專利名稱：一株特異性抗圓形碘泡蟲單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體，尤其涉及圓形碘泡蟲單克隆抗體。
免疫防治可能是治療粘孢子蟲的一條新途徑，而粘孢子蟲的早期檢測則是其基礎(chǔ)。現(xiàn)有以血清學(xué)為基礎(chǔ)的多克隆抗體對粘孢子蟲進(jìn)行的早期檢測，缺點(diǎn)在于，由于多克隆抗體交叉反應(yīng)多，特異性和敏感性低，因而難以得到廣泛應(yīng)用。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
該株特異性抗圓形碘泡蟲單克隆抗體的特征為
1、間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)表明可特異性地與圓形碘泡蟲發(fā)生反應(yīng)；2、間接免疫熒光表明可與圓形碘泡蟲的特異位點(diǎn)結(jié)合；3、間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)表明它可特異性地與圓形碘泡蟲的孢子反應(yīng)，而不與其營養(yǎng)體反應(yīng)；4、免疫印跡表明其識(shí)別抗原分子量為103.6千道爾頓。
特異性抗圓形碘泡蟲單克隆抗體的制備方法按下列步驟順序進(jìn)行1、取患有圓形碘泡蟲病的魚體表孢囊，將其勻漿破碎；2、用蔗糖密度梯度離心分離純化孢子；3、將圓形碘泡蟲的孢子用超聲波破碎；4、在4℃下，用12000轉(zhuǎn)/分鐘離心，取上清液；5、透析濃縮，得孢子的可溶性抗原；6、取50微克可溶性抗原，皮下注射免疫純系(Balb/C)小鼠，隔2周進(jìn)行第二次，再隔2周進(jìn)行第三次免疫；7、取250微克可溶性抗原注射小鼠腹腔，作為融合前的加強(qiáng)免疫；8、無菌條件下將小鼠脾臟磨碎，以10∶1的比例與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合，然后加入聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)細(xì)胞融合；9、將融合細(xì)胞放入含1％HAT的RPMI1640選擇培養(yǎng)液中，在37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；10、以孢子的可溶性抗原包被酶標(biāo)板，空白對照用包被液，用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)來篩選陽性克隆，第一抗體分別為陽性對照是用免疫小鼠的血清，陰性對照是用正常骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，樣品孔用融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清。第二抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG。
11、對有陽性反應(yīng)的孔中的細(xì)胞，用有限稀釋法進(jìn)行3次克??；12、將所得單克隆細(xì)胞1～2×106個(gè)注入小鼠腹腔，定期采集其雜交瘤腹水，作為粗制抗體，其余單克隆細(xì)胞放入凍存緩沖液中于液氮罐保存；13、將粗制抗體用飽和硫酸銨沉淀后，用高效液相色譜純化，得到純化的抗體。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于1、由于該單克隆抗體只與圓形碘泡蟲發(fā)生反應(yīng)，而不與我們所研究的其它粘孢子蟲反應(yīng)，因此，用于圓形碘泡蟲病臨床診斷時(shí)的特異性和敏感性都較高。
2、它只與圓形碘泡蟲的孢子反應(yīng)，而不與它的營養(yǎng)體反應(yīng)，說明圓形碘泡蟲生活史的這兩個(gè)時(shí)期具有不同的抗原表位。
3、該單克隆抗體可以與圓形碘泡蟲的孢子特異地反應(yīng)，因此，它可用于圓形碘泡蟲病的臨床檢測，從而為及時(shí)的預(yù)防和治療打下基礎(chǔ)。
4、可用于圓形碘泡蟲相關(guān)的免疫原性的基礎(chǔ)研究。
5、透析濃縮，得孢子的可溶性抗原；6、取50微克可溶性抗原，皮下注射免疫純系(Balb/C)小鼠，隔2周進(jìn)行第二次，再隔2周進(jìn)行第三次免疫；7、取250微克可溶性抗原注射小鼠腹腔，作為融合前的加強(qiáng)免疫；8、無菌條件下將小鼠脾臟磨碎，以10∶1的比例與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合，然后加入聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)細(xì)胞融合；9、將融合細(xì)胞放入含1％HAT的RPMI1640選擇培養(yǎng)液中，在37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；10、以孢子的可溶性抗原包被酶標(biāo)板，空白對照用包被液，用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)來篩選陽性克隆，第一抗體分別為陽性對照是用免疫小鼠的血清，陰性對照是用正常骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，樣品孔用融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清。第二抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG。
11、對有陽性反應(yīng)的孔中的細(xì)胞，用有限稀釋法進(jìn)行3次克隆；12、將所得單克隆細(xì)胞1～2×106個(gè)注入小鼠腹腔，定期采集其雜交瘤腹水，作為粗制抗體，其余單克隆細(xì)胞放入凍存緩沖液中于液氮罐保存；13、將粗制抗體用飽和硫酸銨沉淀后，用高效液相色譜純化，得到純化的抗體。
一株特異性抗圓形碘泡蟲單克隆抗體的特征為1、間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)表明可特異性地與圓形碘泡蟲發(fā)生反應(yīng)；2、間接免疫熒光表明可與圓形碘泡蟲的特異位點(diǎn)結(jié)合；
3、間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)表明它可特異性地與圓形碘泡蟲的孢子反應(yīng)，而不與其營養(yǎng)體反應(yīng)；4、免疫印跡表明其識(shí)別抗原分子量為103.6千道爾頓。
權(quán)利要求
1.一株特異性抗圓形碘泡蟲單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體的特征為a、間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)表明可特異性地與圓形碘泡蟲發(fā)生反應(yīng)；b、間接免疫熒光表明可與圓形碘泡蟲的特異位點(diǎn)結(jié)合；c、間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)表明它可特異性地與圓形碘泡蟲的孢子反應(yīng)，而不與其營養(yǎng)體反應(yīng)；d、免疫印跡表明其識(shí)別抗原分子量為103.6千道爾頓。
2.制備權(quán)利要求1所述的一株特異性抗圓形碘泡蟲單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法按下列步驟順序進(jìn)行a、取患有圓形碘泡蟲病的魚體表孢囊，將其勻漿破碎；b、用蔗糖密度梯度離心分離純化孢子；c、將圓形碘泡蟲的孢子用超聲波破碎；d、在4℃下，用12000轉(zhuǎn)/分鐘離心，取上清液；e、透析濃縮，得孢子的可溶性抗原；f、取50微克可溶性抗原，皮下注射免疫純系小鼠，隔2周進(jìn)行第二次，再隔2周進(jìn)行第三次免疫；g、取250微克可溶性抗原注射小鼠腹腔；h、無菌條件下將小鼠脾臟磨碎，以10∶1的比例與骨髓瘤細(xì)胞混合，然后加入聚乙二醇介導(dǎo)細(xì)胞融合；i、將融合細(xì)胞放入含1％HAT的RPMI1640選擇培養(yǎng)液中，在37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；j、以孢子的可溶性抗原包被酶標(biāo)板，空白對照用包被液，用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)來篩選陽性克隆；k、對有陽性反應(yīng)的孔中的細(xì)胞，用有限稀釋法進(jìn)行3次克隆；l、將所得單克隆細(xì)胞1～2×106個(gè)注入小鼠腹腔，定期采集其雜交瘤腹水，作為粗制抗體；m、將粗制抗體用飽和硫酸銨沉淀后，用高效液相色譜純化，得到純化的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株特異性抗圓形碘泡蟲單克隆抗體及其制備方法。該單克隆抗體是利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備的，其優(yōu)點(diǎn)是由于該單克隆抗體只與圓形碘泡蟲發(fā)生反應(yīng)，而不與我們所研究的其它粘孢子蟲反應(yīng)，因此，用于圓形碘泡蟲病臨床診斷時(shí)的特異性和敏感性都較高；它只與圓形碘泡蟲的孢子反應(yīng)，而不與它的營養(yǎng)體反應(yīng)，說明圓形碘泡蟲生活史的這兩個(gè)時(shí)期具有不同的抗原表位；該單克隆抗體可以與圓形碘泡蟲的孢子特異地反應(yīng)，因此，它可用于圓形碘泡蟲病的臨床檢測，從而為及時(shí)的預(yù)防和治療打下基礎(chǔ)；可用于圓形碘泡蟲相關(guān)的免疫原性的基礎(chǔ)研究。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1425774SQ0215417
公開日2003年6月25日 申請日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者魯義善, 聶品, 汪建國, 王桂堂 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所