一種 廣義上的運(yùn)輸，被輸送的對(duì)象不僅包括生物大分子、囊泡、信號(hào)分子等，還包括 有絲分裂和減數(shù)分裂中的染色體。也有報(bào)道指出Kifs還參與具有正常生理功能的 紡錘體的形成。迄今為止，人們已經(jīng)以神經(jīng)元為研究對(duì)象，對(duì)Kifs的運(yùn)輸功能進(jìn) 行了大量的研究。證實(shí)了一些Kifs蛋白功能的缺失會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂及相關(guān) 疾病。如人體中Kifs編碼基因的缺陷會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂以及一些神經(jīng)功能退化相關(guān)的癥狀，從而導(dǎo)致amyotrophic lateral sclerosis和Alzheimer等疾病 的產(chǎn)生。Kartagener綜合癥則被證實(shí)和Kif-3運(yùn)輸功能的損失有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸還是動(dòng)物個(gè)體發(fā)育中的重要一環(huán)。Kifs和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸 有關(guān)，和動(dòng)物體的發(fā)育過(guò)程有著必然的聯(lián)系，然而有關(guān)Kifs蛋白和動(dòng)物體發(fā)育關(guān) 系的研究卻不多見(jiàn)，目前見(jiàn)諸于報(bào)道的有Morris和Scholey證實(shí)了 Kinesin II 是胚性纖毛形成所必需的，這可能與動(dòng)物體早期的左右非對(duì)稱形成有關(guān)。Kinesin I和幾種蛋白共同參與了 oAar的mRNA的沿著微管的運(yùn)輸，a^ar在發(fā)育中個(gè)體 的后部參與生殖細(xì)胞的分化和腹部的形成。^Wp7也是Kifs的一員，它在Xen叩us 的早期胚胎發(fā)育中是紡錘體形成和染色體定位的必需因子。還有研究表明 Kinesin-8參與調(diào)節(jié)紡錘體中微管的長(zhǎng)度，用Knockdown的方法干擾kinesin-8 的表達(dá)會(huì)使得紡錘體的長(zhǎng)度增加。Kinesin II還參與Xenponus中的raRNA 運(yùn)輸，阻斷正常的Kinsin II異三聚體的相互作用會(huì)影響到&7 mRNA的定位， ^7是TGF-e家中的成員之一，它參與胚胎中胚層的誘導(dǎo)發(fā)生。另外，Kinesin的 功能還表現(xiàn)在它能夠影響dynein的循環(huán)和定位，這是dynein正常的生理功能所 必需的?！禡olecular Biology of the Cell細(xì)胞分子生物學(xué)》在2005年16， 3187-3199中干燈了一篇"Functional analysis of human microtubule-based motor proteins, the kinesins and dyneins, in mitosis/cytokinesis using RNA interference (采用RNA干涉技術(shù)分析人類中基于微管相互作用的動(dòng)力分子， Kinesi和Dynein在有絲分裂、細(xì)胞周期中的功能)"。文中對(duì)Kinesin-8亞家族 的成員Kifl8的缺失所導(dǎo)致的紡錘體功能異?，F(xiàn)象做了詳細(xì)的分析，認(rèn)為KiflS 通過(guò)影響紡錘體的正常生理功能而導(dǎo)致細(xì)胞的有絲分裂或減數(shù)分裂功能受損，對(duì) Kinesin-8亞家族的成員在細(xì)胞分裂中的作用做了充分肯定，也為本發(fā)明提供了 可供參考的依據(jù)。但文中并沒(méi)有對(duì)Kifl9A在人類中的同源蛋白Kif 19做功能上的 分析。因此目前對(duì)于Kifl9A在細(xì)胞分裂中的作用，僅局限于通過(guò)與其它蛋白質(zhì)的 對(duì)比結(jié)果對(duì)其功能做推測(cè)和假設(shè)，其具體功能尚不清楚，目前也沒(méi)有見(jiàn)到有關(guān) Kifl9A蛋白或其同源蛋白功能的相關(guān)報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明公開(kāi)了一種小鼠Kifl9A蛋白編碼序列，對(duì)于進(jìn)一步研究該在正在發(fā)育個(gè)體中差異表達(dá)有重要意義，同源 比對(duì)結(jié)果預(yù)測(cè)該基因在有絲分裂和減數(shù)分裂中發(fā)揮作用，尤其是減數(shù)分裂的結(jié)果 和生物體的生育能力息息相關(guān)，本發(fā)明可用于解釋生物體不育種的相關(guān)機(jī)制，并 可指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐中的不育種的改造，雌性不育種的改造在畜牧業(yè)和飼養(yǎng)業(yè)中有著 很大的作用，具有重要應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所分離出的或純化的小鼠Kifl9A基因序列以及其編碼區(qū)序列，所述 的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 1中核苷酸的序列，能編碼具有SEQ ID NO. 2所 示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。所述的核苷酸序列，其蛋白編碼區(qū)cDNA全長(zhǎng)為2994bp，能編碼一條含997 個(gè)氨基酸的多肽。所述的核苷酸序列中的第980-1733位核苷酸片段的與SEQ ID NO. 3中的核 苷酸序列完全相同或有至少95%以上的同源性。所述的多肽包括具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽，較佳地，該多肽 是具有SEQIDNO. 2序列的多肽，該多肽屬于Kinesin-8亞家族，在不同年齡組 的老鼠卵巢中差異表達(dá)，而Kinesin-8家族成員功能的缺失能阻斷或妨礙細(xì)胞有 絲分裂或減數(shù)分裂中具有正常生理功能的紡錘體的形成。所述的SEQ ID NO. 1中的探針核苷酸序列，具有SEQ ID N0.3中的核苷酸 序列。在高度嚴(yán)禁的條件下(Northern雜交條件為68°C下雜交兩小時(shí)，洗脫條 件洗脫液成分為0.1XSSC(氯化鈉和檸檬酸鈉溶液)與0.WSDS (十二烷基磺酸 鈉)，在65°C洗脫一次，時(shí)間為15分鐘)能與SEQ ID NO. 1雜交，為Kifl9A檢 測(cè)用探針序列。所述的SEQIDNO. l中核苷酸的序列，該序列存在于一種載體，它包含SEQ ID N0.1中的全部核苷酸。本發(fā)明還涉及一種用上述DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。在實(shí)例 中該宿主細(xì)胞是HEK 293T細(xì)胞和L細(xì)胞。本發(fā)明中所涉及的"分離出的或純化的"是指該DNA或片段己從天然狀態(tài)下 位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的 組分分開(kāi)，而且己經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。本發(fā)明中，所克隆到的與小鼠卵巢發(fā)育相關(guān)的基因名為Kifl9A。它屬于 Kinesin超家族中的Kinesin-8亞家族，該亞家族中的成員多參與到細(xì)胞的有絲 分裂和減數(shù)分裂中，具體表現(xiàn)為影響細(xì)胞分裂中期染色體的排列、移動(dòng)和在赤道 板平面的定位，還影響到紡錘體的形成及其正常的生理功能，在本發(fā)明的實(shí)施過(guò) 程中，還發(fā)現(xiàn)Kifl9A的在不同年齡的小鼠中的表達(dá)方式和其在卵巢內(nèi)的表達(dá)定位 方式與該亞家族中其他成員完全吻合，該基因在發(fā)育期的小鼠(15日齡)卵巢中 高量表達(dá)，據(jù)此可以判定該基因可能參與同樣的生理過(guò)程，對(duì)顆粒細(xì)胞的分裂增 生以及卵母細(xì)胞的成熟及細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸發(fā)揮著重要的生理功能。該基因的研 究成果可用于生物不育種的改造。雌性不育種的改造在畜牧業(yè)和飼養(yǎng)業(yè)中有著很 大的作用，如用于人類，將對(duì)避孕藥開(kāi)發(fā)及不孕癥治療具有應(yīng)用價(jià)值。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"小鼠Kifl9A蛋白(或多肽)編碼序列"指編碼具有小鼠 Kifl9A多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第1-2994位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并 序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQIDNO. l序列的編碼框第1-2994位核苷酸中， 有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由 于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQIDNO. 1中第1-2994位核苷酸序列同源性低至 約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO. 1所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度 嚴(yán)緊條件(Northern雜交條件為68。C下雜交兩小時(shí)，洗脫條件洗脫液成分為 1X SSC(氯化鈉和檸檬酸鈉溶液)與0. 1% SDS (十二烷基磺酸鈉)，在42°C洗脫一 次，時(shí)間為15分鐘)下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下(Northern雜交條件為68°C 下雜交兩小時(shí)，洗脫條件洗脫液成分為O.IXSSC(氯化鈉和檸檬酸鈉溶液)與 0. 1% SDS (十二垸基磺酸鈉)，在65°C洗脫一次，時(shí)間為15分鐘)與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1030-2994位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與 SEQ ID NO. 3中的核苷酸序列的同源性至少70%,較佳地至少80%,更佳地至少 90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的小鼠Kif 19A相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括若干個(gè)(通常為1-90個(gè)， 較佳地卜60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代， 以及在5，和/或3，端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為 10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"小鼠Kifl9A蛋白或多肽"指具有小鼠Kifl9A蛋白活 性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與小鼠Kifl9A相關(guān)相同功能 的變異形式。這些變異形式包括若干個(gè)(通常為l-50個(gè)，較佳地l-30個(gè)，更佳 地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氮基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/ 或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為IO個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè) 以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常 不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通 常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括小鼠Kifl9A相關(guān)蛋白的活性片段和活 性衍生物。本發(fā)明的小鼠Kifl9A的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變 異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高度嚴(yán)緊條件(Northern雜交條件為68°C 下雜交兩小時(shí)，洗脫條件洗脫液成分為0. 1XSSC(氯化鈉和檸檬酸鈉溶液)/0.1% SDS (十二烷基磺酸鈉)，在65。C洗脫一次，時(shí)間為15分鐘)或低度的嚴(yán)緊條件 (Northern雜交條件為68°C下雜交兩小時(shí)，洗脫條件洗脫液成分為2XSSC(氯 化鈉和檸檬酸鈉溶液)/0. 1% SDS (十二垸基磺酸鈉)，室溫洗脫一次，時(shí)間為15 分鐘)下能與小鼠Kifl9A相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗小鼠 Kif 19A抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，"小鼠Kifl9A保守性變異多肽"指與SEQ ID NO. 2的氨基酸 序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或 相近的氨基酸所替換而形成多肽。Identities = 895/998 (89%), Positives = 932/998 (93%), Gaps = 1/998 (0%)Query 181 VAGITEVSTINAKEIMQLLMKGNRQRTQEPTAANQTSSRSHAVLQVAVRQRSRVKN工LQE 240VAG工TEVSTINAKE工MQKLMKGNRQRTQEPTAANQTSSRSHAVLQV VRQRSRVKNILQESbjct 181 VAGITEVSTINAKEIMQLLMKGNRQRTQEPTAANQTSSRSHAVLQVTVRQRSRVKN工LQE 240Query 241 VRQGRLFMIDLAGSERASQTQNRGQRMKEGAHINRSLLALGNC工NALSDKGSNKY工ISIYRD 300Sbjct 241 VRQGRLFMIDLAGSERASQTQNRGQRMKEGAHI服SLLALGMC工NALSDKGSNKYINYRD 300Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct301301361361IAQYTSIIADLRGEIQRLK KID+Q GRGQARG+ DRGDIRHIQAEVQLHSGQ A MG421QLREQL SAF EQMDVRRRLLELEN+AMEVQIDTSRHLLT工AGW+HEKSRRALKWREE+R421481481KESYTKEDSEKDSDTG-DEPDNLjEPPEVASARENIAALVGEQKKIiRKEKLALEQRCRELR KE Y K+DSEKDSDTG D+PD LEPPEVA+ARE+IAALV EGK+LRK+KLALEGRCRELR540argrri^etlprr工gseegrev;lsl:lcrvhe]leventemgsha;llrd al朋r eavrr;l541600EQHRSLCDEI工QGQRQIIDDYNL VP+ LEELYEVYLRELEEGSLE+ATIMD+VASRALQ601660DSSLPK工TPAG +LTPDSDLESVKTLSS+AQ QN+ LPPL T+SE +HVFKA AWQ661720KSSSVPTPPPIQ+GSLVT^EAP GDSLGS INSSP+SSENLSEI LSHKERKEILT TKC721780781VKAA+RRSRALGTEGRHLLAPATERSSLSLHSLSE DDARPPG LACKRPPSPTLGHA360360420420480480539540599600659660719720779780839840Query , ISEDNLSSSTGEGPSRAVGPRGDGTGSWVRGQKKCLSKKREESLEAKRRKRRSRSFEVTG 8 99 SED肌SSSTGE PSRAVG GDGW+RGQKK L KKREESLEAKRRKRRSRSFEVTGQGLS PKTHIAGP +E +SD RMP C P+PG+RHLGKV+LPLAKVK PP+QNTG G+Query 960 SPIAVAPNQAGVSRRATRGPSLPHGSSTFGKDGRDQHN 997SPL V PN G SRRATRGP LPHG+ST GKDG +HN Sbjct 961 SPLAVPPNPGGGSRRATRGPRLPHGTSTHGKDGCSRHN 998表1 SEQ ID NO. 2與人Kif 19蛋白質(zhì)或多肽序列的比對(duì)結(jié)果。Query為SEQ ID NO. 2， Sbjct為人Kifl9蛋白質(zhì)序列。本發(fā)明還包括小鼠Kifl9A蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然小鼠 Kifl9A蛋白或多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修 飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo) 變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還 可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然 L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸 (如e、 Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性 的多肽。修飾通常是指體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎?還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修 飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的 糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸 酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水 解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可以將小鼠Kifl9A編碼序列可操作地連于各種已知的市售表 達(dá)載體序列中，包括質(zhì)粒和粘粒等，從而形成小鼠Kifl9A蛋白的相關(guān)表達(dá)載體。 所述的"可操作地連于"是指即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA 序列其他部分的活性。例如，信號(hào)肽可操作地連于多肽DNA;啟動(dòng)子控制序列可操作地連于編碼序列；核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連于編碼序列等。 一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。還可用Northern印跡法技術(shù)分析小鼠Kif 19A基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析小鼠 Kif 19A的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子SEQ ID NO. 3，該分子 通常具有小鼠Kifl9A核苷酸編碼序列的750個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有450-600 個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼小鼠Kifl9A相關(guān)的核酸 分子。本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在小鼠Kifl9A相關(guān)核苷酸序列的方法， 它包括采用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。本發(fā)明中的小鼠Kifl9A相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增 法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的 有關(guān)核苷酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的c麗A庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常 規(guī)方法所制備的cDNA文庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常 需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在 一起。 一旦獲得了相關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得該序列。通常 的方法是將該序列首先裝入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后從增殖后的宿主細(xì)胞中分 離得到相關(guān)序列。本發(fā)明中涉及的蛋白片段還可用多肽固相合成技術(shù)或者化學(xué)合成的方法 來(lái)直接合成或者化學(xué)連接而獲得。本發(fā)明中鑒定的小鼠Kifl9A在不同發(fā)育時(shí)期的小鼠的卵巢中差異性表達(dá)， 該基因在15天和40天小鼠的卵巢中的表達(dá)量最高，并且我們通過(guò)免疫熒光的方 法發(fā)現(xiàn)，Kifl9A主要定位于發(fā)育中的卵泡中的卵母細(xì)胞和其周圍的顆粒細(xì)胞中， 這提示該基因可能在這兩個(gè)時(shí)期的卵巢中的上述細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用，而這時(shí) 期內(nèi)的重要事件就是顆粒細(xì)胞的增殖和卵母細(xì)胞的體積增大，因此Kifl9A極有可 能是參與了顆粒細(xì)胞有絲分裂和卵母細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。與該基因同屬一個(gè)亞家 族Kinesin-8研究族的成員Kif 18被證實(shí)在人類細(xì)胞的減數(shù)分裂和正常的有絲分裂中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)siRNA的研究手段證實(shí)了 Kifl8和細(xì)胞減數(shù)和有絲分 裂中中期染色體在赤道平面上的排布有關(guān)。阻斷其正常的生理功能，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞 在分裂中期，染色體無(wú)法正常地排列到細(xì)胞的赤道平面上，阻斷其功能會(huì)導(dǎo)致細(xì) 胞分裂的中期向后期的轉(zhuǎn)換時(shí)間延長(zhǎng)，雖然染色體也能分離，但最終細(xì)胞還是無(wú) 法完成正常的分裂。Kifl9A同屬于該亞家族的成員，在一級(jí)序列上與Kifl8有著 較高的同源性。這對(duì)于本發(fā)明研究Kifl9A的生理功能提供了一個(gè)很好的參照。根 據(jù)同源性分析以及本發(fā)明的試驗(yàn)結(jié)果，Kifl9A與發(fā)育中的小鼠卵巢中營(yíng)養(yǎng)與支持 細(xì)胞的增殖和和生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂有關(guān)，其具體的功能可能在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生， 通過(guò)與細(xì)胞分裂中的一些關(guān)鍵因子或步驟相互作用，如影響染色體在中期赤道板 的排列，影響細(xì)胞分裂中中期向后期的轉(zhuǎn)換，影響紡錘體中微管和染色體的相互 作用等等。抑制該發(fā)明的正常的生理功能可能對(duì)會(huì)阻斷生物體健康的卵巢及卵母 細(xì)胞的發(fā)育，以致影響正常生殖細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程，因此本發(fā)明可用于改造生物不 育種的應(yīng)用中。雌性不育種的改造在畜牧業(yè)和飼養(yǎng)業(yè)中有著很大的作用，如用于 人類，將對(duì)避孕藥開(kāi)發(fā)及不孕癥治療具有應(yīng)用價(jià)值。


圖1 DD-RT PCR結(jié)果示意圖；圖中Kifl9A在10天和15天的小鼠卵巢中差異表達(dá)，箭頭所指處為DD-RT PCR所檢測(cè)到的差異表達(dá)的Kifl9A的部分片段。圖2 Kifl9A和其同源蛋白的同源性分析結(jié)果示意圖；圖中:對(duì)Kifl9A和小鼠中其他一些已知的Kifs蛋白保守區(qū)所做同源性分析， 結(jié)果表明Kif 19A和Kifl8A同源性較近，且都屬于Kinesin-8亞家族。圖3 Western Blot檢測(cè)Kif 19A在HEK293T中的瞬時(shí)表達(dá)情況示意圖；圖中泳道1號(hào)為轉(zhuǎn)染了 Kif 19A的HEK 293T細(xì)胞，泳道2號(hào)為轉(zhuǎn)染了空 白對(duì)照質(zhì)粒的HEK 293T細(xì)胞；在泳道1中可以檢測(cè)到Kif 19A的表達(dá)；e -tubulin 用來(lái)顯示兩個(gè)泳道中總蛋白的上樣量相同。圖4、 Kifl9A在成年小鼠的不同組織中的表達(dá)譜分析；圖中Kifl9A在成年小鼠的肺、卵巢中大量表達(dá)，在睪丸、腎和腦中也檢 測(cè)到了痕量表達(dá)，其大小約為3.6Kb，而在心臟中沒(méi)有檢測(cè)到Kifl9A得表達(dá)。圖5、 Kifl9A在不同年齡的小鼠卵巢中的表達(dá)示意圖；圖中Kifl9A在15天和40天小鼠的卵巢中表達(dá)量最高，在5天、20天和 120天中的表達(dá)量比較低。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在 以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明 的保護(hù)范圍不局限于下述的實(shí)施例。
本發(fā)明的實(shí)施例所涉及的序列及記號(hào)分列SEQ ID NO. 1的核苷酸序列中， 56-1032位置的核苷酸為該家族中的保守序列。SEQ ID NO. 2的序列中第14-344 中的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1中保守區(qū)域所編碼的氨基酸序列。以下實(shí)施例中 未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室 手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件， 或制造商所建議的條件。
實(shí)施例1小鼠Kif 19A基因的克隆
1、 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇
本實(shí)施例中所涉及的試驗(yàn)動(dòng)物包括C57BL/6以及C57BL/6XCD-1雜交鼠。
2、 組織分離
收集不同發(fā)育時(shí)期的小鼠的卵巢組織，準(zhǔn)備提取RNA進(jìn)行下步分析。這里本 實(shí)施例選擇了10天，15天小鼠卵巢進(jìn)行分析。
3、 RNA的提取
取收集的卵巢組織，加入約lmlTrizol試劑，與冰上進(jìn)行高速勻漿 (〉3000rpm)， 3次，每次10秒左右。然后按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)抽提卵巢總RNA。 然后用變性甲醛膠鑒定抽提的總RNA質(zhì)量，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。 獲得的RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
4、 DDRT-PCR和cDNA文庫(kù)的篩選
DDRT-PCR的方法參照Z(yǔ)iramermann和Schultz的方法，所采用的引物為 5' -GAGGATCAGC-3'和5' -T"GC-3'，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物樣品分別包括10天，15天 的C57BL/6老鼠的卵巢，如圖1所示。
為了獲得Kifl9A的全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框(ORF)，本實(shí)施例進(jìn)行了 cDNA文庫(kù)的篩 選。文庫(kù)構(gòu)建所需的mRNA取自15天老鼠的卵巢。在cDNA合成時(shí)分別采用了 OligodT和隨機(jī)六合引物來(lái)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后將得到的cDNA兩端加上EcoR I接頭， 并連接到AZAP表達(dá)質(zhì)粒中。文庫(kù)的篩選中用到32P標(biāo)記的探針，用做標(biāo)記探針的 片段取自DDRT-PCR中差異表達(dá)的片段。CDNA文庫(kù)的篩選按照常規(guī)的方法進(jìn)行。 本次實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例一共篩選到11個(gè)陽(yáng)性克隆，并分別對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序分析。 測(cè)序儀器為ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Eltner， USA)
對(duì)測(cè)序結(jié)果的重疊區(qū)拼接,詳細(xì)序列如SEQ ID NO. 1所示。然后對(duì)該序列進(jìn) 行BLAST分析，結(jié)果證實(shí)在不同小鼠發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)的片段是小鼠中新得到的 一個(gè)Kifs超家族的基因,對(duì)于該基因的功能，目前還尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，但亞家族 中的其他成員參與到細(xì)胞分裂過(guò)程，為正常生物體發(fā)育和繁殖所必須。
通過(guò)上述幾種方法的應(yīng)用，獲得了候選的小鼠Kifl9A相關(guān)蛋白的全長(zhǎng)編碼 序列(SEQ ID NO. 1)。
實(shí)施例2小鼠Kif 19A基因序列的相關(guān)信息與同源性分析
本實(shí)施例中，小鼠Kif 19A開(kāi)放閱讀框位共2997個(gè)核苷酸，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID No. 1.根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出的小鼠Kifl9A氨基酸序列，共997個(gè)氨基酸殘基， 分子量為110kDa，等電點(diǎn)(pi)為9.25。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO. 2。
將小鼠Kifl9A相關(guān)的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在 Non-redundant GenBank +EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+ SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)水 平的同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它屬于Kinesin-8亞家族，如圖2所示，并發(fā)現(xiàn)它與 人類Kif 19基因在氨基酸水平上具有89%的同源性，如表1所示。因此，小鼠Kifl9A 與人類中Kifl9基因無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。Kinesin-8 亞家族的成員已被證實(shí)多參與細(xì)胞分裂過(guò)程中染色體的移動(dòng)和正常紡錘體的形 成，人類中的KIfl9蛋白也具有相似的功能，Kifl9A也應(yīng)具有相似的功能。
實(shí)施例3小鼠Kif 19A蛋白或多肽在HEK 293T細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)，以 及過(guò)量表達(dá)宿主細(xì)胞的鑒定。
l.重組表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)小鼠Kifl9A的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO. 1)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的用于該序列 擴(kuò)增的引物，并分別在引物的兩端引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的 具體序列依據(jù)所采用的載體情況而定，以便構(gòu)建表達(dá)載體。將本發(fā)明實(shí)施例1中篩選到的序列為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，將小鼠Kifl9A基因亞克隆至中間載體(如 pUC19)進(jìn)行擴(kuò)增，之后進(jìn)一步亞克隆到雙元表達(dá)載體中，然后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至 宿主細(xì)胞中。
2. 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的準(zhǔn)備HEK 293T細(xì)胞在轉(zhuǎn)染的前一天進(jìn)行傳代，細(xì)胞密度 不要太大，以24小時(shí)后細(xì)胞密度能長(zhǎng)至50-80%為宜。
3. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染采用Invitrogen公司的Lipofectamine Reagent和Plus Reagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體的方法如下(本實(shí)施例中以35mm培養(yǎng)皿為例)
1)將2pg左右的重組質(zhì)粒溶解進(jìn)100nl無(wú)血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中也不能 含有抗生素，混勻后加入5pl Plus Reagent,再次混合均勻，室溫放置15分鐘。 2)將5^1的Lipofectamin Reagent和95^1的無(wú)血清、無(wú)抗生素培養(yǎng)基(這里 采用的是DMEM+谷氨酰胺，下同)混合均勻，室溫放置15分鐘。3)將上述的兩 種液體混合均勻，室溫下放置45-60分鐘。4)在DNA-PLUS-Lipofectamin復(fù)合體 形成的過(guò)程中，將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)液去除，同時(shí)換上無(wú)血清和抗生素的培養(yǎng) 基1. 5ml) 45-60分鐘后，將上述的DNA-PLUS-Lipofectamin復(fù)合體加入到培養(yǎng)皿 中，輕輕混合均勻后置于37°C 5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)。6) 3小時(shí)后，去除細(xì) 胞，吸取培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入正常的含有血清的(不含有抗生素)中培養(yǎng)。 24-48小時(shí)后對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)性抗生素篩選或進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的分析。
4. 瞬時(shí)表達(dá)分析通常采用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法或者Western免疫檢測(cè)的方法。 在RT-PCR的方法中采用了一對(duì)特異性的引物來(lái)檢測(cè)Kifl9A的表達(dá)情況。引物的 詳細(xì)序列如下引物一 5' -GCACTGCCTTTGAAGAGTCC-3， 引物二 5， -CATCTCGGTGTTTTCCACCTC-3' 。
Western免疫檢測(cè)中采用了上海生物工程公 司合成的Kifl9A抗體，如圖3所示。
5. 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選通常采用一些特定的抗生素用以殺死未轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞的方法，這里采用的是G418篩選的方法，所用的細(xì)胞系為L(zhǎng) cell細(xì)胞系。通 過(guò)采用G418的篩選，最終能獲得穩(wěn)定表達(dá)Kif 19A的宿主細(xì)胞。
實(shí)施例4小鼠Kifl9A相關(guān)基因在成年小鼠不同組織中的表達(dá)譜分析 1、 RNA的提取取同一小鼠的不同組織進(jìn)行該分析，本實(shí)施例中采取了心、 腦、卵、睪、肺、腎幾種不同的組織。斷頸處死小鼠后將取得的不同組織分別分 別加入lml左右Trizol試劑，進(jìn)行總RNA提取，(實(shí)驗(yàn)參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū))。2、 總RNA的定量:與260n i處，測(cè)定RNA的紫外光吸光度值0D260;根據(jù)10D260 二40pg/ml的公式，換算成相應(yīng)的RNA濃度。
3、 甲醛變性膠電泳分離RNA: 1)取6ml25X (倍)電泳緩沖液，加入117ml 無(wú)菌水，混勻。2)稱取l.lg瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化， 轉(zhuǎn)入55°C水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26. 8ml甲醛，加入到55°C的凝膠溶液中， 混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的 RNA (20)xg)溶解于2XLoading Buffer中，在80°C下加熱10分鐘，然后立即放 在冰上。6)點(diǎn)樣后進(jìn)行電泳，電泳參數(shù)為5V/cm電壓電泳2小時(shí)左右。
4、 將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜1)轉(zhuǎn)移前先對(duì)瓊脂糖膠進(jìn)行處理，該過(guò)程的同時(shí) 將尼龍膜用IOXSSC浸泡。2)將濕潤(rùn)的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同 的濾紙置20XSSC溶液中濕潤(rùn)，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小 相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。4) 轉(zhuǎn)膜完成后，將尼龍膜放置于紫外交聯(lián)爐中進(jìn)行交聯(lián)固定。
5、 探針的標(biāo)記。用于標(biāo)記探針的模板采用PCR擴(kuò)增的方法，利用基因特異 性引物從SEQ ID N0.1中擴(kuò)增得到，對(duì)PCR得到的結(jié)果進(jìn)行分離純化，得到的核 苷酸序列見(jiàn) SEQ ID NO. 3 。這里采用的基因特異性引物為 5， -GCACTGCCTTTGAAGAGTCC-3， 和 5， -CATCTCGGTGTTTTCCACCTC-3，
PCR實(shí)施的方法為在20)al的反應(yīng)體系中分別加入2^1 10 X buffer, 1. 6|al 25mM MgCl2， 0.4 |al dNTP(10mM each),上下游引物各0. 4pl(20-)， 2pl SEQ ID NO. 1為模板，0.3pl (5U/nl) Taq聚合酶，加水補(bǔ)足至2(^1; PCR擴(kuò)增條件為 94°C下變性5分鐘，然后為94°C lmin, 56°C lmin, 72°C lmin為一個(gè)循環(huán)，循 環(huán)擴(kuò)增34次；接著為72。C 10min， 4°C 10min終止反應(yīng)。對(duì)PCR擴(kuò)增到的產(chǎn)物進(jìn) 行回收后利用NEBlot Phototope Kit試劑盒對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記的方法參照試 劑盒的說(shuō)明書(shū)。
6、 膜上雜交信號(hào)的檢出1)將膜浸在5Xrapid hybrid buffer, 65°C下 預(yù)雜交0.5小時(shí)。2)將預(yù)雜交也吸處，加入10ml左右新鮮的雜交緩沖液，同時(shí) 將準(zhǔn)備好的探針加入，于65°C雜交3小時(shí)。3)洗膜，雜交結(jié)束后，將尼龍膜置 于洗膜液I (IXSSC， 1%SDS)中，于65。C漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液 II (0. 1XSSC， 1%SDS)中于65。C漂洗3次，每次15分鐘。4)曝光。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影。
Northern雜交表明；小鼠Kifl9A在成年小鼠的卵巢、肺和睪丸組織中大量 表達(dá)，其大小約為3.6Kb，在腎臟和肝臟中表達(dá)很少，心臟中幾乎看不到表達(dá)，如 圖4所示。該基因在小鼠的生殖器官中表達(dá)可能預(yù)示著其功能與動(dòng)物體的生殖發(fā) 育有一定的關(guān)系。
實(shí)施例5小鼠Kifl9A相關(guān)基因在不同年齡組小鼠的卵巢組織中的表達(dá)差異
分析
為了獲得更進(jìn)一步的信息，還可以對(duì)小鼠Kifl9A相關(guān)基因在不同發(fā)育時(shí)期 小鼠卵巢中的進(jìn)行表達(dá)差異分析。具體實(shí)施方法如下
1、 取材分別取5天、10天、15天、20天、40天和120天的小鼠的卵巢。 將小鼠斷頸處死后取卵巢，直接進(jìn)行下一步分析或液氮凍存?zhèn)溆谩?br> 2、 總RNA的提取?？俁NA提取的方法按照常規(guī)的方法進(jìn)行，具體方法參見(jiàn) 實(shí)施例4中的總RNA提取程序。
3、 Northern雜交的過(guò)程參見(jiàn)實(shí)施例4中Kifl9A表達(dá)譜分析中的相關(guān)步驟， 這里不再累述。
通過(guò)對(duì)不同年齡組小鼠的卵巢組織的Kifl9A表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 小鼠Kifl9A基因在15天的和成年的小鼠卵巢組織中表達(dá)最為顯著，在10天和 20天的小鼠卵巢中痕量表達(dá)，而在老年和5天的小鼠中未見(jiàn)到有表達(dá)，如圖5所 示。通過(guò)前面的所述可知，15天的小鼠卵巢中正經(jīng)歷著急劇的發(fā)育過(guò)程，包括卵 泡的發(fā)育，卵母細(xì)胞的增大以及顆粒細(xì)胞的增多，在這一過(guò)程中大量的物質(zhì)被合 成，包括各種蛋白質(zhì)分子和mRNA分子，Kinesin家族的成員是細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸分子， 因此Kifl9A的表達(dá)可能與該過(guò)程有關(guān)。另外15天的小鼠卵巢中顆粒細(xì)胞的數(shù)目 大量增加，這個(gè)時(shí)期內(nèi)的卵巢內(nèi)經(jīng)歷著急劇的有絲分裂過(guò)程，Kifl9A的大量表達(dá) 可能參與該過(guò)程。同時(shí)，成年小鼠卵巢中生殖細(xì)胞以及各種營(yíng)養(yǎng)支持細(xì)胞都達(dá)到 了極盛的狀態(tài)，Kif 19A的表達(dá)可能與這種狀況相關(guān)。本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下〈110〉上海交通大學(xué)<120>小鼠Kif 19A蛋白編碼序列<歸3<210〉1<211>2994〈212>DNA<213>小鼠(Mus.隨culus C57BL/6) <400>1ATGMGGACAGCGGTGACTCAMGGACCAGCMCTCATGGTGGCACTTAGGGTCCGGCCC60ATCAGCGTGGCTGAGCTGGAGGAGGGAGCTACCCTCATCGCTCACMGATGGACGAGCAG120ATGGTGGTTCTCATGGACCCMTGGAGGACCCTGACGACATTCTGCGGGCACACCGGTCC180CGGGAGMGTCATACCTCTTTGACGTGGCCTTTGACTTCACTGCCACCCAGGAGATGGTA240TATCAGGCCACCACCMGAGCCTCATCGAGGGCGTCATCTCAGGGTACMTGCCACTGTG300TTTGCCTATGGCCCTACAGGCTGTGGGMGACCTACACCATGCTGGGCACTGACCACGAG360CCAGGCATCTATGTTCGGACCCTCMTGACCTGTTCCGAGCCATCGAGGAGACCAGCMT420GACATGGMTATGAGGTGTCCATGTCCTACCTGGAGATCTACMTGAGATGATCCGGGAC■CTACTGMCCCGGCCCTGGGGTACCTGGAGCTGAGGGMGACTCCAMGGGGTGATCCAG540GTGGCCGGGATCACCGMGTGTCTACCATCMTGCGMGGAGATCATGCAGCTGCTGATG600MGGGGAACCGGCAGAGGACGCMGAGCCCACAGCTGCCAACCAGACATCCTCCCGCTCC660CACGCCGTGCTCCAGGTGGCCGTGCGTCAGCGCAGCCGGGTCMGMCATCCTCCAGGAG720GTGCGGCAGGGCCGCCTGTTTATGATTGACCTAGCTGGCTCCGAGCGTGCCTCTCAGACA780CAGMCCGGGGGCAGCGCATGMGGMGGAGCCCACATCAACCGCTCTCTGCTGGCCCTG840GGCMCTGCATCMTGCGCTGAGTGACMGGGCAGTMTAAATACATCMCTATCGGGAC900AGCAMCTCACCCGGCTCCTGAAGGATTCACTAGGCGGGAACAGCCGCACTGTGATGATT960GCCCACATCAGTCCAGCGAGCACTGCCTTTGMGAGTCCCGGMCACCCTGACCTACGCC1020GGCCGAGCCAAGMTATTAGGACTCGGGTGMGCAGMCCTGCTCAACGTCTCCTACCAC1080ATCGCTCAGTACACCAGCATCATCGCTGATCTGAGAGGCGAGATCCAGAGACTCMGTGC1140MGATCGACCAGCAGGCTGGGCGGGGTCAGGCCCGGGGCAMCTGGACAGGGGTGACATC1200CGCCACATCCMGCTGAGGTTCAGCTACACAGCGGGCAGGMGGGCCCGCGGAGATGGGA1260CAGCTTCGGGAGCMCTCATCAGCGCCTTCCACGAGCAGATGGATGTGCGCCGGCGCCTG1320CTGGAGCTGGAGMCCAGGCCATGGMGTCCAGATTGACACCTCCCGTCACCTCCTCACC1380ATCGCCGGCTGGGAGCACGAGAAGTCACGAAGGGCTCTCAAGTGGCGGGAGGAGCGMGG1440MGGAGTCCTACACCAMGAGGACAGTGAGMGGACTCGGACACAGGCGATGAGCCAGAT1500AACCTGGAGCCACCTGMGTGGCATCAGCCCGTGAAAACATCGCTGCCCTGGTGGGCGM1560CAGMGMGTTGCGCAAAGAGMGCTGGCGCTGGAGCAGCGCTGCCGAGAGCTGCGTGCG1620CGTGGCCGGCGCCTGGMGAGACGCTGCCGCGCCGCATCGGCTCGGAGGAGCAGCGCGAG1680GTGCTCAGCCTGCTGTGCCGCGTGCACGAGCTGGAGGTGGAAAACACCGAGATGCAGTCG1740CACGCTCTGCTCCGCGACAGCGCTCTGCGCCACCGCCGCGAGGCTGTGCGCCGCCTGGAG1800CAGCACCGCAGCCTCTGCGATGAGATCATCCAGGGCCAGCGGCAGATCATCGACGACTAC1860MTCTGGAGGTTCCCCGGCACCTGGAGGMCTCTACGMGTCTACCTTCGGGMCTGGAA1920GAGGGCAGCCTGGAGCGGGCCACCATCATGGACCGAGTGGCCTCCAGAGCCCTGCAGGAC1980AGCTCCTTGCCCAAAATCACTCCAGCAGGGGCCACACTGACCCCAGACTCTGACCTGGAG2040AGTGTGMGACGCTAAGTTCTGAGGCCCAGCGCCCCCAAAACMCACCCTACCCCCACTT2100GGCACAGACAGTGAGTCCTACCATGTGTTCMGGCCAGTCCCAGGGCCTGGCAGGTGMG2160AGCTCCTCTGTGCCTACTCCGCCCCCCATCCAGGTGGGCAGCCTGGTGACCCAGGAGGCC2220CCACCACAGGACAGCCTGGGCAGCCAGATCMCTCTTCCCCGGAGAGCAGCGAGMCCTG2280TCAGAGATCCTTCTGTCCCATAAAGAGAGGAMGAGATCCTGACGCGGACCMGTGTATC2340TCGGTGMGGCCGCCCAGCGGCGCTCCCGGGCCCTGGGMCGGMGGGCGCCACCTGCTG2400GCACCTGCCACAGAGCGCAGCAGCCTATCCCTGCACTCGTTGAGCGAGGCTGATGATGCT2460CGCCCACCCGGGCMCTGGCCTGCMGCGGCCGCCCAGCCCGACACTGCAGCATGCCATC2520AGCGAGGACAATCTATCTAGCAGCACAGGCGAGGGCCCCTCCAGGGCGGTAGGACCTCGA2580GGTGATGGCACTGGGTCCTGGGTGCGTGGCCAGMGAMTGCCTCAGCMAAAMGGGAG2640GAGTCACTGGMGCGMGAGGAGGMGCGGAGGTCTCGGTCCTTTGAGGTCACAGGACM2700GGGCTGTCCCGTCCCMGACACACCTACTGGGACCTCGTCCCTCCGAGGGCCTTTCAGAT2760CGCCGGATGCCGGCGTGTGGGCGGCCATCTCCTGGTGTCAGGCATCTGGGAAMGTCTCT2820CTGCCTCTGGCCMGGTCMATTTCCTCCAMCCAGMCACAGGATCTGGAMCCCTTCA2880CCCCTTCTTGTTGCCCCCMCCMGCCGGTGTTTCCCGTAGAGCTACACGTGGGCCCAGC2940CTACCCCATGGCTCMGCACCTTTGGC嵐GATGGACGCCTCCAGCATMCTGA2994<210>2<211〉997<212>PRT〈213>小鼠(Mus. musculus C57BL/6)<400>2Met Lys AspSer Gly Asp Ser Lys Asp Gin Gin Leu Met Val510Leu Arg Val Arg Pro lie Ser Val Ala Glu Leu Glu Glu Gly20 25 Thr Leu lie Ala His Lys Met Asp Glu Gin Met Val Val Leu35Asp Pro Met Glu Asp Pro Asp Asp 50Arg Glu Lys Ser Tyr Leu Phe Asp40lie Leu Arg Ala His Arg 55Val Ala Phe Asp Phe Thr65 70 Thr Gin Glu Met Val Tyr Gin Ala Thr Thr Lys Ser Leu lie80 85 Gly Val lie Ser Gly Tyr Asn Ala Thr Val Phe Ala Tyr Gly95 100 Thr Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Met Leu Gly Thr Asp His110 115 Pro Gly lie Tyr Val Arg Thr Leu Asn Asp Leu Phe Arg Ala125 130 Glu Glu Thr Ser Asn Asp Met Glu Tyr Glu Val Ser Met Ser140 145 Leu Glu lie Tyr Asn Glu Met lie Arg Asp Leu Leu Asn Pro155 160 Leu Gly Tyr Leu Glu Leu Arg Glu Asp Ser Lys Gly Val lie170 175 Val Ala Gly lie Thr Glu Val Ser Thr lie Asn Ala Lys Glu185 190 Met Gin Leu Leu Met Lys Gly Asn Arg Gin Arg Thr Gin Glu200 205 Thr Ala Ala Asn Gin Thr Ser Ser Arg Ser His Ala Val Leu215 220 Val Ala Val Arg Gin Arg Ser Arg Val Lys Asn lie Leu Gin230235Ala15Ala30Met45Ser60Ala75Glu90Pro105Glu120lie135Tyr150Ala165Gin180lie195Pro210Gin225Glu240Val Arg Gin Gly Arg Leu Phe Met lie Asp Leu Ala Gly Ser Glu245 250 255Arg Ala Ser Gin Thr Gin Asn Arg Gly Gin Arg Met Lys Glu Gly260 265 270Ala His lie Asn Arg Ser Leu Leu Ala Leu Gly Asn Cys lie Asn275 280 285Ala Leu Ser Asp Lys Gly Ser Asn Lys Tyr lie Asn Tyr Arg Asp290 295 300Ser Lys Leu Thr Arg Leu Leu Lys Asp Ser Leu Gly Gly Asn Ser305 310 315Arg Thr Val Met lie Ala His lie Ser Pro Ala Ser Thr Ala Phe320 325 330Glu Glu Ser Arg Asn Thr Leu Thr Tyr Ala Gly Arg Ala Lys Asn335 340 345lie Arg Thr Arg Val Lys Gin Asn Leu Leu Asn Val Ser Tyr His350 355 360lie Ala Gin Tyr Thr Ser lie lie Ala Asp Leu Arg Gly Glu lie365 370 375Gin Arg Leu Lys Cys Lys lie Asp Gin Gin Ala Gly Arg Gly Gin380 385 390Ala Arg Gly Lys Leu Asp Arg Gly Asp lie Arg His lie Gin Ala395 400 405Glu Val Gin Leu His Ser Gly Gin Glu Gly Pro Ala Glu Met Gly410 415 420Gin Leu Arg Glu Gin Leu lie Ser Ala Phe His Glu Gin Met Asp425 430 435Val Arg Arg Arg Leu Leu Glu Leu Glu Asn Gin Ala Met Glu Val440 445 450Gin lie Asp Thr Ser Arg His Leu Leu Thr lie Ala Gly Trp Glu455 460 465His Glu Lys Ser Arg Arg Ala Leu Lys Trp Arg Glu Glu Arg Arg470 475 480Lys Glu Ser Tyr Thr Lys Glu Asp Ser Glu Lys Asp Ser Asp ThrGly Asp Glu Pro Arg Glu Asn lieLys Glu Lys Leu Ala Leu Glu Gin Arg Cys Arg Glu Leu ArgArg Gly Arg Arg Glu Glu Gin ArgLeu Glu Val Glu Asn Thr Glu Met Gin Ser His Ala Leu LeuAsp Ser Ala LeuGin His Arg SerAsp Ser Asp Leu Arg Pro Gin Asn485 Asp 500 Ala 515 Ala 530 Leu 545 Glu 560 Asn 575 Arg 590 Leu 605 Tyr 620 Tyr 635 Met 650 Lys 665 Glu 680 Asn 695 Phe 710 Pro 725Asn Leu Glu Pro Pro Glu Val Ala SerAla Leu Val Gly Glu Gin Lys Lys LeuGlu Glu Thr Leu Pro Arg Arg lie GlyVal Leu Ser Leu Leu Cys Arg Val HisHis Arg Arg Glu Cys Asp Glu lielie lie Asp Asp Tyr Asn Leu Glu Val Pro Arg His Leu GluLeu Tyr Glu Val Tyr Leu Arg Glu LeuArg Ala Thr lie Met Asp Arg Val AlaSer Ser Leu Pro Lys lie Thr Pro Ala Gly Ala Thr Leu ThrThr Leu Pro ProSer Tyr His Val Phe Lys Ala Ser ProSer Ser Ser Val Pro Thr Pro Pro Pro490 Pro 505 Glu 520 Cys 535 Pro 550 Leu 565 Ser 580 Ala 595 lie 610 Pro 625 Glu 640 Ser 655 Gly 670 Leu 685 Leu 700 Arg 715 lie 730Val Arg Arg Leu Gin Gly Gin ArgGlu Gly Ser Leu Arg Ala Leu GinSer Val Lys Thr Leu Ser Ser Glu AlaGly Thr Asp Ser Ala Trp Gin Val Gin Val Gly Ser495 Ala 510 Arg 525 Ala 540 Ser 555 Glu 570 Arg 585 Glu 600 Gin 615 Glu 630 Glu 645 Asp 660 Pro 675 Gin 690 Glu 705 Lys 720 Leu 735Val Thr Gin Glu Ala Pro Pro Gin Asp Ser Leu 740 745
Asn Ser Ser Pro Glu Ser Ser Glu Asn Leu Ser Glu lie 755 760
Ser His Lys Glu Arg lys Glu lie Leu Thr Arg Thr Lys
Gly s erGln lie 750
Ser Val Lys Gly Arg His
770 775 Ala Ala Gin Arg Arg Ser Arg Ala Leu Gly
785
Leu Leu Ala Pro Ala Thr
800
Leu His Ser Leu Ser Glu Ala Asp Asp 815
790 Glu 805 Ala 820
Arg Arg
Ser Ser
Pro Pro
Leu Ala Cys Ser Glu Asp
Lys Arg Pro Pro Ser Pro Thr Leu Gin His 830 835
Asn Leu Ser Ser Ser Thr Gly Glu Gly Pro 845 850 Ala Val Gly Pro Arg Gly Asp Gly Thr Gly Ser Trp Val
860 865 Gin Lys Lys Cys Leu Ser Lys Lys Arg Glu Glu Ser Leu
875 880 Lys Arg Arg lys Arg Arg Ser Arg Ser Phe Glu Val Thr
890 艦 Gly Leu Ser Arg Pro Lys Thr His Leu Leu Gly Pro Arg
905 910 Glu Gly Leu Ser Asp Arg Arg Met Pro Ala Cys Gly Arg
920 925 Pro Gly Val Arg His Leu Gly Lys Val Ser Leu Pro Leu
935 940 Val Lys Phe Pro Pro Asn Gin Asn Thr Gly Ser Gly Asn
950 955 Pro Leu Leu Val Ala Pro Asn Gin Ala Gly Val Ser Arg
965 970 Thr Arg Gly Pro Ser Leu Pro His Gly Ser Ser Thr Phe
Leu Leu
765 Cys lie
780 Thr Glu
795 Leu Ser
810 Gly Gin
825 Ala lie
840 Ser Arg
855 Arg Gly
870 Glu Ala
885 Gly Gin
900 Pro Ser
915 Pro Ser
930 Ala Lys
945 Pro Ser
恥O Arg Ala
975 Gly Lys980 985 990
Asp Gly Arg Leu Gin His Asn 995
<210>3 <211>754
<212>DNA
<213〉小鼠(Mus. musculus C57BL/6) <400>3
GCACTGCCTTTGMGAGTCCCGGMCACCCTGACCTACGC CGGCCGAGCCMGMTATTA60
GGACTCGGGTGMGCAGMCCTGCTCMCGTCTCCTACCA CATCGCTCAGTACACCAGCA120
TCATCGCTGATCTGAGAGGCGAGATCCAGAGACTCMGTG CMGATCGACCAGCAGGCTG180
GGCGGGGTCAGGCCCGGGGCAMCTGGACAGGGGTGACAT CCGCCACATCCMGCTGAGG240
TTCAGCTACACAGCGGGCAGGAAGGGCCCGCGGAGATGGG ACAGCTTCGGGAGCMCTCA300
TCAGCGCCTTCCACGAGCAGATGGATGTGCGCCGGCGCCT GCTGGAGCTGGAGMCCAGG360
CCATGGMGTCCAGATTGACACCTCCCGTCACCTCCTCAC CATCGCCGGCTGGGAGCACG420
AGMGTCACGMGGGCTCTCMGTGGCGGGAGGAGCGMG GMGGAGTCCTACACCAAAG480
AGGACAGTGAGAAGGACTCGGACACAGGCGATGAGCCAGA TMCCTGGAGCCACCTGMG540
TGGCATCAGCCCGTGAAMCATCGCTGCCCTGGTGGGCGA ACAGMGMGTTGCGC嵐G600
AGMGCTGGCGCTGGAGCAGCGCTGCCGAGAGCTGCGTGC GCGTGGCCGGCGCCTGGMG660
AGACGCTGCCGCGCCGCATCGGCTCGGAGGAGCAGCGCGA GGTGCTCAGCCTGCTGTGCC720
GCGTGCACGAGCTGGAGGTGGAAMCACCGAGAT
權(quán)利要求
1、一種小鼠Kif19A蛋白編碼序列，其特征是，所分離出的或純化的小鼠Kif19A基因序列以及其編碼區(qū)序列，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中核苷酸的序列，能編碼具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
2、 如權(quán)利要求l所述的小鼠Kifl9A蛋白編碼序列，其特征是，所述的核苷 酸序列，其蛋白編碼區(qū)cDNA全長(zhǎng)為2994bp，能編碼一條含997個(gè)氨基酸的多肽。
3、 如權(quán)利要求l所述的小鼠Kifl9A蛋白編碼序列，其特征是，所述的核苷 酸序列中的第980-1733位核苷酸片段的與SEQ ID NO. 3中的核苷酸序列完全相 同或有至少95%以上的同源性。
4、 如權(quán)利要求l所述的小鼠Kifl9A蛋白編碼序列，其特征是，所述的SEQ ID NO. l中核苷酸的序列，該序列具有SEQIDN0.3中的核苷酸序列，在Northern 雜交條件為68° C下雜交兩小時(shí)，能與SEQ ID NO. 1雜交，洗脫條件洗脫液成 分為0.1X氯化鈉和檸檬酸鈉溶液與0.W十二垸基磺酸鈉，在65° C洗脫一次， 時(shí)間為15分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的小鼠Kif19A蛋白編碼序列。本發(fā)明所分離出的或純化的小鼠Kif19A基因序列以及其編碼區(qū)序列，具有SEQ ID NO.1中核苷酸的序列，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。所述的SEQ ID NO.1中核苷酸的序列，該序列具有SEQ ID NO.3中的核苷酸序列能與SEQ ID NO.1雜交。所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中的核苷酸序列有至少95％以上的同源性。本發(fā)明可用于改造生物不育種的應(yīng)用中。雌性不育種的改造在畜牧業(yè)和飼養(yǎng)業(yè)中有著很大的作用，如用于人類，將對(duì)避孕藥開(kāi)發(fā)及不孕癥治療具有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101302514SQ200810038829
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者際 吳, 永 張 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)