專利名稱：取代乙酰苯的立體選擇還原的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過微生物還原相應的含酮基化合物制備(S)-1-芳基乙醇的新型立體選擇方法。本發(fā)明涉及通過相應酮的微生物還原制備手性醇的新型方法。
背景技術：
Bing-nan Zhou等J.Am.Chem.Soc.，Vol.105，5926-5928頁，1983描述了L-肉堿的化學微生物合成，L-肉堿在人類的新陳代謝和長鏈脂肪酸的輸送中起重要作用。特別地，該論文教導了通過面包酵母，即釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)將4-氯乙酰乙酸乙酯還原成(S)-4-氯-3-羥基丁酸酯。
Kazutoshi Ushio等Tetrahedron Letters，Vol.27，No.23,2657-2660頁，1986披露了通過甲醇生長酵母還原β-酮酯。該論文教導了該反應引起所得產物中的過量對映體向D-異構體方向顯著偏移。由于在這種培養(yǎng)基內生長的酵母的酶特征導致當采用在甲醇中生長的酵母進行反應時產生這一現(xiàn)象。
Markus Christen等J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，264-266頁，1988披露了甲基-6-(對氯苯硫基)-3，4-二氫己酸酯的四種立體異構體的合成，其中通過合適的酵母還原引起手性的關鍵引入。其中述及盡管已深入研究了采用酵母還原β-酮酯，但仍難以預計產物的絕對構型或特別地難以可能實現(xiàn)對映體過量。
Antonio Trincone等Biotechnology and Bioengineering，Vol.35，559-564頁，1990描述了采用硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)的殘余細胞不對稱還原酮。它述及這一生物體的殘余細胞的還原能力強烈地取決于細胞生長的階段。
Ramesh Patel等Enzyme Microb.Technol.，Vol.13，906-912頁，1991描述了4，5-二氫-4-(4-甲氧基苯基)-6-(三氟甲基-1H-1)-苯并氮雜-2-酮的立體特異性微生物還原。特別地，它披露了通過立體選擇還原母體酮制造關鍵的中間體(3R-順)-1，3，4，5-四氫-3-羥基-4-(4-甲氧基苯基)-6-(三氟甲基)-2H-1-苯并氮雜-2-酮。它述及可能通過特定條件的選擇從四種已知的可能異構體中獲得單一的異構體。
Ramesh Patel等，Enzyme Microb.Technol.，Vol.15，1014-1021頁，1993描述了將二酮化合物3，5-二氧-6-(芐氧基)己酸甲酯立體選擇還原成所得二羥基化合物的單一對映體。
Ramesh Patel等，EnzymeMicrob.Techno l.，Vol.14，731-738頁，1992描述了熱處理白地霉(Geotrichum candidum)的方法，從而改進由β-酮酯還原獲得的羥基產物的光學純度。
Kometani等，Journal of Fermentation and Bioengineering，Vol.80，No.2，208-210頁，1995教導了采用醇作為能源，酵母-介導的生物還原。檢測在面包酵母中乙醇的消耗速率與前手性酮的還原速率之間的關系，并得出結論乙醇可用于由前手性酮大規(guī)模地生產手性醇。
1995年2月21日授予Ramesh Patel等的美國專利No.5391495披露了采用能催化還原的微生物或酶，立體選擇還原某些含酮的氨磺?；衔铮纬上鄳暮u基化合物。所使用的酶是氧化-還原酶或脫氫酶，微生物優(yōu)選選自漢遜酵母屬(Hansenula)、紅球菌屬(Rhodococcus)和諾卡氏菌屬(Nocardia)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過微生物還原相應的含酮基化合物制備(S)-1-芳基乙醇的新型立體選擇方法。本發(fā)明涉及通過相應酮的微生物還原制備手性醇的新型方法，以便合成4-[2-((1R)-1-{[(4-氯苯基)磺?；鵠-2，5-二氟苯胺基}乙基-5-氟苯基)丁酸等，它是一種治療阿爾茨海默病的新型γ-分泌酶抑制劑。
因此本發(fā)明第一方面提供一種通過立體選擇還原式(II)的化合物而制備式(I)的化合物的方法， 其中X和Y各自獨立地選自H，Cl，Br，I和R1；R1是取代或未取代的烷基、鏈烯基或(CH2)nCOR2；
n是1-10的整數(shù)；R2是OH，OR3或NH2；并且R3是取代或未取代的烷基、鏈烯基、C3-7環(huán)烷基或取代或未取代的芳基； 其中X和Y各自獨立地選自H，Cl，Br，I和R1；R1是取代或未取代的烷基、鏈烯基或(CH2)nCoR2；n是1-10的整數(shù)；R2是OH，OR3或NH2；并且R3是取代或未取代的烷基、鏈烯基、C3-7環(huán)烷基或取代或未取代的芳基；該立體選擇還原是通過與能催化式(II)表示的酮的酶促還原的氧化還原酶反應而完成的。
本發(fā)明第二方面提供一種通過立體選擇還原式(II)的化合物而制備式(I)的化合物的方法， 其中X和Y各自獨立地選自H，Cl，Br，I和R1；R1是取代或未取代的烷基、鏈烯基或(CH2)nCOR2；n是1-10的整數(shù)；R2是OH，OR3或NH2；并且R3是取代或未取代的烷基、鏈烯基、C3-7環(huán)烷基或取代或未取代的芳基；
其中X和Y各自獨立地選自H，Cl，Br，I和R1；R1是取代或未取代的烷基、鏈烯基或(CH2)nCOR2；n是1-10的整數(shù)；R2是OH，OR3或NH2；并且R3是取代或未取代的烷基、鏈烯基、C3-7環(huán)烷基或取代或未取代的芳基；該立體選擇還原是通過與供給能催化式(II)表示的酮的酶促還原的氧化還原酶的微生物反應而完成的。
下文提供本發(fā)明的其它方面和實施方案。
發(fā)明詳述根據本發(fā)明，通過與氧化還原酶或優(yōu)選供給氧化還原酶的微生物反應，該氧化還原酶能催化式(II)表示的酮的酶促還原，進行以上式II表示的化合物的立體選擇還原，形成式(I)表示的化合物。微生物細胞可以是完整的濕細胞或干細胞形式，如凍干、噴霧-干燥或加熱-干燥的細胞，或者是處理過的細胞物質形式如破裂細胞或細胞的提取物。盡管已知大量和各種微生物供給某種形式的氧化還原酶，但根據本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)僅僅選擇的紅球菌屬、短桿菌屬(Brevibacterium)、酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、地霉屬(Geotrichum)、紅酵母屬(Rhodotorula)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬、諾卡氏菌屬、Mucor Spingomonas、面包酵母的物種催化還原式II表示的化合物，形成式I的所需化合物，其數(shù)量和對映體產率高。這些物種是紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 4277、紅串紅球菌DSM 6971和紅球菌種(Rhodococcus sp.)ATCC21227、紅串紅球菌ATCC 27854、Candida sonorensis ATCC56511、Candida boidinii ATCC26175和ATCC56507、高里氏念珠菌(Candida guillieromondii)ATCC 9058、Candidautilis ATCC 9950、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)ATCC52820、白地霉(Geotrichum candidum)34614和ATCC 34014、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)ATCC 26207和ATCC201718、Hansenulafabianii ATCC 58045、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)ATCC58401、ATCC34438和ATCC26012、Hansenula saturnus ATCC 16762、鮭色諾卡氏菌(Nocardia salmonicolor)ATCC19149、Pichia anomalaATCC 66094、Pichia capsulata ATCC 29204、甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)ATCC 56510、ATCC 56508和ATCC 58403、Pichia pinusATCC 28780、Pichia silvicola ATCC 16764、Pichia stipitis ATCC59785、少動鞘氨醇單胞菌(Spingomonas paucimobilis)ATCC 202027、釀酒酵母ATCC12341和ATCC44953、Nocardiodes albus ATCC 55425、魯氏毛霉菌(Mucor rouxii)ATCC 24905、Mucor hiemalis ATCC 16636和短桿菌種(Brevibacterium sp.)ATCC19653。此處所使用的術語“ATCC”是指特定生物體的保藏號，即美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852。術語“DSM”是指德意志微生物保藏中心，Branschweig，德國。也認為可使用基因工程生物。宿主細胞可以是任何細胞，例如大腸埃希氏菌(Eschericia coli)，它被修飾成含有表達一種或更多種能具有此處所述催化作用的酶的基因。
此處所使用的下述術語具有以下給出的定義。術語“烷基”是指任選地取代的直鏈或支鏈飽和烴基，它具有1-10個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子。
術語“鏈烯基”是指任選地取代的直鏈或支鏈不飽和烴基，它具有1-10個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子。
術語“取代烷基”是指例如被1-4個取代基取代的烷基，所述取代基例如鹵素、三氟甲基、三氟甲氧基、羥基、烷氧基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)氧基、氧、烷酰基、芳基、芳氧基、芳烷基、烷酰氧基、氨基、烷氨基、芳氨基、芳烷氨基、環(huán)烷氨基、雜環(huán)氨基和二取代氨基。
術語“取代鏈烯基”是指例如被1-4個取代基取代的鏈烯基，所述取代基例如鹵素、三氟甲基、三氟甲氧基、羥基、烷氧基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)氧基、氧、烷?；?、芳基、芳氧基、芳烷基、烷酰氧基、氨基、烷氨基、芳氨基、芳烷氨基、環(huán)烷氨基、雜環(huán)氨基和二取代氨基。
術語“芳基”是指在環(huán)部分具有6-12個碳原子的單環(huán)或雙環(huán)芳烴基，例如苯基、萘基、聯(lián)苯基和二苯基，它們中的每一種可被取代。
術語“取代芳基”是指例如被1-4個取代基取代的芳基，所述取代基例如烷基、取代烷基、鹵素、三氟甲基、三氟甲氧基、羥基、烷氧基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)氧基、烷?；?、烷酰氧基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳烷氨基、環(huán)烷氨基、雜環(huán)氨基、烷酰基氨基、硫醇、烷硫基、環(huán)烷基硫基、雜環(huán)硫基、脲基、硝基、氰基、羧基、羧烷基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、烷基硫羰基、芳基硫羰基、烷磺基、磺基酰氨基、芳氧基等。該取代基可進一步被一個或更多個選自鹵素、氰基、烷基、烷氧基、芳基、取代烷基、取代芳基和芳烷基的基團取代。
關于使用微生物，可在所使用的微生物的發(fā)酵之后，即以兩步發(fā)酵和還原的方式，或同時，即以一步或原位發(fā)酵和還原的方式進行本發(fā)明的酶還原方法。在后者中，微生物可在合適的培養(yǎng)基中生長，特別地含有氮和碳源的培養(yǎng)基中生長，直到實現(xiàn)充分的生長，然后向其中加入選自式II表示的那些化合物中的化合物。之后持續(xù)酶還原，直到實現(xiàn)式II的化合物的基本上完全轉化。
在兩步法中，最初在如上所述的合適培養(yǎng)基中生長微生物，直到它顯示出預定水平的酶活性，此時通過常規(guī)的分離技術收集細胞，并由其制備含合適緩沖劑等的微生物細胞懸浮液。合適的緩沖劑包括磷酸鹽緩沖液，特別是磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液、Tris-HCl、乙酸鈉等?？墒褂盟苽湮⑸锛毎麘腋∫骸Ｈ缓笙蚱渲屑尤胧絀I表示的化合物，并持續(xù)酶還原直到基本上完全轉化。在任一情況下，合適的生長培養(yǎng)基包括如前所述的氮和碳源以及痕量元素。同樣可包括誘導劑。本領域的技術人員公知術語誘導劑是指引發(fā)或提高細胞內所需酶活性，即氧化還原酶活性的任何化合物，以生產所需產物。認為式II表示的化合物是一種誘導劑，特別地當在微生物的生長過程中小量添加時。
合適的培養(yǎng)基用碳源可包括糖如麥芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、丙二醇等、有機酸及其鹽如乙酸鈉、檸檬酸鈉等、氨基酸及其鹽如谷氨酸鈉等、和醇如乙醇、丙醇等。合適的氮源可包括N-Z胺A、玉米浸漬液、大豆粉、牛肉提取物、酵母提取物、糖蜜、面包酵母、胰胨、nutrisoy、胨、yeastamin、硝酸鈉、硫酸銨等。合適的痕量元素可包括磷酸鹽和鎂、錳、鈣、鈷、鎳、鐵、鈉和鉀的鹽。本發(fā)明所使用的合適培養(yǎng)基可包括選自任何這些這類中的多種成分。代表性優(yōu)選培養(yǎng)基在沒有打算限制的情況下包括以重量百分數(shù)計含下述的含水培養(yǎng)基
成分重量百分數(shù)No.1 麥芽提取物 1％PH7.0 酵母提取物 1％胨 1％葡萄糖 2％No.2 麥芽提取物 1％PH7.0 酵母提取物 1％胨 0.3％甘油4％No.3 麥芽提取物 1％PH7.0 酵母提取物 1％胨 0.3％葡萄糖 2％No.4 麥芽提取物 1％PH7.0 酵母提取物 1％胨 0.3％琥珀酸鈉2％No.5 Nzamine A 1.0％PH7.0 Yeastamin 2.0％甘油2.0％Na2HPO40.6％KH2PO40.3％(NH4)2SO40.125％MgSO4*7H2O0.0246％在高壓滅菌No.5培養(yǎng)基之后，添加過濾的新霉素(在水中)和氯霉素(在200標準乙醇)的無菌溶液，使最終濃度分別為10mg/l和33mg/l。
在滅菌之前，優(yōu)選調節(jié)pH到約6-8，最優(yōu)選約pH6.8。然后例如通過在約121℃下加熱30分鐘使培養(yǎng)基滅菌。緊跟在滅菌之后，調節(jié)培養(yǎng)基的pH至6.5-7.5，最優(yōu)選約pH7.0。在微生物生長和還原過程中，維持pH在約4.0至9.0，優(yōu)選約pH6.0至8.0?？煞奖愕厥褂靡陨纤龅某煞之斨械暮线m的堿或酸性鹽調節(jié)pH。
反應混合物的溫度是還原過程可得到熱能的量度，為此應當維持合適的溫度，以確保過程進行完全可得到的充足能量。本發(fā)明的方法的合適溫度范圍在約5℃-約60℃，優(yōu)選約25℃-約40℃。對于本發(fā)明方法的實踐來說已知壓力不是關鍵，和為了方便起見，典型地維持接近大氣壓力。
優(yōu)選在有氧條件下進行本發(fā)明的方法。反應混合物的攪拌和充氣對于本發(fā)明方法也是有利的，因為它影響生物轉化可得到的氧氣量。在如上所述的一步或兩步法中，在微生物的生長過程中，有利地例如在搖瓶培養(yǎng)物或發(fā)酵器罐中進行該方法。優(yōu)選在約10-1000RPM攪拌，其中最優(yōu)選約50-500RPM。優(yōu)選約0.1-10體積充氣/體積培養(yǎng)基/分鐘(v/Vt.)的充氣，特別優(yōu)選約5體積充氣/體積培養(yǎng)基/分鐘(v/Vt.)的充氣。
式II表示的化合物的完全轉化可要求例如約1-72小時，典型地約4-48小時，這是從式II表示的化合物添加到培養(yǎng)基中時開始測量的。優(yōu)選培養(yǎng)基是水基培養(yǎng)基，但同樣可使用有機液體或混溶或互不混溶，即兩相的有機/含水液體混合物。
可通過添加輔因子如還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或煙酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADPH)，進行本發(fā)明的立體選擇酶促還原方法，特別當使用分離酶時。然后例如再生并重新使用NADH或NADPH。可使用原位再生NADH或NADPH的進一步的酶，例如甲酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶或葡萄糖脫氫酶。合適的氫供體包括分子氫、甲酸鹽(例如甲酸的堿金屬或銨鹽)、葡萄糖、次磷酸鹽或在Viologen，例如甲基Viologen存在下的電化學還原。也可能在沒有進一步的酶的情況下，使用例如乙醇或甲酸鹽再生NADH或NADPH。
進一步優(yōu)選將式II的化合物加入到反應培養(yǎng)基中，以便基于起始化合物和培養(yǎng)基的組合重量，式II的化合物占約0.2％-約5wt％。相對于起始材料用量，微生物的接種物足以提供以上數(shù)次所述的式II表示的化合物的酶促還原，它通常為約5wt％-約30wt％的細胞濃度。采用給定的微生物，使用如上所述的優(yōu)選反應參數(shù)將提供大于70％，最佳地超過90％的反應產率，和式I表示的化合物的所需對映體的大于93％，最佳地超過99％的對映體過量?？赏ㄟ^分離和/或純化方法中的任何合適方法如提取、樹脂吸附/解吸、蒸餾、結晶、柱色譜等，回收本發(fā)明還原方法的產物，即式I表示的化合物。
應當理解本發(fā)明實踐中的各種其它實施方案和改進對本領域的技術人員來說是顯而易見的且可容易作出，而沒有脫離如上所述的本發(fā)明的精神和范圍。因此，不打算將所附的權利要求的范圍限制到以上所述的確切描述，而權利要求應當解釋為包括本發(fā)明具有的可授予專利的新穎性方面的所有特征，其中包括相關領域的那些技術人員認為等同的所有特征和實施方案。參考下述實驗工作進一步描述本發(fā)明。
實施例12-溴-4-氟乙酰苯(III)的立體選擇酶還原使用整細胞-兩步法在500ml燒瓶內，將各種微生物培養(yǎng)物(1ml)接種到100ml的培養(yǎng)基1內，并在搖動器上，在28℃和200RPM下溫育48小時。通過離心收集細胞并使細胞懸浮在10ml 100mM的pH7.0磷酸鉀緩沖液中，將葡萄糖加入到細胞懸浮液內，其濃度為25mg/ml，并向其中加入15mg 2-溴-4-氟乙酰苯(底物，見式III)。
在搖動器上，在28℃和200RPM下進行生物轉化(還原)24-48小時。在預定的時間處，用4體積的乙腈猝滅反應混合物，在旋渦混合器上混合，通過0.2微米的濾膜過濾并收集，和通過HPLC方法1分析1ml樣品，確定底物和產物濃度。在氮氣流下蒸發(fā)干殘留溶液，并用1ml乙醇溶解殘渣、根據并通過HPLC方法2分析，確定產物的對映體過量。下表1概述了結果。該實施例的產物如式IV所示。
方法1開發(fā)該方法監(jiān)測式(III)表示的酮還原成式(IV)表示的醇。
柱子獲自Phenomenex的Phenylhexyl(0.46×15cm，5μ)流動相乙腈∶水(1∶1)流速1ml/min柱溫50℃檢測器在210nm處的UV注射體積5μl在約6.3分鐘處洗脫出2-溴-4-氟乙酰苯(III)，在約5.4分鐘處洗脫出S-1-(2’-溴-4-氟苯基)-乙醇(IV)或其對映體。
方法2開發(fā)該方法監(jiān)測式(IV)表示的醇的對映體純度。
柱子Chiralpak AD(0.46×25cm，10μm，Daicel ChemicalIndustries Ltd.)流動相0.249％V/V在己烷中的無水乙醇流速1ml/min柱溫室溫檢測器在210nm處的UV注射體積2和5μl在約48(R)和54(S)分鐘處洗脫出((R/S)S-1-(2-溴-4-氟苯基)-乙醇)的對映體。在約15分鐘處洗脫出底物2-溴-4-氟乙酰苯。
表12-溴-4-氟乙酰苯微生物還原成所需的相應手性醇
實施例2使用面包酵母這一實施例的底物(式III)和產物(式IV)如實施例1所示。
工藝細節(jié)將3L生物反應器(Braun Biostat B)配備pH電極。設定500RPM的葉輪攪拌速度和設定28℃的溫度。將800ml 10mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)加入到生物反應器中。在整個實驗中，以300-500RPM攪拌生物反應器的內容物并維持28℃的溫度。開啟泵控制10％的氫氧化鈉溶液的自動添加，以保持pH恒定在6.0。在30分鐘內緩慢加入150g活性干酵母(獲自Red Star)。添加5g 2-溴-4-氟乙酰苯。使用最小體積的去離子水(5ml)洗滌反應器中任何殘留的酮。視需要，添加0.5ml SAG消泡劑以控制泡沫。為了控制泡沫，可視需要現(xiàn)在或隨后添加額外的0.5ml SAG消泡劑。以8-10ml/小時的速率開始添加25％的葡萄糖溶液。在20-24小時內添加全部葡萄糖溶液(200ml)。在4、8、12、20、22、24小時處，和視需要在2小時的間隔處取出1ml樣品。根據實施例1所討論的分析，確定底物和產物濃度以及產物的對映體過量。20-28小時的反應時間通常足以完成反應。在該方法中，產物的反應產率為90％，所需異構體的對映體過量為99.5％。
實施例3將式(V)表示的酮甲酯還原成式(VI)表示的相應的醇在500ml燒瓶內，將各種微生物培養(yǎng)物(1ml)接種到100ml如上所述的培養(yǎng)基1或培養(yǎng)基3內，并在搖動器上，在28℃和200RPM下溫育48小時。通過離心收集細胞并使細胞懸浮在10ml 100mM的pH7.0磷酸鉀緩沖液中，將葡萄糖加入到細胞懸浮液內，其濃度為25mg/ml，并向其中加入10mg酮甲酯(見式V表示的底物)。
在搖動器上，在28℃和200RPM下進行生物轉化(還原)24-48小時。用2體積乙酸乙酯提取反應混合物，并在氮氣流下蒸發(fā)至干。將部分乙酸乙酯提取物溶解在乙腈中，并通過HPLC方法3分析，確定底物和產物濃度。將另一部分溶解在己烷∶異丙醇(1∶1)的混合物中，并通過HPLC方法4分析，確定產物的對映體過量。
下表2概述了結果。該實施例的產物如式VI所示。
方法3柱子Kromasil C-8(0.46×15cm，5微米，Waters)流動相從100％的溶劑A(0.2％H3PO4)和0％溶劑B(乙腈∶0.2％H3PO490∶10)到20分鐘處70％溶劑B，然后到25分鐘處100％的溶劑B并以100％的溶劑B持續(xù)到30分鐘的梯度洗脫。
流速1ml/min，檢測在210nm處的UV保留時間酮甲酯(V)20.3分鐘和羥基甲酯(VI)18分鐘。
方法4柱子Chiral pak AD(0.46×15cm，10μm，Daicel)流動相己烷∶乙醇∶異丙醇(98.32∶1.43∶0.25)流速1ml/min，檢測在210nm處的UV(R/S)羥基甲酯的對映體在約23.6(R)和31.1(S)分鐘處洗脫出。
表2酮甲酯(式(V))微生物還原成相應的(S)-羥基甲酯(式(VI))微生物 ATCC# 羥基酯 S-羥基甲(產率) 酯的EE甲醇畢赤酵母 58403 40％ ＞99％甲醇畢赤酵母 56510 41％ 99％甲醇畢赤酵母 56508 33％ ＞96％白地霉 34614 6％＞99％Mortierella 34194 5％NDramannianaApiotrichum humicola 26693％ND
Candida boidinii 5650711％＞99％Nocardiodes albus 554254％ NDNocardiodes luteus 554261％ NDStreptomyces rimosus 109704％ NDND＝未確定實施例4將酮乙酯(VII)還原成相應的醇(VIII)在500ml燒瓶內，將各種微生物培養(yǎng)物(1ml)接種到100ml如上所述的培養(yǎng)基1或培養(yǎng)基3內，并在搖動器上，在28℃和200RPM下溫育48小時。通過離心收集細胞并使細胞懸浮在10ml 100mM的pH7.0磷酸鉀緩沖液中，將葡萄糖加入到細胞懸浮液內，其濃度為25mg/ml，并向其中加入10mg酮乙酯(底物，見式VII)。
在搖動器上，在28℃和200RPM下進行生物轉化(還原)。用2體積乙酸乙酯提取反應混合物，并在氮氣流下蒸發(fā)至干。將部分乙酸乙酯提取物溶解在乙腈中，并通過HPLC方法5分析，確定底物和產物濃度。將另一部分溶解在己烷∶異丙醇(1∶1)的混合物中，并通過HPLC方法6分析，確定產物的對映體過量。下表3概述了結果。該實施例的產物如式VIII所示。
方法5柱子Phenylhexyl(0.46×15cm，5微米，Phenomenex)流動相乙腈∶水(1∶1)流速1ml/min，檢測在210nm處的UV
保留時間酮乙酯(VII)12.4分鐘，羥基乙酯(VIII)8.9分鐘。
方法6柱子Chiral pak AD(0.46×15cm，10μm，Daicel)流動相己烷∶乙醇∶異丙醇(96.9∶2.85∶0.25)流速1ml/min，檢測在210nm處的UV(R/S)羥基乙酯的對映體在約15(R)和19(S)分鐘處洗脫出。
表3酮乙酯微生物還原成相應的(S)-羥基乙酯名稱ATCC#羥基乙酯S-羥基乙酯的EE甲醇畢赤酵母56508 18％ 93.0％甲醇畢赤酵母58403 51％ ＞99.9％白地霉 34614 33％ 98.5％實施例5將酮叔丁酯(IX)還原成相應的醇(X)在500ml燒瓶內，將各種微生物培養(yǎng)物(1ml)接種到100ml如上所述的培養(yǎng)基1或培養(yǎng)基3內，并在搖動器上，在28℃和200RPM下溫育48小時。通過離心收集細胞并使細胞懸浮在10ml 100mM的pH7.0磷酸鉀緩沖液中，將葡萄糖加入到細胞懸浮液內，其濃度為25mg/ml，并向其中加入10mg酮叔丁酯(底物，見式IX)。
在搖動器上，在28℃和200RPM下進行生物轉化(還原)。用2體積乙酸乙酯提取反應混合物，并在氮氣流下蒸發(fā)至干。將部分乙酸乙酯提取物溶解在乙腈中，并通過以上實施例4中所述的HPLC方法5分析，確定底物和產物濃度。保留時間為酮叔丁酯(IX)28.3分鐘和羥基叔丁酯(X)19.2分鐘。
將另一部分溶解在己烷∶異丙醇(1∶1)的混合物中，并通過HPLC方法7分析，確定產物的對映體過量。
方法7柱子Chiral pak AD(0.46×15cm，10μm，Daicel)流動相己烷∶異丙醇(90∶10)流速1ml/min，檢測在210nm處的UV(R/S)羥基叔丁酯的對映體在約23.6(R)和32.8(S)分鐘處洗脫出。
下表4概述了結果。該實施例的產物如式(X)所示。
表4酮叔丁酯微生物還原成相應的(S)-羥基叔丁酯名稱 ATCC# 羥基叔丁酯 (S)-叔丁酯羥基酯的EE魯氏毛霉菌24905 9％ ＞99％Mucor hiemalis16636 22％ 93％甲醇畢赤酵母 58403 4％ 92.6％實施例6由純化的酮-還原酶還原酮甲酯酮-還原酶的純化在細胞破壞之前，用10％甘油、1mM的DTT、0.5mM的PMSF和10mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)均化甲醇畢赤酵母ATCC 58403的20％的細胞懸浮液。通過使細胞懸浮液數(shù)次流過微型流化床破壞細胞。在18000rpm下離心破壞的細胞懸浮液至少20分鐘，除去細胞碎片。潷析不含細胞的提取物并用于蛋白質純化。在4℃下進行所有的純化步驟。使用三種不同條件進行純化，用于從Hi-Trap Blue-Sepharose親和柱中洗脫酶。將蛋白質裝載到用緩沖液A(10％甘油、2mM的DTT和10mM的磷酸鉀緩沖液pH6.5)平衡的親和柱上。通過三種方法從親和柱中洗脫蛋白質(1)pH梯度(在pH6.5處裝載并在pH8.5處洗脫)，(2)在緩沖液A中的NaCl梯度(0-0.8M)和(3)在緩沖液A中的NADP梯度(0.1-0.5mM)。
純化酶至均勻。測定醇化酶的分子量為約40Kd。該酶是NADPH-依賴性蛋白質。測定蛋白質的N-端和內部肽序列，它們有助于克隆和過量表達。
備注x＝沒有確認的氨基酸。
測試純化酶將酮甲酯(底物V)還原成相應的(S)-羥基甲酯(產物VI)。5ml磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的反應混合物含有3單位的純化酮還原酶、5mg底物V、0.1mM的NADP、25mg葡萄糖和15單位的葡萄糖脫氫酶(再生NADPH)。如實施例3所述進行反應。如實施例3所述測量底物V和產物VI濃度以及產物的對映體過量。獲得90％的反應產率和99.9％的對映體過量。
實施例7從甲醇畢赤酵母中分離編碼酮還原酶的基因A.由甲醇畢赤酵母制備染色體DNA使甲醇畢赤酵母ATCC 13825的儲存培養(yǎng)物在F7培養(yǎng)基(10.0g麥芽提取物、10.0g酵母提取物、1.0g胨、20.0g右旋糖[pH7.0]/升)中生長，并在液氮下儲存于1ml等分試樣的小瓶內。在室溫下解凍小瓶并接種到250ml燒瓶內的20ml YPD培養(yǎng)基中。每升YPD由10.0g酵母提取物、20.0g胨和20.0g右旋糖組成。在30℃下，以250rpm的搖動溫育燒瓶20小時。如制備甲醇畢赤酵母DNA中所述(Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，NewYork，1990)，使用快速分離釀酒酵母染色體DNA用的方法。用70％乙醇洗滌沉淀的DNA、空氣干燥，并在TE緩沖液(0.01M的Tris-HCl，0.001M的EDTA，pH8.0)中再次懸浮成1.0mg/ml的最終濃度，這可通過在260nm處的分光光度分析來測量。
B.甲醇畢赤酵母的部分Sau3Al文庫的構建在37℃下，在0.25ml由25μm DNA、5單位酶(Promega，Madison，WI)、0.006M的Tris-HCl、0.006M的MgCl2、0.10M的NaCl和0.001M的二硫蘇糖醇(pH7.5)組成的反應體積中，采用限制內切核酸酶Sau3Al部分裂解如1A.部分所述制備的甲醇畢赤酵母染色體DNA 5分鐘。用等體積的1∶1苯酚∶氯仿提取反應混合物1次。離心之后，保留上層水相，向其中加入0.1體積的3M乙酸鈉和0.6體積的異丙醇。在microfuge中，以16000x g離心分鐘，使DNA沉淀，并用0.5mL 70％乙醇洗滌1次。在SpeedVac(Savant Instruments，F(xiàn)armingdale，NY)中干燥5分鐘之后，將沉淀物再次懸浮在0.06ml的TE緩沖液中。在15v下，在含0.5μg/ml溴化乙錠的TAE緩沖液(0.04M的Trizma堿、0.02M的乙酸和0.001M的EDTA，pH8.3)中，通過0.8％的瓊脂糖凝膠電泳DNA 20小時。通過與1Kb的DNA序列梯進行比較(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，鑒定含約5-10Kb的DNA片段區(qū)域并從凝膠中切除。使用QIAquick凝膠純化試劑盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)，按照推薦的程序提取DNA。在15v下，在0.8％的TAE瓊脂糖凝膠上電泳等分試樣20小時，以證明獲得所需的片段大小范圍并通過與DNA質量(Life Technologies)序列梯進行比較，確定片段濃度。
在0.05μl由2μgDNA、0.006M的Tris-HCl、0.006M的MgCl2，0.1M的NaCl和0.001M的DTT(pH7.5)組成的反應體積內，用BamHI(Promega)消化質粒pZerol(Invitrogen，Carlsbad，CA)。加入10單位的限制內切核酸酶，并在37℃下溫育混合物20分鐘。通過添加等體積的1∶1苯酚∶氯仿終止反應。在13000xg下離心5分鐘之后，除去上層(含水)相并放置在新鮮的microfuge管內。將5μl3M的乙酸鈉(pH7.5)和110μl冰冷的100％乙醇(Shelton Scientific，Shelton，CT)與水相混合，并在13000xg下沉淀DNA 10分鐘。通過吸氣除去任何液體，并用70％的冰冷乙醇洗滌沉淀物1次。吸去乙醇，在SpeedVac中干燥沉淀物5分鐘。消化的質粒DNA再次懸浮在無菌蒸餾水中，得到0.01mg/ml的最終濃度。
在由0.1μg染色體DNA、0.03μg質粒DNA、0.03M的Tris-HCl(pH7.8)、0.01M的MgCl2、0.01M的二硫蘇糖醇和0.0005M的腺苷-5’-三磷酸和3Weiss單位的T4 DNA連接酶(Promega)組成的0.02ml反應體積中，將富集的甲醇畢赤酵母的DNA片段(5-10Kb)連接到BamHI-裂解的pZero2上。在16℃下進行反應18小時。濃縮DNA，并用15μl無菌蒸餾水和250μl 1-丁醇提取以除去鹽。以13000xg離心混合物10分鐘，并吸去所有液體。在SpeedVac中干燥沉淀物5分鐘，并再次懸浮在5μl無菌蒸餾水中。根據銷售商的建議，將連接的DNA轉化到電感受態(tài)DHl0B細胞(Life technologies)內。在轉化之后，添加0.96ml LB培養(yǎng)基，并在37℃下使細胞生長1小時。將137mm的Hybond-N+環(huán)(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)放置在含75ml LB-瓊脂+卡那霉素的150mm培養(yǎng)皿上。將足以得到5000菌落形成單位的等分的部分Sau3A1文庫稀釋到1ml LB培養(yǎng)基內，并在濾膜上均勻鋪開。在37℃下溫育平板24小時。菌落在兩個新鮮的濾膜上復制并在37℃下溫育6小時，而該濾膜放置在LB+卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基上。根據濾膜所提供的指示，進行細胞的裂解和所釋放的DNA的中和。使用UV Stratalinker2400單位(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)，以“自動交聯(lián)”模式，使DNA交聯(lián)到濾膜上。通過將濾膜放置在含3×SSC(20×SSC每升含有173.5gNaCl、88.2g檸檬酸鈉，使用10N氫氧化鈉調節(jié)pH到7.0)、0.1％SDS的容器內，并用濕的Kimwipe擦拭裂解的菌落，除去細胞碎片。然后在65℃下，溫育濾膜至少3小時，使用相同的洗滌溶液至少3小時。
C.含酮還原酶基因的菌落的選擇制備基于純化甲醇畢赤酵母酮還原酶的部分氨基酸序列的混合寡糖核酸引物(參見

圖1)。在聚合酶鏈反應(PCR)中采用有義和反義引物的所有可能組合。反應由0.05M的Tris-HCl(pH8.3)、250μg/ml牛血清白蛋白、2％(w/v)蔗糖、0.1mM甲酚紅、0.2mM每種dATP、dCTP、dGTP、dTTP、4mM的MgCl2、0.0005mM的每種引物、0.25μl(0.625U)的TakaraZ-Taq DNA聚合酶(PanVera，Madison，WI)和0.1μg的甲醇畢赤酵母染色體DNA組成，其總體積為0.05ml。在下述條件下，在Perkin-Elmer 480型號的熱循環(huán)儀中進行擴增在94℃下變性4分鐘，接著94℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃1.5分鐘，和在72℃下最后延伸5分鐘，共30次循環(huán)。在各反應的樣品在1.0％的TAE瓊脂糖凝膠上電泳之后，使用寡核苷酸對183+186和185+188，分別觀察到650-和850-bp片段的強烈擴增。
從瓊脂糖凝膠中分離片段，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒純化。根據制造商的程序，將DNA連接到載體pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，并通過電穿孔轉化到大腸埃希氏菌DHl0B內。在含50μg/ml的卡那霉素和Bluo-gal(Life technologies；75μl在二甲基甲酰胺中的2％[w/v]溶液)的LB瓊脂培養(yǎng)基上鋪展細胞，并在37℃下溫育20小時。從每次連接/轉化中隨機選擇的5個白色菌落接種到LB+卡那霉素液體培養(yǎng)基中，并在37℃、250rpm下生長20小時。使用QIAprepSpin Miniplasmid試劑盒(Qiagen)，由各樣品制備質粒DNA。通過PCR，使用如上所述的條件，證明存在預期的插入。使用ALFexpress AutoRead試劑盒(Amersham-Phamacia)測序一種代表性的質粒，并在ALFexpress自動DNA測序裝置上分析。在這兩種情況下，還發(fā)現(xiàn)由純化酶獲得的但不用于合成寡核苷酸的部分氨基酸序列在PCR片段內被編碼。
基于這些結果，根據制造商的說明，使用如上所述的兩套引物和PCRDIG探針合成試劑盒(Roche Biochemicals，Indianapolis，IN)制備洋地黃毒苷標記的試樣。如上所述的約10ng分離的PCR片段引入作為模板DNA。擴增條件是在94℃下變性4分鐘，接著30次循環(huán)94℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃1分鐘。在1.0％的TAE瓊脂糖凝膠上，使5μl的反應等分試樣與未標記的片段一起進行電泳。通過標記片段分子量的顯著增加可證明洋地黃毒苷-dUTP核苷酸的摻入。使用寡核苷酸183+186獲得優(yōu)異的摻入。
在滾瓶內，用10ml DIG EasyHyb溶液(Roche)和5μl變性、標記的PCR片段溫育含獲自甲醇畢赤酵母Sau3A1文庫的裂解且變性DNA的雙份濾膜。在42℃下雜交18小時。用2XSSC(由20X溶液制備；20XSSC每升含有173.5gNaCl、88.2g檸檬酸鈉，用10N氫氧化鈉調節(jié)pH到7.0)、0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)在室溫下經5分鐘洗滌濾膜2次，然后在68℃下用0.5％SSC、0.1％SDS經15分鐘洗滌2次。使用DIG標記和檢測試劑盒試劑和程序(Roche)，進行抗-洋地黃毒苷抗體的結合、洗滌和檢測。將膜放置在Whatman 3MM紙上，除去過量液體，用Saran Wrap覆蓋，并暴露于放射自顯影膜(Kodak X-OMAT LS)下。從主濾膜中挑選單雜交菌落，在LB+卡那霉素瓊脂培養(yǎng)基上劃線，并在37℃下溫育24小時。菌落是使用QIAfilter Plasmid Midi試劑盒(Qiagen)分離質粒用的生長的LB+卡那霉素液體培養(yǎng)基。限制酶切作圖表明約5.0kb的插入片段存在于重組質粒中。使用寡核苷酸183+186和185+188，測試分離的DNA支持擴增的能力，這已得到證明。使用基于分離的PCR片段的DNA序列的寡核苷酸引物，分析在pKR5.0內的插入片段。發(fā)現(xiàn)1059的開放讀框，它編碼分子量為39800道爾頓的353個氨基酸的蛋白質(圖1)。這與分離的酮還原酶的大小幾乎一致(通過凝膠過濾測定為40000道爾頓)。
實施例8在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中甲醇畢赤酵母酮還原酶基因的亞克隆和表達使用聚合酶鏈反應擴增含限制位點的完整酮還原酶基因，該基因適于克隆到表達載體pBMS2000內。以下給出了所使用的引物BspHIa)5’TGCTCATGAATTGGGAAAAAGTTCCACAAG3’(粗體的核苷酸表明限制酶BspHI的識別序列；加下劃線的核苷酸表明酮還原酶基因的起始Met密碼子)
BamHlb)5’CTCGGATCCTTATAAAATTACAGAATATAAG3’(粗體的核苷酸表明限制酶BamHI的識別序列；加下劃線的核苷酸表明在酮還原酶基因的3′端的終止密碼子)PCR條件與1.C部分中給出的那些相同，所不同的是使用pKR5.0DNA作為模板和反應的大小增加到200μl(所有組分的體積成比例地增加)。在1.0％的TAE瓊脂糖凝膠上使反應的等分試樣電泳，證明預期分子量條帶的存在(1077bp)。用1∶1苯酚∶氯仿提取其余反應混合物1次，并以13000x g離心5分鐘之后保留水相。通過添加20μl 3M的乙酸鈉(pH7.5)和440μl 100％的冰冷乙醇沉淀DNA。在以13000xg離心10分鐘之后，吸去液體，并用70％乙醇洗滌沉淀物。吸走乙醇，并在SpeedVac中干燥DNA5分鐘。沉淀物在由0.006M的Tris-HCl、0.006M的MgCl2、0.1M的NaCl和0.001M的DTT(pH7.5)組成的0.05ml反應體積內消化之前，再次將它懸浮在0.043ml的無菌蒸餾水中。添加10單位(1μl)的各種限制內切核酸酶，并在37℃下溫育混合物1.5小時。通過添加等體積的1∶1苯酚∶氯仿，終止反應。以13000xg離心5分鐘之后，除去上層(含水)相并放置在新的microfuge管內。將5μl 3M的乙酸鈉(pH7.5)和110μl冰冷的100％乙醇(Shelton Scientific，Shelton，CT)與水相混合，并在13000xg下沉淀DNA10分鐘。吸去任何液體，并用70％的冰冷乙醇洗滌沉淀物1次。吸去乙醇和在SpeedVac中干燥沉淀物5分鐘。消化的質粒DNA再次懸浮在無菌蒸餾水中，得到0.01mg/ml的最終濃度。
在由0.1μg質粒、0.03μg PCR片段、0.03M的Tris-HCl(pH7.8)、0.01M的MgCl2、0.01M的二硫蘇糖醇和0.0005M的腺苷-5’-三磷酸和3Weiss單位的T4 DNA連接酶(Promega)組成的0.02ml反應體積中，將BspHI/BamHI消化的PCR片段連接到BspHI/BamHI裂解的Pbms2000上。在16℃下進行反應18小時。濃縮DNA，并用15μl無菌蒸餾水和250μl 1-丁醇提取以除去鹽。以13000xg離心混合物10分鐘，并吸去所有液體。在SpeedVac中干燥沉淀物5分鐘，并再次懸浮在5μl無菌蒸餾水中。根據銷售商的建議，將連接的DNA轉化到電感受態(tài)DH10B細胞(Lifetechnologies)內。在轉化之后，添加0.96ml LB培養(yǎng)基，并在37℃下使細胞生長1小時。在含10μg/ml硫酸新霉素(Sigma)的LB瓊脂培養(yǎng)基上展開細胞的等分試樣，并在37℃下溫育平板20小時。通過PCR，使用1.C部分所述的條件，所不同的是16種隨機選擇的菌落中的一部分是模板DNA的來源，從而證明了正確插入的存在。16種菌落中的14種擴增正確大小的片段。來自這些分離物中的質粒稱為pBMS2000-PMKR(對于甲醇畢赤酵母酮還原酶來說)。
根據制造商的程序，將pBMS2000-PMKR轉化到感受態(tài)大腸埃希氏菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RIL細胞(Stratagene)內，將細胞在含30μg/ml氯霉素和10μg/ml新霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上展開。使用1.C部分所述的條件，隨機選擇4種菌落，并用作PCR用模板DNA的來源。所有4種反應擴增正確大小的DNA片段，這證明BL21-CodonPlus(DE3)-RlL已被成功地轉化。選擇這些分離物之一作為表達株并用于所有進一步的實驗。通過在15℃下在MT3/新霉素/氯霉素培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞，制備多瓶表達株，直到對數(shù)中期(0D600約3.5)，添加甘油到10％的最終體積，并在液氮中冷凍。MT3/新霉素/氯霉素培養(yǎng)液的組成是1％NZ-Amine A(Sheffield Products，Norwich，NY)、2％Yeastamin(A.E.Staley，Decataur，1L)、2％甘油、0.6％Na2HPO4、0.3％KH2PO4、0.125％(NH4)2SO4、0.0246％MgSO4.7H2O(EM Science)、10μg/ml硫酸新霉素和30μg/ml氯霉素(EM Science)。
通過在質粒pBMS2000上產生的ptac啟動子的IPTG(異丙硫基-β-D半乳糖苷)誘導，控制酮還原酶基因的表達。在250ml燒瓶內，在15℃、225RPM下，表達株在25ml MT3/新霉素/氯霉素中生長，直到它達到OD600nm約0.7。在這一點處，添加IPTG(Life Technolgies)到0.5mM的最終濃度。使培養(yǎng)物生長過夜(約16小時)，使得酮還原酶基因完全誘導和酮還原酶蛋白質產生。
將1ml過夜表達的培養(yǎng)物樣品轉移到微型離心管中，并以14000xg沉淀細胞2分鐘。真空吸走上清液，并將細胞沉淀物再次懸浮在蒸餾水中，達到30的OD600。將10μl細胞懸浮液加入到17.5μl蒸餾水、10μl0.5M的二硫蘇糖醇(Sigma)和12.5μl 4X的NuPAGE LDS蛋白質樣品加樣緩沖液(Invitrogen)中。將蛋白質樣品在70℃下溫育10分鐘，并將15μl等分試樣加樣到NuPAGE 10％Bis-Tris凝膠(Invitrogen)中。在125mA下，使凝膠在1X NuPAGE MOPS SDS流動緩沖液中電泳，直到示蹤染料到達凝膠底部。在相鄰的泳道中進行蛋白質分子量標準物(Mid-RangeProtein Molecular Weight Weight Markers，Promega Corp.，Madison，WI)的實驗。在完成實驗時，將凝膠轉移到含有蛋白質染色溶液(在40％乙醇/10％乙酸/50％水內的0.1％Coomassie Blue R250[Sigma])的托盤中。在平臺式搖動器上放置該溶液并輕輕攪拌1小時。除去染色溶液并用脫色溶液(1x Gel-Clear Destain，Novez)替代。凝膠返回到平臺式搖動器中并脫色，直到蛋白質條帶清晰可見。由酮還原酶表達株制備的蛋白質樣品顯示出清晰地過量表達的蛋白質，其分子量為約40000道爾頓。對照的培養(yǎng)物，或者未轉化的BL21-CodonPlus(DE3)-RIL或者用pBMS2000轉化的BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，在IPTG誘導之后沒有顯示出類似的條帶。隨后的實驗證明發(fā)現(xiàn)過量表達的蛋白質主要在可溶的蛋白質級分內。
為了測試異源表達的蛋白質是否擁有酮還原酶活性，如上所述生長并誘導表達株，所不同的是培養(yǎng)物體積增加到1L，和燒瓶尺寸增加到4L。在用IPTG過夜誘導之后，如上所述在蛋白質凝膠上分析樣品。結果表明培養(yǎng)物大小的遞增對菌株過量表達異源蛋白質的能力沒有影響。實施例9中給出了在生物轉化方法中使用重組酶的實例。圖1給出了酮還原酶的氨基酸和核苷酸序列。
圖1甲醇畢赤酵母酮還原酶的序列ATG AAT TGG GAA AAA GTT CCA CAA GAA TTA TAC ACTMET Asn Trp Glu Lys Val Pro Gln Glu Leu Tyr ThrCGT TTG GGC TCT TCA GGT CTA CAA ATC TCC AAG ATTArg Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gln Ile Ser Lys IleATT GTT GGG TGT ATG TCA TTC GGT ACC AAA GCA TGGIle Val Gly Cys MET Ser Phe Gly Thr Lys Ala TrpGGA GGT GAT TGG GTT TTG GAG GAT GAG GAT GAG ATCGly Gly Asp Trp Val Leu Glu Asp Glu Asp Glu IleTTT GCG ATT ATG AAA AAG GCT TAT GAT CAA GGT ATCPhe Ala Ile MET Lys Lys Ala Tyr Asp Gln Gly IleAGA ACT TTT GAC ACT GCT GAC TCT TAT TCT AAT GGTArg Thr Phe Asp Thr Ala Asp Ser Tyr Ser Asn GlyGTT TCT GAA AGA CTC TTA GGT AAA TTC ATT AGA AAGVal Ser Glu Arg Leu Leu Gly Lys Phe Ile Arg LysTAC AAC ATT GAT AGA TCT AAG CTT GTT ATT TTG ACTTyr Asn Ile Asp Arg Ser Lys Leu Val Ile Leu ThrAAG GTT TTT TTC CCA GCT CCT GAA GAA TAT GAG TCGLys Val Phe Phe Pro Ala Pro Glu Glu Tyr Glu SerTTT AGC TTC TTT AAT CAT AAT TTC CCT GGT CAC GAGPhe Ser Phe Phe Asn His Asn Phe Pro Gly His Glu
TTG GTC AAC AGA AGT GGC TTA TCG AGA AAA CAT ATTLeu Val Asn Arg Ser Gly Leu Ser Arg Lys His IleTTG GAC TCT GCT GCT GCC TCT GTT GAG AGA TTA GGCLeu Asp Ser Ala Ala Ala Ser Val Glu Arg Leu GlyACC TAT ATC GAT GTA CTA CAA ATT CAT AGA TAT GATThr Tyr Ile Asp Val Leu Gln Ile His Arg Tyr AspCCA AAT ACC CCT GCT GAA GAA ACC ATG GAA GCT TTGPro Asn Thr Pro Ala Glu Glu Thr MET Glu Ala LeuAAT GAT TGT ATT AAA CAA GGT TTA ACC AGA TAC ATTAsn Asp Cys Ile Lys Gln Gly Leu Thr Arg Tyr IleGGA GCA TCT ACC ATG AGA GCC TAT CAA TTC ATC AAGGly Ala Ser Thr MET Arg Ala Tyr Gln Phe Ile LysTAT CAA AAC GTT GCT GAG AAA CAT GGG TGG GCA AAGTyr Gln Asn Val Ala Glu Lys His Gly Trp Ala LysTTC ATC TCG ATG CAA AGC TAC TAC AGT TTA CTT TACPhe Ile Ser MET Gln Ser Tyr Tyr Ser Leu Leu TyrCGT GAA GAA GAA GCA GAA CTA ATT GCA TAC TGT AATArg Glu Glu Glu Ala Glu Leu Ile Ala Tyr Cys AsnGAA ACT GGT GTT GGG TTA ATC CCA TGG TCA CCA AACGlu Thr Gly Val Gly Leu Ile Pro Trp Ser Pro AsnGCT GGT GGA TTC TTA ACC AGA CCA GTA TCC AAG CAAAla Gly Gly Phe Leu Thr Arg Pro Val Ser Lys Gln
GAC ACT GCG AGA AGT GCA AGT GGG GCT GCT GCG TTAAsp Thr Ala Arg Ser Ala Ser Gly Ala Ala Ala LeuTAT GGT CTA GAA CCT TTC AGT GAG GCT GAT AAG GCTTyr Gly Leu Glu Pro Phe Ser Glu Ala Asp Lys AlaATT ATT GAC AGG GTT GAA GAG TTA TCA AAG AAA AAGIle Ile Asp Arg Val Glu Glu Leu Ser Lys Lys LysGGA GTT TCT ATG GCT AGT GTC GCT TTA GCT TGG GTTGly Val Ser MET Ala Ser Val Ala Leu Ala Trp ValATT AGT AAG AAC AGT TGG CCA ATT ATT GGT TTC AGTIle Ser Lys Asn Ser Trp Pro Ile Ile Gly Phe SerAAG CCT GGA AGG GTT GAT GAT GCT TTA GAT GGT TTCLys Pro Gly Arg Val Asp Asp Ala Leu Asp Gly PheAAG TTG AAG CTA ACC GAA GAG GAC ATC AAA TTC TTALys Leu Lys Leu Thr Glu Glu Asp Ile Lys Phe LeuGAA GAG CCT TAT GTT CCA AAA CCT TTG CCT CGC TTAGlu Glu Pro Tyr ValP ro Lys Pro Leu Pro Arg LeuTAT TCT GTA ATT TTA TAATyr Ser Val Ile Leu STP實施例9通過重組大腸埃希氏菌表達來自甲醇畢赤酵母的酮還原酶還原酮甲酯(V)在大腸埃希氏菌中克隆并過量表達來自甲醇畢赤酵母的酮還原酶。在15L和250L發(fā)酵器內，使大腸埃希氏菌的細胞(表達酮還原酶)在培養(yǎng)基5中生長。在培養(yǎng)物的光學細胞密度(OD)達到3.0時，通過添加0.25mM作為誘導劑的異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)，進行大腸埃希氏菌的酮還原酶誘導。在添加IPTG之后，在發(fā)酵器中生長30小時之后收集細胞。使用細胞，通過細胞懸浮液催化酮甲酯(底物V)生物轉化成相應的(S)-羥基甲酯(產物VI)。
該實施例的底物和產物如實施例3所述。將大腸埃希氏菌表達酮還原酶的細胞以10％(W/V)的濃度懸浮在1L 100mM的磷酸鹽緩沖液pH7.0中。將該細胞懸浮液補加100μM煙酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADP)、1mM苯甲烷磺酰氯(PMSF)、50g葡萄糖、3400單位葡萄糖脫氫酶和4.5g底物(酮甲酯，式V)。在500RPM和28℃的溫度下進行生物轉化。如實施例3所述，通過HPLC分析，測定底物V和產物V I濃度和產物VI的對映體過量。在20小時內完成反應，其中產物(羥甲基酯，式VI)的反應產率為95％。對于產物VI來說，獲得99.9％的對映體過量。
權利要求
1.一種通過立體選擇還原式(II)的化合物而制備式(I)的化合物的方法， 其中X和Y各自獨立地選自H，Cl，Br，I和R1；R1是取代或未取代的烷基、鏈烯基或(CH2)nCOR2；n是1-10的整數(shù)；R2是OH，OR3或NH2；并且R3是取代或未取代的烷基、鏈烯基、C3-7環(huán)烷基或取代或未取代的芳基； 其中X和Y各自獨立地選自H，Cl，Br，I和R1；R1是取代或未取代的烷基、鏈烯基或(CH2)nCOR2；n是1-10的整數(shù)；R2是OH，OR3或NH2；并且R3是取代或未取代的烷基、鏈烯基、C3-7環(huán)烷基或取代或未取代的芳基；該立體選擇還原是通過與能催化式(II)表示的酮的酶促還原的氧化還原酶反應而完成的。
2.一種通過立體選擇還原式(II)的化合物而制備式(I)的化合物的方法， 其中X和Y各自獨立地選自H，Cl，Br，I和R1；R1是取代或未取代的烷基、鏈烯基或(CH2)nCOR2；n是1-10的整數(shù)；R2是OH，OR3或NH2；并且R3是取代或未取代的烷基、鏈烯基、C3-7環(huán)烷基或取代或未取代的芳基； 其中X和Y各自獨立地選自H，Cl，Br，I和R1；R1是取代或未取代的烷基、鏈烯基或(CH2)nCOR2；n是1-10的整數(shù)；R2是OH，OR3或NH2；并且R3是取代或未取代的烷基、鏈烯基、C3-7環(huán)烷基或取代或未取代的芳基；該方法包括使所述式(II)的化合物與供給能催化式(II)表示的酮的酶促還原的氧化還原酶的微生物反應。
3.權利要求1的方法，其中所述氧化還原酶是大腸埃希氏菌中表達的圖1的甲醇畢赤酵母酮還原酶。
4.權利要求2的方法，其中所述供給氧化還原酶的微生物選自甲醇畢赤酵母ATCC 56510、甲醇畢赤酵母ATCC 56508和甲醇畢赤酵母ATCC 58403，并且其中所述氧化還原酶是酮還原酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過微生物還原相應的含酮基化合物制備(S)－1－芳基乙醇的新型立體選擇方法。在治療阿爾茨海默病中可用的γ－分泌酶抑制劑化合物的合成中，(S)－1－芳基乙醇用作中間體。
文檔編號C12P7/22GK1498273SQ02806885
公開日2004年5月19日 申請日期2002年3月6日 優(yōu)先權日2001年3月22日
發(fā)明者R·帕特爾, R 帕特爾, A·戈斯瓦米, 雇咼, L·楚, 爬, V·南杜里, 虜, S·戈德伯格, 菜茍, R·約翰斯頓, 多諾范, M·J·多諾范, 米爾法克雷, K·D·米爾法克雷 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司