專利名稱：：對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種殼聚糖化學(xué)改性的功能衍生物，其應(yīng)用于食品行業(yè)，屬于高分子化學(xué)領(lǐng)域。殼聚糖是甲殼素的脫乙酰化產(chǎn)物，是生物界中大量存在的唯一一種帶有陽(yáng)離子的堿性多糖。因分子內(nèi)和分子間氫鍵的作用，殼聚糖只溶于酸和酸性水溶液。殼聚糖分子鏈上含有大量的羥基、氨基等可修飾的基團(tuán)，可通過(guò)化學(xué)改性得到各種具有特殊功能的衍生物，因此可以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。例如，殼聚糖具有優(yōu)良的生物降解性、生物相容性、成膜特性和較強(qiáng)的抗菌防腐保鮮能力，在食品工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。殼聚糖僅能溶解于酸性介質(zhì)中，限制了其應(yīng)用范圍。通常人們通過(guò)在殼聚糖分子上引入季銨鹽、烷基、無(wú)機(jī)酸等，改進(jìn)殼聚糖的溶解性或絮凝性。將對(duì)氨基苯甲酰基接枝到殼聚糖分子鏈上，得到對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖衍生物，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉為實(shí)驗(yàn)菌種，對(duì)衍生物進(jìn)行了抗菌活性研究，繪制了抑菌生長(zhǎng)曲線，可望為該產(chǎn)物應(yīng)用于食品防腐劑中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過(guò)酰氯與殼聚糖的?；磻?yīng)制備出對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖衍生物，并對(duì)其進(jìn)行抗菌作用研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明的目的是要克服殼聚糖不溶于水的缺點(diǎn)，提供一種具有抗菌效果的殼聚糖衍生物，可用作食品中抗菌防腐添加劑。本發(fā)明的另一目的是提供上述殼聚糖衍生物——對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法。本發(fā)明的對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的結(jié)構(gòu)為NH2其中，n在160-180之間，在殼聚糖分子鏈上引入對(duì)氨基苯甲?；?，該化合物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的最低抑菌濃度分別達(dá)到0.1%，0.1%和1%。該化合物的物化
背景技術(shù)：
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發(fā)明內(nèi)容指標(biāo)淺黃色粉末狀固體，溶于水和乙二醇，分子量為45-50KD。本發(fā)明通過(guò)對(duì)氨基苯甲酸與氯化亞砜反應(yīng)，制備出對(duì)氨基苯甲酰氯，然后與殼聚糖反應(yīng)制備得到對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖。取對(duì)氨基苯甲酸放入三頸瓶中，加入一定量的無(wú)水乙醚，再加入氯化亞砜，放入到水溫3(TC的超聲波洗滌器中，反應(yīng)10分鐘；向三頸瓶中加入一定量的殼聚糖乙酸溶液，在5。C一45。C下超聲波振蕩1.5小時(shí)，然后靜置過(guò)夜；反應(yīng)完成后，加入大量丙酮使產(chǎn)物沉淀出來(lái)，過(guò)濾，再用無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚的混合溶劑浸泡24小時(shí)后抽濾，再將抽濾后的濾餅用丙酮進(jìn)行索氏提取24小時(shí)，真空干燥后得產(chǎn)物。本發(fā)明涉及的主要反應(yīng)有兩步(1)制備對(duì)氨基苯甲酰氯,2NH，+S0C12COOH(2)制備對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖Q~C=0HCH2OH0—H\OHHyNH2HCH2OHH/l""^"Q「O-+」nc卜c-o所述對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖化合物的制備方法，其制備步驟如下(1)將稱量的對(duì)氨基苯甲酸溶于50-65'C蒸餾水中，熱抽濾；(2)濾液冷卻到室溫，在室溫下抽濾；(3)取濾餅，真空干燥，得到純凈的對(duì)氨基苯甲酸；(4)將對(duì)氨基苯甲酸放入到三頸瓶中，加入無(wú)水乙醚使對(duì)氨基苯甲酸完全溶解，再加入氯化亞砜，放入到水溫為20-4(TC的超聲波洗滌器中，超聲波振蕩10-60分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物為對(duì)氨基苯甲酰氯；(5)冷卻(4)步的反應(yīng)產(chǎn)物到0-3(TC，將殼聚糖溶于無(wú)水乙酸中，再將其加入三頸瓶中，在5-45'C下超聲波振蕩1-3.5小時(shí)，靜置過(guò)夜；(6)將(5)步的反應(yīng)產(chǎn)物加入丙酮直至產(chǎn)物對(duì)氨基苯甲?；鶜ぞ厶浅恋沓鰜?lái)，抽濾；(7)將(6)步的沉淀用無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚的混合溶劑浸泡12-24小時(shí)后，抽濾，取濾餅；(8)再將(7)步的濾餅用丙酮進(jìn)行索氏提取24-30小時(shí)，真空干燥后得到產(chǎn)物對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖。所述的(l)步中抽濾的工藝條件是用濾瓶和布氏漏斗在50-65°〇烘箱中烘1-3小時(shí)，再在50-65'C下用水泵抽濾反應(yīng)液，抽濾結(jié)束后，迅速把濾液倒入到干凈的燒杯中；所述的(2)、(6)和(7)步中抽濾的工藝條件都是用濾瓶和布氏漏斗在50-65'C烘箱中烘l-3小時(shí)，再在室溫下用水泵抽濾反應(yīng)液，抽濾結(jié)束后，迅速把濾液倒入到干凈的燒杯中。所述的對(duì)氨基苯甲酸氯化亞砜殼聚糖的投料重量比為(l-5):(3-9):l。所述的(7)步的無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚的體積比為l:(i-io)。所述的(8)步的索氏提取的工藝條件為55-65"水浴加熱，提取24-30小時(shí)。所述的(8)步的真空干燥的工藝條件為30-5(TC下，真空度為8X10"Pa，干燥12-24小時(shí)。所述對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖化合物作為制備食品防腐添加劑的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于將對(duì)氨基苯甲?；氲綒ぞ厶欠肿由现苽涑龅男滦蜌ぞ厶茄苌飳?duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉具有良好的抗菌活性，擴(kuò)大了殼聚糖的抑菌范圍，可用作食品防腐添加劑。圖1為殼聚糖的紅外光譜圖。圖2為所制備的對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的紅外光譜圖。圖3為殼聚糖和對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖乙酸溶液的紫外吸收光譜圖。圖4殼聚糖和對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用圖。圖5殼聚糖和對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用圖。圖6殼聚糖和對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的抑制作用圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:取干燥過(guò)的對(duì)氨基苯甲酸lg放入三頸瓶中，加入30ml的無(wú)水乙醚，再加入2ml氯化亞砜，放入到水溫30。C的超聲波洗滌器中，反應(yīng)10分鐘。冷卻到25'C，0.5g殼聚糖溶于30ml乙酸中，將其加入三頸瓶中，在25'C下超聲波振蕩1小時(shí)，靜置過(guò)夜。反應(yīng)完成后，加入70ml丙酮使產(chǎn)物沉淀出來(lái)，抽濾，再用50ml體積比為l:1的無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚的混合溶劑浸泡24小時(shí)后抽濾，再將抽濾后的濾餅用丙酮進(jìn)行索氏提取24小時(shí)，真空干燥后得產(chǎn)物——對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖。實(shí)施例2:取干燥過(guò)的對(duì)氨基苯甲酸lg放入三頸瓶中，加入30ml的無(wú)水乙醚，再加入2ml氯化亞砜，放入到水溫30'C的超聲波洗滌器中，反應(yīng)10分鐘。加熱到45'C，0.5g殼聚糖溶于30ml乙酸中，再將其加入三頸瓶中，在45'C下超聲波振蕩1小時(shí)，靜置過(guò)夜。反應(yīng)完成后，加入70ml丙酮使產(chǎn)物沉淀出來(lái)，抽濾，再用50ml體積比為l:1的無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚的混合溶劑浸泡24小時(shí)后抽濾，再將抽濾后的濾餅用丙酮進(jìn)行索氏提取24小時(shí)，真空干燥后得產(chǎn)物——對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖。實(shí)施例3:取干燥過(guò)的對(duì)氨基苯甲酸lg放入三頸瓶中，加入30ml的無(wú)水乙醚，再加入2ml氯化亞砜，放入到水溫3(TC的超聲波洗滌器中，反應(yīng)10分鐘。冷卻到5'C，0.5g殼聚糖溶于30ml乙酸中，再將其加入三頸瓶中，在5'C下超聲波振蕩1小時(shí)，靜置過(guò)夜。反應(yīng)完成后，加入70ml丙酮使產(chǎn)物沉淀出來(lái)，抽濾，再用50ml體積比為l:1的無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚的混合溶劑浸泡24小時(shí)后抽濾，再將抽濾后的濾餅用丙酮進(jìn)行索氏提取24小時(shí)，真空干燥后得產(chǎn)物——對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖。分析圖l和圖2兩幅紅外譜圖可見(jiàn)，殼聚糖紅外譜圖中1597.2cm—1處為氨基N-H變形振動(dòng)峰，2875.7cm"處為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，3417.7cm"處歸屬于殼聚糖分子中O-H伸縮振動(dòng)和N-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，1082.4cm"處為C-OH的吸收峰；產(chǎn)物中出現(xiàn)1735.5cm"是C=0伸縮振動(dòng)峰；1602.3cm'1和1517.8cm—1處是苯環(huán)的骨架振動(dòng)吸收峰；1082.4cm"處的C-OH吸收峰沒(méi)有大的變化，可推知對(duì)氨基苯甲酰氯主要在殼聚糖的氨基上發(fā)生酰化反應(yīng)。圖3為以lg/L的醋酸溶液為溶劑，將殼聚糖和對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖制成濃度為1X10"VmL的溶液，測(cè)得的紫外吸收光譜圖。其中，2為殼聚糖的紫外吸收光譜圖，1為對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的紫外吸收光譜圖。從圖中可以看出，將對(duì)氨基苯甲?；拥綒ぞ厶欠肿由希捎邗０贰⑻佳蹼p鍵、苯環(huán)等生色團(tuán)的影響，殼聚糖衍生物在284nm處有個(gè)大的吸收峰，即在284nm處有強(qiáng)的紫外線吸收峰值。實(shí)施例4:本發(fā)明所得產(chǎn)物對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖和殼聚糖對(duì)大腸桿菌的抑菌效率(％)樣品濃度(％)0.50.250.10.080.050.0250.010.005殼聚糖100100979187736757對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖1001001009693898372實(shí)施例5:本發(fā)明所得產(chǎn)物對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖和殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明所得產(chǎn)物對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖和殼聚糖對(duì)黑曲霉的抑菌效率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述抑菌效率的測(cè)定配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的殼聚糖溶液和衍生物溶液(以0.5%的醋酸溶液為溶劑)。分別將0.1mL菌懸液和0.1mL不同濃度的樣品溶液均勻涂布在培養(yǎng)基平板上，空白為不加樣品溶液的菌懸液。所有平板在37'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出觀察各個(gè)平板上的細(xì)菌生長(zhǎng)情況，計(jì)算抑菌率-I-(m-n2)/n!X1000/0其中，m和ti2分別為空白和涂有樣品的平板上的菌落數(shù)。對(duì)于黑曲霉采用干重法測(cè)定殼聚糖和衍生物的抑菌效率。配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的殼聚糖溶液和衍生物溶液(以0.5%的醋酸溶液為溶劑)。分別將lmL黑曲霉菌懸液和2mL不同濃度的樣品溶液添加到沙氏培養(yǎng)基中，空白為不加樣品溶液的菌懸液，在28"C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，抽濾，干燥并稱菌體干重，計(jì)算抑菌率I二(m廣m2)/nuX1000/0其中，rm和m2分別為不加樣品培養(yǎng)液中和添加樣品培養(yǎng)液中的菌絲干重。抑菌活性實(shí)驗(yàn)對(duì)于細(xì)菌采用比濁法，添加一定量的殼聚糖溶液和衍生物溶液分別于液體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，使樣品濃度為0.01%，分別接入0.2mL濃度為1(^個(gè)/mL的菌懸液，在37"C恒溫振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定吸光度值，用吸光度值的變化反映細(xì)菌數(shù)量的變化。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸濁液在620nm下的吸光度OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線和相同菌種在加入殼聚糖或衍生物后的抑菌曲線。以未接種細(xì)菌的液體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為空白。對(duì)于黑曲霉菌采用菌體干重法，添加一定量的殼聚糖溶液和衍生物溶液分別于沙氏培養(yǎng)基中，使樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%，接入黑曲霉懸浮液lmL，在28'C恒溫振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取8樣，用布氏漏斗抽濾，干燥并稱菌體干重。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體干重為縱坐標(biāo)，繪制霉菌的生長(zhǎng)曲線和相同菌種在加入殼聚糖或衍生物后的抑菌曲線。所得到的殼聚糖和對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑制作用曲線如圖4、圖5和圖6。圖4和圖5分別為殼聚糖和產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用曲線。從圖中可知?dú)ぞ厶呛蛯?duì)氨基苯甲酰殼聚糖的存在顯著地抑制了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)4h后便開(kāi)始繁殖，吸光度增大，當(dāng)添加殼聚糖后，生長(zhǎng)適應(yīng)期均延長(zhǎng)為8h;當(dāng)添加對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖后，40h內(nèi)培養(yǎng)基中的菌生長(zhǎng)被抑制在一個(gè)較低水平，起到了很好的抑制作用。表明殼聚糖和對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均具有抑制作用，且對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的抑菌效果優(yōu)于殼聚糖。圖6為殼聚糖和對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的抑制作用曲線。殼聚糖對(duì)黑曲霉不僅沒(méi)有抑制作用，反而有助于其生長(zhǎng)。原因可能是黑曲霉屬于真菌類，真菌的細(xì)胞壁含有殼聚糖，而黑曲霉中就有較高的殼聚糖含量，使得黑曲霉對(duì)殼聚糖的抗菌性能有一定的抗性，決定了殼聚糖對(duì)黑曲霉沒(méi)有抑制能力，反而可能用于促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖。添加對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖后，黑曲霉的菌體干重比對(duì)照組有所減少，說(shuō)明產(chǎn)物可以有效地抑制黑曲霉的生長(zhǎng)，擴(kuò)大了殼聚糖的抑菌范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒(méi)有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖，其特征在于該衍生物具有下式所示結(jié)構(gòu)其中，n在160-180之間。2、一種如權(quán)利要求l所述對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的制備步驟如下(1)將稱量的對(duì)氨基苯甲酸溶于50-65'C蒸餾水中，熱抽濾；(2)濾液冷卻到室溫，在室溫下抽濾；(3)取濾餅，真空干燥，得到純凈的對(duì)氨基苯甲酸；(4)取純凈的對(duì)氨基苯甲酸放入到三頸瓶中，加入無(wú)水乙醚使對(duì)氨基苯甲酸完全溶解，再加入氯化亞砜，放入到水溫為20-40'C的超聲波洗滌器中，超聲波振蕩10-60分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物為對(duì)氨基苯甲酰氯；(5)冷卻(4)步的反應(yīng)產(chǎn)物到0-3(TC，將殼聚糖溶于無(wú)水乙酸中，再將其加入三頸瓶中，在5-45'C下超聲波振蕩1-3.5小時(shí)，靜置過(guò)夜；(6)將(5)步的反應(yīng)產(chǎn)物加入丙酮直至產(chǎn)物對(duì)氨基苯甲?；鶜ぞ厶浅恋沓鰜?lái)，抽濾；(7)再用無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚的混合溶劑浸泡12-24小時(shí)后，抽濾，取濾餅；(8)再將(7)步的該濾餅用丙酮進(jìn)行索氏提取24-30小時(shí)，真空干燥后得對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖產(chǎn)物。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的(l)步中抽濾的工藝條件是用濾瓶和布氏漏斗在50-65。C烘箱中烘1-3小時(shí)，再在50-65'C下用水泵抽濾反應(yīng)液，抽濾結(jié)束后，迅速把濾液倒入到干凈的燒杯中；(2)、(6)和W步中抽濾的工藝條件都是用濾瓶和布氏漏斗在50-65。C烘箱中烘l-3小時(shí)，再在室溫下用水泵抽濾反應(yīng)液，抽濾結(jié)束后，迅速把濾液倒入到干凈的燒杯中。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的對(duì)氨基苯甲酸氯化亞砜殼聚糖的投料重量比為(l-5):(3-9):l。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的(7)步的無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚的體積比為1:(1-10)。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的(8)步的索氏提取的工藝條件為55-65'C水浴加熱，提取24-30小時(shí)。7、根據(jù)權(quán)利要求2所述對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的(8)步的真空干燥的工藝條件為30-5(TC下，真空度為8xlO"Pa，干燥12-24小時(shí)。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖作為制備食品防腐添加劑的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖及其制備方法，其結(jié)構(gòu)如右所示，其中，n在160-180之間，在殼聚糖分子鏈上引入對(duì)氨基苯甲酰結(jié)構(gòu)后，該化合物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的最低抑菌濃度分別達(dá)到0.1％，0.1％和1％。該化合物的物化指標(biāo)淺黃色粉末狀固體，溶于水和乙二醇，分子量為45-50KD。對(duì)氨基苯甲酰殼聚糖增強(qiáng)了殼聚糖的抗菌活性，且擴(kuò)大了殼聚糖的抗菌范圍，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉具有良好的抗菌活性，可作為制備食品中抗菌防腐添加劑的應(yīng)用。文檔編號(hào)C08B37/08GK101649005SQ200910018199公開(kāi)日2010年2月17日申請(qǐng)日期2009年9月9日優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日發(fā)明者王江濤,金曉曉申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)