專利名稱：玉米dreb類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及玉米DREB類耐寒和耐旱轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
玉米(Zea mays L.)是重要的糧食作物之一，培育耐寒，耐旱的品種對(duì)提高玉米產(chǎn)量具有重要意義。
本發(fā)明提供的2個(gè)玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子之一為maDREB1，它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2的玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB1由281個(gè)氨基酸殘基組成。
玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1編碼玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB1的基因由1388個(gè)堿基組成。該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第57到第902位堿基。
本發(fā)明提供的另一個(gè)玉米的DREB類轉(zhuǎn)錄因子是maDREB2，它具有序列表中序列4的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列4的氨基酸殘基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列4的玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB2由267個(gè)氨基酸殘基組成。
玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB2的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列3的DNA序列；2)與序列表中序列3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列3編碼玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB2的基因由1085個(gè)堿基組成。該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第120到第923位堿基。
本發(fā)明所提供的2個(gè)玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB1和maDREB2具有與DRE順式作用元件結(jié)合的能力，并能激活下游基因的表達(dá)。其編碼基因都含有保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域序列，代表了玉米中的一種轉(zhuǎn)錄因子家族。
用本發(fā)明所提供的編碼轉(zhuǎn)錄因子maDREB1和maDREB2的基因，使用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的表達(dá)載體(這些植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體以及用于單子葉植物微彈轟擊的載體)轉(zhuǎn)化植株，都可獲得對(duì)低溫和干旱脅迫耐受力得到增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。載體還可包括3’非翻譯區(qū)域，包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它的可效應(yīng)mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。聚腺苷酸信號(hào)引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。3’區(qū)域的例子有農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)等。本發(fā)明的maDREB1和maDREB2基因的3’非翻譯區(qū)域可被用于在植物中表達(dá)。本發(fā)明的2個(gè)基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子很多，如花椰菜花葉病毒(CAMV 35S)和Ubiqutin啟動(dòng)子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。本發(fā)明的2個(gè)基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，也可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的翻譯。翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是天然或合成等多種不同來源的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，包括加入植物可選擇性標(biāo)記。使用的選擇性標(biāo)記可以是編碼對(duì)抗生素抗性酶的基因，抗生素包括慶大霉素、潮霉素、卡那霉素等。也可以是產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因，如GUS、熒光酶，還可以是抗化學(xué)試劑(例如除莠劑)的基因。當(dāng)然，也可以不用任何篩選標(biāo)記。
攜帶有本發(fā)明maDREB1和maDREB2基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，Now York，pp.421-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2ndEdition)。
可使用包括本發(fā)明的2個(gè)基因maDREB1和maDREB2的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物宿主(既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等)，培育抗寒和抗旱的植物品種。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
圖2為maDREB2基因轉(zhuǎn)化酵母雙報(bào)導(dǎo)子細(xì)胞后，在0mM 3-AT SD/-His-Ura-Trp平板和30mM 3-ATSD/-His-Ura-Trp平板上的生長情況。
圖3為Southern雜交分析maDREB1基因在玉米基因組中組成的結(jié)果。
圖4為Southern雜交分析maDREB2基因在玉米基因組中組成的結(jié)果。
圖7為maDREB1基因在低溫、干旱條件下表達(dá)狀態(tài)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。
圖8為maDREB2基因在低溫、干旱條件下表達(dá)狀態(tài)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)施例2、含有DRE順式作用元件的酵母雙報(bào)道子細(xì)胞的獲得將從rd29A啟動(dòng)子區(qū)分離的由75bp組成的DRE順式作用元件通過HindIII酶切位點(diǎn)將其串聯(lián)成4個(gè)重復(fù)，獲得含有4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的DRE元件的DNA片段。將所得到的DNA片段插入pHISi-1載體的PminHIS3啟動(dòng)子的上游，并獲得能在缺乏組氨酸的SD培養(yǎng)基上正常生長的酵母轉(zhuǎn)化體。同時(shí)將這個(gè)DNA片段構(gòu)建到pLacZi載體的PCYC1啟動(dòng)子的上游，然后將載體轉(zhuǎn)化到含有pHISi-1載體的酵母轉(zhuǎn)化體中。這樣，在同時(shí)缺乏組氨酸和尿氨酸的培養(yǎng)基上，選擇獲得含有pHISi-1和pLacZi載體的酵母轉(zhuǎn)化體。以同樣的方法獲得含有突變型DRE順式作用元件的酵母雙報(bào)導(dǎo)子細(xì)胞。HIS和LacZ基因作為2個(gè)報(bào)告基因，當(dāng)其上游的DRE元件被DREB轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別后，其表達(dá)強(qiáng)度會(huì)顯著增強(qiáng)。通過3-AT(組氨酸合成酶競(jìng)爭性抑制劑)來檢測(cè)HIS基因的表達(dá)強(qiáng)度，同時(shí)通過β-半乳糖苷酶活力的測(cè)定來檢測(cè)LacZ基因的表達(dá)強(qiáng)度。若其上游為突變型的DRE順式作用元件，則其表達(dá)將無法得到增強(qiáng)。圖3和圖4分別顯示了本發(fā)明編碼DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB1和maDREB2的2個(gè)基因轉(zhuǎn)化酵母雙報(bào)導(dǎo)子細(xì)胞后在含3-AT的SD/-His-Ura-Trp平板上的生長情況。圖3中，A、B、C分別表示擬南芥DREB1A、maDREB1、YepGAP空載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)化子。圖4中，A、B、C分別表示擬南芥DREB1A、maDREB2、YepGAP空載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)化子。
實(shí)施例3、玉米cDNA文庫的篩選和編碼轉(zhuǎn)錄因子maDREB1和maDREB2的基因的克隆利用含有DRE順式作用元件的酵母雙報(bào)導(dǎo)子細(xì)胞，在含30mM 3-AT的SD/-His-Ura-Leu的平板上篩選玉米cDNA文庫，(具體操作步驟見Clontech Mathchmakerone-hybrid system)。所得到的陽性克隆在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將所插入的cDNA片段從載體上切下，構(gòu)建到Y(jié)epGAP酵母表達(dá)載體中。由于此載體上無GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，因此只有既能與DRE元件結(jié)合又能激活下游報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的蛋白才能在30mM 3-AT的SD/-His-Ura-Leu的平板上生長。對(duì)于這樣的陽性克隆，將其cDNA片段再構(gòu)建到SK+載體上，經(jīng)過測(cè)序獲得了編碼轉(zhuǎn)錄因子maDREB1和maDREB2的基因的核苷酸序列。maDREB1基因包括843bp的開放讀碼框架，編碼由281個(gè)氨基酸組成的多肽，其5’端為56bp，3’端為488bp，為序列表中的序列1。maDREB2基因包括816bp的開放讀碼框架，編碼由272個(gè)氨基酸組成的多肽，其5’端為119bp，3’端為165bp，為序列表中的序列3。
實(shí)施例4、maDREB1和maDREB2基因在玉米基因組中的分析提取玉米品種P138和水6的基因組總DNA，分別用EcoRI、XbaI、PstI3種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。將消化后的DNA轉(zhuǎn)到N+Hybond膜上，用全長的maDREB1作探針，進(jìn)行Southern雜交分析。在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下洗膜(65℃，0.2×SSC，0.1％SDS)得到2-3雜交條帶，結(jié)果如圖3所示，圖中E帶是用EcoRI進(jìn)行消化的、X帶是用XbaI進(jìn)行消化的、P帶是用PstI進(jìn)行消化的，表明maDREB1基因在玉米基因組中以低拷貝形式存在。提取玉米品種P138的基因組總DNA，分別用BamHI、SalI、XbaI、PstI 4種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。以同樣的方法進(jìn)行Southern雜交分析，在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下同樣得到2-3雜交條帶，結(jié)果如圖4所示，圖中B帶是用BamHI進(jìn)行消化的、S帶是用SalI進(jìn)行消化的、X帶是用XbaI進(jìn)行消化的、P帶是用PstI進(jìn)行消化的，結(jié)果表明maDREB2基因在玉米基因組中與maDREB1基因一樣以低拷貝形式存在。
實(shí)施例5、玉米maDREB1和maDREB2基因在逆境中的表達(dá)特征對(duì)在1/2MS培養(yǎng)基上生長10-14天的玉米植株，在4℃下低溫處理4小時(shí)，或在干旱條件下處理4小時(shí)，經(jīng)液氮速凍，提取RNA作RT-PCR分析。RT-PCR反應(yīng)中以玉米actinl基因?yàn)閮?nèi)對(duì)照，以控制PCR反應(yīng)中模板cDNA濃度的一致。結(jié)果如圖5、圖6所示，圖5中(A)是檢測(cè)maDREB1基因在低溫、干旱條件下表達(dá)狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)組、(B)是對(duì)照組、C帶的樣品未經(jīng)逆境處理、L帶的樣品經(jīng)低溫處理4小時(shí)、D帶的樣品經(jīng)干旱處理4小時(shí)，從圖中可以看出maDREB1的轉(zhuǎn)錄受到低溫和干旱的微弱誘導(dǎo)；圖6中(A)是檢測(cè)maDREB2基因在低溫、干旱條件下表達(dá)狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)組、(B)是對(duì)照組、C帶的樣品未經(jīng)逆境處理、L帶的樣品經(jīng)低溫處理4小時(shí)、D帶的樣品經(jīng)干旱處理4小時(shí)，從圖中可以看出maDREB2基因的轉(zhuǎn)錄受到低溫和干旱的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。
序列表<160>4<210>1<211>1388<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<220><221>CDS<222>(57)...(902)<400>1ccagagtacc agacaccact gcgcatcagt gcaaagaggt agctacccta tctgcc atg 59Met1gct caa gag ctc cac gaa acg tcc tct tgc tct gcc acc acc acc tcg 107Ala Gln Glu Leu His Glu Thr Ser Ser Cys Ser Ala Thr Thr Thr Ser5 10 15tcg tgc acc aca tcc tgc tgc tcg tcc act gtc aca gac tcg tcc tct 155Ser Cys Thr Thr Ser Cys Cys Ser Ser Thr Val Thr Asp Ser Ser Ser20 25 30tcg ccc ccg tca ccg gcg gcg gcc aat gcc gcg ccc gcg aca cgg aag 203Ser Pro Pro Ser Pro Ala Ala Ala Asn Ala Ala Pro Ala Thr Arg Lys35 40 45cgg cag gcg ttg gag gcc gag gcc gag gcc gag gcg ggc ggt gag gag 251Arg Gln Ala Leu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Gly Gly Glu Glu50 55 60 65gag gag gag gag gag gaa ggc tgt gct ggt aat aag gcg gcg ccg gcc 299Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Cys Ala Gly Asn Lys Ala Ala Pro Ala70 75 80aag aag cga ccg cgg ggc agc gag ggg aag cac ccg acg ttc cgc ggc 347Lys Lys Arg Pro Arg Gly Ser Glu Gly Lys His Pro Thr Phe Arg Gly85 90 95gtg cgg atg cgg gcg tgg ggc aag tgg gtg tcg gag atc cgc gag ccg 395Val Arg Met Arg Ala Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu Pro100 105 110cgc aag aag tcg cgc ata tgg ctc ggc acg ttc ccc acc gcc gag atg 443Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Met115 120 125gcc gcg cgc gcc cac gac gtc gcg gcg ctc gcc atc aag ggc cgc gcc 491Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile Lys Gly Arg Ala130 135 140 145gcg cac ctc aac ttc ccg gac ctc gcc ggc gcg ctc ccg cgc gcc gcg 539Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala Gly Ala Leu Pro Arg Ala Ala150 155 160tcc gcg gcg ccc aag gac gtc cag gca gcc gcc gca ttg gcc gct gcg 587Ser Ala Ala Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala165 170 175ttc acg tcg ccg tca tcg gag ccc ggc gcc ggc gcg cac gag gag ccc 635Phe Thr Ser Pro Ser Ser Glu Pro Gly Ala Gly Ala His Glu Glu Pro180 185 190gct gcc aag gac ggc gcc gcg ccc gag gag gca gcc gcc gac gca cag 683Ala Ala Lys Asp Gly Ala Ala Pro Glu Glu Ala Ala Ala Asp Ala Gln195 200 205gca cca gta cca gta gca cta cca ccg ccg gcg gcc tct cgg cca ggg 731Ala Pro Val Pro Val Ala Leu Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Pro Gly210 215 220 225acg ccg tcg agc ggc gtg gag gac gag cgg cag ctg ttc gac ctg ccg 779Thr Pro Ser Ser Gly Val Glu Asp Glu Arg Gln Leu Phe Asp Leu Pro230 235 240gac ctg ctc ctc gac atc cgg gac ggg ttc ggg cgc ttc ccg ccg atg 827Asp Leu Leu Leu Asp Ile Arg Asp Gly Phe Gly Arg Phe Pro Pro Met245 250 255tgg gcc ccg ctc act gac gtg gag gag gtg gtc aat gcg gag ctg cgc 875Trp Ala Pro Leu Thr Asp Val Glu Glu Val Val Asn Ala Glu Leu Arg
260 265 270ctc gag gag ccg ctg ctt tgg gag tagcggtcag agatgctcgt tgcctgcatt 929Leu Glu Glu Pro Leu Leu Trp Glu275 280gcaaacgagg tctaaacaat agtagcagtg gtatcccatt tcttctcgtt ttgcttctcg989ccctctcctt tttttctctc tttcttgctt actttggggg gaaaacagct agttcttttt 1049ttcttcttct tcttcttctt ttattaaatt gagttttaat aagtataaac atatataaac 1109gagagagaga tataagctgt gtacttaaaa gtgtaagacg agtacctatc agttcattat 1169tacgtatcta ctagtggtac cagtagtgat catgttgtcc cggccgtgtg tgaattccag 1229cggtagttgt tgaccttgct agatttttat agttgcttgt gttgtgtgct gtaccaaaat 1289tccccaggga aaaagggcag gaagcaaacg aatgtaacgg gaacacaagc agcatctaat 1349ctctattact gctgacaacg aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1388<210>2<211>281<212>PRT<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>2Met Ala Gln Glu Leu His Glu Thr Ser Ser Cys Ser Ala Thr Thr Thr1 5 10 15Ser Ser Cys Thr Thr Ser Cys Cys Ser Ser Thr Val Thr Asp Ser Ser20 25 30Ser Ser Pro Pro Ser Pro Ala Ala Ala Asn Ala Ala Pro Ala Thr Arg35 40 45Lys Arg Gln Ala Leu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Gly Gly Glu50 55 60Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Cys Ala Gly Ash Lys Ala Ala Pro65 70 75 80Ala Lys Lys Arg Pro Arg Gly Ser Glu Gly Lys His Pro Thr Phe Arg85 90 95Gly Val Arg Met Arg Ala Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu100 105 110Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu115 120 125Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile Lys Gly Arg130 135 140Ala Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala Gly Ala Leu Pro Arg Ala145 150 155 160Ala Ser Ala Ala Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ala165 170 175Ala Phe Thr Ser Pro Ser Ser Glu Pro Gly Ala Gly Ala His Glu Glu180 185 190Pro Ala Ala Lys Asp Gly Ala Ala Pro Glu Glu Ala Ala Ala Asp Ala195 200 205Gln Ala Pro Val Pro Val Ala Leu Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Pro210 215 220Gly Thr Pro Ser Ser Gly Val Glu Asp Glu Arg Gln Leu Phe Asp Leu225 230 235 240Pro Asp Leu Leu Leu Asp Ile Arg Asp Gly Phe Gly Arg Phe Pro Pro245 250 255Met Trp Ala Pro Leu Thr Asp Val Glu Glu Val Val Asn Ala Glu Leu260 265 270Arg Leu Glu Glu Pro Leu Leu Trp Glu275 280<210>3<211>1085<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<220><221>CDS<222>(120)...(923)<400>3gctcaagctc gagacaagaa accagaacca gctcactcct cactccactt ccactcccaa 60cagcaagctc aagcagtcag tcaccggcag gggtcagggt cacagtcaca gcagcagcc 119atg gac acg gcc ggc ctc gtc cag cac gcg acc tcc tcg tct tcc acc 167Met Asp Thr Ala Gly Leu Val Gln His Ala Thr Ser Ser Ser Ser Thr1 5 10 15tcc acc tcg gcg tcg tcg tcc tcg tcc gag cag cag agc cgc aag gcg 215Ser Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Glu Gln Gln Ser Arg Lys Ala20 25 30gcg tgg ccg ccg tcg acc gct tcc tca cca cag cag ccg ccc aag aag 263Ala Trp Pro Pro Ser Thr Ala Ser Ser Pro Gln Gln Pro Pro Lys Lys35 40 45cgc ccc gcg ggg cgc aca aag ttc cgg gag acg cgg cac ccg gtg ttc 311Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Phe50 55 60cgc ggc gtg cgg cgg cgg ggc gcc gcg ggc cgg tgg gtg tgc gag gtg 359Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Ala Ala Gly Arg Trp Val Cys Glu Val65 70 75 80cgc gtc ccg ggg agg cgc ggc gcg cgg ctg tgg ctc ggc acc tac ctc 407Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Ala Arg Leu Trp Leu Gly Thr Tyr Leu85 90 95gcc gcc gag gcg gcg gcg cgc gcg cac gac gcc gcg ata ctc gcc ctg 455Ala Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala His Asp Ala Ala Ile Leu Ala Leu100 105 110cag ggc cgc ggc gcg ggg cgc ctc aac ttc ccg gac tcc gcg cgg ctg 503Gln Gly Arg Gly Ala Gly Arg Leu Asn Phe Pro Asp Ser Ala Arg Leu115 120 125ctc gcc gtg ccg ccc ccg tcc gcg ctc ccg ggc ctg gac gac gcc cgc 551Leu Ala Val Pro Pro Pro Ser Ala Leu Pro Gly Leu Asp Asp Ala Arg130 135 140cgc gcg gcg ctc gag gcc gtc gcg gag ttc cag cgc cgc tct ggg tcc 599Arg Ala Ala Leu Glu Ala Val Ala Glu Phe Gln Arg Arg Ser Gly Ser145 150 155 160ggg tcc ggg gcc gcc gac gaa gcg acc tcg ggc gcg tct cct ccc tcc 647Gly Ser Gly Ala Ala Asp Glu Ala Thr Ser Gly Ala Ser Pro Pro Ser165 170 175tcg tcg ccg tcg ctg ccg gac gtt tct gcg gct ggc tcg ccg gcg gcg 695Ser Ser Pro Ser Leu Pro Asp Val Ser Ala Ala Gly Ser Pro Ala Ala180 185 190gcg ctt gag cac gtg cct gtg aag gcc gac gaa gca gtg gcg ttg gac 743Ala Leu Glu His Val Pro Val 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Gln Pro Pro Lys Lys35 40 45Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Phe50 55 60Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Ala Ala Gly Arg Trp Val Cys Glu Val65 70 75 80Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Ala Arg Leu Trp Leu Gly Thr Tyr Leu85 90 95Ala Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala His Asp Ala Ala Ile Leu Ala Leu100 105 110Gln Gly Arg Gly Ala Gly Arg Leu Asn Phe Pro Asp Ser Ala Arg Leu115 120 125Leu Ala Val Pro Pro Pro Ser Ala Leu Pro Gly Leu Asp Asp Ala Arg130 135 140Arg Ala Ala Leu Glu Ala Val Ala Glu Phe Gln Arg Arg Ser Gly Ser145 150 155 160Gly Ser Gly Ala Ala Asp Glu Ala Thr Ser Gly Ala Ser Pro Pro Ser165 170 175Ser Ser Pro Ser Leu Pro Asp Val Ser Ala Ala Gly Ser Pro Ala Ala180 185 190Ala Leu Glu His Val Pro Val Lys Ala Asp Glu Ala Val Ala Leu Asp195 200 205Leu Asp Gly Asp Val Phe Gly Pro Asp Trp Phe Gly Asp Met Gly Leu210 215 220Glu Leu Asp Ala Tyr Tyr Ala Ser Leu Ala Glu Gly Leu Leu Val Glu225 230 235 240Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala Trp Asp His Gly Asp Cys Cys Asp Ser245 250 255Gly Ala Ala Asp Val Ala Leu Trp Ser Tyr Tyr260 26權(quán)利要求
1.玉米的DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB1，它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
3.玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB1的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB1的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第57到第902位堿基。
6.玉米的DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB2，它具有序列表中序列4的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列4的氨基酸殘基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于它具有序列表中序列4的氨基酸殘基序列。
8.玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB2的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列3的DNA序列；2)與序列表中序列3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于所述玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子maDREB2的編碼基因是序列表中序列3的DNA序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第120到第923位堿基。
11.含有權(quán)利要求3或/和8所述基因的表達(dá)載體。
12.含有權(quán)利要求3或/和8所述基因的細(xì)胞系。
13.權(quán)利要求3和權(quán)利要求8所述的基因在培育抗寒和抗旱植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了2個(gè)玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，具體的說是公開了2個(gè)玉米DREB類耐寒和耐旱轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供玉米的2個(gè)DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，該轉(zhuǎn)錄因子在植物抗寒和抗旱反應(yīng)中具有調(diào)控作用。本發(fā)明提供的2個(gè)玉米DREB類轉(zhuǎn)錄因子分別為maDREB1和maDREB1，具有序列表中序列2和序列4的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?和序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2和序列4的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2和序列4衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子在培育抗寒和抗旱植物品種中具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1472222SQ0212537
公開日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2002年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月29日
發(fā)明者劉強(qiáng), 秦峰, 趙軍, 陳受宜, 劉 強(qiáng) 申請(qǐng)人:清華大學(xué), 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所