專利名稱：野生稻抗凍基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中與抗脅迫相關(guān)的基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別涉及野生稻中的一個(gè)與抗凍相關(guān)的基因及其編碼蛋白與其在培育抗凍能力提高植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物的生長(zhǎng)受到環(huán)境中多種非生物因素的影響，其中凍害及冷脅迫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要因素之一。研究表明大量逆境應(yīng)答基因的表達(dá)為植物獲得抗逆性所必需(Gong et al，PNAS，9911507-11512)。在多數(shù)干旱、高鹽或凍害等水分脅迫應(yīng)答基因的啟動(dòng)子區(qū)都含有一個(gè)或多個(gè)脫水反應(yīng)元件或叫C重復(fù)(Dehydration-responsive element/C-repeat，即DRE/CRT)，該元件的核心序列為G/ACCGAC(Shinozaki et al.，Curr.Opin.Plant Biol.，3217-223)。DREB1/CBF(Dehydration-responsive element binding protein/C-repeat binding factor)轉(zhuǎn)錄因子家族通過(guò)和該順式作用元件結(jié)合來(lái)激活下游基因的表達(dá)(Liu et al.，Plant Cell，101391-1406)。近年來(lái)，在對(duì)模式植物擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)組成型表達(dá)的bHLH(basic Helix-Loop-Helix)類轉(zhuǎn)錄因子ICE1(inducer of CBF expressionl，ICE1)能夠和CBF3基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的MYC識(shí)別序列結(jié)合并調(diào)節(jié)DREB1/CBF基因的轉(zhuǎn)錄。ICE1可被修飾(或與配體結(jié)合)后激活，引起CBF及其下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而提高植物的抗逆性(Chinnusamy et al.，Genes Dev 171043-1054)。
我國(guó)江西省東鄉(xiāng)普通野生稻(O.rufipogon)是分布在世界上最北端的野生稻品種，蘊(yùn)含豐富的抗病蟲(chóng)基因和耐冷基因，具有優(yōu)良的耐冷性、耐旱性、耐瘠性和抗病性等，而且蛋白質(zhì)含量較高，可利用價(jià)值巨大。因此充分利用東鄉(xiāng)野生稻的一系列有益基因，在植物育種研究中具有重大價(jià)值。此外，擬南芥和水稻基因組測(cè)序工作的完成，為利用這些模式植物進(jìn)行基因功能的研究提供了便利條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供野生稻中的一個(gè)抗凍基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的抗凍基因，名稱為OrICLb，來(lái)源于東鄉(xiāng)野生稻(O.rufipogon)，它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由1206個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第25-1161位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明抗凍基因所編碼的蛋白(OrICLb)，具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物抗凍性的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №2由378個(gè)氨基酸殘基組成。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增OrICLb中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的抗凍基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)低溫耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它的參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
使用OrICLb構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、根部特異表達(dá)啟動(dòng)子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明OrICLb的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、玉米等單子葉植物，也可以是擬南芥、煙草等雙子葉植物。
本發(fā)明借助芯片技術(shù)從東鄉(xiāng)野生稻中篩選到的抗凍基因OrICLb為研究東鄉(xiāng)野生稻的抗凍機(jī)理和水稻的育種工作提供了理論基礎(chǔ)，將在培育抗凍性增強(qiáng)的植物(特別是水稻)中發(fā)揮重要的作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為RT-PCR擴(kuò)增的OrICLb的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖2為OrICLb超表達(dá)載體pSNICLb的物理圖譜圖3為轉(zhuǎn)OrICLb擬南芥的PCR鑒定結(jié)果圖4為轉(zhuǎn)OrICLb擬南芥經(jīng)冷凍處理后的表型具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、OrICLb的克隆根據(jù)ICE1bHLH結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基序列“GKKKGMPAKNLMAERRRRKKLNDRLYMLRSVVPKISKMDRASILGDAIDYLKELLQRINDLHNELES”，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索(blastp)，在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)同源性較高的全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)其中一個(gè)基因(OrICLb)的核苷酸序列設(shè)計(jì)以下引物5’端引物GGATCCTTCTCAGAGCGCTGCGAGGT(帶下劃線部分堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn))；3’端引物GGTACCATCAAATCCCAGTGCATTGGTC(帶下劃線部分堿基為限制性內(nèi)切酶Kpn I識(shí)別位點(diǎn))。以東鄉(xiāng)野生稻(O.rufipogon)幼苗經(jīng)4℃處理30分鐘的總RNA為模板，在上述引物對(duì)的引導(dǎo)下，RT-PCR擴(kuò)增OrICLb的cDNA序列，具體方法包括以下步驟1、總RNA的提取把在不含激素的1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩周的東鄉(xiāng)野生稻幼苗放在低溫培養(yǎng)箱中4℃處理30分鐘，用Trizol法(所用試劑購(gòu)自Invitrogen公司)提取幼苗總RNA，具體方法為收集經(jīng)4℃低溫處理的水稻材料100mg，立即置于液氮中研磨，加入1mL Trizol試劑，充分混勻后，室溫放置5分鐘；加入0.2mL氯仿，劇烈振搖15秒，室溫溫育3分鐘；4℃，12000g離心15分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5mL離心管中，加入0.5mL異丙醇沉淀RNA；最后將RNA沉淀用1mL 75％乙醇洗滌后溶于適量經(jīng)DEPC處理過(guò)的水中，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、第一鏈cDNA的合成用SuperscriptTMII RT試劑盒(Invitrogen)并按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作取1-5μg步驟1獲得的水稻總RNA放入滅活了RNase的PCR管中，加入Oligo(dT)12-18(500mg/mL)1μL和dNTP Mix(10mM each)1μL，用DEPC處理后的雙蒸水補(bǔ)充至12μL，混勻后在65℃下加熱5分鐘，然后迅速置于冰上，1分鐘。短暫離心后再加入5×第一鏈合成緩沖液4μL、0.1M DTT 2μL和RNaseOutTM(40unit/μL)1μL，輕輕混勻后，42℃溫育2分鐘，然后加入SuperscriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶(200unit/μL)1μL，混勻，42℃溫育50分鐘，70℃加熱15分鐘使酶失活，得到第一鏈cDNA。
3、OrICLb cDNA的合成取1μL步驟2獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在5’端引物和3’端引物的引導(dǎo)下，用PCR的方法合成OrICLb的cDNA，PCR反應(yīng)體系為L(zhǎng)A taq(TaKaRa公司)0.5μL、2×GC緩沖液(TaKaRa公司)25μL、dNTP 1μL、5’端引物(10μM/L)1μL、3’端引物(10μM/L)1μL、模板1μL、加雙蒸水補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μL。PCR反應(yīng)條件為先94℃ 4分鐘；再94℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 2分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。
反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(泳道M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000，泳道1為OrITCLb的RT-PCR產(chǎn)物)，得到分子量約為1.8kb的條帶(圖中箭頭所指)，與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天為時(shí)代公司)回收該片段，然后將該回收片段與載體pGEM-T Easy(Promega)進(jìn)行連接，連接體系為T(mén)4DNA連接酶(3u/μL)、2×連接酶緩沖液5μL、pGEM-TEasy(50ng/μL)0.5μL和回收PCR產(chǎn)物3.5μL，4℃反應(yīng)12-24小時(shí)。參照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，692110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-T Easy載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，命名為pTE-OrICLb。以該質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明OrICLb具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，由1206個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框(ORF)為自5’端第25-1161位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。與ICE1進(jìn)行同源性比較，核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為38.92％和39.66％，OrICLb的保守結(jié)構(gòu)域與ICE1的保守結(jié)構(gòu)域bHLH有著極高的同源性。
實(shí)施例2、OrICLb超表達(dá)載體pSNICLb的構(gòu)建1、玉米泛素啟動(dòng)子(UbiPro)的獲得1)玉米基因組DNA的提取剪取約0.2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取緩沖液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1％SDS和1％β-巰基乙醇)，劇烈振蕩使其全部懸??；65℃水浴30分鐘，每5分鐘顛倒混勻一次；然后加入250μL預(yù)冷的5M乙酸鉀，立即顛倒混勻，冰浴5分鐘；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm離心5分鐘；收集上清，加入0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA，室溫放置40分鐘；4℃ 12000rpm離心15分鐘，棄上清；沉淀用70％、100％乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNase的ddH2O中，得到玉米基因組DNA。
2)PCR擴(kuò)增玉米泛素啟動(dòng)子(UbiPro)取2μL步驟1)獲得的玉米基因組DNA溶液作為模板，在帶有Hind III識(shí)別位點(diǎn)的5′引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和帶有BamHI識(shí)別位點(diǎn)的3′引物(CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為先94℃ 3分鐘；再94℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，表明得到長(zhǎng)度約為2kb的擴(kuò)增片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收該目的片段，用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I雙酶切后回收，得到帶有粘性末端的玉米泛素啟動(dòng)子(UbiPro)，備用。
2、用限制性內(nèi)切酶Sac I和EcoR I將Noster poly A終止序列從質(zhì)粒載體pBI221(Clontech)上切下，連接到載體pUC19(TaKaRa公司)的相應(yīng)位點(diǎn)中，得到重組載體，命名為pUC19-Noster。再用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切pUC19-Noster，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收線性化的載體大片段，并將該回收片段與步驟1獲得的帶有粘性末端的玉米泛素啟動(dòng)子(UbiPro)相連，得到重組載體，命名為pUN19。
3、用限制性內(nèi)切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切從步驟2購(gòu)建的重組載體pUN19切下包含UbiPro和Noster的長(zhǎng)度約為2.3kb的片段，將該片段克隆入質(zhì)粒載體pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriclture，www.cambia.org)多克隆位點(diǎn)的EcoR I和HindIII位點(diǎn)處，得到重組載體，命名為pUN1301。
4、用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI對(duì)質(zhì)粒載體pBI221進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收長(zhǎng)度約為0.8kb的35S啟動(dòng)子片段，將其與經(jīng)相同酶雙酶切的質(zhì)粒載體pUN1301進(jìn)行連接，得到含有35S啟動(dòng)子片段的重組載體，命名為pSN1301。
5、對(duì)重組質(zhì)粒載體pTE-OrICLb和pSN1301分別用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切體系為質(zhì)粒5μL、10×酶切緩沖液2.5μL、KpnI 1μL、BamHI O.8μL，加ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μL，37℃酶切8小時(shí)。用瓊脂糖電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，回收1215bp的OsICLb片段和13Kb的載體pSN1301大片段，分別溶解于45μL ddH2O中。再按以下反應(yīng)體系將兩者進(jìn)行連接T4DNA連接酶2μL、10×連接酶緩沖液2μL、回收的OsIClb 10μL、pSN1301 6μL，16℃連接16小時(shí)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Kan+平板篩選得到陽(yáng)性菌株，將該重組質(zhì)粒命名為pSNICLb，其物理圖譜如圖2所示。在該質(zhì)粒中采用CaMV 35S強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因OrICLb在植物中超表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法見(jiàn)下述實(shí)施例。
實(shí)施例3、OrICLb超表達(dá)擬南芥的獲得及其鑒定含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌浸泡轉(zhuǎn)化的植株所結(jié)種子以及由該種子長(zhǎng)成的植株用T0代表，T1代表示T0代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株，T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株。
一、轉(zhuǎn)化有OrICLb超表達(dá)質(zhì)粒pSNICLb的擬南芥的獲得1、OrICLb超表達(dá)質(zhì)粒pSNICLb轉(zhuǎn)化擬南芥用EasyJecT Plus電激儀(英國(guó)EquiBio公司)并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將質(zhì)粒pSNICLb用電激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58，經(jīng)含卡那霉素的抗性平板篩選得到農(nóng)桿菌的陽(yáng)性克??；再參照Clough等的方法(Clough SJ and Bent AF，1998 Plant J 16735-43)，在上述陽(yáng)性克隆農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，將pSNICLb轉(zhuǎn)化擬南芥。
2、轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性苗的抗菌素篩選將收獲的步驟1獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子用0.2％ TritonX-100浸泡10分鐘；再用10％的次氯酸鈉表面消毒，12分鐘；滅菌水洗滌五次，每2分鐘一次；用水將種子鋪在含25mg/L潮霉素的MS平板上，用錫箔紙包裹，在4℃、黑暗條件下放置2天，取出后于23℃的培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)3-4天；3-4天后，長(zhǎng)勢(shì)最高的為初篩到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗，在避光條件下取出，光下再培養(yǎng)3天，然后將轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗移至花盆中培養(yǎng)，得到T1代轉(zhuǎn)基因材料。
二、轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定GUS染色液100mmol/L磷酸鹽pH 7.0，0.1％Triton X-100，10mmol/L EDTA，0.5mmol/L鐵氰化鉀，X-Gluc 1mg/mL。
Edwards提取緩沖液200mM Tris-Cl pH7.5，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS。
1、擬南芥陽(yáng)性苗的GUS染色鑒定取生長(zhǎng)3周的步驟1篩選的擬南芥陽(yáng)性幼苗葉片尖部2-3mm材料進(jìn)行GUS染色。37℃溫育12小時(shí)，再用75％酒精脫色，葉片呈藍(lán)色的為陽(yáng)性植株。
2、轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定1)基因組DNA的提取取一片用步驟1的方法鑒定的擬南芥陽(yáng)性植株的葉片放入1.5mL Eppendorf管中，加入液氮，用組織研磨杵研磨10秒鐘，磨碎；加入400μL Edwards提取緩沖液，輕輕研磨(洗去杵上組織)；振蕩5秒鐘，離心1分鐘，轉(zhuǎn)移300μL的上清液到新管中，加入300μL異丙醇，混合，于室溫放置2分鐘；離心、棄上清，風(fēng)干沉淀，溶于100μL水中，得到轉(zhuǎn)基因材料的基因組DNA。
2)轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定以步驟1)獲得的基因組DNA為模板，在引物1(5’端引物)GGATCCTTCTCAGAGCGCTGCGAGGT和引物2(3’端引物)GGTACCATCAAATCCCAGTGCATTGGTC的引導(dǎo)下，用PCR的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定，PCR反應(yīng)體系為基因組DNA溶液1μL、LA taq0.5μL、2×GC緩沖液25μL、dNTP 1μL、引物1(10μM/L)和引物2(10μM/L)各1μL、加雙蒸水補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μL。PCR反應(yīng)條件為先94℃ 4分鐘；再94℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 2分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示(泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000，泳道2為野生型植株，泳道3-5和泳道6-8分別代表兩個(gè)不同轉(zhuǎn)基因株系，泳道9為質(zhì)粒對(duì)照(所用引物同上))，所有轉(zhuǎn)基因株系都擴(kuò)出了約1.2kb的陽(yáng)性條帶，與預(yù)期大小相符，而野生型則沒(méi)有，表明目的基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥中。
實(shí)施例4、低溫脅迫處理后的OrICLb轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型將發(fā)芽后的轉(zhuǎn)OrICLb擬南芥及野生型擬南芥種子種到蛭石上，放到擬南芥培養(yǎng)室(23℃)進(jìn)行培養(yǎng)，每?jī)芍軡补嘁淮?/2MS營(yíng)養(yǎng)液，待幼苗生長(zhǎng)四周后，轉(zhuǎn)到低溫培養(yǎng)箱中4℃冷馴化一周，然后放到-1℃低溫生化培養(yǎng)箱中預(yù)冷16小時(shí)，再在-12℃下低溫處理6小時(shí)，然后轉(zhuǎn)到4℃低溫培養(yǎng)箱中恢復(fù)生長(zhǎng)24小時(shí)，再轉(zhuǎn)到培養(yǎng)室中培養(yǎng)，4天后觀察轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的表型并統(tǒng)計(jì)存活率，表型觀察結(jié)果如圖4所示(圖中A為野生型植株，B和C為兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)OrICLb擬南芥株系)，表明轉(zhuǎn)OrICLb擬南芥具有明顯的低溫脅迫抗性。
序列表<160>2<210>1<211>1206<212>DNA<213>東鄉(xiāng)野生稻(O.rufipogon)<400>1ttctcagagc gctgcgaggt tgccatggac gaggcggagg cggcggcggc ggcggcgaag 60atggacgagc tggcgggagg aggaggagga ggcggcggcg actggtcgta cctcgcggcg 120gacgcgctgg cggcggcgtc gttcacggcg ttcccgctcc accaccacca ccaccgcgac 180gtgctctcgg cgtcgacccc gtcgtcgctg ctcctcaaca tggacgcggc caccgccgcg 240gccatgttcg acttccaggc ggccttcccg tcgtcctccg tcccgccgcc gccgcccacg 300acgacggcgg cgctcccgcc gttccacgac ttcgcctcct ccaacccgtt cgacgacgcg 360ccgcccccgt tcctcgcgcc gccggggcag aagctcgggt tcctggggcc ccccggcggc 420gcgttcggcg gcgggatggg atgggacgac gacgacgaga tcgagcagag cgtggacgcc 480tcgtccatgg gtgtctcggc ctcgctggag aatgccgcgc ccgtggcggc cggaggaggc 540ggcggcggtg gcggcggcgg tgggaggggc aagaagaagg ggatgccggc caagaacctc 600atggcggagc ggcggcgcag gaagaagctc aacgaccgcc tctacatgct gcgctccgtg 660gtgcccaaga tcagcaagat ggacagagct tctatccttg gtgatgcaat tgagtacttg 720aaggagctcc tgcagaggat taacgatctt cacaatgaac ttgagtctgc tcctagctct 780tcgcttactg gaccatcatc ggctagcttc cacccatcaa cacccacatt gcagacgttt 840cctggccgcg ttaaggagga actttgccca acctcatttc caagccctag tggtcaacaa 900gccacggtcg aagttaggat gagggaaggt catgcagtca atatccacat gttctgcgca 960cgcaggcccg gcattctgat gtccacattg agggctctcg acagccttgg cctcgggatc1020gagcaggcgg tcatcagctg tttcaatggg tttgcaatgg atgttttccg cgccgagcaa1080tgcagggatg gtcctggact cgggcctgaa gaaattaaga ccgtgctcct gcactctgct1140ggccttcaga acgcaatgta atcagcaagt cagaaagcag tcaagaccaa tgcactggga1200tttgat 1206
<210>2<211>378<212>PRT<213>東鄉(xiāng)野生稻(O.rufipogon)<400>2Met Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Met Asp Glu Leu1 5 10 15Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Trp Ser Tyr Leu Ala Ala20 25 30Asp Ala Leu Ala Ala Ala Ser Phe Thr Ala Phe Pro Leu His His His35 40 45His His Arg Asp Val Leu Ser Ala Ser Thr Pro Ser Ser Leu Leu Leu50 55 60Asn Met Asp Ala Ala Thr Ala Ala Ala Met Phe Asp Phe Gln Ala Ala65 70 75 80Phe Pro Ser Ser Ser Val Pro Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Ala Ala85 90 95Leu Pro Pro Phe His Asp Phe Ala Ser Ser Asn Pro Phe Asp Asp Ala100 105 110Pro Pro Pro Phe Leu Ala Pro Pro Gly Gln Lys Leu Gly Phe Leu Gly115 120 125Pro Pro Gly Gly Ala Phe Gly Gly Gly Met Gly Trp Asp Asp Asp Asp130 135 140Glu Ile Glu Gln Ser Val Asp Ala Ser Ser Met Gly Val Ser Ala Ser145 150 155 160Leu Glu Asn Ala Ala Pro Val Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly165 170 175Gly Gly Gly Gly Arg Gly Lys Lys Lys Gly Met Pro Ala Lys Asn Leu180 185 190Met Ala Glu Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu Asn Asp Arg Leu Tyr Met195 200 205
Leu Arg Ser Val Val Pro Lys Ile Ser Lys Met Asp Arg Ala Ser Ile210 215 220Leu Gly Asp Ala Ile Glu Tyr Leu Lys Glu Leu Leu Gln Arg Ile Asn225 230 235 240Asp Leu His Asn Glu Leu Glu Ser Ala Pro Ser Ser Ser Leu Thr Gly245 250 255Pro Ser Ser Ala Ser Phe His Pro Ser Thr Pro Thr Leu Gln Thr Phe260 265 270Pro Gly Arg Val Lys Glu Glu Leu Cys Pro Thr Ser Phe Pro Ser Pro275 280 285Ser Gly Gln Gln Ala Thr Val Glu Val Arg Met Arg Glu Gly His Ala290 295 300Val Asn Ile His Met Phe Cys Ala Arg Arg Pro Gly Ile Leu Met Ser305 310 315 320Thr Leu Arg Ala Leu Asp Ser Leu Gly Leu Gly Ile Glu Gln Ala Val325 330 335Ile Ser Cys Phe Asn Gly Phe Ala Met Asp Val Phe Arg Ala Glu Gln340 345 350Cys Arg Asp Gly Pro Gly Leu Gly Pro Glu Glu Ile Lys Thr Val Leu355 360 365Leu His Ser Ala Gly Leu Gln Asn Ala Met370 37權(quán)利要求
1.野生稻的一個(gè)抗凍基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凍基因，其特征在于所述抗凍基因具有序列表中SEQ ID No1的DNA序列。
3.權(quán)利要求1所述抗凍基因編碼的蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物抗凍性的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中的SEQ ID №2氨基酸殘基序列。
5.含有權(quán)利要求1所述抗凍基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求1所述抗凍基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求1所述抗凍基因的宿主菌。
8.一種培育抗凍植物的方法，是利用植物表達(dá)載體將權(quán)利要求1所述的抗凍基因?qū)胫参锛?xì)胞，獲得對(duì)低溫耐受力增強(qiáng)的的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述被轉(zhuǎn)化的植物宿主為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了野生稻的一個(gè)抗凍基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。該基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。該基因的編碼蛋白可具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物抗凍性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的抗凍基因?qū)⒃谂嘤箖鲂栽鰪?qiáng)的植物(特別是水稻)中發(fā)揮重要的作用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1772898SQ200510068048
公開(kāi)日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日
發(fā)明者種康, 李飛, 徐云遠(yuǎn), 陳大洲, 肖葉青, 許智宏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所