專利名稱：多核苷酸測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定多核苷酸序列的方法。
背景技術(shù)：
正如繪制編碼人類基因組DNA的30億個(gè)堿基圖譜的人類基因組計(jì)劃所展現(xiàn)出的，測(cè)定多核苷酸序列的能力具有極為重要的科學(xué)意義。
在大規(guī)模DNA測(cè)序中普遍使用的基本方法是鏈終止法。這一方法最初由Sanger和Coulson發(fā)展起來(Sanger等，Proc.Natl.Aacd.Sci.USA，1977；745463-5467)，該方法依賴于使用四種三磷酸核苷的雙脫氧衍生物，這些衍生物在聚合酶反應(yīng)中摻入到新生多核苷酸鏈中。一旦摻入，雙脫氧衍生物就會(huì)終止聚合酶反應(yīng)，用凝膠電泳將產(chǎn)物分離并加以分析，以揭示特定雙脫氧衍生物在鏈中摻入的位置。
盡管這種方法得到廣泛應(yīng)用，而且能產(chǎn)生可靠的結(jié)果，但還是被認(rèn)為速度慢，勞動(dòng)強(qiáng)度大以及費(fèi)用昂貴。
熒光標(biāo)記已被用于在聚合酶反應(yīng)中識(shí)別增長的新生多核苷酸鏈中核苷酸的摻入(WO91/06678)。但是這些技術(shù)有一個(gè)缺點(diǎn)，即由熒光團(tuán)所引起的背景干擾的增加。隨著DNA分子的增長，背景″噪音″也會(huì)增加，檢測(cè)每個(gè)核苷酸摻入情況所需的時(shí)間也需要增加。這嚴(yán)重限制了這種方法在大分子核苷酸測(cè)序中的應(yīng)用?；跓晒馊玖系亩嗪塑账釡y(cè)序系統(tǒng)的最大限制在于光褪色的問題。
光褪色是一種已被廣泛報(bào)道的存在于熒光染料系統(tǒng)中的現(xiàn)象，其為將染料暴露于激發(fā)波長時(shí)所導(dǎo)致的結(jié)果。所有的染料系統(tǒng)在發(fā)生光褪色前都能吸收有限數(shù)量的光子。一旦光褪色發(fā)生熒光染料就不能再被觀測(cè)到，因此如果其結(jié)合了一個(gè)分子，則該分子也就不能被檢測(cè)到。
因此就有必要有一種改進(jìn)的用于測(cè)定多核苷酸序列的方法，這種方法能極大地增高檢測(cè)多核苷酸的速率以及片段大小，而且優(yōu)選的不依靠對(duì)核苷酸的熒光標(biāo)記。而且該方法可由自動(dòng)化進(jìn)程來執(zhí)行，從而減少了與現(xiàn)存方法相聯(lián)的復(fù)雜性和成本。
發(fā)明概述本發(fā)明基于如下認(rèn)識(shí)當(dāng)多核苷酸加工酶結(jié)合并且沿著靶多核苷酸推移時(shí)，酶的構(gòu)象和/或質(zhì)量和/或能量分布會(huì)發(fā)生變化，這一變化可以通過使用非線性光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，包括基于二次或三次諧波生成的非線性光學(xué)成像技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，測(cè)定多核苷酸序列的方法包括以下步驟(i)在足以誘導(dǎo)酶活性的條件下，將靶多核苷酸與固定在一固定位置上的多核苷酸加工酶相接觸；和(ii)檢測(cè)所述酶與多核苷酸相互作用的效果，所述效果用非線性光學(xué)信號(hào)或線性信號(hào)聯(lián)合非線性信號(hào)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明具有很多優(yōu)點(diǎn)。測(cè)序只要少量的多核苷酸就可以進(jìn)行，且可以測(cè)得單鏈多核苷酸分子，而且可以消除在開始測(cè)序前的擴(kuò)增需求。可獲得長的序列讀取長度，而且可以最低限度地考慮二級(jí)結(jié)構(gòu)。獲得長的讀取長度就不再需要經(jīng)過計(jì)算對(duì)大量片段的重新組裝。另外，由于本發(fā)明不依賴熒光標(biāo)記的核苷酸或任何測(cè)量熒光的步驟，因此可以克服由于存在光褪色現(xiàn)象或其他不可預(yù)測(cè)的熒光效應(yīng)所導(dǎo)致在單分子水平上的讀取長度的限制。本發(fā)明同樣允許用同一酶系統(tǒng)順序地讀取長多核苷酸片段。這樣就具有如下優(yōu)點(diǎn)，即允許在測(cè)定眾多不同的多核苷酸模板序列時(shí)，單一酶系統(tǒng)可再生和重復(fù)使用。最后，使用不會(huì)帶來光損失和光褪色效應(yīng)的二次或三次諧波生成具備很多優(yōu)點(diǎn)，這要?dú)w功于即使在焦平面上光化學(xué)反應(yīng)也不會(huì)發(fā)生，這是因?yàn)橛煞枪舱裥陨渚€所激發(fā)的信號(hào)并不包含有限壽命的激活狀態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)發(fā)面，固體支持材料包括至少一種聚合酶和至少一種定位于聚合酶上或接近聚合酶的位置的偶極分子。
根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)發(fā)面，一種為測(cè)定非線形光學(xué)信號(hào)而建立的成像系統(tǒng)包括固體支持物，其上固定有一種與多核苷酸相互作用的酶，和一種定位于酶上或接近酶的位置的偶極分子。


參考所附的附圖來描述本發(fā)明，其中圖1.一種使用二次諧波生成的成像系統(tǒng)的示意圖。
圖2.顯示特定核苷酸摻入時(shí)源自聚合酶的二次諧波生成。
發(fā)明詳述本發(fā)明使用常規(guī)的非線性光學(xué)檢測(cè)方法來確定，當(dāng)多核苷酸加工酶與靶多核苷酸上的單個(gè)堿基發(fā)生相互作用或當(dāng)新生多核苷酸分子整合核苷酸時(shí)，酶的構(gòu)象和/或質(zhì)量和/或能量分布所發(fā)生的變化。
使用非線性光學(xué)方法對(duì)分子進(jìn)行成像的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。但在使用不可移動(dòng)的或固定的酶時(shí)，這些方法能被應(yīng)用于多核苷酸測(cè)序的方面則是未知的。
在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施例中，除了非線性信號(hào)還生成了線性信號(hào)，且該線性信號(hào)亦被檢測(cè)。這兩種信號(hào)的聯(lián)合結(jié)果可以增強(qiáng)檢測(cè)效果。
這里使用的術(shù)語″多核苷酸″應(yīng)以廣義解釋，包括DNA和RNA，包括修飾的DNA和RNA，DNA/RNA雜交分子，以及其他雜交的核酸樣分子如肽核酸(PNA)。
這里使用的術(shù)語″多核苷酸加工酶″應(yīng)以廣義解釋，涉及任何能與多核苷酸相互作用并能沿著多核苷酸連續(xù)移動(dòng)的酶。該酶優(yōu)選為聚合酶，而且可以是任何已知的類型。例如，聚合酶可以是任何DNA依賴的DNA聚合酶。如果靶多核苷酸是RNA分子，則聚合酶可以是RNA依賴的DNA聚合酶，即逆轉(zhuǎn)錄酶，或RNA依賴的RNA聚合酶，即RNA復(fù)制酶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合酶為T4聚合酶。在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合酶為大腸桿菌(E.Coli)III型聚合酶全酶(McHenry，Ann.Rev.Biochem.，1988；57519)；T7聚合酶(Schwager等.，Methods in Molecular and CellularBiology，1989/90；1(4)155-159)，或復(fù)合有大腸桿菌硫氧還蛋白的噬菌體T7基因5聚合酶(Tabor等，J.Biol.Chem.，1987；2621612-1623)。每種聚合酶都能以高的加工能力(和忠實(shí)度)與靶多核苷酸結(jié)合，并因此甚至能在未發(fā)生有效聚合的時(shí)候，維持聚合酶-多核苷酸復(fù)合體。
能與多核苷酸相互作用的可選擇性酶包括解旋酶、引發(fā)酶、全酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶或促旋酶。這些酶能提供更多的優(yōu)點(diǎn)。例如，使用解旋酶可以減低存在于多核苷酸分子內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)所引發(fā)的問題，因?yàn)榻庑概c其遭遇即可克服這些在自然環(huán)境里存在的結(jié)構(gòu)。第二，解旋酶能夠支持室溫條件下雙鏈DNA的必需反應(yīng)。
當(dāng)酶與多核苷酸上的連續(xù)堿基相作用時(shí)，該酶的構(gòu)象將會(huì)發(fā)生變化，該變化依賴于與其相接觸的靶點(diǎn)上的堿基(或核苷酸)。這樣，反應(yīng)過程中堿基對(duì)增加的實(shí)時(shí)次序就可以在核酸單分子上進(jìn)行檢測(cè)，也就是說，待測(cè)模板多核苷酸上的酶系統(tǒng)活性可被實(shí)時(shí)地跟蹤。通過鑒別借助酶催化活性而摻入靶多核苷酸增長的互補(bǔ)鏈中的堿基(核苷酸)，即可推斷出序列。
本發(fā)明的一種重要方面為將酶固定于一個(gè)相對(duì)成像系統(tǒng)固定的位置上。優(yōu)選的將酶固定在一個(gè)固體支持物上，而同時(shí)保持其活性。將適當(dāng)?shù)拿腹潭ㄔ诠腆w支持物的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。例如，WO-A-99/05315中詳細(xì)描述了將聚合酶固定在固體支持物上的方法。將蛋白固定在支持物上的一般方法即為適用的。
本發(fā)明中使用的光學(xué)檢測(cè)方法是要在單分子水平上成像的，即產(chǎn)生針對(duì)一個(gè)酶的清楚的影象/信號(hào)。多個(gè)酶也能以允許單酶分辨率的密度固定在固體支持物上。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，即有多個(gè)酶固定在固體支持物上，而且本發(fā)明的方法可由這些酶同時(shí)實(shí)施。這就允許不同的多核苷酸分子一齊進(jìn)行測(cè)序。
對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，在適于促進(jìn)酶活性的條件下實(shí)施成像方法是顯而易見的。例如，關(guān)于聚合酶，進(jìn)行聚合酶反應(yīng)必須的其他組分也是需要的，這一點(diǎn)是顯而易見的。在這一實(shí)施例中，多核苷酸引物分子和每種三磷酸核苷dATP，dTTP，dCTP，dGTP即為所需要的。三磷酸核苷可以順序的加入，且要在加入下一種三磷酸核苷之前去掉那些未結(jié)合的核苷酸。選擇性地，所有三磷酸核苷也可以在同一時(shí)間加入。優(yōu)選使用具有一個(gè)或更多保護(hù)基團(tuán)的三磷酸核苷，其中保護(hù)基團(tuán)以用脈沖調(diào)制的單色光來選擇地將其去除，從而避免非控制性的結(jié)合。WO-A-99/05315中已經(jīng)披露了適用的保護(hù)的三磷酸核苷。
高分辨率的非線性信號(hào)成像系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的。通常，對(duì)物質(zhì)的非線性極化可以表示為P＝X(1)E1+X(2)E2+X(3)E3+.....
其中P代表誘導(dǎo)的極化，X(n)代表n次非線性易感性，E為電場(chǎng)矢量。第一項(xiàng)描述了正常吸收和光反射；第二項(xiàng)描述了二次諧波生成(SHG)，和頻和差頻產(chǎn)生；第三項(xiàng)描述了光散射，激發(fā)的拉曼過程，三次諧波生成，以及二光子和三光子的吸收。
本發(fā)明優(yōu)選的成像系統(tǒng)依賴于檢測(cè)二次或三次諧波生成所產(chǎn)生的信號(hào)。
使用二次或三次諧波生成(下文稱做SHG)的單分子方案是本領(lǐng)域所熟知的(Peleg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999；956700-6704和Peleg等，Bioimaging，1996；4215-224)。
成像系統(tǒng)的一般結(jié)構(gòu)已經(jīng)在Peleg等，1996，supra中進(jìn)行了描述，圖1中給出示意。參照?qǐng)D1，激光(1)作為照射源，產(chǎn)生的激光束隨即通過偏光器(2)。激光束的一部分可直接通過非線性晶體(3)從而產(chǎn)生綠色光束以輔助校正激光束。光敏二極管(4)置于接近于光路的位置，以便提供監(jiān)測(cè)生成的近紅外強(qiáng)度的手段。濾光器(5)被置于顯微鏡的進(jìn)口端前方，以阻止任何二次諧波進(jìn)入顯微鏡。激光束被聚焦于包含固定化酶的固體支持物上，非線性信號(hào)被透鏡(7)收集后用單色儀(8)進(jìn)行檢測(cè)。用IR濾光器屏蔽基本強(qiáng)度。信號(hào)通過光電倍增器被放大，使用脈沖平均器(boxcar averager)和信道綜合器(9)進(jìn)行平均和總合。隨后將產(chǎn)生的信號(hào)傳送入計(jì)算機(jī)(10)以產(chǎn)生影象。
為了生成二次或三次諧波，需要在固定化酶上或其附近放置合適的標(biāo)記。高度偶極分子適用于此目的(Lewis等.Chem.Phys.，1999；245133-144)。一個(gè)合適分子的例子為染料，特別是苯乙烯基染料(例如膜染色劑JPW1259-由Molecular Probes提供)。綠色熒光蛋白(GFP)是″染料″或″標(biāo)記″的另一個(gè)例子，其可以用于通過SHG成像。在這里使用時(shí)，GFP不但指野生型蛋白而且也指譜移的突變體(Tsien，Ann.Rev.Biochem.，1998；67509和US5,777,079和US5,625,048)。其他適用的染色劑包括di-4-ANEPPS，di-8-ANEPPS和JPW2080(Molecular Probes)。
偶極分子可被定位于多核苷酸(或其互補(bǔ)體，如果該偶極分子連接于三磷酸核苷和被用于聚合酶反應(yīng)中)的單個(gè)堿基上。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，酶，例如聚合酶，與GFP制備成重組融合體。GFP可被定位于酶的N-末端或C-末端(如果聚合酶欲與″滑動(dòng)鉗″綴合使用，則最好定位于C末端)?？蛇x擇的，只要酶活性可被保留，GFP則可定位于酶內(nèi)任何位置上。
本發(fā)明一個(gè)獨(dú)立實(shí)施例中，非線性光學(xué)成像系統(tǒng)為拉曼光譜法或表面增強(qiáng)的拉曼光譜法(SERS)，對(duì)拉曼光譜法的概述可以從McGlip，Progress in Surface Science，1995；49(1)1-106中獲得。
用于激發(fā)拉曼系統(tǒng)的光學(xué)輻射優(yōu)選為近紅外輻射(NIR)。NIR激發(fā)具有降低周圍介質(zhì)或溶劑中的熒光和拉曼信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明一個(gè)獨(dú)立實(shí)施例中，非線性信號(hào)可用金屬納米粒子和/或粗糙化的金屬表面予以加強(qiáng)(Boyed等，Phys.Rev.，1984；B.30519-526，Chen等，phys.Rev.Lett.1981；461010-1012和Peleg等，1996，同上)。一個(gè)信號(hào)增強(qiáng)型金屬納米粒子可被綴合在酶上(例如納米粒子綴合抗體，Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1999；966700-6704)，固定在固定化/定位化的酶附近或被帶至非常接近SHG染色劑/酶的位置。
金屬納米粒子增強(qiáng)與來自納米級(jí)區(qū)域的SHG相關(guān)的光譜成像，因此就允許在單分子水平上改進(jìn)成像?；诶⑸涞墓庾V成像也能夠通過使用金屬納米粒子來得到改進(jìn)。適用的金屬納米粒子是本領(lǐng)域所熟知的，包括金和銀納米粒子。該納米粒子的直徑為5nm至100nm，優(yōu)選為10nm至60nm。該納米粒子可被連接于多核苷酸上(或其互補(bǔ)體，如果該納米粒子連接于三磷酸核苷和被用于聚合酶反應(yīng)中)。
粗糙化金屬表面同樣可以改進(jìn)SHG進(jìn)程的靈敏度(Chen等，1981，同上，和Peleg等，1996，同上)，而且也是SERS所必需的。金屬表面通常為銀或其他貴金屬。金屬表面以次波長空間分辨率進(jìn)行的初次選擇性修飾可以用多種技術(shù)來實(shí)施，包括使用原子力顯微技術(shù)(atomicforce microscopy)(AFM)。涂覆鉑的AFM針尖，可被用于催化疊氮化物末端到氨基基團(tuán)的氫化，該氨基基團(tuán)適合于進(jìn)一步的衍生化反應(yīng)(Muller等.，Science，1995；268272-273)。酶可被置于“熱點(diǎn)(hotspot)”內(nèi)，其中大量局域場(chǎng)存在于光模(optical mode)局域化的區(qū)域內(nèi)(Scalaev等.Phys.Rep.，1996；27261)。
本發(fā)明一個(gè)獨(dú)立實(shí)施例中，納米粒子可用AFM懸臂針尖端/探針帶至非常接近酶的位置，從而增強(qiáng)非線性信號(hào)。
AFM最近被認(rèn)為具有可應(yīng)用于蛋白構(gòu)象改變動(dòng)力學(xué)成象的時(shí)間分辨率和靈敏度(Rousso等，J.Struc.Biol.，1997；119158-164)。這被應(yīng)用于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，其中AFM探針/尖端被定位于酶上，聯(lián)合非線性光學(xué)信息(如SHG)，其被用于檢測(cè)當(dāng)酶沿著靶多核苷酸移動(dòng)時(shí)，由于酶和所述核苷酸序列的相互作用而導(dǎo)致的蛋白構(gòu)象變化。該信息可以用光學(xué)系統(tǒng)在遠(yuǎn)場(chǎng)收集，或者，如果與全部內(nèi)部反射(totalinternal reflection)聯(lián)用，也可以用反射方式收集。
在更進(jìn)一步的實(shí)施例中，非線性信號(hào)(例如SHG)可以用近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微技術(shù)(Near-Field Scanning Optical Microscopy)(NSOM)在近場(chǎng)進(jìn)行監(jiān)控。NSOM是一種掃描探針顯微技術(shù)，其利用納米針頭(如在AFM中所用的)和樣本之間的光學(xué)交互作用以獲取空間分辨光學(xué)信息。近場(chǎng)光學(xué)顯微技術(shù)與SHG的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)得到廣泛的研究，而且已經(jīng)顯示出具有原子水平上的表面敏感性(McGilp，1995，同上)。使用NSOM作為成像系統(tǒng)一個(gè)組成部分的主要優(yōu)點(diǎn)在于，其可以允許分辨率被大幅增至次波長尺度。因?yàn)楸景l(fā)明涉及監(jiān)控單個(gè)酶(如聚合酶)與多核苷酸相互作用時(shí)的構(gòu)象，故次波長空間分辨率是非常需要的。在本發(fā)明的關(guān)于此方面的描述中，AFM懸臂尖端被用做無孔近場(chǎng)掃描顯微鏡是優(yōu)選的(Sangohdar等，J.Opt.APure Appl.Opt.，1999；523-530)。類似的，可以使用金屬納米粒子作為局域場(chǎng)增強(qiáng)源。優(yōu)選的，針頭由貴重金屬或其他任何能夠增強(qiáng)局域電磁場(chǎng)的金屬所制備，或涂覆?？蛇x擇的，金屬納米粒子可以直接連接至懸臂尖端上。已有報(bào)道顯示其可以應(yīng)用于監(jiān)控單分子水平的構(gòu)象變化(Rousso等，同上)。
在本發(fā)明另一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施例中，一個(gè)獨(dú)立生成的表面等離子(Surface plasmon)(或偏振子)/倏逝波場(chǎng)(evanescent field)可被用于增強(qiáng)非線性信號(hào)的信噪比。該倏逝波(evanescent wave)增強(qiáng)的成像技術(shù)比其他如SHG單獨(dú)成像技術(shù)有更高的信噪比。在這一實(shí)施例中，來自標(biāo)記酶的倏逝增強(qiáng)的SHG場(chǎng)信號(hào)可以用一NSOM纖維在同時(shí)獲得AFM構(gòu)象信息數(shù)據(jù)時(shí)于近場(chǎng)采集，同時(shí)，可以監(jiān)測(cè)吸收的倏逝輻射以獲得在倏逝波場(chǎng)和標(biāo)記聚合酶/SHG場(chǎng)之間的聯(lián)合量的信息。
在這一方面(NSOM采集模式)中，系統(tǒng)即作為光子掃描隧道顯微鏡(PSTM)，且倏逝波場(chǎng)或表面等離子場(chǎng)被偶合至NSOM纖維探針尖端。任何通過聚合酶對(duì)到達(dá)探針尖端的信號(hào)的場(chǎng)強(qiáng)度的減弱都將借助定位于探針尖末端的探測(cè)器被監(jiān)測(cè)到。
表面等離子共振(Surface plasmon resonance)是本領(lǐng)域中熟知的，其依賴于使用一入射光照射入棱鏡所產(chǎn)生的倏逝波。這一實(shí)施例中這一應(yīng)用的典型裝置包括棱鏡以及與之光學(xué)耦聯(lián)的以金屬涂層的玻片，玻片上固定有酶。該玻片是微流流體室系統(tǒng)的一個(gè)組成部分，具有一個(gè)入口以導(dǎo)入配體(核苷酸)至固定的酶上。所述酶也被標(biāo)記以便產(chǎn)生非線性效應(yīng)。入射光束作用于棱鏡以產(chǎn)生表面等離子場(chǎng)。同時(shí)，通過以下方式產(chǎn)生了非線性信號(hào)(如二次諧波場(chǎng))，即，將脈沖調(diào)制的近紅外激光通過偏光器和半波偏振片，進(jìn)入光學(xué)掃描器，該光學(xué)掃描器通過濾片控制光束，從而消除光學(xué)二次諧波噪音，然后激光進(jìn)入樣品。使用透鏡和濾光器采集非線性信號(hào)并將其送入單色器，再進(jìn)入檢測(cè)用的光電倍增管，將信號(hào)放大并記錄在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中。
當(dāng)非線性光學(xué)信號(hào)與那些產(chǎn)生倏逝波場(chǎng)的相偶合時(shí)，被檢測(cè)的信號(hào)也可以是線性的(倏逝)信號(hào)。在這一實(shí)施例中，NSOM可用于采集線性信號(hào)。
在本發(fā)明一個(gè)獨(dú)立的方面，多核苷酸測(cè)序可以在細(xì)胞內(nèi)實(shí)施。
已經(jīng)證明，在其天然細(xì)胞環(huán)境中，DNA聚合酶以及與其關(guān)聯(lián)的復(fù)制復(fù)合體被錨定(或被局域化)在胞內(nèi)適當(dāng)?shù)奈恢蒙?Newport等，Curr.Opin.Cell Biol.，1996；8365；和Lemon等.，Science，1998；2821516-1519)。這一天然錨定的復(fù)制復(fù)合體即類似于固定在固體支持物上的酶。
這就允許在活體內(nèi)的單分子水平上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)在DNA復(fù)制和/或細(xì)胞分裂期間發(fā)生的復(fù)制體相關(guān)分子構(gòu)象的變化和模板序列相關(guān)的變化。
為了實(shí)施這一內(nèi)容，就需要修飾酶以便可以使用非線性光學(xué)檢測(cè)技術(shù)予以成像。這種修飾可以通過將酶和，如綠色熒光蛋白(GFP)進(jìn)行基因融合的方式完成。為了能夠進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞也應(yīng)被固定。
表達(dá)的融合蛋白可借助非線性光學(xué)檢測(cè)方法(二次諧波生成)在其錨定的細(xì)胞內(nèi)位置上得到監(jiān)測(cè)/檢測(cè)。
下列實(shí)施例解釋本發(fā)明在本實(shí)驗(yàn)中，借助本領(lǐng)域內(nèi)熟知的重組技術(shù)來制備綠色熒光蛋白(GFP)和聚合酶的融合蛋白。
石英芯片(直徑14mm，厚度0.3mm)旋轉(zhuǎn)涂以一層50nm厚的金，然后涂以一層平面葡聚糖。這些覆金石英芯片隨即置于傳統(tǒng)近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微鏡(NSOM)的流體室中。該覆金石英芯片可借助指標(biāo)機(jī)油(index matching oil)與石英棱鏡完成光耦合。流體室隨即被密封，然后使聚合酶緩沖液流過芯片。
將聚合酶固定在芯片表面可以根據(jù)記載于Jonsson等.，Biotechniques，1991；11620-627中的內(nèi)容來實(shí)施。芯片環(huán)境用操作緩沖液(10mM hepes，10mM MgCl2，150mM NaCl，0.05％表面活性劑P20，pH7.4)進(jìn)行平衡。將等量的N-羥基琥珀酰亞胺(0.1M水溶)和N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)(0.1M水溶)混合在一起，然后經(jīng)注射越過芯片的表面以激活羧甲基葡聚糖。聚合酶-GFP融合蛋白(150μl)與10mM醋酸鈉(100μl，pH5)混合經(jīng)注射越過被激活的芯片表面。最后，將芯片表面上的殘留N-羥基琥珀酰亞胺與乙醇胺(35μl，1M水溶，pH8.5)反應(yīng)，未結(jié)合的聚合酶就從芯片表面被洗脫掉。固定步驟于25℃使用連續(xù)的操作緩沖液流(5μl/min)完成。
50μl抗體結(jié)合緩沖液(10mM MES pH6.0，150mM NaCl，3mM EDTA)于25℃流過在芯片表面固定的聚合酶/GFP，流速為5μl/min。一抗(GFP(B-2)B生物素綴合200μl ml-1，Santa Cruz Biotechnology)用抗體結(jié)合緩沖液稀釋為1∶3000，繼而以5μl/min的流速流經(jīng)芯片表面30分鐘。然后用抗體結(jié)合緩沖液以5μl/min的流速流經(jīng)芯片表面30分鐘以洗脫掉多余的抗體。
二抗(免疫金綴合EM山羊抗小鼠IgG(H+L)40nm，British BiocellInternational)用抗體結(jié)合緩沖液稀釋為1∶1000，繼而以5μl/min的流速流經(jīng)芯片表面30分鐘。然后用抗體結(jié)合緩沖液以5μl/min的流速流經(jīng)芯片表面30分鐘以洗脫掉多余的抗體。該緩沖液隨即返回至操作緩沖液，其將在開始下一步驟前以5μl/min的流速流經(jīng)芯片表面30分鐘。
使用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺生化方法合成兩個(gè)寡核苷酸。示于SEQ IDNO.1中的寡核苷酸被用作靶多核苷酸，示于SEQ ID NO.2中的寡核苷酸被用作引物。
SEQ ID NO.1CAAGGAGAGGACGCTGCTTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAGSEQ ID NO.2CTCTCCCTTCTCTCGTC該兩個(gè)寡核苷酸于雜交條件下反應(yīng)以獲得靶序列-引物復(fù)合物。該引物化的DNA隨即懸浮于包含150μl能形成圍繞引物DNA的滑動(dòng)鉗的β亞基的緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.5，8mM MgCl2，4％(v/v)甘油，5mM二硫蘇糖醇(DDT))。這一過程一般被稱為預(yù)初始化(pre-initiation)。
為檢測(cè)聚合酶的構(gòu)象變化，一種使用牽拉石英多模態(tài)100μm長的纖維懸臂的修飾的NSOM被用于分支模式(tapping mode)。所述懸臂被驅(qū)動(dòng)至接近其共振頻率，然后對(duì)包含固定化抗體的芯片表面做一個(gè)初始區(qū)域掃描。二次諧波生成借助脈沖調(diào)制的近紅外激光源的初始照射而由流體室中的固定化聚合酶產(chǎn)生。然后將NSOM探針頭掃描在流體室中的芯片表面，以獲取流體室中與聚合酶結(jié)合的40nm金粒子的影像。然后將探針頭在聚合酶上保持為靜止模式。
預(yù)初始化的前引物化復(fù)合物隨即以5μl/min的流速注入流體室中，從而使得環(huán)繞引物-模板分子的“鉗”與固定化的酶一起形成一復(fù)合物。然后使用流體室中的冷卻設(shè)備將流體室保存在25℃。
然后用操作緩沖液以500μl/min的流速連續(xù)沖洗流體室。10分鐘后將0.4mM dATP(8μl)注入500μl/min流速的緩沖液中以啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)。4分鐘后向流體室中注入0.4mM dTTP(8μl)。然后再4分鐘后注入0.4mM dGTP(8μl)，再4分鐘后注入0.4mM dCTP(8μl)。將這一循環(huán)重復(fù)10次。這一完整的時(shí)間段內(nèi)，借助多模態(tài)纖維進(jìn)行傳輸?shù)亩沃C波信號(hào)經(jīng)過單色儀而進(jìn)入光電倍增器。從光電倍增器中出來的信號(hào)被放大并被輸入計(jì)算機(jī)以備分析和存儲(chǔ)。
在每次注入開始10秒鐘期間內(nèi)的源自聚合酶復(fù)合體的二次諧波信號(hào)的強(qiáng)度改變被隨后計(jì)算出來，根據(jù)注入流體室的核苷酸而繪制圖形。測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果顯示于圖2中。從該圖中可以看出，大的強(qiáng)度改變(更大的強(qiáng)度改變說明相互毗鄰的為相同核苷酸)符合SEQ ID NO.1的互補(bǔ)序列(自右向左讀，減去與引物序列雜交的那一部分)。
序列表<110>Medical Biosystems Ltd.
<120>多核苷酸測(cè)序方法<130>REP06729WO<140>未知<141>2002-05-20<150>0112238.1<151>2001-05-18<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>1caaggagagg acgctgcttg tcgaaggtaa ggaacggacg agagaaggga gag53<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>2ctctcccttc tctcgtc1權(quán)利要求
1.一種測(cè)定多核苷酸序列的方法，該方法包括以下步驟(i)在足以誘導(dǎo)酶活性的條件下，將靶多核苷酸與固定在一固定位置上的多核苷酸加工酶相接觸；和(ii)檢測(cè)所述酶與多核苷酸相互作用的效果，其中，所述效果用非線性光學(xué)信號(hào)或線性信號(hào)聯(lián)合非線性信號(hào)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述效果用非線性信號(hào)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述非線性光學(xué)檢測(cè)方法為二次或三次諧波生成成像技術(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述非線性光學(xué)檢測(cè)方法為拉曼光譜分析或表面增強(qiáng)的拉曼光譜分析。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中將一種偶極分子定位于酶上或接近酶的位置。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述分子為苯乙烯基染料分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述分子為綠色熒光蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述偶極分子連接在多核苷酸的單個(gè)堿基上。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述酶為聚合酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶為解旋酶或引發(fā)酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中步驟(i)包括加入三磷酸核苷dATP，dTTP，dGTP和dCTP。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述三磷酸核苷包括可以被脈沖調(diào)制的單色光選擇性去除的一個(gè)或多個(gè)保護(hù)基團(tuán)。
13.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中將金屬納米粒子定位于酶上或接近酶的位置。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述納米粒子為金或銀納米粒子。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述納米粒子摻入至多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)單個(gè)堿基上。
16.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述酶被固定在固體支持物上。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中將多個(gè)酶固定在固體支持物上。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述固體支持物具有粗糙的金屬表面。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)所述的方法，其中所述支持物為金或銀。
20.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述測(cè)定用原子力顯微技術(shù)或近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微技術(shù)來完成。
21.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，還包括應(yīng)用局域化表面等離子共振。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶固定在細(xì)胞內(nèi)的固定位置上。
23.一種固體支持物質(zhì)，包括至少一種固定的聚合酶和至少一種定位于聚合酶上或接近聚合酶的位置的偶極分子。
24.一種固體支持物質(zhì)，包括固定在其上的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含固定在其內(nèi)固定位置上的聚合酶。
25.一種檢測(cè)非線形光學(xué)信號(hào)的成像系統(tǒng)裝置，包括固體支持物，其上固定有與多核苷酸相互作用的酶，和定位于酶上或接近酶的位置的偶極分子。
全文摘要
一種測(cè)定多核苷酸序列的方法，包括以下步驟(i)在足以誘導(dǎo)酶活性的條件下，將靶多核苷酸與固定在一固定位置上的多核苷酸加工酶相接觸；和(ii)檢測(cè)所述酶與多核苷酸相互作用的效果，所述效果用非線性光學(xué)信號(hào)或線性信號(hào)聯(lián)合非線性信號(hào)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK1537172SQ02810145
公開日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2002年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月18日
發(fā)明者D·H·登沙姆, D H 登沙姆 申請(qǐng)人:醫(yī)療生物系統(tǒng)有限公司