專利名稱：一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法涉及一種基因芯片檢測(cè)方法，特別是一種基因芯片的非放射性標(biāo)記、非熒光標(biāo)記檢測(cè)法。
基因芯片技術(shù)將生命科學(xué)研究中所涉及的許多不連續(xù)的分析過程，如樣品制備、化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè)等，通過采用微電子、微機(jī)械等工藝集成到芯片中，使之連續(xù)化、集成化和微型化。這一技術(shù)的成熟和應(yīng)用將在新世紀(jì)里給遺傳研究、疾病診斷和治療、新藥發(fā)現(xiàn)和環(huán)境保護(hù)等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域帶來一場(chǎng)革命。
目前，常規(guī)的分子雜交結(jié)果的檢測(cè)方法主要是熒光標(biāo)記檢測(cè)法和同位素標(biāo)記檢測(cè)法。膜芯片的分子雜交過程是，將待檢測(cè)樣品固定于濾膜上，與同位素或熒光標(biāo)記的探針在一定雜交液及溫度下進(jìn)行雜交，一般均需要較長的時(shí)間(4-24h)才能完成分子雜交過程，且一般每次只能檢測(cè)為數(shù)不多的一個(gè)到幾個(gè)探針?；蛐酒菍⒁阎蛄械腄NA探針，固化于玻璃等基片的表面，而將待檢測(cè)樣品進(jìn)行標(biāo)記并與微集成陣列進(jìn)行雜交。同位素標(biāo)記檢測(cè)法由于操作復(fù)雜，有污染，獲取數(shù)據(jù)速度慢等缺點(diǎn)，逐步為熒光標(biāo)記檢測(cè)法所替代，而基因芯片檢測(cè)不僅使得檢測(cè)過程平行化，可以同時(shí)檢測(cè)成百上千的基因序列；而且由于集成的顯微化，使得雜交所需的探針及待檢測(cè)樣品均大為減少，雜交時(shí)間明顯縮短，一般的分子雜交過程可在30min內(nèi)完成。但是由于其信號(hào)讀取設(shè)備價(jià)格昂貴，從而大大制約了芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床診斷方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是利用最新的銀在納米金顆粒上沉積使雜交信號(hào)通過呈現(xiàn)于芯片表面，即在待檢測(cè)樣品的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過程中，加入地高辛或生物素標(biāo)記，然后與芯片進(jìn)行雜交，雜交以后用抗體與納米金標(biāo)記的地高辛或生物素標(biāo)記結(jié)合，再加入銀染試劑就可得到相應(yīng)的信號(hào)。
具體的說，一種基因芯片的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特點(diǎn)在于包括下列步驟；1.待測(cè)基因的純化，可使用任意有效的核酸純化方法如(1)蛋白酶K消化裂解法、(2)直接裂解法、(3)堿變性法、(4)煮沸法、(5)碘化鈉法、(6)異硫氰酸胍法、(7)異硫氰酸胍-二氧化硅法、(8)異硫氰酸胍-玻璃粉法、(9)Chelex-100法、(10)尿素消化裂解法、(11)全血直接擴(kuò)增法。詳細(xì)方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版.作者，J.薩姆布魯克；2.待測(cè)目的脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)進(jìn)行基因擴(kuò)增；基因擴(kuò)增方法是跟據(jù)實(shí)際需要選用下列方法之一或者它們的組合(1)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；(2)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)?RT-PCR)；(3)依賴核酸序列的擴(kuò)增(Nucleicacid sequence-based amplification，NASBA)，(4)芯片原位基因擴(kuò)增；3.核酸標(biāo)記方法選用下列方法之一(1)摻入法在脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入了地高辛或生物素標(biāo)記的核酸單體，(2)末端標(biāo)記法用地高辛或生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)剑?3)化學(xué)標(biāo)記法，此方法可以對(duì)基因擴(kuò)增產(chǎn)物或純化的核酸直接進(jìn)行標(biāo)記；4.脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)在進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)奖粩U(kuò)增并標(biāo)記后用于與基因芯片雜交；如果選用的是芯片原位擴(kuò)增，則此步省去。雜交時(shí)使用雜交液與基因擴(kuò)增產(chǎn)物混合，改變基因擴(kuò)增產(chǎn)物中的離子強(qiáng)度并在其中加入封閉劑；5.根據(jù)核酸標(biāo)記物不同，雜交后使用納米金標(biāo)記的地高辛抗體與地高辛充分結(jié)合，或使用納米金標(biāo)記親合素(streptavidin or avidin)與生物素充分結(jié)合；6.利用銀染試劑的氧化還原反應(yīng)中形成的銀顆粒聚集在納米金上，放大雜交信號(hào)；7.使用普通光學(xué)掃描儀進(jìn)行掃描檢測(cè)，使用基于CCD的顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，可將圖象進(jìn)行數(shù)字化，并可對(duì)圖象進(jìn)行進(jìn)一步分析雜交結(jié)果。如果僅僅是初步觀測(cè)，則可用放大鏡或普通光學(xué)顯微鏡直接觀察。8.基因擴(kuò)增的片斷是指檢測(cè)對(duì)象包含有(1)守基因片斷、(2)基因突變的片斷；或者(1)(2)的組合。9.基因擴(kuò)增的片斷所使用的引物至少有能夠擴(kuò)增檢測(cè)對(duì)象的保守基因片斷或者包含基因突變的片斷。
所述的樣品的處理過程是待測(cè)樣品基因的抽提，針對(duì)樣品不同，可選擇使用蛋白酶K消化裂解法、直接裂解法、堿變性法、煮沸法、碘化鈉法、異硫氰酸胍法、異硫氰酸胍-二氧化硅法、異硫氰酸胍-玻璃粉法、Chelex-100法、全血直接擴(kuò)增法、尿素消化裂解法；可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社。作者，J.薩姆布魯克；可以使用所述的樣品的標(biāo)記過程，根據(jù)不同方法分別說明(1)摻入法在脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入了地高辛或生物素標(biāo)記的核酸單體，例如，DIG-16-dUTP、Biotin-11-dUTP；(2)末端標(biāo)記法在引物合成時(shí)用地高辛或生物素標(biāo)記，脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)交蛞蕾嚭怂嵝蛄械臄U(kuò)增；(3)化學(xué)標(biāo)記法，此方法可以對(duì)基因擴(kuò)增產(chǎn)物或純化的核酸直接進(jìn)行標(biāo)記，例如使用BrightStarTMPsoralen-Biotin Nonisotopic Labeling Kit可標(biāo)記RNA、DNA、PCR產(chǎn)物和寡核苷酸。
所述的雜交過程是取適量標(biāo)記的脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)加入一定量的雜交液混合均勻后，滴于已封閉的基因芯片陣列表面，蓋上蓋玻片，置于與基因芯片探針Tm值相關(guān)的溫度下預(yù)熱的雜交盒中保溫20-30分鐘，使地高辛或生物素標(biāo)記的DNA樣品與芯片上的特異性探針結(jié)合。對(duì)于脫氧核糖核酸(DNA)雙鏈，預(yù)變性可以提高信噪比。
所述的納米金標(biāo)記過程是在室溫下，取出芯片，去除蓋玻片，用芯片清洗液中洗滌5分鐘，不時(shí)搖晃，清洗兩次，同時(shí)封阻芯片上的蛋白非特異性結(jié)合位點(diǎn)，然后取出芯片，用吸水紙吸除多余液體，另取納米金標(biāo)記的地高辛抗體或納米金標(biāo)記的親和素溶液滴于芯片表面，蓋上蓋玻片靜置30分鐘左右，使納米金標(biāo)記的地高辛抗體或納米金標(biāo)記的親和素與地高辛或生物素充分結(jié)合。然后用芯片清洗液中洗滌5分鐘。
所述的銀染過程是在基因芯片雜交區(qū)域內(nèi)，滴上銀染試劑，并蓋上蓋玻片靜置30分鐘左右，用去離子水沖掉芯片表面液體，涼干。
所述的檢測(cè)過程是雜交信號(hào)借助放大鏡或普通光學(xué)顯微鏡肉眼可見灰色或黑色圓點(diǎn)，使用基于CCD的顯微鏡或用普通光學(xué)掃描儀掃描記錄并分析結(jié)果。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)與效果1.本發(fā)明的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法可以進(jìn)行基因檢測(cè)，具有高的靈敏度和雜交特異性。2.本發(fā)明中的樣品標(biāo)記處理，采用標(biāo)記方法具有成本低廉，試劑有效期長，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。3.可使用基于CCD(電荷耦合器件)的普通光學(xué)檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行掃描，如使用普通光學(xué)掃描儀進(jìn)行掃描，或使用基于CCD的顯微鏡進(jìn)行掃描，在某些情況下，用放大鏡或普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。4.在種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法中將地高辛或生物素標(biāo)記在引物上，具有成本低廉，并能夠長時(shí)間保存，大大降低了芯片的使用成本。5.在一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法中使用信號(hào)顯示方法是銀顆粒，結(jié)果易于保存、對(duì)比，以及標(biāo)準(zhǔn)化；同時(shí)，該方法比使用酶顯色法要求的環(huán)境條件低，反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。6.在一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法中使用電荷耦合器件(CCD)作為信號(hào)采集器，甚至可以使用普通掃描儀進(jìn)行信號(hào)采集。從而可以徹底改善目前芯片價(jià)格昂貴和芯片檢測(cè)設(shè)備價(jià)格昂貴而難以推廣的現(xiàn)狀。
實(shí)施實(shí)例2多種血液傳染病檢測(cè)型基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)過程1、取血液傳染病檢測(cè)型基因芯片，芯片表面固定了多種基因的檢測(cè)(如HTLV、HIV、HBV、HCV、HPVS、EV、CMV、EBV、HSV)用多聚寡核苷酸，寡核苷酸序列含有檢測(cè)目的基因保守序列，檢測(cè)對(duì)象有RNA病原體和DNA病原體；2、按試劑盒提供的試劑及使用方法進(jìn)行基因抽提；注意，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)防止RNA被酶解；使用RNase free器材；3、取10uL萃取好的RNA至RNase free微量離心管，加入2uL RT primer，70℃下，作用10分鐘，使RNA變性，之后置於冰上；4、取出一支新的RT管，加入38uL DEPC水，置冰上。在數(shù)分鐘內(nèi)將RT管內(nèi)溶液，全部加至步驟3中的RNA管中；在42℃反應(yīng)45分鐘，然后70℃反應(yīng)10分鐘，即完成反錄；5、跟據(jù)芯片所用基因片斷，按試劑盒提供的引物基因擴(kuò)增。在每對(duì)引物的正向引物的5′端標(biāo)記了生物素，如5′-biotin-CCTGGTTATCGCTGGATG-3′；5′-AGGGTTCAAATGTATACCC-3′。按芯片指定的條件進(jìn)行PCR溫度循環(huán)，首先95℃，變性3分鐘；再以95℃，30秒，52℃，30秒，72℃，30秒循環(huán)30次，最后，72℃延伸4分鐘；獲得標(biāo)記了生物素的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)于RNA病原體則同時(shí)完成了反轉(zhuǎn)錄及基因擴(kuò)增；6、取芯片試劑盒中封閉液對(duì)檢測(cè)基因芯片進(jìn)行封閉；7、取標(biāo)記了生物素的基因擴(kuò)增產(chǎn)物在94℃下充分變性后在冰上急冷，取2ul與1ul雜交液混和，滴于芯片陣列表面，蓋上蓋玻片，置于40℃預(yù)熱的雜交盒中保溫20-30分鐘，使生物素標(biāo)記的DNA樣品與芯片上的特異性探針結(jié)合。8、在室溫下，取出芯片，去除蓋玻片，浸入芯片試劑盒提供的清洗液中洗滌5分鐘，兩次，不時(shí)晃動(dòng)溶液，用吸水紙吸除多余液體；再浸入芯片試劑盒提供的平衡液中1分鐘；9、取5μl芯片試劑盒提供納米金標(biāo)記親合素溶液滴于芯片表面，蓋上蓋玻片，靜置10分鐘，使親合素與生物素充分結(jié)合；去除蓋玻片，吸除多余液體，然后置于平衡液中洗滌1分鐘，取出芯片，用吸水紙吸除多余液體；10、取芯片試劑盒提供銀染試劑10μl滴于芯片表面，蓋上蓋玻片；11、用芯片試劑盒提供清洗液清洗芯片表面，吹干，在放大鏡下可見雜交信號(hào)呈灰色或黑色的圓點(diǎn)。用普通光學(xué)掃描儀掃描記錄；12、可運(yùn)用多種芯片雜交信號(hào)分析軟件對(duì)雜交信號(hào)分析。
實(shí)施實(shí)例31、自制乙型肝炎突變檢測(cè)基因芯片；所有突變位點(diǎn)位于正向引物的3′端的三個(gè)堿基中，其中大部分位于3′端第一個(gè)堿基位置上，5′端修飾了氨基，這些引物作為探針固定在芯片表面；2、按試劑盒提供的試劑用SDS煮沸法進(jìn)行基因抽提；取20μl血清加入裂解液混勻后煮沸10分鐘，每分鐘12000轉(zhuǎn)離心10分鐘；3、跟據(jù)芯片所用基因片斷，進(jìn)行基因抽提及基因擴(kuò)增。使用2×HotStar Tag RCRbuffer、50μM dNTPs、20μg/μl BSA、0.1-0.4uM反向引物和3u HotStar TagDNA polymerase(Qiagen)；其中反向每個(gè)引物的的5′端標(biāo)記了生物素，如5′-biotin-GGGCATTTGGTGGTCT(G/A)T-3′；5′-biotin-AGGGTTCAAATGTATACCC-3′。按芯片指定的條件進(jìn)行PCR溫度循環(huán)，首先95℃，變性4分鐘；再以95℃，40秒，52℃，40秒，72℃，40秒循環(huán)35次，最后，72℃延伸4分鐘；獲得標(biāo)記了生物素的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，并且產(chǎn)物特異地結(jié)合在芯片表面；4、在室溫下，取出芯片，去除蓋玻片，浸入芯片試劑盒提供的清洗液中洗滌5分鐘，兩次，不時(shí)晃動(dòng)溶液，用吸水紙吸除多余液體；再浸入芯片試劑盒提供的平衡液中1分鐘；5、取5μl芯片試劑盒提供納米金標(biāo)記親合素溶液滴于芯片表面，蓋上蓋玻片，靜置10分鐘，使親合素與生物素充分結(jié)合；去除蓋玻片，吸除多余液體，然后置于平衡液中洗滌1分鐘，取出芯片，用吸水紙吸除多余液體；6、取芯片試劑盒提供銀染試劑10μl滴于芯片表面，蓋上蓋玻片；7、用芯片試劑盒提供清洗液清洗芯片表面，吹干，在10倍放大鏡下可見雜交信號(hào)呈灰色或黑色的圓點(diǎn)。用普通光學(xué)掃描儀掃描記錄；8、可運(yùn)用多種芯片雜交信號(hào)分析軟件對(duì)雜交信號(hào)分析。
權(quán)利要求
1.一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特征在于包括a)針對(duì)不同標(biāo)本中待測(cè)目的脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)抽提方法使用下列方法之一(1)蛋白酶K消化裂解法、(2)直接裂解法、(3)堿變性法、(4)煮沸法、(5)碘化鈉法、(6)異硫氰酸胍法、(7)異硫氰酸胍—二氧化硅法、(8)異硫氰酸胍一玻璃粉法、(9)Chelex-100法、(10)尿素消化裂解法、(11)全血直接擴(kuò)增法；b)目的基因標(biāo)記地高辛或生物素，其方法可使用化學(xué)標(biāo)記法或者基因擴(kuò)增法；c)脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)在地高辛或生物素標(biāo)記后用于與基因芯片雜交；d)雜交后使用納米金標(biāo)記的地高辛抗體與地高辛結(jié)合，或使用納米金標(biāo)記親合素(streptavidin or avidin)與生物素結(jié)合；e)使用銀染試劑對(duì)雜交后的基因芯片進(jìn)行染色；f)使用普通光學(xué)掃描儀進(jìn)行掃描檢測(cè)或使用基于CCD的顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特征在于基因擴(kuò)增方法是指檢測(cè)對(duì)象的基因片斷通過擴(kuò)增方法使之?dāng)?shù)量增加，擴(kuò)增方法可使用下列方法之一或其組合使用，一是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；二是反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)?；三是依賴核酸序列的擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)，四是芯片原位基因擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特征在于基因擴(kuò)增法標(biāo)記地高辛或生物素樣品的標(biāo)記過程是以下方法之一，一是在脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入了地高辛或生物素標(biāo)記的核酸單體；二是用地高辛或生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)剑蝗窃诨驍U(kuò)增后直接進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特征在于雜交時(shí)使用雜交液與基因擴(kuò)增產(chǎn)物混合，改變基因擴(kuò)增產(chǎn)物中的離子強(qiáng)度并在其中加入封閉劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特征在于使用芯片原位基因擴(kuò)增法同時(shí)對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增、標(biāo)記和雜交。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特征在于雜交后使用納米金標(biāo)記的地高辛抗體與地高辛充分結(jié)合，或使用納米金標(biāo)記親合素(streptavidin or avidin)與生物素充分結(jié)合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特征在于利用銀染試劑的氧化還原反應(yīng)中形成的銀顆粒聚集在納米金上，放大雜交信號(hào)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特征在于使用普通光學(xué)掃描儀進(jìn)行掃描檢測(cè)，或使用基于CCD的顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，可將圖象進(jìn)行數(shù)字化，并可對(duì)圖象進(jìn)行進(jìn)一步分析雜交結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特征在于基因擴(kuò)增的片斷是指檢測(cè)對(duì)象包含有(1)守基因片斷、(2)基因突變的片斷；或者(1)(2)的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法，其特征在于基因擴(kuò)增的片斷所使用的引物至少有能夠擴(kuò)增檢測(cè)對(duì)象的保守基因片斷或者包含基因突變的片斷。
全文摘要
本發(fā)明一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法涉及的是一種基因芯片檢測(cè)方法，特別是一種基因芯片的非放射性標(biāo)記、非熒光標(biāo)記檢測(cè)法。該檢測(cè)法包括以下步驟抽提了標(biāo)本中待測(cè)目的基因后，將待檢測(cè)樣品的基因標(biāo)記地高或物素分子，得到地高辛或生物素標(biāo)記的脫氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)，用于與基因芯片雜交；雜交后使用納米金標(biāo)記的地高辛抗體與地高辛結(jié)合，或使用納米金標(biāo)記親合素與生物素結(jié)合；使用銀染試劑對(duì)雜交后的基因芯片進(jìn)行染色；用直接用顯微鏡進(jìn)行觀察、CCD(電荷耦合器件)記錄信號(hào)或用普通光學(xué)掃描儀進(jìn)行掃描檢測(cè)可得到相應(yīng)的雜交結(jié)果；并可使用相關(guān)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1392269SQ0211314
公開日2003年1月22日 申請(qǐng)日期2002年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月11日
發(fā)明者劉全俊, 趙偉, 劉偉, 陸祖宏, 朱紀(jì)軍, 王宏 申請(qǐng)人:劉全俊, 劉偉, 陸祖宏