專利名稱:一種快速特異擴(kuò)增差異表達(dá)基因長(zhǎng)片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)基因的克隆，尤其是涉及一種快速特異擴(kuò)增差異表達(dá)基因長(zhǎng)片段的方法。
背景技術(shù)：
許多年以來(lái)，分離差異表達(dá)基因的方法僅限于差異篩選cDNA文庫(kù)，直到1992年mRNA差異顯示技術(shù)(Liang P，Pardee A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of thepolymerase chain reaction.Science，1992，257967-971)，第一次實(shí)現(xiàn)了同時(shí)很靈敏地檢測(cè)到真核細(xì)胞中大部分的轉(zhuǎn)錄本。近些年來(lái)，在分離和克隆差異表達(dá)基因的功能基因組學(xué)研究中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者又發(fā)展了多種分析方法，如代表性差異分析、抑制消減雜交(Diatchenko L，Lau Y FC，Campbell A P，et al.Suppression subtractive hybridizationA method for generating differentiallyregulated or tissue-specific cDNA probes and libraries.Proc Natl Acad Sci USA，1996，936025-6030)和基因芯片技術(shù)等等。實(shí)踐證明，這些方法的應(yīng)用，取得了很多的成就，克隆了一系列的差異表達(dá)基因，均各具獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也具有其自身的缺陷，如有的假陽(yáng)性高、有的產(chǎn)生的基因片段短、有的技術(shù)復(fù)雜成本高等(李斐雪，王雁玲.差異表達(dá)基因的高通量篩選方法.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2004，26339-343；周延凱，周建林，聶東宋.篩選差異表達(dá)基因方法的新進(jìn)展.生物技術(shù)通報(bào)，2004，15(6)620-622；李文雍，陳清軒.篩選差異表達(dá)基因的方法進(jìn)展.阜陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，21(1)1-6；徐德全，熊遠(yuǎn)著.差異表達(dá)基因克隆技術(shù)的研究進(jìn)展.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2004，31(3)31-34；謝偉偉，王憑青，楊青川等.植物差異表達(dá)基因克隆技術(shù)及研究進(jìn)展.重慶大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28(12)96-100；肖朝庭，儲(chǔ)明星，傅衍.幾種基因差異表達(dá)篩選技術(shù)在動(dòng)物發(fā)育與繁殖中的最新進(jìn)展.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2006，33(4)34-38)此外，引物退火時(shí)能否與其靶序列特異結(jié)合，是PCR能否成功擴(kuò)增的關(guān)鍵因素之一，因此優(yōu)化引物的結(jié)構(gòu)是非常重要的。退火溫度的高低決定引物是否能與其互補(bǔ)鏈完全結(jié)合，還是有一個(gè)或多個(gè)堿基錯(cuò)配，因此通過(guò)調(diào)整退火溫度就可以增加引物與模板結(jié)合的特異性。許多研究者提出了各種辦法來(lái)提高引物退火的特異性，如在引物的5’端增加一段通用引物序列，或加一段同聚物，或加上一段環(huán)狀序列，以增加PCR擴(kuò)增的特異性和雜交的穩(wěn)定性(Brownie J，Shawcross S，TheakerJ，et al.The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.Nucleic Acids Res，1997，253235-3241；Saiki R K，Walsh P S，Levenson C H，et al.Genetic analysis of amplified DNA withimmobilized sequence-specific oligonucleotide probes.Proc Natl Acad Sci USA，1989，866230-6234；Ailenberg M，Silverman M.Controlled hot start and improved specificity in carryingout PCR utilizing touch-up and loop incorporated primers(TULIPS).BioTechniques，2000，291018-1024)，但這些方法并不能消除初始反應(yīng)的非特異性雜交。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述方法所存在的不足，提供一種具有重復(fù)性高、假陽(yáng)性低、快速實(shí)惠和獲得的基因片段較長(zhǎng)等特點(diǎn)的，特別有利于在非模式生物中克隆的快速特異擴(kuò)增差異表達(dá)基因長(zhǎng)片段的方法。
本發(fā)明的具體步驟為1)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈以總RNA或mRNA為模板，dT-RSL為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈；2)PCR擴(kuò)增第一條cDNA鏈經(jīng)稀釋后，與dT-RSL引物和RSL隨機(jī)引物混合于PCR管中退火，進(jìn)行一個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)，合成第二條cDNA鏈，隨后將PCR反應(yīng)體系中的dT-RSL和RSL隨機(jī)引物分別與cDNA第二條鏈特異結(jié)合，經(jīng)PCR循環(huán)，擴(kuò)增出特異的DNA片段；3)結(jié)果檢測(cè)取擴(kuò)增產(chǎn)物溶解于上樣緩沖液中，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；4)采用普通方法割膠純化差異表達(dá)基因片段，與T質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)基因片段的序列進(jìn)行測(cè)定和分析。
在步驟1所述的逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈中，是在0.5mL的PCR管中加入如下反應(yīng)體系1～3μg總RNA(或0.1～0.3μgmRNA)，10μM dT-RSL2μL，加無(wú)RNA酶雙蒸水至總體積12μL，混合均勻；70℃孵育2min，再在冰上冷卻2min；往管中加入如下反應(yīng)體系5×RTbuffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2μL，200u/uL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(或其它逆轉(zhuǎn)錄酶)1μL，混合均勻；42℃孵育90min，再在94℃變性2min；合成的cDNA第一條鏈用無(wú)DNA酶雙蒸水稀釋10倍，置于-20℃?zhèn)溆谩?br> 在步驟2所述的PCR擴(kuò)增中，是在PCR管中加入20μL如下反應(yīng)體系10×PCR buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM dT-RSL1μL，10μM RSL隨機(jī)引物1μL，5U/uLTaq DNA聚合酶0.1～0.2μL，cDNA1～3μL，加無(wú)DNA酶雙蒸水至總體積20μL，混合均勻；PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94℃ 5min，50℃ 3～5min，72℃ 1～2min，1個(gè)循環(huán)；94℃40s，65℃40s，72℃40s，35～40個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
在步驟3中，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物取5uL，上樣緩沖液取1μL。
本發(fā)明具有重復(fù)性高、假陽(yáng)性低、快速實(shí)惠和獲得的基因片段較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，特別有利于在非模式生物中的快速特異擴(kuò)增差異表達(dá)基因長(zhǎng)片段。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1dT-RSL引物序列為5’-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTT TTT TTT TTT TTTTTT TTTT-3’RSL3隨機(jī)引物序列為5’AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTI III ICC GGA GGATG-3’分別從對(duì)照組和副溶血弧菌誘導(dǎo)4h、1天和2天的大黃魚肝臟中提取總RNA，每一時(shí)相各取1μg RNA等量混合后分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組總RNA。
1.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈1)分別在兩個(gè)0.5mL的PCR管中，加入如下反應(yīng)體系3μg總RNA(對(duì)照組或?qū)嶒?yàn)組)，10μM dT-RSL2μL，加無(wú)RNA酶雙蒸水至總體積12μL，混合均勻。
2)70℃孵育2min，再在冰上冷卻2min。
3)往兩個(gè)管中分別加入如下反應(yīng)體系5×RT buffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2μL，200u/uL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(或其它逆轉(zhuǎn)錄酶)1μL，混合均勻。
4)42℃孵育90min，再在94℃變性2min。
5)合成的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的cDNA第一條鏈分別用無(wú)DNA酶雙蒸水稀釋10倍，置于-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.PCR擴(kuò)增及其結(jié)果的檢測(cè)1)分別在兩個(gè)0.5mL的PCR管中，加入20μL如下反應(yīng)體系10×PCR buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM dT-RSL1μL，10μM RSL3隨機(jī)引物1μL，5U/uL Taq DNA聚合酶0.1μL，cDNA(對(duì)照組或?qū)嶒?yàn)組)1μL，加無(wú)DNA酶雙蒸水至總體積20μL，混合均勻。
2)PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94℃ 5min，50℃ 3min，72℃ 2min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 40s，65℃40s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
3)分別取對(duì)照組或?qū)嶒?yàn)組5uL擴(kuò)增產(chǎn)物溶解于1μL上樣緩沖液中，用2.0％的瓊脂糖凝膠電泳30min，電壓5V/cm，凝膠中加入0.5ug/ml溴化乙錠。在紫外燈下觀察經(jīng)過(guò)電泳后的凝膠，在1350bp左右處對(duì)照組有一條比實(shí)驗(yàn)組亮的條帶。
3.割膠純化基因片段使用QIAEX膠回收試劑盒，具體步驟如下1)用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，在紫外燈下將所要的DNA目的片段用無(wú)菌刀片割下來(lái)，稱重。
2)以3∶1的比例加入Buffer QX1。
3)先將QIAEX II用振蕩器振蕩30s，再往樣品中加入30μL，混勻。
4)50℃水浴10min，以使瓊脂糖溶解，每隔2min拿出振蕩5s。
5)10000g離心1min，小心移出上清液。
6)用500μL的Buffer QX1洗滌。
7)再用Buffer PE洗滌兩次。
8)將沉淀晾干10min。
9)加入20μLddH2O，振蕩使其溶解。在室溫下放置5min。
10)10000g離心1min，小心將上清液移到新管中。
4.與質(zhì)粒載體連接往管中加入以下反應(yīng)體系按1∶5的比例加入PMD18-T質(zhì)粒和純化好的基因片段，加ddH2O至5μL，再加入5μL ligation mix(TaKaRa)?；靹蚍磻?yīng)體系，在16℃下連接反應(yīng)1h。
5.感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及篩選將已轉(zhuǎn)入基因的質(zhì)粒10μL加到200μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，冰上放置30min。42℃熱激1min，冰上再放置2min。加入900μL LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩(300r/min)1h。將40μL2％X-gal和14μL10％IPTG均勻涂布在含Amp(60μg/mL)LB培養(yǎng)基表面，再在培養(yǎng)基表面均勻涂布100μL細(xì)菌培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑具有白斑的單克隆于5mL LB(含60μg/mL Amp)液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。
6.提取并檢測(cè)質(zhì)粒用V-gene質(zhì)粒提取試劑盒提取，具體步驟如下1)取2mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液，12000g離心1min，棄盡上清。
2)用0.25mL已加入RNaseA1的S1溶液懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊。
3)加0.25mLS2溶液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不應(yīng)超過(guò)5min。
4)加入0.4mL 4℃預(yù)冷的S3溶液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合均勻，直至形成緊實(shí)的凝集塊，室溫靜置2min。12000g離心5min。
5)吸取步驟4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2mL離心管中)，3600rpm離心1min。
6)將制備管置回離心管，加0.5mL W1溶液，3600rpm離心1min，棄濾液。
7)將制備管置回離心管，加0.7mL W2溶液，3600rpm離心1min，以同樣的方法再用0.7mLW2溶液洗滌一次，棄濾液。
8)將制備管移入離心管中，12000g離心1min。
9)將制備管移至新的1.5mL離心管中，在DNA制備膜正中央加60μL水，室溫靜置1min。12000g離心1min洗脫DNA。
10)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其含量。
7.檢測(cè)質(zhì)粒插入片段在PCR管中，加入20μL如下反應(yīng)體系10×buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM M13正向引物0.5μL，10μM M13反向引物0.5μL，5U/uLTaq DNA聚合酶0.2μL，15.9μL ddH2O，0.5μL模板DNA。
PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為95℃，1min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；4℃，5min。用瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。
8.測(cè)序PCR及其純化用MegaBACE測(cè)序試劑盒，反應(yīng)體系為模板DNA100ng，mix4μL，1ulM13正向引物2μL，加ddH2O至10μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為95℃，20s；95℃ 15s，50℃ 20s，60℃ 90s，30個(gè)循環(huán)；4℃，5min。往PCR產(chǎn)物中加入28.5μL 100％乙醇和NH4Ac的混合物(27.5∶1)顛倒混勻，靜置10min，12000g離心15min，棄盡上清液；加入300μL 75％乙醇，12000g離心3min，棄盡上清液；將沉淀晾干5min后加入10μL loading solution。
9.全自動(dòng)序列測(cè)定及分析用MegaBACE500毛細(xì)管自動(dòng)DNA測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序，獲得1個(gè)1360bp纖維蛋白原β鏈基因長(zhǎng)片段的抗病候選基因，已有研究表明該基因的表達(dá)水平可受病原體感染誘導(dǎo)而提高，可能是參與機(jī)體免疫機(jī)能的重要基因。
權(quán)利要求
1.一種快速特異擴(kuò)增差異表達(dá)基因長(zhǎng)片段的方法，其特征在于其步驟為1)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈以總RNA或mRNA為模板，dT-RSL為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈；2)PCR擴(kuò)增第一條cDNA鏈經(jīng)稀釋后，與dT-RSL引物和RSL隨機(jī)引物混合于PCR管中退火，進(jìn)行一個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)，合成第二條cDNA鏈，隨后將PCR反應(yīng)體系中的dT-RSL和RSL隨機(jī)引物分別與cDNA第二條鏈特異結(jié)合，經(jīng)PCR循環(huán)，擴(kuò)增出特異的DNA片段；3)結(jié)果檢測(cè)取擴(kuò)增產(chǎn)物溶解于上樣緩沖液中，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；4)采用普通方法割膠純化差異表達(dá)基因片段，與T質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)基因片段的序列進(jìn)行測(cè)定和分析。
2.如權(quán)利要求
1所述的一種快速特異擴(kuò)增差異表達(dá)基因長(zhǎng)片段的方法，其特征在于在步驟1所述的逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈中，是在0.5mL的PCR管中加入如下反應(yīng)體系1～3μg總RNA或0.1～0.3μg mRNA，10μM dT-RSL2μL，加無(wú)RNA酶雙蒸水至總體積12μL，混合均勻；70℃孵育2min，再在冰上冷卻2min；往管中加入如下反應(yīng)體系5×RT buffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2μL，200u/uL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或其它逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，混合均勻；42℃孵育90min，再在94℃變性2min；合成的cDNA第一條鏈用無(wú)DNA酶雙蒸水稀釋10倍，置于-20℃?zhèn)溆谩?br>3.如權(quán)利要求
1所述的一種快速特異擴(kuò)增差異表達(dá)基因長(zhǎng)片段的方法，其特征在于在步驟2所述的PCR擴(kuò)增中，是在PCR管中加入20μL如下反應(yīng)體系10×PCR buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM dT-RSL1μL，10μM RSL隨機(jī)引物1μL，5U/uL Taq DNA聚合酶0.1～0.2μL，cDNA1～3μL，加無(wú)DNA酶雙蒸水至總體積20μL，混合均勻；PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94℃5min，50℃3～5min，72℃1～2min，1個(gè)循環(huán)；94℃40s，65℃40s，72℃40s，35～40個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
4.如權(quán)利要求
1所述的一種快速特異擴(kuò)增差異表達(dá)基因長(zhǎng)片段的方法，其特征在于在步驟3中，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物取5uL，上樣緩沖液取1μL。
專利摘要
一種快速特異擴(kuò)增差異表達(dá)基因長(zhǎng)片段的方法，涉及一種表達(dá)基因的克隆。提供一種重復(fù)性高、假陽(yáng)性低、快速實(shí)惠和獲得的基因片段較長(zhǎng)的快速特異擴(kuò)增差異表達(dá)基因長(zhǎng)片段的方法。步驟為以總RNA或mRNA為模板，dT－RSL為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈；PCR擴(kuò)增第一條cDNA鏈經(jīng)稀釋后，與dT－RSL引物和RSL隨機(jī)引物混合于PCR管中退火，進(jìn)行一個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)，合成第二條cDNA鏈，隨后將PCR反應(yīng)體系中的dT－RSL和RSL隨機(jī)引物分別與cDNA第二條鏈特異結(jié)合，經(jīng)PCR循環(huán)，擴(kuò)增出特異的DNA片段；取擴(kuò)增產(chǎn)物溶解于上樣緩沖液中，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1995390SQ200610135246
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年11月24日
發(fā)明者王藝?yán)? 張子平, 謝芳靖 申請(qǐng)人:集美大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan