專利名稱：神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)基，具體是涉及一種用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，本發(fā)明還涉及該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法。
對(duì)于一般的胚胎干細(xì)胞而言，在適宜環(huán)境下可以分化生長(zhǎng)成各種不同的組織細(xì)胞，故人們可用胚胎干細(xì)胞培育出各種新組織甚至器官進(jìn)行移植。而對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞而言，主要焦點(diǎn)在于成功地從不同途徑培養(yǎng)、獲得足夠數(shù)量的神經(jīng)前體細(xì)胞，以供移植治療、或進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作攻擊腫瘤的生長(zhǎng)、觀察某些合成/天然化合物的神經(jīng)活性等。比如，若能從自體抽得骨髓組織作為神經(jīng)干細(xì)胞的種子細(xì)胞，在一定條件下誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞、進(jìn)而回輸于自體體內(nèi)，并在局部微環(huán)境作用下產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，就可用于治療其帕金森癥。而令這種技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵前提，是能否使骨髓源等種子細(xì)胞在特定環(huán)境中培養(yǎng)成所需的神經(jīng)干細(xì)胞。現(xiàn)用一般合成細(xì)胞培養(yǎng)基均為普遍細(xì)胞存活培養(yǎng)之用，如Eagle，DMEM，F(xiàn)12，RPMI1640，CMRL1066，L15，199，MB752/1等，其主要含有成份為氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、糖類等。這些合成培養(yǎng)基的主要作用是為不同種類組織細(xì)胞提供一般生存生長(zhǎng)的微環(huán)境，而上述細(xì)胞培養(yǎng)基都缺乏將不同來(lái)源的種子細(xì)胞(如骨髓組織細(xì)胞等)定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有使骨髓組織等不同來(lái)源種子細(xì)胞定向發(fā)育分化為神經(jīng)干細(xì)胞功能的細(xì)胞培養(yǎng)基，可隨時(shí)準(zhǔn)確無(wú)誤地為醫(yī)學(xué)科研教學(xué)及臨床應(yīng)用提供相關(guān)需要的神經(jīng)干細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的提供該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基由下列重量配比的組分配成(重量份)DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液10000～25000胰島素(Insulin) 4.5～12.5鹽酸丁二胺(Putrescine) 9.2～35.6硒化鈉(Sodium Selenide) 0.01～0.51氫化可的松(Hydrocortisone) 5.0～35.0所述本發(fā)明各組分的優(yōu)先重量(份)配比范圍是DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液 10000～15000胰島素(Insulin) 4.5～6.5鹽酸丁二胺(Putrescine) 9.2～15硒化鈉(Sodium Selenide) 0.01～0.4氫化可的松(Hydrocortisone) 9～12所述本發(fā)明還包含下列重量配比的組分(重量份)L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 3.5～12.5人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin) 50.0～150.0黃體酮(Progesterone) 0.01～0.55將上述各組分制成本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法依次包括以下步驟①按所述比例取DMEM和F12以1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加純凈水至濃度為10～25g/L，并充分?jǐn)嚢枞芙猓频眉?xì)胞的一般基礎(chǔ)培養(yǎng)液；②按所述比例再取胰島素(Insulin)、鹽酸丁二胺(Putrescine)、硒化鈉(SodiumSelenide)、氫化可的松(Hydrocortisone)依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分?jǐn)嚢杈鶆?；③?～10當(dāng)量濃度的氫氧化鈉調(diào)pH7.4～8.0；
④層流細(xì)胞培養(yǎng)室抽濾消毒，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法的步驟2中還可按所述比例加入L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)、黃體酮(Progesterone)。
本發(fā)明中的DMEM和F12混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液作為一般種子細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的基本微環(huán)境；胰島素可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂，特別是促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)；L-谷氨酰胺可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育生長(zhǎng)期間核酸、蛋白質(zhì)的合成；鹽酸丁二胺能刺激、誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖；硒化鈉參與、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞代謝；人轉(zhuǎn)鐵蛋白可結(jié)合鐵離子，減少其毒性和被細(xì)胞所利用，同時(shí)使神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量增多、減少成纖維細(xì)胞數(shù)；氫化可的松促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育；黃體酮促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)。用本發(fā)明培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定表達(dá)特有的高親和力抗原NESTIN；表達(dá)NESTIN抗原的神經(jīng)干細(xì)胞可進(jìn)一步分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，證明本發(fā)明能有效地誘導(dǎo)包括骨髓組織種子細(xì)胞在內(nèi)的各種來(lái)源組織細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞，其誘導(dǎo)時(shí)間為11～21天。用本發(fā)明培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞移植至有腦或脊髓損傷的病灶周圍，移植3個(gè)月后癥狀有明顯改善(主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能不同程度的恢復(fù))，病理切片檢測(cè)有神經(jīng)干細(xì)胞向病灶區(qū)遷移、整合現(xiàn)象。另外其配制方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便易行。本發(fā)明為有關(guān)神經(jīng)干細(xì)胞及其應(yīng)用的科研、教學(xué)、臨床應(yīng)用等能起到不可估量的作用，同時(shí)也孕育著巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
2、再取胰島素(Irsulin)5mg、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)3.9mg、鹽酸丁二胺(Putrescine)10mg、硒化鈉(Sodium Selenide)0.03mg、人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)50mg、氫化可的松(Hydrocortisone)10mg、黃體酮(Progesterone)0.02mg依次加入步驟1所制得的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，并以純凈水定容?000毫升，此時(shí)呈橙黃微濁狀態(tài)；3、以5當(dāng)量濃度的氫氧化鈉調(diào)pH為7.8，此時(shí)培養(yǎng)基呈桃紅色清亮狀態(tài)；4、層流細(xì)胞培養(yǎng)室抽濾消毒(過(guò)濾膜孔直徑為0.22μm規(guī)格)，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 配制上述實(shí)施例二、三、四的制備方法與實(shí)施例一相同，不同之處在于各組分的含量。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于由下列重量配比的組分配成DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液10000～25000胰島素(Insulin) 4.5～12.5鹽酸丁二胺(Putrescine) 9.2～35.6硒化鈉(Sodium Selenide) 0.01～0.51氫化可的松(Hydrocortisone) 5.0～35.0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述各組分的優(yōu)先重量(份)配比是DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液 10000～15000胰島素(Insulin) 4.5～6.5鹽酸丁二胺(Putrescine) 9.2～15硒化鈉(Sodium Selenide) 0.01～0.4氫化可的松(Hydrocortisone) 9～12
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于還包含下列重量配比的組分L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 3.5～12.5人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin) 50.0～150.0黃體酮(Progesterone)0.01～0.55
4.權(quán)利要求3所述神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟①按所述比例取DMEM和F12以1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加純凈水至濃度為10～25g/L，并充分?jǐn)嚢枞芙猓频眉?xì)胞的一般基礎(chǔ)培養(yǎng)液；②按所述比例再取胰島素(Insulin)、鹽酸丁二胺(Putrescine)、硒化鈉(Sodium Selenide)、氫化可的松(Hydrocortisone)依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分?jǐn)嚢杈鶆颍虎垡?～10當(dāng)量濃度的氫氧化鈉調(diào)pH7.4～8.0；④層流細(xì)胞培養(yǎng)室抽濾消毒，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于步驟2中還可按所述比例加入L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)、黃體酮(Progesterone)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法,由DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胰島素、鹽酸丁二胺、硒化鈉、氫化可的松、L－谷氨酰胺、人轉(zhuǎn)鐵蛋白和黃體酮配制而成,本發(fā)明具有使骨髓組織等不同來(lái)源種子細(xì)胞定向發(fā)育分化為神經(jīng)干細(xì)胞功能,可隨時(shí)準(zhǔn)確無(wú)誤地為醫(yī)學(xué)科研教學(xué)及臨床應(yīng)用提供相關(guān)需要的神經(jīng)干細(xì)胞;其配制方法簡(jiǎn)單,可重復(fù)性強(qiáng),操作簡(jiǎn)便易行。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1389566SQ0213431
公開日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2002年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月8日
發(fā)明者姜曉丹, 徐如祥 申請(qǐng)人:姜曉丹, 徐如祥