專利名稱：Torc多核苷酸和多肽以及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及某些多核苷酸和多肽、含有它們的細(xì)胞以及使用它們的方法。具體地，本發(fā)明公開了TORC多核苷酸和TORC多肽、它們的變體、TORC特異性抗體和含TORC的細(xì)胞。本發(fā)明還公開了使用TORC組合物的藥學(xué)研究方法、測定方法、診斷方法和治療方法。
背景技術(shù)：
環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件(CRE)結(jié)合蛋白(CREB)家族轉(zhuǎn)錄因子家族代表一小組蛋白質(zhì)，包括CREB1和密切相關(guān)的CREM和ATF-1蛋白。CREB1蛋白通過與存在于影響許多生物學(xué)過程的大量基因的啟動子中的cAMP應(yīng)答元件(CRE)結(jié)合來控制基因表達(dá)。CREB調(diào)節(jié)一系列靶基因，所述靶基因參與細(xì)胞生長調(diào)節(jié)和分化、代謝、發(fā)育、神經(jīng)元活性以及免疫調(diào)節(jié)(綜述于Mayr和Montminy，2001；Shaywitz和Greenberg，1999)。特別地，據(jù)認(rèn)為CREB是適應(yīng)性行為的多個關(guān)鍵信號途徑的終點(綜述參閱West等，2001和Lonze等，2002)。
基因表達(dá)的長期變化(據(jù)認(rèn)為是長期記憶的基礎(chǔ))很可能部分或大部分是通過CREB介導(dǎo)的(Bourtchuladze等，1994，Yin等，1994，參閱Tully等，2003)。人們已經(jīng)提出激活CREB介導(dǎo)的基因表達(dá)是在多種臨床環(huán)境(包括神經(jīng)變性和精神疾病)中增強(qiáng)記憶的可行方法(Tully等，2003；Jackson等，2003)。激活cAMP應(yīng)答或破壞CREB活性也已顯示能影響成癮行為(參閱Chao和Nestler 2004)和對乙醇的敏感性(Moore等，1998)。破壞小鼠CREB活性會破壞晝夜節(jié)律鐘(Gau等，2002)、增加焦慮并影響嗎啡撤除后的行為(Valverde等，2004)，這說明修飾CREB活性可能還可用于治療睡眠障礙、焦慮或成癮。
CREB調(diào)節(jié)多種促生長和抗調(diào)亡基因包括cfo、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白D1、PCNA、Bcl2以及神經(jīng)營養(yǎng)因子如BDNF。多種研究還提示神經(jīng)元的存活需要CREB活性。在小鼠中阻斷CREB和CREM導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和進(jìn)展性神經(jīng)變性(Mantamadiotis 2002；綜述參閱Lonze等2002)。因此，激活CREB可能有神經(jīng)保護(hù)作用，并在神經(jīng)變性疾病或中風(fēng)方面具有臨床益處。除了其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用以外，大量代謝調(diào)節(jié)基因在其啟動子中含有CRE位點，并且已經(jīng)顯示糖異生的限速酶PEPCK的基因受cAMP的調(diào)節(jié)。在小鼠中阻斷CREB1功能導(dǎo)致低血糖(Herzig等，2001)。CREB1還在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，因為CREB1缺陷型小鼠表現(xiàn)出有缺陷的T細(xì)胞發(fā)育(Rudolf等，1998)，并且阻斷通過CREB1的轉(zhuǎn)錄激活的CREB1異構(gòu)體ICER阻斷IL-2表達(dá)(Bodor等，2000)。已經(jīng)提出激活CREB是在多種臨床環(huán)境(包括神經(jīng)變性和精神疾病)中增強(qiáng)記憶的可行方法，并且可能起神經(jīng)保護(hù)作用(Tully等，2003)，CREB信號傳導(dǎo)還與TNFα誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移有關(guān)，所述遷移可以促進(jìn)粥樣動脈硬化斑的形成(Ono等，2004)。
申請人先前已經(jīng)公開，TORC1是磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)、雙向調(diào)節(jié)因子和趨化因子如IL-8和Exodus-1/MIPα等蛋白的有效誘導(dǎo)物，并據(jù)信通過CREB激活發(fā)揮作用(PCT專利公開WO2004/085646和Iourgenko，等2003)。TORC1和其他TORC蛋白與增強(qiáng)CREB與TFIID的TAFII130組分之間的相互作用有關(guān)(Conkright，等2003)。由此，相信本發(fā)明的TORC蛋白可作為新藥物靶標(biāo)，用于治療與啟動子區(qū)含有CRE位點的基因異常激活相關(guān)的病理病癥，以及用于治療與PEPCK、雙向調(diào)節(jié)因子和趨化因子特別是IL-8和Exodus-1/MIPα異常激活相關(guān)的病癥。這些病癥包括但不僅限于骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、病理性血管發(fā)生、糖尿病、高血壓、慢性痛和其他炎性和自身免疫疾病以及神經(jīng)退化病癥例如阿爾茨海默病、帕金森氏病和亨廷頓病。
因此仍然需要調(diào)節(jié)TORC活性。還仍然需要鑒定TORC活性候選調(diào)節(jié)劑。另外，仍然需要治療與患病的細(xì)胞或組織中異常TORC活性相關(guān)的疾病或病理病癥。本發(fā)明內(nèi)容致力于解決這些及相關(guān)需求。
發(fā)明概述本發(fā)明廣泛涉及與調(diào)節(jié)的CREB(TORC)家族物質(zhì)的傳感器相關(guān)的多核苷酸、多肽和抗體組合物以及在研究、診斷應(yīng)用和治療應(yīng)用中使用這些組合物的方法。
首先，本發(fā)明公開了確定樣品中TORC多肽的生物活性是否異常的方法，其中所述方法包括a)確定TORC多肽在樣品細(xì)胞的多種亞細(xì)胞級分中的第一分布；和b)將a)的結(jié)果與TORC多肽在一種或多種參照細(xì)胞的亞細(xì)胞級分中的第二分布比較，所述參照細(xì)胞已確定具有正常的TORC分布；由此，如果樣品細(xì)胞中TORC多肽的分布與參照細(xì)胞中TORC多肽的分布不同，則樣品細(xì)胞中TORC多肽的生物活性為異常。在該測定方法的重要實施方案中，首要亞細(xì)胞級分為細(xì)胞質(zhì)，在其他實施方案中，其次的亞細(xì)胞級分為核。在其他實施方案中，細(xì)胞為上皮細(xì)胞或腦中天然存在的細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明包括鑒定細(xì)胞中CREB啟動過程的調(diào)節(jié)劑的方法，包括將細(xì)胞與調(diào)節(jié)細(xì)胞的亞細(xì)胞區(qū)室中TORC多肽積累的物質(zhì)相接觸。在該方法的重要實施方案中，調(diào)節(jié)物質(zhì)可以是離子載體、細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的刺激劑、細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的刺激劑或蛋白激酶A活性的刺激劑。在其他重要的實施方案中，亞細(xì)胞級分可以是細(xì)胞核，或抑制劑例如親免素結(jié)合劑。在其他重要的實施方案中，細(xì)胞可以是哺乳動物細(xì)胞或上皮細(xì)胞或腦中天然存在的細(xì)胞。另外，在該方法中，細(xì)胞可以體外培養(yǎng)，或其可從受試者中離體培養(yǎng)或在受試者中體內(nèi)培養(yǎng)。
另一方面，本發(fā)明公開了調(diào)節(jié)細(xì)胞中CREB啟動的過程的方法，包括將細(xì)胞與調(diào)節(jié)細(xì)胞中TORC多肽表達(dá)的物質(zhì)接觸。在該方法的重要實施方案中，物質(zhì)可包括反義寡核苷酸、干擾寡核苷酸、微小寡核苷酸(microoligonucleotide)、三螺旋核酸、核酶、RNA適體、雙鏈或單鏈RNA、肽模擬物、含有肽模擬物編碼序列的多核苷酸、或它們中任何兩個或更多的混合物。在其他重要的實施方案中，細(xì)胞可以是哺乳動物細(xì)胞或上皮細(xì)胞，或腦中天然存在的細(xì)胞。另外在該方法的重要實施方案中，細(xì)胞可以體外培養(yǎng)，或其可從受試者中離體培養(yǎng)或在受試者中體內(nèi)培養(yǎng)。
本發(fā)明的另一方面提供了用于在受試者中基本抑制疾病或病理病癥的發(fā)展、治療或改善疾病或病理病癥的方法，所述疾病或病理病癥與細(xì)胞中CREB啟動過程的水平異常相關(guān)。該方法包括對受試者施用一種或多種治療有效劑量的物質(zhì)，所述物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞中亞細(xì)胞區(qū)的TORC多肽積累。在該療法的有利實施方案中，亞細(xì)胞區(qū)可為細(xì)胞質(zhì)，或其可以是細(xì)胞核。在其他有利的實施方案中，病理病癥可以是神經(jīng)變性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，或其可選自阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓病、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、COPD、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、糖尿病、高血壓和慢性痛。在另一有利的實施方案中，CRE調(diào)節(jié)劑改變(例如抑制或增強(qiáng))一種或多種TORC蛋白質(zhì)的活性或積累，所述TORC蛋白質(zhì)選自TORC1、TORC2或TORC3。在另一有利的實施方案中，TORC調(diào)節(jié)劑包括TORC蛋白質(zhì)的一種或多種抗體或其片段，其中所述抗體或其片段改變TORC蛋白質(zhì)的活性或積累。在另一有利的實施方案中，TORC調(diào)節(jié)劑包括TORC蛋白質(zhì)的一種或多種肽模擬物，其中所述肽模擬物改變TORC蛋白質(zhì)的活性或積累。
本發(fā)明的又一方面提供了用于在受試者中基本抑制疾病或病理病癥的發(fā)展、治療或改善疾病或病理病癥的方法，所述疾病或病理病癥與細(xì)胞中TORC相關(guān)過程的水平異常相關(guān)。該方法包括對受試者施用一種或多種治療有效劑量的物質(zhì)，所述物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞中亞細(xì)胞區(qū)的TORC多肽積累。在該療法的有利實施方案中，亞細(xì)胞區(qū)可為細(xì)胞質(zhì)，或其可以是細(xì)胞核。在其他有利的實施方案中，病理病癥可以是神經(jīng)變性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，或其可選自阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓病、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、COPD、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、糖尿病、高血壓和慢性痛。在另一有利的實施方案中，CRE調(diào)節(jié)劑改變一種或多種TORC蛋白質(zhì)的活性或積累，所述TORC蛋白質(zhì)選自TORC1、TORC2或TORC3。在另一有利的實施方案中，TORC調(diào)節(jié)劑包括TORC蛋白質(zhì)的一種或多種抗體或其片段，其中所述抗體或其片段改變TORC蛋白質(zhì)的積累。在另一有利的實施方案中，TORC調(diào)節(jié)劑包括TORC蛋白質(zhì)的一種或多種肽模擬物，其中所述肽模擬物改變TORC蛋白質(zhì)的積累。
本發(fā)明的另一方面提供了用于在受試者中基本抑制疾病或病理病癥的發(fā)展、治療或改善疾病或病理病癥的方法，所述疾病或病理病癥與細(xì)胞中TORC激活的或CREB啟動的過程的水平異常相關(guān)。該方法包括向受試者使用治療有效劑量的調(diào)節(jié)細(xì)胞中TORC多肽表達(dá)的物質(zhì)。在該療法的重要實施方案中，抑制物質(zhì)包括反義寡核苷酸、干擾寡核苷酸、微小寡核苷酸、三螺旋核酸、核酶、RNA適體、雙鏈或單鏈RNA、肽模擬物、含有肽模擬物編碼序列的多核苷酸、或它們中任何兩個或更多的混合物。在其他重要的實施方案中物質(zhì)調(diào)節(jié)選自TORC1、TORC2或TORC3中任何一種或多種TORC蛋白質(zhì)的表達(dá)。在其他重要的實施方案中，病理病癥可以是神經(jīng)變性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，或其可選自阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓病、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、COPD、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、糖尿病、高血壓和慢性痛。
本發(fā)明另一方面提供鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞中TORC相關(guān)過程活性的物質(zhì)的方法，包括a)將TORC多肽引入第一細(xì)胞和參照細(xì)胞；b)將所述第一細(xì)胞與所述物質(zhì)接觸；和c)確定與未接觸所述物質(zhì)的參照細(xì)胞中TORC多肽的生物功能相比，是否所述第一細(xì)胞中的TORC多肽生物功能受到調(diào)節(jié)；從而如果出現(xiàn)功能差異，則調(diào)節(jié)物質(zhì)得以鑒定。在該方法的重要實施方案中，生物功能包括調(diào)節(jié)多種亞細(xì)胞區(qū)室中TORC多肽的分布。在其他重要的實施方案中，首要亞細(xì)胞級分可以是細(xì)胞質(zhì)，或其次的亞細(xì)胞級分可以是細(xì)胞核。在另一重要的實施方案中，該方法還包括在步驟b)中將第一細(xì)胞與參照細(xì)胞均與調(diào)節(jié)細(xì)胞核級分中TORC多肽積累的物質(zhì)接觸；而在另一重要的實施方案中，該方法還包括在步驟b)中將第一細(xì)胞與參照細(xì)胞均與調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)級分中TORC多肽積累的物質(zhì)接觸。在另一重要的實施方案中，TORC多肽選自TORC1、TORC2或TORC3。在另一重要的實施方案中，第一細(xì)胞和參照細(xì)胞體外或離體觀察，或得自體內(nèi)模型。
本發(fā)明另一方面提供與TORC多肽免疫特異性結(jié)合的抗體。在有利的實施方案中，抗體與多肽免疫特異性結(jié)合，所述多肽的氨基酸序列如SEQID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6、或其片段所示。
本發(fā)明另一方面公開了用于測定用途、用于診斷用途以及用于研究目的的試劑盒--本發(fā)明的TORC相關(guān)組合物，其中該試劑盒在一個和多個容器中包含一種或多種選自以下的組分a)TORC多核苷酸；b)TORC融合多核苷酸；c)本文所述的TORC多肽；d)TORC融合多肽；和e)TORC抗體。
在包含多核苷酸的試劑盒的重要實施方案中，多核苷酸可包括反義寡核苷酸、干擾寡核苷酸、微小寡核苷酸、三螺旋核酸、核酶、RNA適體、雙鏈或單鏈RNA、肽模擬物、含有肽模擬物編碼序列的多核苷酸、或它們中任何兩個或更多的混合物。
本發(fā)明廣泛涉及多種測定和診斷方法。一方面本發(fā)明公開了檢測樣品中TORC多核苷酸的存在或?qū)ζ涠康姆椒ǎú襟Ea)提供含有樣品核酸的樣品；和b)檢測在樣品TORC多核苷酸的存在或?qū)ζ涠俊?br> 在該方法的重要實施方案中，樣品來自細(xì)胞的亞細(xì)胞級分。在另一重要的實施方案中，擴(kuò)增樣品核酸中包含至少一部分TORC序列的靶核苷酸序列，并且步驟b)中的檢測或定量在擴(kuò)展的靶TORC序列上進(jìn)行。在另一重要的實施方案中，擴(kuò)增包括逆轉(zhuǎn)錄或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或二者兼而有之。在另一重要的實施方案中，步驟b)中的檢測或定量包括i)細(xì)胞或亞細(xì)胞級分的熒光原位雜交，或ii)實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在其他重要的實施方案中，步驟b)中的檢測或定量包括在確保TORC多核苷酸與探針雜交的條件下，使樣品核酸與探針核酸接觸，并檢測與探針核酸雜交的TORC多核苷酸的存在或?qū)⑵涠?，所述探針核酸包括與TORC多核苷酸雜交的TORC多核苷酸。在其他重要的實施方案中，TORC多核苷酸包含標(biāo)記，且檢測或定量包括檢測或定量標(biāo)記。在該方法的其他重要的實施方案中，探針核酸與固體表面結(jié)合。
本發(fā)明另一方面公開了鑒定調(diào)節(jié)劑的方法，所述調(diào)節(jié)劑可用于在第一受試者中診斷或預(yù)測病理或者開發(fā)其治療策略，所述病理與CREB依賴性基因表達(dá)相關(guān)，該方法包括步驟a)提供來自第一受試者的包含樣品核酸的樣品，其中樣品包括TORC核苷酸序列；和b)確定是否來自第一受試者的樣品中TORC序列的量與參照樣品中TORC序列的量不同，其中參照樣品包含來自已知沒有該病狀的第二受試者的參照核酸；從而促成診斷、預(yù)測該病理或者開發(fā)其治療策略。在該方法的重要實施方案中，樣品來自細(xì)胞的亞細(xì)胞級分。另一方面，病理病癥可以是神經(jīng)變性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，或其可選自阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓病、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、COPD、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、糖尿病、高血壓和慢性痛。另一方面該方法包括比較第一樣品和參照樣品的表達(dá)基因的基因表達(dá)譜。
另一方面本發(fā)明公開了檢測樣品中TORC多肽的存在或?qū)⑵涠康姆椒ǎú襟Ea)提供懷疑含有TORC多肽的樣品；b)在確保TORC多肽與特異性結(jié)合劑結(jié)合的條件下，使多肽與結(jié)合TORC多肽的特異性結(jié)合劑接觸；和c)檢測與TORC多肽結(jié)合的特異性結(jié)合劑的存在或?qū)⑵涠俊?br> 在有利的實施方案中，樣品來自細(xì)胞的亞細(xì)胞級分。在該方法的另一有利的實施方案中，特異性結(jié)合劑包含標(biāo)記，或所述特異性結(jié)合劑與包含標(biāo)記的第二結(jié)合劑結(jié)合，其中檢測或定量包括檢測或定量標(biāo)記。在另一有利的實施方案中，特異性結(jié)合劑為抗體。
另一方面本發(fā)明公開了確定樣品中TORC多肽的量與參照樣品中TORC多肽的量是否不同的方法，其中該方法包括步驟a)提供懷疑含有TORC多肽的樣品；b)在確保TORC多肽與特異性結(jié)合劑結(jié)合的條件下，使多肽與結(jié)合TORC多肽的特異性結(jié)合劑接觸；和c)檢測在步驟b)中使用的相同條件下，與樣品結(jié)合的特異性結(jié)合劑的量和與參照結(jié)合的特異性結(jié)合劑的量是否不同，其中參照包括標(biāo)準(zhǔn)或參照量的TORC多肽。
在該方法的重要實施方案中，樣品來自細(xì)胞的亞細(xì)胞級分。在其他重要的實施方案中，樣品由人提供而參照樣品由人提供，或樣品由哺乳動物提供而參照由相同物種的哺乳動物提供。在該方法的另一重要的實施方案中，特異性結(jié)合劑包含標(biāo)記，或特異性結(jié)合劑與包含標(biāo)記的第二結(jié)合劑結(jié)合，其中檢測或定量包括檢測或定量標(biāo)記。在另一重要的實施方案中，特異性結(jié)合劑為抗體。
另一方面本發(fā)明公開了在第一受試者中促成診斷或預(yù)后疾病或病理，或開發(fā)其治療策略的方法，其中在該病理中TORC多肽的亞細(xì)胞定位已知與非病理狀態(tài)下TORC多肽的亞細(xì)胞定位不同，該方法包括步驟a)提供來自第一受試者的懷疑包含TORC多肽的樣品；b)在確保TORC多肽與特異性結(jié)合劑結(jié)合的條件下，使樣品與結(jié)合本文所述TORC多肽的特異性結(jié)合劑接觸；和c)檢測在步驟b)中使用的相同條件下，與樣品結(jié)合的特異性結(jié)合劑的量和與參照結(jié)合的特異性結(jié)合劑的量是否不同，其中參照由已知不具有該病理的第二受試者提供；從而促成診斷、預(yù)后該病理或發(fā)展其治療策略。在該方法的重要實施方案中，樣品來自細(xì)胞的亞細(xì)胞級分。在其他重要的實施方案中，病理病癥可以是神經(jīng)變性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，或其可選自阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓病、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、COPD、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、糖尿病、高血壓和慢性痛。在其他重要的實施方案中，樣品由人提供而參照樣品由人提供，或樣品由哺乳動物提供而參照由相同物種的哺乳動物提供。在該方法的另一重要的實施方案中，特異性結(jié)合劑包含標(biāo)記，或特異性結(jié)合劑與包含標(biāo)記的第二結(jié)合劑結(jié)合，其中檢測或定量包括檢測或定量標(biāo)記。在另一重要的實施方案中，特異性結(jié)合劑為抗體。
附圖簡述

圖1.使用熒光顯微術(shù)對瞬間轉(zhuǎn)染熒光TORC蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位圖。圖A-D，HeLa細(xì)胞。圖E-H，HEK293細(xì)胞。
圖2.使用熒光顯微術(shù)成像的轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中TORC2-eGFP(圖A)和TORC3-eGFP(圖B)的亞細(xì)胞定位圖。
圖3.HeLa細(xì)胞TORC1轉(zhuǎn)運篩選的結(jié)果圖。各MCG全長cDNA集合克隆(菱形點)均標(biāo)繪了胞核-胞質(zhì)熒光差異。細(xì)霉素B包含在每個平板中作為TORC轉(zhuǎn)運(x點)的陽性對照。標(biāo)示了含有TRPV6和PKA的陽性克隆。
圖4.顯微術(shù)成像用空表達(dá)載體pCMV-SPORT6(圖A)或含有TRPV6(B圖)或PKA(C圖)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中TORC1-eGFP的定位圖。最初遞交的上面一組圖A-C為彩色的。下面一組圖A-C通過使用計算機(jī)將彩色圖轉(zhuǎn)化為灰度圖像制作。
圖5.通過熒光顯微術(shù)獲得的HeLa細(xì)胞中應(yīng)答cAMP信號傳導(dǎo)的熒光TORC融合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運圖。
圖6.通過熒光免疫組織化學(xué)(IHC)獲得的HEK293細(xì)胞中內(nèi)源TORC轉(zhuǎn)運圖和通過顯微攝影術(shù)獲得的核染色(Hoechst)圖。
圖7.使用熒光顯微術(shù)的HEK293細(xì)胞中應(yīng)答GPCR激動劑異丙腎上腺素的熒光TORC融合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運圖。
圖8.使用熒光顯微術(shù)的HeLa細(xì)胞中TORC1-eGFP融合蛋白轉(zhuǎn)運圖，所述細(xì)胞應(yīng)答鈣信號傳導(dǎo)通過神經(jīng)鈣蛋白激活穩(wěn)定表達(dá)TORC1-eGFP。
圖9.使用熒光和顯微照相術(shù)的HeLa細(xì)胞中TORC1-eGFP轉(zhuǎn)運圖，所述細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)由激活的神經(jīng)鈣蛋白誘導(dǎo)的TORC1-eGFP。上面一組圖A和B最初遞交時為彩色的。下面一組圖A和B通過計算機(jī)將彩色圖轉(zhuǎn)化為灰度圖像制作。
圖10.TRPV6激活NF-AT依賴性的熒光素酶報告基因圖。
圖11.使用熒光顯微術(shù)獲得的，響應(yīng)用幾種外源因子處理的TORC融合蛋白質(zhì)在HEK293中的轉(zhuǎn)運圖。
圖12.使用熒光顯微術(shù)獲得的，響應(yīng)紫外線照射和PMA施用的TORC1-eGFP在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運圖。
圖13.HeLa細(xì)胞中TORC1過表達(dá)對刺激依賴性CRE指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的影響圖。
圖14.HeLa細(xì)胞中鈣誘導(dǎo)的CRE驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄或NFKB驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄對TORC蛋白質(zhì)的需要圖。
圖15.處理HeLa細(xì)胞后獲得的Western印跡圖，所述細(xì)胞在引入多種物質(zhì)前用抗GFP特異性siRNA轉(zhuǎn)染或用TORC1和TORC2特異性siRNA二者共同轉(zhuǎn)染。
圖16.TORC1(1-44)-eGFP融合蛋白質(zhì)對啟動子驅(qū)動的基因表達(dá)的影響圖。
圖17.通過熒光顯微術(shù)成像，果蠅涎細(xì)胞中應(yīng)答cAMP和鈣的熒光果蠅TORC蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運圖。上面一組圖A至E最初遞交時為彩色。下面一組圖A至E通過計算機(jī)將彩色圖轉(zhuǎn)化為灰度圖像制作。
圖18.TORC1激活CREB介導(dǎo)的PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄。HeLa細(xì)胞用pGL3-basic-2kb-PGC1α-Luc，phRL-SV40(作為轉(zhuǎn)染效率的對照)與所示的多種cDNA構(gòu)建體一同轉(zhuǎn)染。裂解細(xì)胞并在轉(zhuǎn)染后48小時檢測熒光素酶活性。計算螢火蟲發(fā)光(ff)與海腎發(fā)光(RL)的比值(均值±SEM)，表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素酶，并用作PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄的指數(shù)。
圖19.TORC1異位表達(dá)促進(jìn)PGC-1α和細(xì)胞色素C表達(dá)，提示其誘導(dǎo)線粒體發(fā)生。HeLa細(xì)胞用對照慢病毒(終止或GFP)或TORC1慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。A、轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時從細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)并進(jìn)行Western印跡分析，以確定PGC-1α蛋白質(zhì)的表達(dá)。B、轉(zhuǎn)導(dǎo)后24、48和72小時從細(xì)胞中提取總RNA并進(jìn)行qPCR分析，以確定內(nèi)源PGC-1α(B)和細(xì)胞色素c(C)mRNA的表達(dá)水平。
圖20.TORC1的異位表達(dá)促進(jìn)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞呼吸。HeLa細(xì)胞用對照(終止)或TORC慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞呼吸在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時使用Clark電極測定。寡霉素和CCCP的濃度分別為2μg/ml和2μM。
圖21.TORC1、2和3激活PGC-1α基因的轉(zhuǎn)錄。HeLa細(xì)胞用pGL3-basic-2kb-PGC1-Luc，phRL-SV40(作為轉(zhuǎn)染效率的對照)與所示的多種cDNA構(gòu)建體一同轉(zhuǎn)染。裂解細(xì)胞并在轉(zhuǎn)染后48小時檢測熒光素酶活性。計算螢火蟲發(fā)光與海腎發(fā)光的比值(均值±SEM)，表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素酶活性，并用作PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄的指數(shù)。N＝6，*P＜0.05(TORC1、2、3相對于載體)。
圖22.TORC2或TORC3的異位表達(dá)促進(jìn)PGC-1α和線粒體標(biāo)志物的表達(dá)。初級肌細(xì)胞用TORC2、TORC3或GFP腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。A.轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時從細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)并進(jìn)行Western印跡分析，以確定異位TORC2和TORC3蛋白質(zhì)的表達(dá)。檢測異位TORC2和TORC3蛋白質(zhì)表達(dá)的一抗和二抗分別為V5和山羊抗兔IgG。B-C.轉(zhuǎn)導(dǎo)后24和48小時從細(xì)胞中提取總RNA并進(jìn)行qPCR分析，以確定內(nèi)源PGC-1α(B)和PGC-1α靶基因(C)，包括ERRα和線粒體標(biāo)志物、細(xì)胞色素c(CytC)、細(xì)胞色素氧化酶亞基II(CoxII)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)的表達(dá)水平。N＝3，*P＜0.05(TORC2或TORC3相對于GFP)。
圖23.TORC2或TORC3的異位表達(dá)促進(jìn)小鼠初級肌細(xì)胞中的脂肪酸氧化。初級肌細(xì)胞用TORC2、TORC3或GFP腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時進(jìn)行14C-軟脂酸氧化。N＝3，*P＜0.05。
圖24.TORC2或TORC3的異位表達(dá)促進(jìn)小鼠初級肌細(xì)胞中細(xì)胞呼吸。初級肌細(xì)胞用TORC、TORC3或GFP腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時。不加處理(本底)或用寡霉素或CCCP處理后測量細(xì)胞呼吸。N＝3，*p＜0.05(TORC相對于GFP)。
發(fā)明詳述認(rèn)為本文所述發(fā)明不限制為所述的具體方法論、流程和試劑，因為其可變化。還應(yīng)理解本文使用的命名法僅用于描述具體實施方案的目的，而不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管任何與本文所述類似或等效的方法和材料可用于實踐或檢測本發(fā)明，現(xiàn)描述了優(yōu)選的方法、設(shè)備和材料。所有本文提到的出版物引用作為參考，用于描述和公開可結(jié)合本發(fā)明使用的出版物中報道的材料和方法論。
實踐本發(fā)明要使用許多分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)眾所周知并描述于例如《Current Protocols in Molecular Biology》，第I、II和III卷，1997(F.M.Ausubel編)；Sambrook等，1989，《Molecular CloningA LaboratoryManual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.；《DNA CloningA Practical Approach》，第I和II卷，1985(D.N.Glover編)；《Oligonucleotide Synthesis》，1984(M.L. Gait編)；《NucleicAcid Hybridization》，1985，(Hames和Higgins)；《Transcription andTranslation》，1984(Hames和Higgins編)；《Animal Cell Culture》，1986(R.I.Freshney編)；《Immobilized Cells and Enzymes》，1986(IRL Press)；Perbal，1984，《A Practical Guide to Molecular Cloning》；《Methods inEnzymology》系列(Academic Press，Inc.)；《Gene Transfer Vectors forMammalian Cells》，1987(J.H.Miller和M.P. Calos編，Cold SpringHarbor Laboratory)以及《Methods in Enzymology》第154卷和第155卷(分別由Wu和Grossman以及Wu編)。
縮寫ATF激活轉(zhuǎn)錄因子cAMP環(huán)AMPCBPCREB結(jié)合蛋白CCE庫容性鈣內(nèi)流CNS中樞神經(jīng)系統(tǒng)COPD慢性阻塞性肺病CPA圓弧偶氮酸(cyclopiazonic acid)CREcAMP應(yīng)答元件CREBcAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白CREMcAMP應(yīng)答元件調(diào)節(jié)劑CsA環(huán)孢素AdTORC調(diào)節(jié)的CREB的果蠅傳感器HTS高通量篩選ICER可誘導(dǎo)的cAMP早期阻遏物L(fēng)MB細(xì)霉素BNF-AT激活的T-細(xì)胞核因子PKA環(huán)AMP依賴性蛋白激酶ASOCC鈣庫控制的鈣通道TORC調(diào)節(jié)的CREB傳感器TRPV6瞬時受體電位陽離子通道，V亞家族，成員6實施例證明TORC蛋白質(zhì)是CREB依賴性基因表達(dá)的關(guān)鍵共調(diào)節(jié)蛋白。發(fā)現(xiàn)TORC蛋白質(zhì)主要存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，但是通過多種已知協(xié)同調(diào)控CREB1磷酸化的可誘導(dǎo)通路快速轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核。這些包括提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的物質(zhì)、誘導(dǎo)瞬時鈣增加的物質(zhì)、紫外光、蛋白激酶A(PKA)激活和GPCR配體。另外，對于誘導(dǎo)CRE介導(dǎo)的基因表達(dá)，TORC活性是必要的而TORC核轉(zhuǎn)運是充分的。另外，TORC1以神經(jīng)鈣蛋白依賴性方式轉(zhuǎn)運至核，從而代表示除了NF-AT之外的受該種方式調(diào)節(jié)的另一哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子。響應(yīng)鈣信號傳導(dǎo)的TORC1轉(zhuǎn)運以及較小程度的TORC2轉(zhuǎn)運對環(huán)孢素A(CSA)敏感，提示這是親免素結(jié)合劑發(fā)生效力和毒力的一種新機(jī)制。還說明單個果蠅TORC蛋白質(zhì)即dTORC也受神經(jīng)鈣蛋白依賴性的核轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)，進(jìn)一步說明TORC功能的重要保守作用。最后，TORC轉(zhuǎn)運提供了cAMP和鈣依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活的簡單生物傳感器。
實施例中報道的實驗顯示TORC轉(zhuǎn)運測定可用作鑒定TORC功能調(diào)節(jié)劑并最終鑒定CRE依賴的基因激活調(diào)節(jié)劑的高通量篩選方法。根據(jù)用已知修飾基因獲得的結(jié)果，還相信TORC功能和轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)劑以及干擾TORC多肽表達(dá)的物質(zhì)對調(diào)整CREB1介導(dǎo)的應(yīng)答有效。另外，相信TORC功能和轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)劑以及干擾TORC多肽表達(dá)的物質(zhì)會有效地在受試者中基本抑制疾病或病理病癥發(fā)展、治療或改善疾病或病理病癥，所述疾病或病理病癥與細(xì)胞中TORC相關(guān)過程或CREB啟動過程的水平異常相關(guān)。
本文使用術(shù)語“樣品”和類似的詞語是指任何物質(zhì)、組合物或物體，其包含與完整細(xì)胞中核酸、多核苷酸或寡核苷酸或蛋白質(zhì)或多肽的形式相同或最低限度不同的核酸、多核苷酸或寡核苷酸或蛋白質(zhì)或多肽。廣義地，樣品可以是由完整細(xì)胞組成的生物學(xué)樣品。在該廣義含義中，樣品中的DNA為基因組DNA，樣品中的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA和類似的RNA。樣品還可以包含從基因組DNA最小限度改變來的DNA，考慮到例如從細(xì)胞樣品中分離細(xì)胞核或破壞細(xì)胞樣品中包含的細(xì)胞核的步驟。就其他含義而言，樣品可以是亞細(xì)胞級分或亞細(xì)胞區(qū)室或細(xì)胞器，或就完整細(xì)胞而言，可以是細(xì)胞本身或細(xì)胞的亞細(xì)胞區(qū)。在本文考慮的若干實施方案中，包含細(xì)胞、核酸、多核苷酸或寡核苷酸或蛋白質(zhì)或多肽的樣品從懷疑患有或診斷患有特定病理的受試者獲得。
本文使用術(shù)語“參照”和類似的詞語，是指如上“樣品”定義的任何物質(zhì)、組合物或物體，其中樣品得自懷疑患有或診斷患有特定病理的受試者的方法實施例中的除外，此時相同方法中同類步驟中使用的參照來自已知不患有該病理的受試者。更廣泛而言，參照來自能可靠地作為對照使用或表征為非實驗狀態(tài)或非病理學(xué)狀態(tài)的來源。
本文使用術(shù)語“激動劑”是指直接或間接調(diào)節(jié)多肽(例如TORC多肽)和促進(jìn)所述多肽生物活性的分子(即調(diào)節(jié)劑)。激動劑可包括蛋白質(zhì)、核酸、糖類或其他分子。增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)生物化學(xué)功能的調(diào)節(jié)劑分別是促進(jìn)所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄或刺激其生物化學(xué)性質(zhì)或活性的物質(zhì)。
本文使用術(shù)語“拮抗劑”或“抑制劑”是指直接或間接調(diào)節(jié)多肽(例如TORC多肽)的分子(即調(diào)節(jié)劑)，其封閉或抑制所述多肽的生物學(xué)活性。拮抗劑和抑制劑可包括蛋白質(zhì)、核酸、糖類或其他分子。抑制蛋白質(zhì)表達(dá)或生物化學(xué)功能的調(diào)節(jié)劑分別是降低基因表達(dá)或所述蛋白質(zhì)生物活性的物質(zhì)。
檢測和標(biāo)記?？梢杂枚喾N方法檢測TORC多核苷酸或TORC多肽。檢測可以包括任何一種或多種能夠觀察TORC多核苷酸或TORC多肽存在或數(shù)量的方法。在一個實施方案中，含有TORC的樣品核酸可在擴(kuò)增前檢測。在可選實施方案中，樣品中的TORC多核苷酸可擴(kuò)增以產(chǎn)生擴(kuò)增的TORC多核苷酸，并檢測或定量擴(kuò)增的多核苷酸。可使用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法檢測并定量TORC多核苷酸。非限制性實例的物理方法包括光學(xué)顯影，包括多種顯微鏡技術(shù)如熒光顯微術(shù)、共聚焦顯微術(shù)、原位雜交的顯微成像，表面等離子共振(SPR)檢測，如將探針結(jié)合至表面并使用SPR檢測TORC多核苷酸或TORC多肽對固定探針的結(jié)合，或?qū)⑻结樦糜谏V介質(zhì)中并檢測色譜介質(zhì)中結(jié)合的TORC多核苷酸。物理方法還包括凝膠電泳或毛細(xì)管電泳形式，其中將TORC多核苷酸或TORC多肽從其他多核苷酸或多肽中分離并檢測分離的TORC多核苷酸或TORC多肽。物理方法還廣義地包括任何檢測或定量物質(zhì)的分光鏡方法?；瘜W(xué)方法通常包括雜交方法，其中TORC多核苷酸與探針雜交。生物學(xué)方法包括引起TORC多核苷酸或TORC多肽對細(xì)胞產(chǎn)生生物效應(yīng)，并檢測該效應(yīng)。本發(fā)明公開了可作為生物學(xué)測定的生物效應(yīng)的實例。在許多實施方案中，多核苷酸可如下所述標(biāo)記以便于檢測和定量。例如，可以通過化學(xué)或酶促添加標(biāo)記部分，例如標(biāo)記的核苷酸或標(biāo)記的寡核苷酸接頭，以標(biāo)記樣品核酸。許多等效的檢測TORC多核苷酸或多肽的方法為本發(fā)明領(lǐng)域相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知，并認(rèn)為落入本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明核酸可使用cDNA、mRNA或可選的基因組DNA作為模板，與適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋镆黄鸶鶕?jù)任何廣義的PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的核酸可克隆進(jìn)適合的載體并通過DNA序列分析進(jìn)行征。另外，對應(yīng)TORC核苷酸序列的寡核苷酸可通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)(例如使用自動DNA合成儀)制備。
擴(kuò)增的多核苷酸可直接進(jìn)行檢測和/或定量。例如，擴(kuò)增的多核苷酸可在根據(jù)大小分離的凝膠中進(jìn)行電泳，并用顯示其存在和數(shù)量的染料染色。可選地，擴(kuò)增的TORC多核苷酸可通過在雜交條件下(如下)接觸探針核酸并檢測和/或定量雜交結(jié)合進(jìn)行檢測。檢測以任何允許檢測TORC多核苷酸已與探針結(jié)合的方法完成。這可通過檢測因與片段雜交引起的探針物理性質(zhì)改變完成。這類物理檢測法的非限制性實例為SPR。
完成檢測的另一方法是使用TORC多核苷酸或TORC多肽的標(biāo)記形式并檢測結(jié)合的標(biāo)記。多核苷酸可在擴(kuò)增核酸的操作中或通過其他方法被標(biāo)記為另外的特征?？赏ㄟ^使用修飾的核苷酸將標(biāo)記摻入進(jìn)片段中，所述核苷酸包含在用于擴(kuò)增片段群的組合物中。標(biāo)記可以是例如能夠通過其放射性檢測的放射性標(biāo)記如125I、35S、32p、14C或3H。另外，可選擇能夠使用例如分光鏡方法檢測的標(biāo)記。在一個實例中，標(biāo)記可以是吸收入射光的發(fā)色團(tuán)。優(yōu)選可以通過冷光檢測的標(biāo)記。冷光包括熒光、磷光和化學(xué)發(fā)光。因此可以使用發(fā)熒光、發(fā)磷光或引起化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的標(biāo)記。合適的熒光標(biāo)記或熒光色素的實例包括152Eu標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、羅丹明標(biāo)記、藻紅蛋白標(biāo)記、藻藍(lán)蛋白標(biāo)記、Cy-3、Cy-5、異藻藍(lán)蛋白標(biāo)記、o-鄰苯二醛標(biāo)記和熒光胺標(biāo)記。發(fā)冷光標(biāo)記提供高靈敏度的檢測。標(biāo)記還可以是磁共振標(biāo)記，例如可通過電子順磁共振檢測的穩(wěn)定自由基標(biāo)記，或可通過核磁共振檢測的核標(biāo)記。標(biāo)記還可以是特異配體-受體對中的配體；然后通過特異性受體的二次結(jié)合檢測配體的存在，所述特異性受體通常自身標(biāo)記用于檢測。這類配體-受體對的非限制性實例包括生物素和鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白；半抗原如地高辛配基或抗原及其特異性抗體等。標(biāo)記還可以是附著在TORC多核苷酸或TORC多肽上的融合序列。這類融合允許分離和/或檢測并定量TORC多核苷酸或TORC多肽。作為非限制性的實例，融合序列可以是FLAG序列、多聚組氨酸序列、熒光蛋白質(zhì)序列，如綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白，堿性磷酸酶，谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶等?？傊?，可以用本公開相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法完成標(biāo)記。任何允許檢測和/或定量TORC多核苷酸或TORC多肽的等效標(biāo)記應(yīng)理解落入本發(fā)明范圍內(nèi)。
檢測、定量包括標(biāo)記的方法對于本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常是公知的，作為非限制性的實例，相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員包括光譜學(xué)、核酸化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的技術(shù)人員。定量允許測定與探針結(jié)合的核酸或多核苷酸或其片段的數(shù)量、質(zhì)量或濃度。定量包括確定如此處和下文所述的物理、化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)的改變的量。例如來自標(biāo)記的信號強(qiáng)度可用于評價與探針結(jié)合的核酸量。任何能夠檢測與探針核酸雜交的多核苷酸或其片段的存在和/或數(shù)量、質(zhì)量或濃度的等效操作認(rèn)為落入本發(fā)明的范圍。
本文使用術(shù)語“基本抑制與細(xì)胞中TORC相關(guān)或CREB啟動過程相關(guān)的疾病或病理病癥的發(fā)展”，以及類似的術(shù)語和短語是指對受試者的處理，其預(yù)防性地起作用以最小化或基本消除疾病或病癥的起始表現(xiàn)。作為非限制性的實例，這類起始表現(xiàn)包括檢測的診斷值或該疾病或病癥的系統(tǒng)癥狀。其疾病或病理病癥被基本抑制的受試者顯示與正常無病的受試者臨床和診斷上無法區(qū)別。
本文在關(guān)于細(xì)胞中TORC相關(guān)或CREB促進(jìn)進(jìn)程使用術(shù)語“治療”和類似的術(shù)語和短語時，是指對受試者的處理，其發(fā)揮作用以阻止疾病或病癥的發(fā)展或在受試者中起始改善，作為非限制性的實例，這可以通過檢測診斷值或疾病或病癥的系統(tǒng)性癥狀評價。
本文使用術(shù)語“改善”和類似的術(shù)語和短語，當(dāng)用于細(xì)胞中TORC相關(guān)或CREB促進(jìn)進(jìn)程相關(guān)的疾病或病理病癥時，是指對受試者的處理，其發(fā)會作用以降低或基本消除受試者中疾病或病癥的表現(xiàn)。這類表現(xiàn)包括的非限制性實例為檢測的診斷值或疾病或病癥的系統(tǒng)性癥狀。
本文使用術(shù)語“Torc相關(guān)的”或“Torc激活的”是指作為Torc活性的結(jié)果或狀態(tài)表達(dá)的基因或蛋白質(zhì)。例如Torc活性或分布之上游或下游途徑中被抑制或誘導(dǎo)的Torc相關(guān)基因或蛋白質(zhì)。
多核苷酸本文使用術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”和類似的術(shù)語和短語認(rèn)為彼此同義，并按照例如生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)和本發(fā)明相關(guān)的類似領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解使用。本發(fā)明使用的多核苷酸可以是單鏈或配對的雙鏈結(jié)構(gòu)，或甚至是三鏈堿基配對結(jié)構(gòu)。多核苷酸可以是DNA、RNA或DNA鏈與RNA鏈的任意混合物，例如非限制性實例為DNA-RNA雙鏈體結(jié)構(gòu)。本文所用的多核苷酸和“寡核苷酸”除了鏈長度外，在本文定義的多核苷酸的任何和所有屬性方面相同。本文使用的多核苷酸可以是長度約50個核苷酸或堿基對或更長，或長度為或長于約60，或約79，或約80，或約100，或約150，或約200，或約300，或約400，或約500，或約700，或約1000，或約1500，或約2000或約2500，或約3000個核苷酸或堿基對或甚至更長。寡核苷酸長度可以是至少3個核苷酸或堿基對，或長度可以短于約70，或約60，或約50，或約40，或約30，或約20，或約15，或約10個核苷酸或堿基對。多核苷酸和寡核苷酸均可化學(xué)合成。寡核苷酸可用作探針。
本文使用“分離的”核酸分子是與至少一種存在于所述核酸天然來源中的其他核酸分子分離開來的分子。分離的核酸分子的實例包括(但不僅限于)重組多核苷酸分子、載體中包含的重組多核苷酸序列、異源宿主細(xì)胞中存在的重組多核苷酸分子、部分或基本純化的核酸分子以及合成的DNA或RNA分子。優(yōu)選的，“分離的”核酸不含有此核酸來源的生物基因組DNA中天然位于核酸側(cè)翼的序列(即位于核酸5’和3’末端的序列)。例如，在多種實施方案中，分離的TORC核酸分子可包含少于約50kb、25kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然位于核酸來源的細(xì)胞基因組DNA核酸分子的側(cè)翼。此外，“分離的”核酸分子如cDNA分子通過重組技術(shù)制備時可基本不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或通過化學(xué)合成時不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。
本發(fā)明的核酸分子(例如具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQID NO5核苷酸序列的核酸分子)或任何該核苷酸序列的互補(bǔ)物可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)和本文提供的序列信息進(jìn)行分離。使用SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5任一核酸序列的全部或部分作為雜交探針，可使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)分離TORC核酸序列(例如如Sambrook等編，MOLECULAR CLONINGA Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001和Brent等，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(2003)所述)。
本文使用術(shù)語“互補(bǔ)的”是指核酸分子的核苷酸單位間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對。本文和權(quán)利要求中使用術(shù)語“互補(bǔ)的”和類似的詞語，是指核酸、多核苷酸或寡核苷酸的一條鏈中的第一核酸堿基僅與核酸、多核苷酸或寡核苷酸的另一條鏈中的特定第二核酸堿基特異性地相互作用。作為非限制性的實例，如果考慮天然存在的堿基，A和T或U相互作用，而G和C相互作用。本發(fā)明和權(quán)利要求中使用“互補(bǔ)的”旨在表示區(qū)域內(nèi)“完全互補(bǔ)”，即當(dāng)兩條多核苷酸鏈互相比對時，至少在該區(qū)域內(nèi)一條鏈上的連續(xù)堿基序列中每個堿基都與相對鏈中相同長度的連續(xù)堿基序列中的相互作用堿基互補(bǔ)。
本文使用“雜交”和類似的詞語是指通過引起鏈與互補(bǔ)序列互相作用形成核酸、多核苷酸或寡核苷酸雙鏈體的過程。相互作用通過各鏈上的互補(bǔ)堿基特異性地相互作用成對產(chǎn)生。鏈彼此雜交的能力取決于如下所述的多種條件。當(dāng)各鏈上足夠數(shù)量對應(yīng)位置被能夠相互作用的核苷酸占據(jù)時，核酸鏈彼此雜交。本發(fā)明領(lǐng)域技術(shù)人員(包括非限制性的實例分子生物學(xué)家和細(xì)胞生物學(xué)家)能理解，形成雙鏈體的鏈的序列不需要100％地彼此互補(bǔ)而能夠特異性雜交。
在另一實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5任一所示核苷酸序列或該核苷酸序列的部分互補(bǔ)的核酸分子。與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5任一所示核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5任一所示核苷酸序列足夠互補(bǔ)，而可與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5任一所示核苷酸序列很少或無錯配地以氫鍵結(jié)合從而形成穩(wěn)定的雙鏈體。
核酸、多核苷酸或寡核苷酸的重要用途是在鑒定探針核酸與之雜交的靶序列的測定法中的用途。探針對靶標(biāo)的選擇性受到雜交條件嚴(yán)格度的影響。雜交反應(yīng)的“嚴(yán)格度”容易由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，并通常根據(jù)探針長度、溫度和緩沖液組成按經(jīng)驗評估。當(dāng)互補(bǔ)的鏈存在于低于它們解鏈溫度的環(huán)境中時，雜交通常取決于變性DNA再退火的能力。更高的相對溫度旨在使反應(yīng)條件更加嚴(yán)格，而更低的溫度則更加不嚴(yán)格。對于雜交反應(yīng)和鑒定多種嚴(yán)格度的雜交條件的更多細(xì)節(jié)和解釋參見Brent等，《Current Protocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers，(2003)和Sambrook等，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，第三版，New YorkCold Spring Harbor Press，2001。另外，在高通量或多元測定系統(tǒng)中，探針性質(zhì)和嚴(yán)格度均可優(yōu)化，以允許在單組嚴(yán)格度條件下達(dá)到多元測定的目的。
本文定義的“嚴(yán)格條件”或“高嚴(yán)格條件”的非限制性實例包括(1)采用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行洗滌，例如50℃0.015 M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉；(2)雜交中使用變性劑，如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺與0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液在pH6.5與750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉在42℃；(3)使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5×Denhardt′s溶液，超聲處理的鮭精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖在42℃，在42℃用0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和在55℃用50％甲酰胺洗滌，然后是在55℃用包括含有EDTA的0.1×SSC的高嚴(yán)格度洗滌，或(4)在50℃采用7％的十二烷基磺酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，以及在50℃用2×SSC，0.1％SDS洗滌。
“中度嚴(yán)格條件”的非限制性實例包括使用比上述更不嚴(yán)格的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度和％SDS)。中度嚴(yán)格條件的實例為在37℃溶液中孵育過夜，所述溶液包含20％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性的剪切鮭精DNA，然后在1×SSC中于大約37-50℃洗滌濾紙。熟練技術(shù)人員將明白如何調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等，這是適應(yīng)諸如探針長度等因素所必須的。
變體Torc多核苷酸本發(fā)明還包括與公開的TORC核苷酸序列不同的核酸分子。例如序列可以因為遺傳密碼的簡并性而不同。從而這些核酸編碼與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示核苷酸序列編碼的相同的TORC蛋白。在這類實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子具有下述核苷酸序列其編碼具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5任一所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
除SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5任一所示人TORC核苷酸序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解群體(例如人群)中可存在引起TORC蛋白質(zhì)氨基酸序列改變的DNA等位序列多態(tài)性。這類天然等位變異通常引起TORC基因核苷酸序列中1-5％的改變。任何及所有這類核苷酸變異和引起的TORC蛋白中的氨基酸多態(tài)性，為天然等位變異的結(jié)果而且并不改變TORC蛋白的功能活性，旨在包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
此外，編碼來自其他物種的TORC直向同源物的核酸分子，具有與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5任一不同的核苷酸序列，旨在包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。對應(yīng)于本發(fā)明TORC cDNA的天然等位變體和直向同源物可基于它們與本文公開的人TORC核酸的同源性，使用人cDNA或其部分作為雜交探針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)在嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行分離。
保守突變除了群體中可能存在的TORC序列天然存在的等位變體外，熟練技術(shù)人員還將理解SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5任一的核苷酸序列的變體可由熟練技術(shù)人員產(chǎn)生，從而引起編碼的TORC蛋白氨基酸序列改變而不改變TORC蛋白的功能。例如，可在SEQ ID NO1、SEQID NO3或SEQ ID NO5任一的序列中進(jìn)行引起“非必需”氨基酸殘基上氨基酸置換的核苷酸置換?！胺潜匦琛卑被釟埢切蛄兄锌勺訲ORC蛋白野生型序列改變但不改變產(chǎn)生的基因產(chǎn)物生物活性的位置上的殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性必需的位置上的殘基。例如，TORC蛋白家族(本發(fā)明的TORC蛋白是其成員)成員內(nèi)不變的氨基酸殘基預(yù)示著特別不適于進(jìn)行改變。在進(jìn)行了多肽的同源物、直系同源物和旁系同源物的多重序列比對之后，多肽氨基酸序列中的位置是否不變或可進(jìn)行替換將是顯而易見的。
因此本發(fā)明很重要的一個方面涉及編碼TORC蛋白的核酸分子，其中在不是活性所必需的氨基酸殘基中含有改變。這些TORC蛋白在氨基酸序列上與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中任一序列不同，但保留了生物活性。在一個實施方案中，分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQID NO6中任一序列至少約75％相似的氨基酸序列。優(yōu)選地，核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中任一序列至少約80％相同，更優(yōu)選與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約98％并且最優(yōu)選至少約99％相同?？梢酝ㄟ^以下方法產(chǎn)生編碼與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中任一序列相似的蛋白質(zhì)的分離核酸分子在相應(yīng)的核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸置換、添加或缺失，從而在編碼的蛋白質(zhì)中引入一個或多個氨基酸置換、添加或缺失。
優(yōu)選在一個或多個推測的非必需氨基酸殘基上進(jìn)行保守性氨基酸取代?！氨Ｊ匦园被崛〈笔前被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基取代。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。某些氨基酸具有帶有多于一種分類特征的側(cè)鏈，如帶有長脂肪側(cè)鏈的極性氨基酸。氨基酸家族包括具有以下側(cè)鏈的氨基酸堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸)、β-分支側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)和金屬絡(luò)合側(cè)鏈(如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和組氨酸)。可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，在SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5中引入突變?；蛘撸诹硪粚嵤┓桨钢?，可以通過如飽和誘變在TORC編碼序列的全部或部分中隨機(jī)引入突變，可以篩選所得突變體的TORC蛋白生物活性，以鑒定保留活性的突變體。對SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQID NO5進(jìn)行誘變之后，可以通過本領(lǐng)域已知的任何重組技術(shù)表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)并測定蛋白質(zhì)的活性。
測定兩種或更多序列之間的相似性為了測定兩種氨基酸序列或兩種核酸之間的百分比相似性，出于最佳比較的目的比對序列(如可以在被比較的任一序列中引入缺口，以實現(xiàn)序列間的最佳比對)。本文使用的氨基酸或核苷酸“同一性”與氨基酸或核苷酸“同源性”同義。
術(shù)語“序列同一性”指在特定的比較區(qū)域中，兩種多核苷酸或多肽序列在逐個堿基基礎(chǔ)上相同的程度。通過以下步驟計算術(shù)語“序列同一性百分比”在比較區(qū)域中比較最佳比對的兩種序列；確定在兩種序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(如核酸情況下的A、T或U、C、G或I)的位置數(shù)，以獲得匹配位置數(shù)；用匹配位置數(shù)除以比較區(qū)域中的位置總數(shù)(即窗口大小)；結(jié)果乘以100以獲得序列同一性百分比。本文使用的術(shù)語“基本同一”表示多核苷酸序列的特征，其中在比較區(qū)中與參照序列相比，多核苷酸包含具有至少80％序列同一性、優(yōu)選至少85％序列同一性、通常為90％至95％序列同一性、更通常為至少99％序列同一性的序列。在多肽中，通過以下步驟計算“陽性殘基百分比”在比較區(qū)域中比較最佳比對的兩種序列；測定在兩種序列中出現(xiàn)相同和上文定義的保守性氨基酸取代的位置數(shù)，以獲得匹配位置數(shù)；用匹配位置數(shù)除以比較區(qū)域中的位置總數(shù)(即窗口大小)；用結(jié)果乘以100獲得陽性殘基百分比。
本領(lǐng)域已知的“同一性”是通過序列比較測定的兩種或更多多肽序列或兩種或更多多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”的情況還可以指多肽或核苷酸序列之間的序列相關(guān)性程度，通過這些序列串間的匹配測定?？梢允褂靡阎椒ū憷販y定“同一性”和“相似性”，包括但不僅限于《Computational Molecular Biology》，Lesk.A.M.編輯，OxfordUniversity Press，New York，1988；《BiocomputingInformatics andGenome Projects》，Smith，D.W.編輯，Academic Press，New York，1993；《Computer Analysis of Sequence Data》，Part I.Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編輯Humana Press，New Jersey，1994；《Sequence Analysis inMolecular Biology》，von Heinj e，G.，Academic Press，1987和《SequenceAnalysis Primer》，Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，M Stockton Press.New York，1991以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.(1988)481073中所述的方法。確定同一性的優(yōu)選方法設(shè)計用以給出測試序列間的最大匹配。公共可用的計算機(jī)程序中編程了確定同一性和相似性的方法。確定兩種序列之間同一性和相似性的優(yōu)選計算機(jī)程序方法包括但不僅限于GCG程序包(Devercux，J.，等(1984)Nucleic Acids Research 12(1)387)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等(1990)J.Molec.Biol.215403-410。BLAST X程序可從NCBI和其他來源公開得到(BLASTManual，Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.，等(1990)J.Mol.Biol.215403-410)。還可以使用熟知的SmithWaterman算法確定同一性。
此外，BLAST算法可用于檢測兩種序列之間的相似性和百分比同一性。BLAST可自萬維網(wǎng)上國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)址獲得。描述BLAST分析的參考文獻(xiàn)包括Madden，T.L.，Tatusov，R.L.&Zhang，J.(1996)Meth.Enzymol.266131-141；Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.&Lipman，D.J.(1 997)Nucleic Acids Res.253389-3402和Zhang，J.&Madden，T.L.(1997)Genome Res.7649-656。
反義核酸本發(fā)明的另一方面涉及分離的反義核酸分子或其變體、片段、類似物或衍生物，所述反義核酸分子與包含核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO3或SEQ ID NO5的核酸分子雜交或互補(bǔ)?！胺戳x”核酸包含與編碼蛋白質(zhì)的“有義”核酸互補(bǔ)(例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)或與mRNA序列互補(bǔ))的核苷酸序列。在具體方面提供了反義核酸分子，所述反義核酸分子包含與至少約10、25、50、100、250或500個核苷酸的部分或整個TORC編碼鏈互補(bǔ)的序列。
在一個實施方案中，反義核酸分子與編碼TORC蛋白的核苷酸序列編碼鏈的“編碼區(qū)”反義。術(shù)語“編碼區(qū)”指包含翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)域(如人TORC蛋白的蛋白編碼區(qū)，對應(yīng)于SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中任一)。在另一實施方案中，反義核酸分子與編碼TORC蛋白的核苷酸序列編碼鏈的“非編碼區(qū)”反義。術(shù)語“非編碼區(qū)”指編碼區(qū)側(cè)翼的5’和3’序列，它們不翻譯成氨基酸(即也稱為5’和3’非翻譯區(qū))，但它們可能含有調(diào)節(jié)表達(dá)的序列。
給定編碼本文公開的TORC蛋白的編碼鏈序列(如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5)，可以按照Watson和Crick或Hoogsteen堿基配對原則設(shè)計本發(fā)明的反義核酸。反義核酸分子可以與TORC mRNA的完整編碼區(qū)互補(bǔ)，但更優(yōu)選僅與TORC mRNA的部分編碼區(qū)或非編碼區(qū)反義的寡核苷酸。
本發(fā)明的反義核酸分子一般對受試者施用或原位產(chǎn)生，從而它們與編碼TORC蛋白的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯?？梢酝ㄟ^常規(guī)核苷酸互補(bǔ)性進(jìn)行雜交以形成穩(wěn)定的雙鏈體，或者例如在反義核酸分子與DNA雙鏈體結(jié)合的情況下，通過雙螺旋大溝中的特異性相互作用進(jìn)行雜交。
干擾RNA在本發(fā)明的一個方面，可以通過RNA干擾減弱TORC基因的表達(dá)。本領(lǐng)域熟知的一種方法是短干擾RNA(siRNA)或小RNA(文中也稱為干擾多核苷酸或小多核苷酸)介導(dǎo)的基因沉默，其中特異性雙鏈TORC產(chǎn)生的siRNA核苷酸序列靶向TORC基因的表達(dá)產(chǎn)物，所述siRNA核苷酸序列與TORC基因轉(zhuǎn)錄物(包括5’非翻譯(UT)區(qū)、ORF或3’UT區(qū))的至少19-25 nt長區(qū)段互補(bǔ)。參閱如PCT申請WO 00/44895、WO 99/32619、WO 01/75164、WO 01/92513、WO 01/29058、WO 01/89304、WO 02/16620和WO 02/29858，所述文獻(xiàn)各以其整體引入本文為參考，還參閱Jia等(2003)J.Vir0l.77(5)3301-3306和Morris等(2004)Science3051289-1292。靶向的基因可以是TORC基因或TORC基因的上游或下游調(diào)節(jié)劑。TORC基因上游或下游調(diào)節(jié)劑的非限制性實例包括例如與TORC基因啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子、與TORC多肽相互作用的激酶或磷酸酶以及參與TORC調(diào)節(jié)途徑的多肽。
本發(fā)明的TORC多核苷酸包括siRNA多核苷酸?？梢允褂肨ORC多核苷酸序列獲得這樣的TORC siRNA，例如通過在無細(xì)胞系統(tǒng)中加工TORC核糖多核苷酸序列、通過轉(zhuǎn)錄重組雙鏈TORC RNA或通過化學(xué)合成與TORC序列類似的多核苷酸序列。參閱如Tuschl，Zamore，Lehmann，Bartel和Sharp(1999)，Genes&Dev.133191-3197，所述文獻(xiàn)以其整體引入本文為參考。
一般使用這樣的siRNA雙鏈體可以觀察到最有效的沉默由21-nt有義鏈和21-nt反義鏈組成，以具有2-nt 3’突出的方式配對。2-nt 3’突出的序列對siRNA靶標(biāo)識別的特異性也稍有貢獻(xiàn)。對特異性的貢獻(xiàn)局限于與第一個配對堿基毗鄰的未配對核苷酸。在一個實施方案中，3’突出中的核苷酸為核糖核苷酸。在備選實施方案中，3’突出中的核苷酸為脫氧核糖核苷酸。
為了產(chǎn)生siRNA，本發(fā)明的預(yù)期重組表達(dá)載體包含克隆進(jìn)表達(dá)載體的TORC DNA分子，所述載體在TORC序列兩側(cè)以允許兩條鏈均表達(dá)的方式包含有效連接的調(diào)節(jié)序列?？梢泽w內(nèi)雜交有義和反義RNA鏈，以通過切割RNA而形成siRNA來產(chǎn)生用于沉默TORC基因的siRNA構(gòu)建體?；蛘撸梢允褂脙煞N構(gòu)建體產(chǎn)生siRNA構(gòu)建體的有義和反義鏈。最后，克隆的DNA可以編碼具有二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體，其中單個轉(zhuǎn)錄物同時具有來自一個或多個靶基因的有義和互補(bǔ)反義序列。在該實施方案的實施例中，發(fā)夾RNAi產(chǎn)物與靶基因的全部或部分相似。在另一實施例中，發(fā)夾RNAi的產(chǎn)物為siRNA。TORC序列側(cè)翼的調(diào)節(jié)序列可以相同，或者可以不同，從而可以獨立調(diào)節(jié)或者以時間或空間方式調(diào)節(jié)其表達(dá)。
在具體的實施方案中，通過將TORC基因模板克隆進(jìn)載體來胞外轉(zhuǎn)錄siRNA，所述載體含有例如來自小核RNA(snRNA)U6的RNA pol III轉(zhuǎn)錄單位或人Rnase P RNA H1。載體系統(tǒng)的一個實例為GeneSuppressorTMRNA干擾試劑盒(可購自Imgenex)。U6和H1啟動子為III型Pol III啟動子的成員。
siRNA載體具有提供長效mRNA抑制的優(yōu)點。相反，用外源合成siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞一般在7天或10輪細(xì)胞分裂后從mRNA抑制中恢復(fù)。siRNA表達(dá)載體的長效基因沉默能力可以提供在基因治療中的應(yīng)用。
一般而言，通過稱為DICER的ATP依賴性核糖核酸酶從較長的dsRNA消化出siRNA。DICER是雙鏈RNA特異性內(nèi)切核酸酶RNase III家族成員。siRNA與細(xì)胞蛋白質(zhì)裝配成內(nèi)切核酸酶復(fù)合物。果蠅的體外研究提示siRNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物(siRNP)其后轉(zhuǎn)移至稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的第二種酶復(fù)合物，它含有與DICER不同的內(nèi)切核核糖酸酶。RISC使用反義siRNA鏈編碼的序列尋找并破壞互補(bǔ)序列的mRNA。因此siRNA發(fā)揮向?qū)ё饔?，限制核糖核酸酶僅切割與一條或兩條siRNA鏈互補(bǔ)的mRNA。
siRNA靶向的TORC mRNA區(qū)一般選自從起始密碼子下游50至100nt開始的期望TORC序列?；蛘?，可以使用5’或3’UTR和起始密碼子附近的區(qū)域，但一般應(yīng)該避免，因為它們可能有更多調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點。UTR結(jié)合蛋白和/或轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物可以干擾siRNP或RISC內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合。參閱Elbashir等2001 EMBO J.20(23)6877-88。因此在靶向所需基因時，應(yīng)該仔細(xì)斟酌以適應(yīng)SNP、多態(tài)性、等位變體或物種特異性變異。
涉及TORC siRNA的實驗包括正確的陰性對照。一般應(yīng)該混排(scramble)TORC siRNA的核苷酸序列并進(jìn)行同源性搜索以確保它與任何其他基因均缺乏同源性。
本發(fā)明的發(fā)明性治療方法將施用TORC siRNA構(gòu)建體作為療法，以補(bǔ)償異常的TORC表達(dá)或活性。獲得TORC核糖多核苷酸并加工成siRNA片段，或者如上文所述合成TORC siRNA。如上文所述使用已知的核酸轉(zhuǎn)染技術(shù)對細(xì)胞或組織施用TORC siRNA。對TORC基因具有特異性的TORC siRNA會降低或敲低TORC轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這將引起TORC多肽產(chǎn)量下降，導(dǎo)致細(xì)胞或組織中TORC多肽活性降低。
本發(fā)明還包括基本抑制患者疾病或病理病癥的發(fā)生、治療或改善疾病或病理病癥的方法，所述疾病或病理病癥與細(xì)胞中TORC相關(guān)的或CREB啟動的過程的水平異常相關(guān)，所述方法包括對個體施用靶向蛋白mRNA(編碼該蛋白的mRNA)以進(jìn)行降解的RNAi構(gòu)建體。特異性RNAi構(gòu)建體包括siRNA或加工成siRNA的雙鏈基因轉(zhuǎn)錄物。經(jīng)治療靶TORC蛋白的表達(dá)受到抑制。
核酶本文考慮的多核苷酸還可以是核酶，即酶RNA分子，可用于通過特異性切割RNA來抑制基因表達(dá)。核酶的作用機(jī)制涉及核酶分子與互補(bǔ)靶RNA的序列特異性雜交，其后是內(nèi)切核酸酶切割。可以使用的實例包括改造的“錘頭狀”或“發(fā)夾”基序核酶分子，它們可以設(shè)計成特異并高效地催化基因序列(如TORC1、TORC2或TORC3基因)的內(nèi)切核酸酶切割。可以合成核酶以識別目的蛋白質(zhì)的特異性核苷酸序列并切割(Cech.J.Amer.Med Assn.2603030(1988))。設(shè)計用于基因表達(dá)的靶向性抑制的這些分子的技術(shù)為本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
核酶方法包括使細(xì)胞接觸核酶或誘導(dǎo)細(xì)胞中這些小RNA酶分子的表達(dá)(Grassi和Marini，1996，Annals of Medicine 28499-510；Gibson，1996，Cancer and Metastasis Reviews 15287-299)。可以利用錘頭狀和發(fā)夾核酶的胞內(nèi)表達(dá)抑制基因編碼的蛋白，所述核酶靶向與至少一種本文所述基因?qū)?yīng)的mRNA。
核酶可以以摻入了核酶序列的RNA寡核苷酸的形式直接遞送至細(xì)胞，或者作為編碼所需核酶RNA的表達(dá)載體引入細(xì)胞?？梢栽隗w內(nèi)以足以高效催化切割mRNA的數(shù)目常規(guī)表達(dá)核酶，從而修飾細(xì)胞中的mRNA豐度(Cotten等，1989 EMBO J.83861-3866)。
適體還可以將RNA適體引入細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)，以修飾RNA豐度或活性。RNA適體是蛋白質(zhì)的特異性RNA配體，如能夠特異性抑制其翻譯的Tat和Rev RNA(Good等，1997，Gene Therapy 445-54)。
三螺旋多核苷酸可以使用“三螺旋”堿基配對法實現(xiàn)對基因表達(dá)的抑制。三螺旋配對之所以有用是因為它導(dǎo)致抑制雙螺旋打開至足以結(jié)合聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)分子的能力。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了使用三鏈DNA的最近的治療進(jìn)展(Gee，J.E.等(1994)InHuber，B.E.and B.I.Carr，Molecular andImmunologic Approaches，F(xiàn)utura Publishing Co.，Mt.Kisco，N.Y.)。這些分子還可以設(shè)計為通過阻止由結(jié)合核糖體引起的轉(zhuǎn)錄來阻斷mRNA的翻譯。
可以使用本領(lǐng)域合成核酸分子的任何已知技術(shù)來制備本發(fā)明的所有多核苷酸，包括反義分子、三螺旋DNA、RNA適體和核酶。它們包括化學(xué)合成寡核苷酸的技術(shù)，如固相亞磷酰胺化學(xué)合成?；蛘撸梢酝ㄟ^體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼本文所述多肽基因的DNA序列來制備RNA分子。這樣的DNA序列可以摻入到具有適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶啟動子(如T7或SP6)的多種載體中。或者可以將組成型或誘導(dǎo)型合成反義RNA的cDNA構(gòu)建體引入細(xì)胞系、細(xì)胞或組織。
RNA的產(chǎn)生使用已知方法產(chǎn)生TORC的有義RNA(ssRNA)和反義RNA(asRNA)，如在RNA表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。參閱如Sambrook等《Molecular Cloning》，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Plainview，N.Y.(2001)。使用Expedite RNA亞磷酰胺和胸苷亞磷酰胺(Proligo，Germany)化學(xué)合成siRNA，如21 nt RNA。使合成的寡核苷酸去保護(hù)并凝膠純化(Elbashir等(2001)Genes&Dev.15，188-200)，其后通過Sep-Pak C18盒(Waters，Milford，Mass.，USA)純化(Tuschl等(1993)Biochemistry，3211658-11668)。通過在退火緩沖液(100mM乙酸鉀、30mM pH 7.4的HEPES-KOH、2mM乙酸鎂)中于90℃孵育1分鐘，之后37℃孵育1小時，使RNA單鏈退火。
PNA部分在多個實施方案中，可以修飾TORC核酸以產(chǎn)生肽核酸(參閱Hyrup等(1996)Bioorg Med Chem 45-23)。本文使用的術(shù)語“肽核酸”或“PNA”指核酸模擬物，如DNA模擬物，其中脫氧核糖核酸骨架被替換為假肽骨架，僅保留四種天然核堿基。已經(jīng)顯示在低離子強(qiáng)度條件下PNA的中性骨架能與DNA和RNA特異性雜交。可以使用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方案實現(xiàn)PNA寡聚物的合成，如上文Hyrup等(1996)；Perry-O′Keefe等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9314670-675所述。
TORC的PNA可用于治療和診斷應(yīng)用。例如，PNA可以作為反義或抗基因劑，用于通過如誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯停止或抑制復(fù)制來序列特異性地調(diào)節(jié)基因表達(dá)。TORC蛋白的PNA還可用于例如通過PNA指導(dǎo)的PCR箝位(clamping)進(jìn)行的基因中單堿基對突變分析；與其他酶(如S1核酸酶(Hyrup B.(1996)見上文))組合時作為人工限制性酶；或作為探針或引物用于DNA測序和雜交(Hyrup等(1996)，上文；Perry-O′Keefe(1996)，上文)。
多肽本文使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”或“寡肽”和基于它們的類似詞語指由肽鍵連接的α氨基酸聚合物。α氨基酸包括核酸、多核苷酸和寡核苷酸的三聯(lián)密碼子編碼的氨基酸。它們還可以包括具有與遺傳密碼編碼的氨基酸不同的側(cè)鏈的氨基酸。
本文使用的本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)的“成熟”形式為天然存在的多肽或前體形式或前蛋白的產(chǎn)物。天然存在的多肽、前體或前蛋白的非限制性實例包括由相應(yīng)基因編碼的全長基因產(chǎn)物?；蛘撸梢远x為本文公開的開放讀碼框編碼的多肽、前體或前蛋白。還是作為非限制性實例，產(chǎn)物的“成熟”形式作為細(xì)胞或宿主細(xì)胞中可能發(fā)生的一種或多種天然存在加工步驟的結(jié)果而產(chǎn)生，基因產(chǎn)物在所述細(xì)胞或宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。這些導(dǎo)致多肽或蛋白質(zhì)“成熟”形式的加工步驟的實例包括切割開放讀碼框起始密碼子編碼的N端甲硫氨酸殘基或蛋白水解切割信號肽或前導(dǎo)肽。因此在去除N端甲硫氨酸后，來自具有殘基1至N(其中殘基1為N端甲硫氨酸)的前體多肽或蛋白質(zhì)的成熟形式將保留殘基2至N?；蛘撸瑏碜跃哂袣埢?至N(其中切去從殘基1至殘基M的N端信號序列)將保留殘基M+1至殘基N。本文使用的多肽或蛋白質(zhì)的“成熟”形式還可以來自翻譯后修飾步驟，而不是蛋白水解切割事件。作為非限制性實例，這些其他過程包括糖基化、肉豆蔻?；蛄姿峄?。通常，成熟的多肽或蛋白質(zhì)可以僅來自這些過程之一，或者來自其任何組合。
本文使用的“氨基酸”代表可見于蛋白質(zhì)的任何一種天然存在的α氨基酸。此外，術(shù)語“氨基酸”代表蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)和其他本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何非天然存在氨基酸。它們的非限制性實例包括肌氨酸、羥脯氨酸、正亮氨酸、別異亮氨酸、環(huán)己基丙氨酸、苯基甘氨酸、高半胱氨酸、二羥苯丙氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、天然存在L-氨基酸的D-氨基酸異構(gòu)體等等。此外氨基酸還可以是經(jīng)修飾或衍生的，例如通過用標(biāo)記偶聯(lián)側(cè)鏈?？梢栽诒疚墓_的多肽中摻入任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氨基酸。
本文使用的術(shù)語“表位標(biāo)記”指嵌合多肽，它包含與“標(biāo)記多肽”融合的TORC多肽。標(biāo)記多肽具有足以提供表位的殘基，可以針對所述表位產(chǎn)生抗體，但是又足夠短，從而不干擾與其融合的多肽的活性。標(biāo)記多肽還優(yōu)選十分獨特，從而抗體基本不與其他表位交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)記多肽通常具有至少6個氨基酸殘基，一般約8至50個氨基酸殘基(優(yōu)選約10至20個氨基酸殘基)。
本文使用的術(shù)語“活性的”或“活性”和類似術(shù)語指多肽的形式，所述形式保留自然或天然存在的TORC的生物活性和/或免疫活性，其中“生物”活性指與誘導(dǎo)產(chǎn)生針對自然或天然存在的TORC所具有的抗原表位的抗體的能力不同的、由自然或天然存在的TORC引起的生物功能(抑制或刺激)，而“免疫”活性指誘導(dǎo)產(chǎn)生針對自然或天然存在的TORC所具有的抗原表位的抗體的能力。
TORC蛋白和多肽本發(fā)明的TORC蛋白包括分離的TORC蛋白，其序列在SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中提供。本發(fā)明還包括突變體或變體蛋白，其殘基可以由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的相應(yīng)殘基發(fā)生改變，但仍編碼保持TORC蛋白樣活性和生理功能的蛋白質(zhì)或其功能性片段。例如，本發(fā)明包括上述變體TORC核酸編碼的多肽。在突變體或變體蛋白質(zhì)中，可以這樣改變多達(dá)20％或以上的殘基。
一般而言，保留TORC蛋白樣功能的TORC蛋白樣變體包括任何變體，其中特定位置的殘基被其他氨基酸取代，還包括在親本蛋白質(zhì)的兩個殘基之間插入額外的殘基的可能性，以及缺失親本序列中一個或多個殘基的可能性。本發(fā)明包括任何氨基酸取代、插入或缺失。在有利的情況下，取代為上文定義的非必需或保守性取代。此外，不限制本發(fā)明范圍地，可以取代SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中的任何位置，從而突變體或變體蛋白質(zhì)可以包括一個或多個取代。
本發(fā)明還包括分離的TORC蛋白及其生物活性部分或其衍生物、片段、類似物或同源物。還提供了適于作為產(chǎn)生抗TORC蛋白抗體的免疫原的多肽片段。蛋白質(zhì)或多肽的片段如肽或寡肽的長度可以為5個氨基酸殘基或更多，或者長度為6個或更多，7個或更多，8個或更多，9個或更多，10個或更多，15個或更多，20個或更多，25個或更多，30個或更多，50個或更多，100個或更多殘基，上至比全長序列短一個氨基酸的長度。在一個實施方案中，可以使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過適當(dāng)?shù)募兓桨笍募?xì)胞或組織來源中分離天然TORC蛋白。在另一實施方案中，通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生TORC蛋白。作為重組表達(dá)的備選方案，可以使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成TORC蛋白或多肽。蛋白質(zhì)和多肽的純化描述于教科書例如“Protein Purification，第三版”，R.K.Scopes，Springer-Verlag，New York，1994；“Protein Methods，第二版，”D.M.Bollag，M.D.Rozycki和S.J.Edelsterin，Wiley-Liss，New York，1996以及“Guide to ProteinPurification”，M.Deutscher，Academic Press，New York，2001中。
TORC蛋白的生物活性部分包括這樣的肽它含有與TORC蛋白氨基酸序列充分相似或來自TORC蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO2、SEQID NO4或SEQ ID NO6)的氨基酸序列，包含少于全長TORC蛋白的氨基酸，并顯示至少一種TORC蛋白活性。生物活性部分一般包含具有至少一種TORC蛋白活性的結(jié)構(gòu)域或基序。TORC蛋白的生物活性部分可以是例如長度為10、25、50、100或更多氨基酸的多肽。
本發(fā)明TORC蛋白的生物活性部分可以含有至少一種上文鑒定的在TORC蛋白質(zhì)家族中保守的結(jié)構(gòu)域。此外，可以通過重組技術(shù)制備缺失了其他蛋白區(qū)域的生物活性部分，并評估一種或多種天然TORC蛋白的功能活性。
在一個實施方案中，TORC蛋白具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中任一所示的氨基酸序列。在其他實施方案中，TORC蛋白與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中任一基本相似，并保留SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中任一的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變而在氨基酸序列上存在差異，這在下文有詳細(xì)描述。因此，在另一實施方案中，TORC蛋白是這樣的蛋白質(zhì)它包含與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中任一氨基酸序列具有至少約45％的相似性，更優(yōu)選約55％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，98％或更高，或甚至99％或更高的相似性，并保留具有序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的相應(yīng)多肽的TORC蛋白功能活性。作為TORCX多肽與同源或旁系同源多肽比對的結(jié)果鑒定了可以在變體多肽分子中改變的特定氨基酸殘基的非限制性實例。
嵌合及融合蛋白本發(fā)明還提供TORC蛋白嵌合或融合蛋白。本文使用的TORC蛋白“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括與非TORC多肽有效連接的TORC多肽?！癟ORC多肽”指具有對應(yīng)于TORC蛋白的氨基酸序列的多肽，而“非TORC多肽”指具有對應(yīng)于與TORC蛋白不基本相似的蛋白質(zhì)(例如來自相同或不同生物的與TORC蛋白不同的蛋白質(zhì))的氨基酸序列的多肽。在含有TORC蛋白的融合蛋白中，TORC多肽可以對應(yīng)于TORC蛋白的全部或部分。在一個實施方案中，TORC蛋白融合蛋白包含全長TORC蛋白或TORC蛋白的至少一個生物活性片段。在另一實施方案中，TORC蛋白融合蛋白包含TORC蛋白的至少兩個片段，所述片段各自保留其生物活性。在融合蛋白中，術(shù)語“有效連接”旨在表示TORC多肽和非TORC多肽彼此框內(nèi)融合。非TORC多肽可以與TORC多肽的N端或C端融合。
在另一實施方案中，融合蛋白為GST-TORC蛋白融合蛋白，其中TORC蛋白序列與GST(即谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)序列的C端融合。這樣的融合蛋白可以便于純化重組TORC蛋白。其他融合實施方案包括用于純化和檢測融合構(gòu)建體的FLAG標(biāo)記融合和熒光蛋白融合。
在另一實施方案中，融合蛋白為在其N端含有異源信號序列的TORC蛋白。例如，可以除去天然TORC蛋白信號序列并替換為來自另一蛋白質(zhì)的信號序列。在某些宿主細(xì)胞(如哺乳動物宿主細(xì)胞)中，可以通過使用異源信號序列提高TORC蛋白的表達(dá)和/或分泌。
在另一實施方案中，融合蛋白為TORC蛋白-免疫球蛋白融合蛋白，其中包含一個或多個結(jié)構(gòu)域的TORC蛋白序列與來自免疫球蛋白家族成員的序列融合。本發(fā)明的TORC蛋白-免疫球蛋白融合蛋白可以摻入到藥物組合物中并對受試者施用，以抑制TORC蛋白配體與細(xì)胞表面TORC蛋白之間的相互作用，從而抑制TORC蛋白介導(dǎo)的體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的TORC蛋白嵌合或融合蛋白。例如，按照常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片段框內(nèi)連接在一起，例如使用平末端或粘末端連接、限制性酶消化以提供適當(dāng)?shù)哪┒?、適當(dāng)時補(bǔ)平粘末端、堿性磷酸酶處理以避免不期望的連接以及酶促連接。在另一實施方案中，可以通過常規(guī)技術(shù)(包括自動化DNA合成儀)合成融合基因?；蛘呖梢允褂缅^定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，所述錨定引物產(chǎn)生兩個連續(xù)基因片段之間的互補(bǔ)突出，所述突出可以退火并再擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列(參閱如Brent等，《Current Protocols in MolecularBiology》，Wiley Interscience Publishers，(2003))。此外，許多已經(jīng)編碼融合部分(如GST多肽)的表達(dá)載體是市售的?？梢詫ORC蛋白編碼核酸克隆進(jìn)這些表達(dá)載體，從而融和部分與TORC蛋白框內(nèi)連接。
TORC多肽或TORC寡肽的“特異性結(jié)合劑”是與TORC多肽或寡肽特異性結(jié)合但與其他多肽和寡肽結(jié)合很弱或不結(jié)合的任何物質(zhì)。特異性結(jié)合劑的非限制性實例包括抗體、TORC多肽的特異性受體、這些抗體和受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域、適體、印痕聚合物等。
TORC激動劑和拮抗劑本發(fā)明還涉及發(fā)揮TORC蛋白激動劑(模擬物)或TORC蛋白拮抗劑功能的TORC蛋白片段或變體。TORC蛋白激動劑可以保留天然存在形式TORC蛋白的基本相同的生物活性或其子集。TORC蛋白的拮抗劑可以抑制天然存在形式TORC蛋白的一種或多種活性，例如通過與包括TORC蛋白的細(xì)胞信號級聯(lián)的下游或上游成員競爭性結(jié)合。
可以通過篩選TORC蛋白突變體(如截短突變體)組合文庫的TORC蛋白激動劑或拮抗劑活性來鑒定發(fā)揮激動劑(模擬物)或拮抗劑功能的TORC蛋白變體或片段。在一個實施方案中，通過核酸水平的組合誘變產(chǎn)生TORC變體雜色文庫(variegated library)，并由雜色基因文庫編碼?？梢酝ㄟ^例如以下方法產(chǎn)生TORC變體雜色文庫將合成寡核苷酸混合物酶促連接進(jìn)基因序列，從而潛在TORC序列的簡并集合可作為單個多肽表達(dá)，或者作為其中含有TORC序列集的較大的融合蛋白集合(如用于噬菌體展示)表達(dá)。可以在自動化DNA合成儀中進(jìn)行簡并基因序列的化學(xué)合成，接著將合成基因連接進(jìn)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體。合成簡并寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域已知(參閱如Narang(1983)Tetrahedron 393；Itakura等(1984)Annu Rev Biochem 53323；Itakura等(1984)Science 1981056；Ike等(1983)Nucl Acid Res 11477)。
由于TORC基因家族含有高度保守的關(guān)鍵區(qū)，因此預(yù)計TORC蛋白的肽模擬物也發(fā)揮TORC調(diào)節(jié)劑的作用。實施例中公開了模擬物的實施方案。這些肽來自或設(shè)計自阻斷TORC功能的TORC家族蛋白。預(yù)計這些模擬物阻斷所有高度相關(guān)TORC蛋白的功能?？梢园凑粘Ｒ?guī)方法基于對多肽中TORC蛋白活性所必需區(qū)域的了解來產(chǎn)生合適的TORC蛋白的合適的肽模擬物。簡言之，通過常規(guī)結(jié)構(gòu)-功能研究(如野生型蛋白的缺失或突變分析)和多序列比對鑒定蛋白質(zhì)中的短氨基酸序列。肽模擬物的氨基酸序列可以由完全或部分與該區(qū)域匹配的氨基酸組成?？梢杂门c原始氨基酸相似但賦予更好的藥理學(xué)特性如較高的抑制活性、穩(wěn)定性、半衰期或生物利用率的化學(xué)結(jié)構(gòu)替代這些氨基酸。
多肽文庫此外，TORC蛋白編碼序列片段的文庫可用于產(chǎn)生用于篩選和其后選擇TORC蛋白變體的功能性片段雜色群。
本領(lǐng)域已知的若干技術(shù)可用于篩選通過點突變或截短產(chǎn)生的組合文庫的基因產(chǎn)物以及用于在cDNA文庫中篩選具有選定特性的基因產(chǎn)物。這些技術(shù)適用于快速篩選通過TORC蛋白組合誘變產(chǎn)生的基因文庫。遞歸總體誘變(REM)，一種增強(qiáng)文庫中功能性突變體頻率的新技術(shù)，可以與篩選測定組合使用，以鑒定TORC變體(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering6327-331)。
抗TORC抗體本文使用的術(shù)語“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有與抗原特異性結(jié)合(與之免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合位點的分子。這些抗體包括但不僅限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab、Fab，和F(ab′)2片段以及Fab表達(dá)文庫。一般而言，得自1 人的抗體分子是指IgG、IgM、IgA、IgE和IgD類中的任一種，這些類因分子中存在的重鏈的性質(zhì)而彼此有別。某些類還有亞類，如IgG1、IgG2等。此外，在人中，輕鏈可以是κ鏈或λ鏈。本文提到的抗體包括所有這些人抗體種類的類、亞類和型。本文公開的任何抗體都與其同源抗原“免疫特異性”結(jié)合。免疫特異性結(jié)合指通過用特定免疫原攻擊宿主而產(chǎn)生的抗體與包含免疫原部分的分子(如抗原)以高親和力結(jié)合，并且與不含有免疫原的分子僅以弱親和力結(jié)合或根本不結(jié)合。在該定義中使用的高親和力指具有低于約1×10-6M的解離常數(shù)，弱親和力指具有高于約1×10-6M的解離常數(shù)。
旨在用作抗原的本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)或其部分或片段可以作為免疫原，使用多克隆和單克隆抗體制備的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生與抗原免疫特異性結(jié)合的抗體。全長蛋白可以用作免疫原，或者本發(fā)明提供用作免疫原的抗原的抗原肽片段。抗原肽片段包含全長蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6)氨基酸序列的至少6個氨基酸殘基，并包括其表位，從而針對該肽產(chǎn)生的抗體與全長蛋白或含有該表位的任何片段形成特異性免疫復(fù)合物。優(yōu)選地，抗原肽包含至少10個氨基酸殘基，或至少15個氨基酸殘基，或至少20個氨基酸殘基，或至少30個氨基酸殘基。抗原肽優(yōu)選包含的表位為位于其表面的蛋白質(zhì)區(qū)域，一般是親水性區(qū)域。
多種本領(lǐng)域已知的方法可用于產(chǎn)生針對本發(fā)明蛋白質(zhì)或針對其衍生物、片段、類似物、同源物或直向同源物的多克隆或單克隆抗體(參閱例如《AntibodiesA Laboratory Manual》，Harlow E和Lane D，1988，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，此處引用作為參考)。下文討論了一些這類抗體。
1.多克隆抗體為了產(chǎn)生多克隆抗體，可以通過一次或多次注射天然蛋白質(zhì)、其合成變體或上述物質(zhì)的衍生物來免疫多種合適的宿主動物(如兔、山羊、小鼠或其他哺乳動物)。合適的免疫原性制品可以含有例如天然存在的免疫原性蛋白質(zhì)、代表該免疫原性蛋白質(zhì)的化學(xué)合成多肽或重組表達(dá)的免疫原性蛋白質(zhì)。此外，蛋白質(zhì)可以與已知在免疫動物中為免疫原性的另一種蛋白質(zhì)綴合。這些免疫原性蛋白質(zhì)的實例包括但不僅限于匙孔械血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。
可以從哺乳動物(如從血中)分離針對免疫原性蛋白質(zhì)的多克隆抗體分子并使用熟知的技術(shù)進(jìn)一步純化，如使用A蛋白或G蛋白的親和層析，其主要提供免疫血清的IgG級分。免疫球蛋白的純化討論于例如D.Wilkinson(The Scientist，The Scientist，Inc.，Philadelphia PA出版，14卷，8期(2000年4月17日)，25-28頁)。
2.單克隆抗體本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”(MAb)或“單克隆抗體組合物”指僅含有一種抗體分子的抗體分子群，其由單一的輕鏈基因產(chǎn)物和單一的重鏈基因產(chǎn)物組成。特別地，單克隆抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)在該群的所有分子中都相同。因此MAb含有能與抗原特定表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點，特征在于對其獨特的結(jié)合親和力。
可以使用雜交瘤方法制備單克隆抗體，如Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)所述。在雜交瘤方法中，一般用免疫劑免疫小鼠、倉鼠或其他適當(dāng)?shù)乃拗鲃游?，以誘發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與免疫劑特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?，可以體外免疫淋巴細(xì)胞。接著使用適當(dāng)?shù)娜诤蟿?如聚乙二醇)使淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合，以形成雜交瘤細(xì)胞[Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，Academic Press，(1986)59-103頁]。永生化細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，特別是嚙齒類、牛和人來源的骨髓瘤細(xì)胞。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是高效融合、支持選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行抗體的穩(wěn)定高水平表達(dá)并且對培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞系。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是小鼠骨髓瘤細(xì)胞，它可得自如SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California以及美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，Virginia。還描述了利用人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系生產(chǎn)人單克隆抗體(KozborJ.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)51-63頁)。
接著可以測定培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對該抗原的單克隆抗體的存在。鑒定了所需雜交瘤細(xì)胞之后，可以通過有限稀釋操作對克隆進(jìn)行亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding，1986)。用于該目的的合適培養(yǎng)基包括如Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基?；蛘呖梢泽w內(nèi)(如作為哺乳動物的腹水)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。
可以通過常規(guī)免疫球蛋白純化操作從培養(yǎng)基或腹水中分離或純化亞克隆分泌的單克隆抗體，例如A蛋白-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
還可以通過重組DNA方法產(chǎn)生單克隆抗體，如美國專利No.4,816,567所述。
3.人源化抗體針對本發(fā)明蛋白質(zhì)抗原的抗體還可以包括人源化抗體或人抗體。這些抗體適用于對人施用而不引起人對所施用免疫球蛋白的免疫應(yīng)答?？贵w的人源化形式為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)，其原則上由人免疫球蛋白序列組成，并含有最少的來自非人免疫球蛋白的序列。可以遵循Winter及同事的方法(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))，通過將嚙齒類CDR或CDR序列替換為人抗體的相應(yīng)序列來進(jìn)行人源化(還可參閱美國專利No.5,225,539)人源化抗體最好還包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，一般是人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Jones等，1986；Riechmann等，1988以及Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596)。
4.人抗體全人抗體基本指其中輕鏈和重鏈(包括CDR)的全部序列都來自人基因的抗體分子。本文中這樣的抗體被稱為“人抗體”或“全人抗體”?？梢酝ㄟ^三源雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(參閱Kozbor，等(1983)Immunol Today 472)和EBV雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生人單克隆抗體來制備人單克隆抗體(參閱Cole，等(1985)，MONOCLONALANTIBODIES ANDCANCERTHERAPY，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁)?？梢栽诒景l(fā)明的實踐中使用人單克隆抗體，并且可以使用人雜交瘤(參閱Cote，等(1983)Proc Natl Acad SciUSA 802026-2030)或通過用EB(Epstein Barr)病毒體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞來生產(chǎn)(參閱參閱Cole，等(1985)，MONOCLONALANTIBODIES ANDCANCERTHERAPY，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁)。
此外，還可以使用其他技術(shù)產(chǎn)生人抗體，包括噬菌體展示文庫(Hoogenboom和Winter(1991)J.Mol.Biol.，227381；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222581)。類似的，可以通過將人免疫球蛋白基因座引入內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或完全失活的轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)來產(chǎn)生人抗體。在攻擊后觀察到了人抗體產(chǎn)生，其在所有方面(包括基因重排、裝配和抗體譜)都與人中觀察到的高度相似。該方法描述于例如美國專利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和Marks等(1992)(Bio/Technology 10，779-783)；Lonberg等((1994)Nature 368856-859)；Morrison((1994)Nature 368，812-13)；Fishwild等，((1996)Nature Biotechnology 14，845-51)；Neuberger((1996)Nature Biotechnology14，826)；以及Lonberg和Huszar((1995)Intern.Rev.Immunol.13 65-93)。產(chǎn)生目的抗體如人抗體的方法還公開于美國專利No.5,916,771。
還可以使用轉(zhuǎn)基因非人動物生人抗體，所述動物經(jīng)修飾從而應(yīng)答于抗原攻擊而產(chǎn)生全人抗體而不是動物的內(nèi)源抗體(參閱出版物WO94/02602)。使非人動物中編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈的內(nèi)源基因失能，并將編碼人重鏈和輕鏈免疫球蛋白的活性基因座插入宿主基因組。使用例如含有必需人DNA區(qū)段的酵母人工染色體來整合人基因。通過含有少于全部修飾補(bǔ)體(complement)的中間轉(zhuǎn)基因動物的雜交育種來以后代獲得提供所有所需修飾的動物。
5.Fab片段和單鏈抗體根據(jù)本發(fā)明，可適用技術(shù)產(chǎn)生對本發(fā)明抗原蛋白具有特異性的單鏈抗體(參閱如美國專利No.4,946,778)。此外，可適用方法構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(參閱如Huse，等，1989 Science 2461275-1281)，以允許迅速并高效地鑒定對蛋白質(zhì)或其衍生物、片段、類似物或同源物具有所需特異性的單克隆Fab抗體片段。可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生含有針對蛋白質(zhì)抗原的獨特型的抗體片段，包括但不僅限于(i)通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab′)2片段；(ii)通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵而產(chǎn)生的Fab片段；(iii)通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子而產(chǎn)生的Fab片段和(iv)Fv片段。
6.雙特異性抗體雙特異性抗體是對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆(優(yōu)選人或人源化)抗體。在本案中，結(jié)合特異性之一是針對本發(fā)明抗原蛋白質(zhì)的。第二結(jié)合靶標(biāo)是任何其他抗原，有利地是細(xì)胞表面蛋白或受體或受體亞基。
產(chǎn)生雙特異性抗體的方法為本領(lǐng)域已知。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組產(chǎn)生是基于共表達(dá)兩種免疫球蛋白重鏈/輕鏈對，其中兩種重鏈具有不同的特異性(Milstein和Cuello，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤)產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有1種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟實現(xiàn)正確分子的純化。類似的操作公開于1993年5月13日出版的WO 93/08829和Traunecker等(1991)EMBO J.，103655-3659。產(chǎn)生雙特異性抗體的其他細(xì)節(jié)參閱如Suresh等(1986)Methods in Enzymology，121210。
7.免疫綴合物本發(fā)明還涉及包含與細(xì)胞毒性劑綴合的抗體的免疫綴合物，所述細(xì)胞毒性劑為例如化學(xué)治療劑、毒素(如細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性綴合物)。
上文已經(jīng)描述了用于產(chǎn)生這類免疫綴合物的化學(xué)治療劑?？梢允褂玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、莫迪素A鏈、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin)、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制劑、多花白樹毒蛋白、絲林毒素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊諾霉素(enomycin)和單端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。多種放射性核素可用于產(chǎn)生放射性綴合抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
使用多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑產(chǎn)生抗體與細(xì)胞毒性劑的綴合物，所述蛋白偶聯(lián)劑為例如N-琥珀酰亞胺基-3-2-吡啶二硫代基-丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫醇(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(如己二亞氨酸二甲酯鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HCL))、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(如戊二醛)、雙疊氮化合物(如雙(對疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(如雙(對重氮苯甲?；?乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯基2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(如1，5-二氟代-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等，Science，2381098(1987)所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。14C標(biāo)記的1-異硫氰酰基芐基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸綴合到抗體上的示例性螯合劑，參閱WO94/11026。
8.針對TORC蛋白的抗體的診斷應(yīng)用針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體可用于本領(lǐng)域已知的與蛋白質(zhì)定位和/或定量有關(guān)的方法中(如用于測量適當(dāng)?shù)纳順悠分械牡鞍踪|(zhì)水平、用于診斷方法、用于蛋白質(zhì)造影等)?？筎ORC抗體可用于檢測或定量樣品中的TORC蛋白抗原。在許多這樣的實施方案中，抗體用于免疫吸附測定。
對本發(fā)明蛋白具有特異性的抗體可用于通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如免疫親和層析或免疫沉淀來分離該蛋白質(zhì)。這樣的抗體可便于從細(xì)胞中純化天然蛋白質(zhì)抗原以及純化宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的抗原?？梢酝ㄟ^將抗體與可檢測物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)來使檢測更為便利?？蓹z測物質(zhì)的實例包括多種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光物質(zhì)的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基氨基熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的實例包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的實例包括熒光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性物質(zhì)的實例包括125I、131I、35S或3H。
9.抗體的藥物組合物可以以藥物組合物的形式施用特異性結(jié)合本發(fā)明蛋白的抗體以及通過本文公開的篩選測定鑒定的其他分子，以用于治療多種疾病。涉及制備這類組合物的原則和注意事項以及組分選擇的指南提供于例如Remington《The Science And Practice Of Pharmacy》第19版(Alfonso R.Gennaro，等，editors)Mack Pub.Co.，Easton，Pa.1995；《Drug AbsorptionEnhancementConcepts，Possibilities，Limitations，And Trends》，HarwoodAcademic Publishers，Langhorne，Pa.，1994以及《Peptide And ProteinDrug Delivery》(Advances In Parenteral Sciences，卷4)，1991，M.Dekker，New York。
還可以在膠體藥物遞送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米囊)或巨乳中將活性成分包進(jìn)(例如分別通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合)制備的微膠囊中，例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊以及聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊。
10.抗體療法本發(fā)明的抗體(包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體和全人抗體)可以用作治療劑。這樣的物質(zhì)一般用于治療或預(yù)防受試者的疾病或病狀。對受試者施用抗體制品(優(yōu)選對其靶抗原具有高特異性和高親和力的抗體制品)，所述抗體制品一般由于其與靶標(biāo)的結(jié)合而具有效應(yīng)。這樣的效應(yīng)可以是兩種之一，取決于給定抗體分子與所述靶抗原之間相互作用的具體性質(zhì)。在第一種情況下，施用抗體消除或抑制靶標(biāo)與其天然結(jié)合的內(nèi)源配體之間的結(jié)合。在這種情況下，抗體與靶標(biāo)結(jié)合并掩蓋天然存在配體的結(jié)合位點，其中該配體作為效應(yīng)分子。從而受體介導(dǎo)配體負(fù)責(zé)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
或者，效應(yīng)可以是由于與靶分子上的效應(yīng)物結(jié)合位點結(jié)合而引發(fā)生理結(jié)果。在這種情況下，靶標(biāo)，即其內(nèi)源配體在疾病或病理下缺乏或受損的受體，與作為代用效應(yīng)物配體的抗體結(jié)合，起始基于受體的受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。
需要施用的量還取決于抗體對其特異性抗原的結(jié)合親和力，還取決于其在所施用受試者的自由體積中清除的速率。作為非限制性實例，本發(fā)明抗體或抗體片段的治療有效劑量的一般范圍約0.1mg/kg體重至約50mg/kg體重。一般給藥頻率范圍可以從例如每天兩次至每周一次。
TORC重組載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一方面涉及含有編碼TORC蛋白核酸的載體(優(yōu)選表達(dá)載體)或其衍生物、片段、類似物或同源物。本文使用的術(shù)語“載體”指能夠運輸與其連接的另一核酸的核酸分子。一類載體為“質(zhì)?！保缚梢栽谄渲胁迦氪B接的額外DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體為病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可以連接進(jìn)病毒基因組中。某些載體能夠在其引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和附加體哺乳動物載體)。其他載體(如非附加體哺乳動物載體)在引入宿主細(xì)胞后整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，從而與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)與其有效連接的基因的表達(dá)。這些載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體通常為質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最普遍使用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括這些發(fā)揮等效功能的其他形式的表達(dá)載體，如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含適于核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式的本發(fā)明核酸，這意味著重組表達(dá)載體包括一種或多種調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞來選擇，并與待表達(dá)的核酸序列有效連接。在重組表達(dá)載體中，“有效連接”指目的核苷酸序列以允許核苷酸序列表達(dá)的方式與調(diào)節(jié)序列連接(如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或當(dāng)載體引入宿主細(xì)胞時的宿主細(xì)胞中)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”旨在包括啟動子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(如多腺苷酸化信號)。這些調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel(1990)《GENEEXPRESSIONTECHNOLOGYMETHODS INENZYMOLOGY》185，AcademicPress，San Diego，Calif。調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)核酸序列在許多類型的宿主細(xì)胞中組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)序列和指導(dǎo)核苷酸序列僅在某些宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列(如組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，表達(dá)載體的設(shè)計可以取決于例如以下這些因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等。可以將本發(fā)明的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生由本文公開的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，包括融合蛋白或肽(如TORC蛋白、TORC蛋白的突變形式、融合蛋白等)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以設(shè)計用于在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)TORC蛋白。例如，TORC蛋白可以在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel(1990)中有進(jìn)一步的討論?；蛘呖梢泽w外轉(zhuǎn)錄并翻譯重組表達(dá)載體，例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。
可以使用載體從任何所需基因中選擇啟動子區(qū)，所述載體在限制性位點或用于引入候選啟動子片段(即可能含有啟動子的片段)的位點下游含有缺乏啟動子區(qū)的報告基因轉(zhuǎn)錄單位(如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(“CAT”)或熒光素酶(LUC)轉(zhuǎn)錄單位)。例如，在CAT或LUC基因限制性位點上游將含啟動子的片段引入載體分別引起CAT或LUC活性的產(chǎn)生，所述活性可以通過標(biāo)準(zhǔn)CAT或LUC測定進(jìn)行檢測。適用于該目的的載體為本領(lǐng)域所熟知并且易于獲得。兩種這樣的載體為pKK232-8和pCM7。因此，用于表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的啟動子不僅包括熟知并且易于獲得的啟動子，還包括可使用報告基因通過上述技術(shù)便利地獲得的啟動子。
蛋白質(zhì)在原核生物中的表達(dá)最常使用含有組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體在大腸桿菌中進(jìn)行，所述啟動子指導(dǎo)融合或非融合蛋白的表達(dá)。在已知細(xì)菌啟動子中，適用于表達(dá)多核苷酸和多肽的為大腸桿菌lacI和lacZ啟動子、T3和T7啟動子、T5 tac啟動子、λPR、PL啟動子和trp啟動子。融合載體在其編碼的蛋白質(zhì)中(通常在重組蛋白的氨基端)添加若干氨基酸。這些融合載體一般用于三個目的(1)提高重組蛋白的表達(dá)；(2)提高重組蛋白的溶解度和(3)通過在親和純化中作為配體而輔助純化重組蛋白。在融合表達(dá)載體中，常在融合部分與重組蛋白接合處引入蛋白水解切割位點，以使在純化蛋白后可以將重組蛋白與融合部分分離。這樣的酶及其同源識別序列包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson(1988)Gene 6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，它們分別將靶重組蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A融合。
合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實例包括pTrc(Amrann等，(1988)Gene 69301-315)和pET 11d(Studier等(1990)《GENEEXPRESSIONTECHNOLOGYMETHODS INENZYMOLOGY》185，Academic Press，SanDiego，Calif.60-89)。
在另一實施方案中，TORC表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體。用于在釀酒酵母(S.cerivisae)中表達(dá)的載體實例包括pYepSec1(Baldari，等，(1987)EMBO J 6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell30933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)和picZ(InVitrogen Corp，SanDiego，Calif.)。
或者，可以使用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)TORC蛋白?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(如SF9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等(1983)Mol Cell Biol 32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
在另一個實施方案中，使用哺乳動物表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸。哺乳動物表達(dá)載體的實例包括pCDM8(Seed(1987)Nature329840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J 6187-195)。當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中使用時，經(jīng)常通過病毒調(diào)節(jié)元件提供表達(dá)載體的控制功能。例如，普遍使用的啟動子來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。其他真核啟動子包括CMV即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子如勞氏肉瘤病毒(“RSV”)啟動子，以及金屬硫蛋白啟動子如小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。
對于原核及真核細(xì)胞的其他合適的表達(dá)系統(tǒng)，參閱如Sambrook等，《MOLECULARCLONINGA LABORATORYMANUAL》第三版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，2001。
在另一實施方案中，重組哺乳動物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)核酸在特定細(xì)胞類型中優(yōu)先表達(dá)。合適的組織特異性啟動子的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝特異性，Pinkert等(1987)Genes Dev 1268-277)、淋巴特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv Immunol 43235-275)特別是T細(xì)胞受體啟動子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J 8729-733)和免疫球蛋白啟動子(Banerji等(1983)Cell 33729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33741-748)、神經(jīng)特異性啟動子(如神經(jīng)絲啟動子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 865473-5477)、胰特異性啟動子(Edlund等(1985)Science 230912-916)和乳腺特異性啟動子(如乳清啟動子；美國專利No.4,873,316和歐洲申請出版物No.264,166)。還包括發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子，如鼠源hox啟動子(Kessel和Gruss(1990)Science 249374-379)和甲胎球蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev 3537-546)。
本發(fā)明還提供包含以反義取向克隆進(jìn)表達(dá)載體的本發(fā)明DNA分子的重組表述載體。即DNA分子以允許(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)表達(dá)與TORCmRNA反義的RNA分子的方式與調(diào)節(jié)序列有效連接。與反義取向克隆的核酸有效連接的調(diào)節(jié)序列可以選擇指導(dǎo)反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中持續(xù)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列(如病毒啟動子和/或增強(qiáng)子)，或者可以選擇指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。關(guān)于使用反義基因的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)的討論參閱Weintraub等，“AntisenseRNA as a molecular tool for genetic analysis，”Reviews--Trends in Genetics，Vol.1(1)1986。
宿主細(xì)胞本發(fā)明另一方面涉及引入了本發(fā)明重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本文中術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”可互換使用。應(yīng)該理解，這些術(shù)語不僅指特定的受試細(xì)胞，還指這些細(xì)胞的后代或可能的后代。因為在其后的世代中可能由于突變或環(huán)境影響而出現(xiàn)某些修飾，因此這些后代可能事實上不與親本細(xì)胞相同，但仍包括在本文使用的術(shù)語范圍內(nèi)。
宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。例如，可以在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)中表達(dá)TORC蛋白。其他合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
此外，可以選擇以所需的特定方式調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或修飾并加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這些修飾(如糖基化)和加工(如切割)對蛋白質(zhì)的功能可能是很重要的。不同的宿主細(xì)胞對蛋白質(zhì)的翻譯后加工和修飾具有不同的特征性和特定的機(jī)制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。為此，可以使用具有用于正確加工原始轉(zhuǎn)錄物、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)器的真核宿主細(xì)胞。這些哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不僅限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38細(xì)胞。
可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入原核或真核細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”旨在指多種用于將外源核酸(如DNA)引入宿主細(xì)胞的本領(lǐng)域已知技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可見于Sambrook，等(2001)、Brent等(2003)以及其他實驗室手冊。
就哺乳動物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言，為了鑒定和選擇穩(wěn)定整合體，一般將編碼可選擇標(biāo)記(如對抗生素的抗性)的基因與目的基因一起引入宿主細(xì)胞中。多種可選擇標(biāo)記包括賦予對藥物(如G418、潮霉素和氨甲喋呤)的抗性的標(biāo)記。
細(xì)胞培養(yǎng)使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件繁殖用于表達(dá)TORC的細(xì)胞培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染前24小時(約80％匯合)，用胰蛋白酶處理細(xì)胞并用無抗生素的新鮮培養(yǎng)基以1∶5稀釋(1-3×105細(xì)胞/ml)，轉(zhuǎn)移至24孔板(500ml/孔)。使用市售的脂轉(zhuǎn)染試劑盒或通過FuGENE6或通過電穿孔、磷酸鈣顆粒摻入或生物射彈進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用帶有陽性和陰性對照的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)監(jiān)測TORC的表達(dá)。陽性對照是天然表達(dá)TORC的細(xì)胞，而陰性對照是不表達(dá)TORC的細(xì)胞。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞如培養(yǎng)的原核或真核宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)(即表達(dá))TORC蛋白。因此，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)TORC蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中引入了編碼TORC蛋白的重組表達(dá)載體)，從而生產(chǎn)TORC蛋白。在另一實施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離TORC蛋白。
轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可用于產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞為受精的卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，其中引入了TORC蛋白編碼序列。接著可以使用這些宿主細(xì)胞產(chǎn)生在其基因組中引入了外源TORC蛋白序列的非人轉(zhuǎn)基因動物或改變了內(nèi)源TORC蛋白序列的同源重組動物。這樣的動物可用于研究TORC蛋白的功能和/或活性以及用于鑒定和/或評估TORC蛋白活性的調(diào)節(jié)劑。本文使用的“轉(zhuǎn)基因動物”指非人動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選嚙齒類如大鼠或小鼠，其中動物的一種或多種細(xì)胞包含轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動物的其他實例包括非人靈長類、綿羊、狗、牛、山羊、雞、兩棲動物等。轉(zhuǎn)基因是整合進(jìn)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞基因組的外源DNA，并且所述外源DNA在成熟動物的基因組中保留，從而指導(dǎo)所編碼的基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因動物的一種或多種細(xì)胞類型或組織中表達(dá)。本文使用的“同源重組動物”是非人動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選小鼠，其中在發(fā)育成動物之前，通過內(nèi)源基因與引入動物細(xì)胞(如動物的胚胎細(xì)胞)的外源DNA分子之間的同源重組改變了內(nèi)源TORC基因。
可以通過(如通過顯微注射、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染)將TORC蛋白編碼核酸引入受精卵母細(xì)胞的雄原核，并使卵母細(xì)胞在假孕的雌性代孕動物中發(fā)育來產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物。通過胚胎操作和顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物特別是諸如小鼠等動物的方法已成為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，并描述于例如美國專利No.4,736,866、4,870,009和4,873,191以及Hogan 1986，《MANIPULATING THEMOUSEEMBRYO》，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y中。接著可以使用轉(zhuǎn)基因初建(founder)動物繁育帶有轉(zhuǎn)基因的其他動物。此外，帶有編碼TORC蛋白的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物還可以與帶有其他轉(zhuǎn)基因的其他轉(zhuǎn)基因動物雜交。同源重組載體的描述參閱如Thomas等(1987)Cell 51503。將載體引入胚胎干細(xì)胞系(例如通過電穿孔)并選擇引入的TORC蛋白基因與內(nèi)源TORC蛋白基因同源重組的細(xì)胞(參閱如Li等(1992)Cell 69915)。參閱如Bradley 1987，《TERATOCARCINOMAS ANDEMBRYONICSTEMCELLSA PRACTICALAPPROACH》，Robertson編輯IRL，Oxford，113-152頁和Bradley(1991)Curr Opin Biotechnol 2823-829；PCT國際公開WO 90/1184；WO91/01140；WO 92/0968和WO 93/04169。
藥物組合物以治療有效劑量對患者施用本文公開的藥物組合物，所述藥物組合物用于預(yù)防、治療或改善與異常CRE依賴性基因表達(dá)或趨化因子異?；罨嚓P(guān)的病理疾病。治療有效劑量指化合物的量足以引起對所述疾病發(fā)生的基本抑制、治療或改善。
與一種或多種其他治療劑“組合”給藥包括同時(共存)和任何順序的連續(xù)給藥。
本文使用的“載體”包括在使用劑量和濃度下對接觸的哺乳動物無毒的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。生理可用載體經(jīng)常是水性pH緩沖溶液。生理可用載體的實例包括緩沖液如磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液和其他有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑包括抗壞血酸；小分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；形成鹽的抗衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
本發(fā)明的TORC核酸分子、TORC蛋白和抗TORC蛋白抗體及其衍生物、片段、類似物和同源物在本文中稱為“活性化合物”或“治療劑”。這些治療劑可以摻入適于對患者施用的藥物組合物中。這樣的組合物一般包含核酸分子、蛋白質(zhì)或抗體和可藥用載體。
本文使用的“可藥用載體”旨在包括與藥物施用相容的任一或所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。合適的載體在教科書有所描述，如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，Gennaro AR編輯第20版(2000)Williams&Wilkins PA，USA和《Wilsonand Gisvold’s Textbook of Organic Medicinal and PharmaceuticalChemistry》，Delgado和Remers，Lippincott-Raven，所述教科書均引入本文為參考?？稍谶@些載體或稀釋劑中使用的組分的優(yōu)選實例包括但不僅限于水、鹽水、磷酸鹽、羧酸鹽、氨基酸溶液、Ringer溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。還可以使用脂質(zhì)體和非水性載體如不揮發(fā)油。
將本發(fā)明的藥物組合物配制為與其預(yù)期給藥途徑相容。給藥途徑的實例包括胃腸外如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口(如吸入)、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜和直腸給藥。用于胃腸外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或混懸液可以包括以下組分無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸、檸檬酸或磷酸以及用于調(diào)整張力的物質(zhì)如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂盟峄驂A調(diào)整pH，如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外制品可以包裝在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制成的多劑量管中。
就吸入給藥而言，化合物以氣溶膠噴霧的形式由加壓容器或含有適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑(如氣體如二氧化碳)的分配器或噴霧器中遞送。
還可以通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方式全身給藥。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥，在制劑中使用適用于待滲透屏蔽的滲透劑。這類滲透劑為本領(lǐng)域所共知，包括如用于經(jīng)粘膜給藥的去污劑、膽鹽和夫西地酸衍生物?？梢酝ㄟ^使用鼻腔噴霧或栓劑實現(xiàn)經(jīng)粘膜給藥。對于經(jīng)皮給藥，將活性化合物配制為軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或霜劑中，如本領(lǐng)域所共知。
還可以以用于直腸遞藥的栓劑(如用常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂及其他甘油酯)或保留灌腸劑的形式制備化合物。
可以制備緩釋制劑。合適的緩釋制劑的實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為有形物品如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實例包括多元酯、水凝膠(例如聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯或聚乙烯醇)、聚乳酸(美國專利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRCN DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的注射用微球)以及聚-D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乙酸-乙醇酸使分子釋放超過100天，而某些水凝膠在較短的時間段中釋放藥物活性成分。
已經(jīng)使用人生長激素(rhGH)、干擾素-(rhIFN-)、白細(xì)胞介素-2和MN rgpl20成功實現(xiàn)了用于緩釋的重組蛋白微囊化。Johnson等，Nat Med.2795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，271221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technology，8755-758(1990)；Cleland，“Design and Production ofSingle Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide MicrosphereSystems”，Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach，Powell和Newman編輯，(Plenum PressNew York.1995)，439-462頁；WO 97/03692，WO 96/40072，WO 96/7399和美國專利No.5,654,010。
本發(fā)明的核酸分子可以插入載體并作為基因治療載體使用?；蛑委熭d體可以包括反義多核苷酸和抑制性多核苷酸，包括microRNA(miRNA)、修飾的miRNA、小抑制性RNA(siRNA)和修飾的siRNA，其中如本發(fā)明所述引入修飾以至少賦予分子穩(wěn)定性。在基因治療的一個實施方案中，TORC核酸是在受試者中表達(dá)TORC蛋白或其片段或嵌合蛋白的表達(dá)載體的一部分。具體地，這樣的核酸具有與TORC編碼區(qū)有效連接的啟動子，所述啟動子為誘導(dǎo)型或組成型以及任選地為組織特異性。在另一具體實施方案中，使用這樣的核酸分子其中TORC編碼序列和任何其他目的序列的側(cè)翼為促進(jìn)在基因組期望位點同源重組的區(qū)域，從而提供TORC核酸的染色體內(nèi)表述(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342435-438)。
可以通過大量途徑中的任一種將基因治療載體遞送至受試者，如美國專利No.5,703,055所述，將其構(gòu)建為適當(dāng)?shù)暮怂岜磉_(dá)載體的一部分并施用，從而使其進(jìn)入胞內(nèi)，如通過施用缺陷型或減毒逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他表達(dá)載體進(jìn)行感染(參閱如美國專利No.4,980,286和下文提到的其他專利)或通過裸DNA直接注射或通過使用微粒轟擊(如基因槍；生物射彈，Dupont)或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包衣、包裹在脂質(zhì)體、微?；蛭⒛z囊中或通過與已知入核的肽結(jié)合施用、通過與經(jīng)受受體介導(dǎo)的胞吞作用的配體結(jié)合施用(參閱如美國專利No.5,166,320；5,728,399；5,874,297和6,030,954，均以其整體引入本文為參考)(可用于靶向特異性表達(dá)受體的細(xì)胞類型)等。因此遞送可包括例如靜脈內(nèi)注射、局部給藥(參閱美國專利No.5,328,470)或立體定位注射(參閱Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA913054-3057)?；蛑委熭d體的藥物制品可以包括處于可用稀釋劑中的基因治療載體，或者可以包含包埋基因遞送載體的緩釋基質(zhì)?；蛘撸?dāng)重組細(xì)胞可以產(chǎn)生完整的基因遞送載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)時，藥物制品可以包含一種或多種產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。
在替代實施方案中，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參閱如美國專利No.5,219,740、5,604,090和5,834,182)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)被修飾以缺失包裝病毒基因組和整合進(jìn)宿主細(xì)胞DNA中不必要的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。將待用于基因治療的TORC核酸克隆進(jìn)便于將基因遞送給患者的載體。
腺病毒是基因治療中可以使用的另一種病毒載體。在將基因遞送至呼吸上皮時腺病毒是特別有利的載體。腺病毒天然感染呼吸上皮，引起輕微的疾病?；谙俨《镜倪f送系統(tǒng)的其他靶標(biāo)為肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒具有能夠感染不分裂細(xì)胞的優(yōu)勢。進(jìn)行基于腺病毒的基因治療的方法描述于例如美國專利No.5,824,544、5,868,040、5,871,722、5,880,102、5,882,877、5,885,808、5,932,210、5,981,225、5,994,106、5,994,132、5,994,134、6,001,557和6,033,8843，所述文獻(xiàn)均以其整體引入本文為參考。
還已提出將腺相關(guān)病毒(AAV)用于基因治療。生產(chǎn)和使用AAV的方法描述于例如美國專利No.5,173,414、5,252,479、5,552,311、5,658,785、5,763,416、5,773,289、5,843,742、5,869,040、5,942,496和5,948,675，所述文獻(xiàn)均以其整體引入本文為參考。
基因治療的另一方法涉及通過諸如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染的方法將基因轉(zhuǎn)移至組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞。轉(zhuǎn)移方法通常包括將可選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞。接著將細(xì)胞置于選擇壓力下，以分離攝取并表達(dá)轉(zhuǎn)移基因的細(xì)胞。接著將這些細(xì)胞遞送給患者。在優(yōu)選的實施方案中，用于基因治療的細(xì)胞是患者自體的細(xì)胞。
本發(fā)明的藥物組合物的劑量和期望的藥物濃度可以取決于具體的用途而變化。確定適當(dāng)?shù)膭┝炕蚪o藥途徑在普通醫(yī)師的能力之內(nèi)。動物實驗為確定人治療的有效劑量提供了可靠的指導(dǎo)?？梢园凑誐ordenti，J.和Chappell，W.“The use of interspecies scaling in toxicokinetics”，Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi等編輯，PergamonPress，New York 1989，42-96頁規(guī)定的原則進(jìn)行有效劑量的物種間縮放。
在體內(nèi)施用TORC多肽或其激動劑或拮抗劑時，取決于給藥途徑，正常劑量可以在每天約10ng/kg至100mg/kg哺乳動物體重之間變化，優(yōu)選約1.mu.g/kg/天至10mg/kg/天。文獻(xiàn)中提供了關(guān)于具體劑量和遞送方法的指導(dǎo)，參閱如美國專利No.4,657,760、5,206,344或5,225,212。應(yīng)該理解，不同的制劑對不同的治療化合物和不同的紊亂有效，例如，靶向一種器官或組織的給藥可能需要以與靶向其他器官或組織不同的方式遞送。可以配制化合物及其生理可用鹽和溶劑化物用于通過吸入或吹入(通過口或鼻)或局部、經(jīng)口、口腔、胃腸外或直腸給藥。
就經(jīng)口給藥而言，藥物組合物可以是例如片劑或膠囊劑的形式，所述片劑或膠囊劑使用可藥用賦形劑如粘合劑(如預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)、填充劑(如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)、潤滑劑(如硬脂酸鎂、滑石或硅)、崩解劑(如馬鈴薯淀粉或羥乙酸淀粉鈉)或濕潤劑(如十二烷基硫酸鈉)通過常規(guī)方法制備?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法包衣片劑。用于經(jīng)口給藥的液體制品可以是例如溶液、糖漿劑或混懸劑的形式，或者它們可以以干產(chǎn)品的形式出現(xiàn)，在使用前與水或其他合適的載體重構(gòu)?？梢允褂每伤幱锰砑觿┤鐟腋?如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)、乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性載體(如杏仁油、油酯類、乙醇或分級植物油)和防腐劑(如對羥基苯甲酸丙酯或?qū)αu基苯甲酸甲酯或山梨酸)通過常規(guī)方法制備這樣的液體制品。制品還可以適當(dāng)?shù)睾芯彌_鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。
可以適當(dāng)?shù)嘏渲朴糜诮?jīng)口給藥的制劑，以提供活性化合物的控釋。
對于口腔給藥，組合物可以是以常規(guī)方式制備的片劑或錠劑形式。
對于吸入給藥，以來自增壓包或噴霧器的氣溶膠噴霧的形式便利地遞送根據(jù)本發(fā)明使用的化合物，其中使用合適的推進(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在增壓氣霧劑的情況下，可以通過提供遞送計定量的閥門來確定劑量單位。用于吸入器或吹入器的膠囊或藥筒(如明膠的)可以制備為含有化合物的粉劑混合物和合適的粉劑基質(zhì)如乳糖或淀粉。
可以將化合物配制為用于通過注射(如推注或連續(xù)輸注)進(jìn)行胃腸外給藥。注射用制劑可以以單位劑量形式(如安瓿)或帶有防腐劑的多劑量容器出現(xiàn)。組合物可以為以下形式，如油性或水性載體中的混懸劑、溶液或乳劑，并且可以含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是在使用前與合適的載體(如無菌無熱原水)重構(gòu)的粉劑形式。
化合物還可以配制成直腸組合物如栓劑或保留灌腸劑，例如含有常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂或其他甘油酯。
除了上述劑型以外，化合物還可以配制為貯藏制品。這些長效制劑可以通過植入(如皮下或肌內(nèi))或通過肌內(nèi)注射給藥。因此，化合物可以與合適的聚合物或疏水材料(例如作為可用油中的乳劑)或者離子交換樹脂一起配制或配制為微溶衍生物(如作為微溶鹽)。
需要時，組合物可以以含有一個或多個單位劑量形式活性成分的包裝或分配裝置的形式出現(xiàn)。包裝可以包含例如金屬或塑料箔，例如水泡眼包裝。包裝或分配裝置可以含有給藥說明書。
適用于本發(fā)明的藥物組合物包括這樣的組合物其中包含有效劑量的活性成分，以實現(xiàn)預(yù)期目的。有效劑量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
對于任何化合物，首先可以在細(xì)胞培養(yǎng)測定(如癌細(xì)胞)或動物模型(通常為小鼠、兔、狗或豬)中估計治療有效劑量。動物模型還可用于確定適當(dāng)?shù)臐舛确秶徒o藥途徑。可以在動物模型中配制劑量，以獲得包括IC50(即測試化合物對癥狀實現(xiàn)半數(shù)最大抑制的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。接著可以使用這些信息確定用于人給藥的劑量和給藥途徑。
治療有效劑量指用于預(yù)防、治療或改善特定的目的病理疾病的有效成分的量?？梢栽诩?xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏型ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)操作確定有效劑量和毒性，如ED50(在50％群體中具有療效的劑量)和LD50(對50％群體致死的劑量)。毒效應(yīng)與療效之間的劑量比為治療指數(shù)，可以表示為比例LD50/ED50。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的藥物組合物。使用得自細(xì)胞培養(yǎng)物測定和動物研究的數(shù)據(jù)配制用于人的劑量范圍。這些組合物中含有的劑量優(yōu)選在包括ED50而沒有或幾乎沒有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。取決于使用的劑型、患者的敏感性和給藥途徑，劑量可以在該范圍內(nèi)變化。
具體的劑量可以由從業(yè)醫(yī)師考慮需要治療的受試者的相關(guān)因素來確定。調(diào)整劑量和給藥以提供足夠水平的活性部分或維持所需的效應(yīng)?？赡芸紤]的因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度、受試者的總體健康程度、受試者的年齡、體重和性別、飲食、給藥時間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性和對療法的耐受性/反應(yīng)性?？梢悦?至4天、每周或每兩周一次施用長效藥物組合物，取決于具體制劑的半衰期和清除率。
取決于給藥途徑，正常劑量可以在0.1至100,000微克、上至約1g之間變化。文獻(xiàn)中提供了關(guān)于具體劑量和遞送方法的指導(dǎo)，并且是本領(lǐng)域的從業(yè)醫(yī)師普遍可獲得的。對于核苷酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員將使用與蛋白質(zhì)或其抑制劑不同的劑型。類似的，多核苷酸或多肽的遞送對于具體的細(xì)胞、條件、位置等要具體對待。適用于蛋白質(zhì)經(jīng)口給藥的藥物劑型描述于例如美國專利5,008,114、5,505,962、5,641,515、5,681,811、5,700,486、5,766,633、5,792,451、5,853,748、5,972,387、5,976,569和6,051,561。
本發(fā)明的其他用途和方法本文描述的核酸分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)同源物和抗體可用于一種或多種以下方法(a)篩選測定；(b)預(yù)測醫(yī)學(xué)(如診斷測定、預(yù)后測定、監(jiān)測臨床試驗和藥物基因組學(xué))以及(c)治療方法(如治療和預(yù)防)。
篩選測定本發(fā)明提供用于鑒定調(diào)節(jié)劑的“篩選測定”，所述調(diào)節(jié)劑即與TORC蛋白結(jié)合或者對例如TORC蛋白表達(dá)或TORC蛋白活性具有刺激或抑制效應(yīng)的候選或測試化合物或物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、核酸或多核苷酸、肽、肽模擬物、小分子包括激動劑或拮抗劑、或其他藥物)。可以利用任一所述測定以及藥理學(xué)、血液學(xué)、內(nèi)科學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域從業(yè)醫(yī)師已知的其他測定，以篩選候選物質(zhì)作為治療劑的特性。已經(jīng)指出，本發(fā)明的治療劑包括蛋白質(zhì)、多肽、核酸或多核苷酸、肽、肽模擬物、小分子包括激動劑或拮抗劑、或本文所述其他藥物。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于篩選結(jié)合或調(diào)控TORC蛋白或多肽或其生物活性部分的篩選或測試化合物的方法?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的組合文庫法多種方法中的任一種獲得本發(fā)明的測試化合物，包括生物文庫、空間可尋址的平行固相或液相文庫、需要去褶合的合成文庫法、“一珠一化合物”文庫法和使用親和層析選擇的合成文庫法。生物文庫法限于肽文庫，而其他四種方法可用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文庫(Lam(1997)Anticancer Drug Des 12145)。
用于合成分子文庫的方法實例可見于本領(lǐng)域，例如DeWitt等(1993)Proc Natl Acad Sci U.S.A.906909；Erb等(1994)Proc Natl Acad Sci U.S.A.9111422；Zuckermann等(1994)J Med Chem 372678；Cho等(1993)Science 2611303；Carrell等(1994)Angew Chem Int Ed Engl 332059；Carell等(1994)Angew Chem Int Ed Engl 332061和Gallop等(1994)JMed Chem 371233。
化合物文庫可以呈現(xiàn)于溶液(如Houghten(1992)Biotechniques13412-421)或珠子(Lam(1991)Nature 35482-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364555-556)、細(xì)菌(Ladner美國專利No.5,223,409)、孢子(LadnerUSP′409)、質(zhì)粒(Cull等(1992)Proc Natl Acad Sci USA 891865-1869)或噬菌體(Scott和Smith(1990)Science 249386-390；Devlin(1990)Science249404-406；Cwirla等(1990)Proc Natl Acad Sci U.S.A.876378-6382；Felici(1991)JMolBiol 222301-310；Ladner，見上文)上。
在重要的實施方案中，基于細(xì)胞的測定包括使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生標(biāo)記的來自異源TORC多核苷酸的TORC蛋白。通過檢查標(biāo)記TORC的亞細(xì)胞分布來評估可以測試效率的候選活性物質(zhì)應(yīng)用(見實施例)。
在另一個實施方案中，測定為基于細(xì)胞的測定，其中使在細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式TORC蛋白或其生物活性部分的細(xì)胞與測試化合物接觸，并測定測試化合物與TORC蛋白結(jié)合的能力。細(xì)胞可以是例如哺乳動物來源或是酵母細(xì)胞?？梢酝ㄟ^如以下方法測定測試化合物與TORC蛋白的結(jié)合將測試化合物與放射性同位素或酶標(biāo)記偶聯(lián)，從而可以通過檢測復(fù)合物中標(biāo)記的化合物來測定測試化合物與TORC蛋白或其生物活性部分的結(jié)合。例如，可以用125I、35S、14C或3H直接或間接標(biāo)記測試化合物，并通過直接計數(shù)放射性發(fā)射或通過閃爍計數(shù)檢測放射性同位素。或者，可以用例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶來酶標(biāo)記測試化合物，并通過測定適當(dāng)?shù)孜镏廉a(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來檢測酶標(biāo)記。
在另一實施方案中，測定為基于細(xì)胞的測定，包括使在細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式TORC蛋白或其生物活性部分的細(xì)胞與測試化合物接觸，并測定測試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)TORC蛋白或其生物活性部分的活性的能力?？梢酝ㄟ^例如測定TORC蛋白與TORC蛋白靶分子結(jié)合或相互作用的能力來測定測試化合物調(diào)節(jié)TORC蛋白或其生物活性部分的活性的能力。在一個實施方案中，TORC蛋白靶分子是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組分，所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)胞外信號(如通過化合物與膜結(jié)合TORC蛋白分子的結(jié)合產(chǎn)生的信號)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞。靶標(biāo)可以是例如具有催化活性的第二胞內(nèi)蛋白或促進(jìn)信號傳導(dǎo)分子與TORC蛋白結(jié)合的蛋白。
可以通過用于測定直接結(jié)合的上述方法之一實現(xiàn)對TORC蛋白與TORC蛋白靶分子結(jié)合或相互作用的能力的測定。在一個實施方案中，可以通過測定靶分子的活性實現(xiàn)對TORC蛋白與TORC蛋白靶分子結(jié)合或相互作用的能力的測定。例如，可以通過以下方法測定靶分子的活性檢測靶標(biāo)對胞內(nèi)第二信使的誘導(dǎo)(即胞內(nèi)Ca2+、二?；视?、IP3等)、檢測靶標(biāo)對適當(dāng)?shù)孜锏拇呋?酶促活性、檢測對報道基因的誘導(dǎo)(包括與編碼可檢測標(biāo)記(如熒光素酶)的核酸有效連接的TORC應(yīng)答調(diào)節(jié)元件)、或檢測細(xì)胞應(yīng)答，例如細(xì)胞存活、細(xì)胞分化或細(xì)胞增殖。
又在另一個實施方案中，本發(fā)明的測定是無細(xì)胞測定，包括使TORC蛋白或其生物活性部分與測試化合物接觸，并測定測試化合物與TORC蛋白或其生物活性部分結(jié)合的能力?？梢匀缟鲜鲋苯踊蜷g接測定測試化合物與TORC蛋白的結(jié)合。在一個實施方案中，測定包括使TORC蛋白或其生物活性部分與已知結(jié)合TORC蛋白的化合物接觸以形成測定混合物、使測定混合物與測試化合物接觸，并測定測試化合物與TORC蛋白相互作用的能力，其中測定測試化合物與TORC蛋白相互作用的能力包括測定測試化合物與已知化合物相比優(yōu)先與TORC蛋白或其生物活性部分結(jié)合的能力。
在另一實施方案中，測定為無細(xì)胞測定，包括使TORC蛋白或其生物活性部分與與測試化合物接觸，并測定測試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)TORC蛋白或其生物活性部分的活性的能力。可以通過上述測定直接結(jié)合的方法之一測定TORC蛋白與TORC蛋白靶分子結(jié)合的能力來測定測試化合物調(diào)節(jié)TORC蛋白活性的能力。在備選實施方案中，可以通過測定TORC蛋白進(jìn)一步調(diào)節(jié)TORC蛋白靶分子的能力來實現(xiàn)測定測試化合物調(diào)節(jié)TORC蛋白活性的能力。例如，可以如上述測定靶分子對適當(dāng)?shù)孜锏拇呋?酶促活性。
又在另一實施方案中，無細(xì)胞測定包括使TORC蛋白或其生物活性部分與已知結(jié)合TORC蛋白的化合物接觸以形成測定混合物、使測定混合物與測試化合物接觸，并測定測試化合物與TORC蛋白相互作用的能力，其中測定測試化合物與TORC蛋白相互作用的能力包括測定TORC蛋白與TORC蛋白靶分子優(yōu)先結(jié)合或調(diào)節(jié)TORC蛋白靶分子活性的能力。
在上述本發(fā)明測定方法的多于一個實施方案中，可能需要固定TORC蛋白或其靶分子，以便于從一種或兩種蛋白質(zhì)的非復(fù)合形式中分離復(fù)合形式以及實現(xiàn)測定的自動化?？梢栽谶m于容納反應(yīng)物的任何容器中實現(xiàn)存在或不存在候選化合物情況下測試化合物與TORC蛋白的結(jié)合或TORC蛋白與靶分子的相互作用。這些容器的實例包括微孔板、試管和微量離心管。在一個實施方案中，可以提供添加了允許一種或兩種蛋白與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
用于將蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上的其他技術(shù)也可以用于本發(fā)明的篩選測定。例如，可以使用綴合生物素和鏈霉抗生物素蛋白來固定TORC蛋白或其靶分子?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)(如生物素化試劑盒，PierceChemicals，Rockford，Ill.)由生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化的TORC蛋白或靶分子，并固定在用鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemical)中。或者，可以在平板的孔中衍生與TORC蛋白或靶分子反應(yīng)但不干擾TORC蛋白與其靶分子結(jié)合的抗體，未結(jié)合的靶標(biāo)或TORC通過抗體綴合而留在孔中。除了上文所述用于GST固定復(fù)合物的方法以外，用于檢測這類復(fù)合物的方法包括使用與TORC蛋白或靶分子反應(yīng)的抗體進(jìn)行復(fù)合物的免疫檢測，以及依賴于檢測與TORC蛋白或靶分子相關(guān)的酶活性的酶聯(lián)試驗。
在另一方面，在這樣的方法中鑒定CREB促進(jìn)過程的調(diào)節(jié)劑使細(xì)胞與候選化合物接觸并測定細(xì)胞中TORC mRNA或蛋白的表達(dá)。將存在候選化合物時TORC mRNA或蛋白的表達(dá)水平與不存在候選化合物時TORC mRNA或蛋白的表達(dá)水平相比較。接著可以將候選化合物鑒定為TORC表達(dá)的調(diào)節(jié)劑和/或CREB促進(jìn)過程的調(diào)節(jié)劑。例如，若存在候選化合物時TORC mRNA或蛋白的表達(dá)高于(統(tǒng)計學(xué)意義地高于)不存在候選化合物時的表達(dá)，則候選化合物被鑒定為TORC mRNA或蛋白表達(dá)的刺激劑?；蛘?，若存在候選化合物時TORC mRNA或蛋白的表達(dá)低于(統(tǒng)計學(xué)意義地低于)不存在候選化合物時的表達(dá)，則候選化合物被鑒定為TORC mRNA或蛋白表達(dá)的抑制劑。可以通過本文所述檢測CREB促進(jìn)過程或TORC mRNA或蛋白的調(diào)節(jié)劑的方法來測定細(xì)胞中TORCmRNA或蛋白的表達(dá)水平。
又在本發(fā)明的另一實施方案中，TORC蛋白可以在雙雜交測定或三雜交測定中用作“誘餌蛋白”(參閱如美國專利No.5,283,317；Zervos等(1993)Cell 72223-232；Madura等(1993)J Biol Chem 26812046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques 14920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene81693-1696和Brent WO 94/10300)，以鑒定與TORC蛋白結(jié)合或相互作用(“TORC蛋白結(jié)合蛋白”或“TORC蛋白-bp”)并調(diào)節(jié)TORC蛋白活性的其他蛋白質(zhì)。這些TORC蛋白結(jié)合蛋白也可能作為如TORC蛋白途徑的上游或下游元件參與TORC蛋白信號的傳播。
雙雜交系統(tǒng)基于大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子的組件性質(zhì)，其由分開的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域組成。簡言之，該測定使用兩種不同的DNA構(gòu)建體。在一個構(gòu)建體中，編碼TORC蛋白的基因與編碼已知轉(zhuǎn)錄因子(如GAL-4)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因融合。在另一構(gòu)建體中，將來自DNA序列文庫的編碼未鑒定蛋白(“獵物”或“樣品”)的DNA序列與編碼已知轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)構(gòu)域的基因融合。如果“誘餌”與“獵物”蛋白能夠在體內(nèi)相互作用，形成TORC蛋白依賴性復(fù)合物，則轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合和激活結(jié)構(gòu)域互相接近。這種接近使與應(yīng)答于該轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點有效連接的報道基因(如LacZ)轉(zhuǎn)錄?？梢詸z測報道基因的表達(dá)，并分離含有功能性轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞集落，并用于獲得編碼與TORC蛋白相互作用的蛋白質(zhì)的克隆基因。
還可以體內(nèi)進(jìn)行篩選。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明包括通過施用測試化合物篩選調(diào)節(jié)劑的方法，所述調(diào)節(jié)劑在TORC蛋白相關(guān)疾病中具有活性或為其潛在因素或?qū)ζ湟赘?，或者在患TORC相關(guān)疾病風(fēng)險增高的測試動物中具有活性或為其潛在因素或?qū)ζ湟赘?。在一些實施方案中，測試動物重組表達(dá)TORC多肽。測量施用化合物后測試動物中多肽的活性，并將測試動物中蛋白質(zhì)的活性與未施用所述多肽的對照動物中該多肽的活性比較。所述測試動物中所述多肽活性相對于對照動物的改變表示測試化合物是TORC相關(guān)疾病的潛在因素或?qū)ζ湟赘械恼{(diào)節(jié)劑。
在一些實施方案中，測試動物是重組測試動物，所述重組測試動物以相對于野生型測試動物提高的水平表達(dá)測試蛋白轉(zhuǎn)基因或表達(dá)啟動子控制下的轉(zhuǎn)基因。優(yōu)選地，啟動子不是轉(zhuǎn)基因的天然基因啟動子。
本發(fā)明還涉及通過上述篩選測定鑒定的新物質(zhì)及其用于本文所述治療的用途。
預(yù)測醫(yī)學(xué)本發(fā)明還涉及預(yù)測醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中將診斷測定、預(yù)后測定、藥物基因組學(xué)和監(jiān)測臨床試驗用于預(yù)后(預(yù)測)目的，從而預(yù)防性地治療個體。因此，本發(fā)明的一個方面涉及診斷測定，以測定生物樣品(如血、血清、細(xì)胞、組織)中CREB啟動過程或TORC蛋白和/或核酸表達(dá)以及TORC蛋白活性的調(diào)節(jié)劑，從而確定個體是否患有與異常TORC表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病癥或有患病風(fēng)險。本發(fā)明還提供用于確定個體是否有發(fā)生TORC蛋白、核酸表達(dá)或活性相關(guān)病癥的診斷(或預(yù)測)測定。例如，可以測定生物樣品中TORC基因的突變。這樣的測定可用于診斷或預(yù)測目的，從而在病癥發(fā)生前預(yù)防性治療個體，所述病癥以TORC蛋白、核酸表達(dá)或活性為特征或與之相關(guān)。
診斷測定對應(yīng)于SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的TORC核酸中任一部分的多核苷酸或寡核苷酸可用于檢測含有相應(yīng)ORF基因的DNA，或者檢測相應(yīng)TORC基因或TORC蛋白樣基因的表達(dá)。例如，可以使用在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)的TORC核酸來鑒定該特定細(xì)胞類型的存在。
用于檢測CREB啟動過程決定性調(diào)節(jié)劑或生物樣品中TORC的存在或不存在的示例方法包括從測試受試者中獲得生物學(xué)樣品并將該生物學(xué)樣品與化合物或物質(zhì)接觸，從而檢測生物樣品中TORC蛋白的存在，所述化合物或物質(zhì)能夠檢測TORC蛋白或編碼TORC蛋白的核酸(例如mRNA、基因組DNA)。用于檢測TORC mRNA或基因組DNA的物質(zhì)為能夠與TORC mRNA或基因組DNA雜交的標(biāo)記的核酸探針。核酸探針可以是例如全長TORC核酸(例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5核酸)或其部分(如至少15、30、50、100、250或500個核苷酸長度并足夠與如上所述的TORC mRNA或基因組DNA在嚴(yán)格條件下特異性雜交的寡核苷酸)。用于本發(fā)明診斷測定的其他合適探針在本文中描述。
用于檢測TORC蛋白的物質(zhì)為能夠結(jié)合TORC蛋白的抗體，優(yōu)選為帶有可檢測標(biāo)記的抗體?？贵w可以是多克隆抗體，或更優(yōu)選單克隆抗體?？墒褂猛暾贵w或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。術(shù)語“標(biāo)記的”涉及探針或抗體時旨在包括通過將可檢測物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)至探針或抗體上的直接標(biāo)記探針或抗體，以及通過與另一直接標(biāo)記的試劑反應(yīng)而間接標(biāo)記探針或抗體。間接標(biāo)記的實例包括使用熒光標(biāo)記的二抗和用生物素末端標(biāo)記的DNA探針檢測一抗，從而其可用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行檢測。術(shù)語“生物樣品”旨在包括從受試者中分離的組織、細(xì)胞和生物學(xué)流體，以及存在于受試者中的組織、細(xì)胞和流體。即可使用本發(fā)明的方法檢測體外和體內(nèi)生物學(xué)樣品TORC mRNA、蛋白質(zhì)或基因組DNA。例如，用于檢測TORC mRNA的體外技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。用于檢測TORC蛋白的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、Western印跡、免疫沉淀和免疫熒光法。用于檢測TORC基因組DNA的體外技術(shù)包括Southern雜交。另外，用于檢測TORC蛋白的體內(nèi)技術(shù)包括向受試者中引入標(biāo)記的抗TORC蛋白抗體。例如，可用放射性標(biāo)記物標(biāo)記抗體，所述放射性標(biāo)記物的存在和定位可通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)檢測。
本發(fā)明還包括用于檢測生物樣品中CREB啟動過程的決定性調(diào)節(jié)劑或TORC存在的試劑盒。例如，所述試劑盒可包含能夠檢測生物樣品中CREB啟動過程的決定性調(diào)節(jié)劑或TORC蛋白或mRNA存在的標(biāo)記的化合物或物質(zhì)；用于確定樣品中TORC量的部件(means)和用于將樣品中TORC量與標(biāo)準(zhǔn)比較的部件。所述化合物或物質(zhì)可包裝在合適的容器中。試劑盒還可包含使用該試劑盒檢測TORC蛋白或核酸的說明書。
預(yù)后測定本文描述的診斷方法還可用于鑒定患有或有發(fā)生與異常TORC表達(dá)或活性相關(guān)疾病或紊亂風(fēng)險的受試者。例如，本文描述的測定法，如先前的診斷測定或隨后的測定，可用于鑒定患有或具有發(fā)生與異常TORC蛋白、核酸表達(dá)或活性相關(guān)疾病風(fēng)險的受試者。
此外，本文描述的預(yù)后測定可用于確定是否受試者可以用藥(例如激動劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或其他候選藥物)治療與異常TORC表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或紊亂。例如，這類方法可用于確定是否患者能夠用針對疾病(例如增生性紊亂、分化障礙、神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)紊亂等)的物質(zhì)有效治療。因此，本發(fā)明提供用于確定是否受試者能夠用物質(zhì)有效治療的方法，所述物質(zhì)針對與異常TORC表達(dá)或活性相關(guān)的疾病，在所述方法中獲得測試樣品并檢測TORC蛋白或核酸(例如其中TORC蛋白或核酸的存在可診斷受試者能夠施用治療與異常TORC表達(dá)或活性相關(guān)疾病的物質(zhì))。
本發(fā)明的方法還可用于檢測調(diào)節(jié)TORC表達(dá)和活性的TORC基因中的遺傳損傷，從而確定是否帶有損傷基因的受試者具有風(fēng)險或患有增生性紊亂、分化障礙、神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)紊亂等。在多個實施方案中，所述方法包括在來自受試者的樣品中檢測遺傳損傷的存在或不存在，所述損傷表征為至少一個影響編碼TORC蛋白的基因的完整性的改變，或TORC基因的錯誤表達(dá)。
監(jiān)測臨床效力監(jiān)測物質(zhì)(例如藥物、化合物)對TORC表達(dá)或活性的影響可應(yīng)用于臨床試驗。例如，通過本文所述篩選測定確定的物質(zhì)提高TORC基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平，或促進(jìn)TORC生物功能的效力可在顯示降低的TORC基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或下調(diào)的TORC活性的受試者臨床試驗中監(jiān)測。另外，通過篩選測定確定的物質(zhì)降低TORC基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或抑制TORC生物功能的效力可在顯示提高的TORC基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或上調(diào)的TORC活性的受試者的臨床試驗中監(jiān)測。在這類臨床試驗中，TORC和優(yōu)選的其他基因(涉及例如增生或神經(jīng)紊亂)的表達(dá)或活性可用作特定細(xì)胞應(yīng)答性的“讀出”或標(biāo)記物。這類方法包括評價TORC亞細(xì)胞定位，或測定TORC的CREB共激活活性。
治療方法本發(fā)明提供治療有患病風(fēng)險(或易患病的)或患有與異常TORC表達(dá)或活性相關(guān)疾病的受試者的預(yù)防和治療方法。
表征為提高(相對于未患有疾病或病癥的受試者)水平或生物活性的疾病和病癥可用拮抗(即降低或抑制)活性的療法治療。拮抗活性的療法可以以治療或預(yù)防的方式進(jìn)行?？墒褂玫寞煼ò?但不僅限于)(i)TORC多肽，或其衍生物、片段或同源物；(ii)TORC多肽抗體；(iii)編碼TORC肽的核酸；(iv)施用反義或siRNA TORC核酸；或(v)改變TORC肽及其結(jié)合配偶體之間相互作用的調(diào)節(jié)劑(即抑制劑、激動劑和拮抗劑，包括其他本發(fā)明的肽模擬物或?qū)Ρ景l(fā)明肽特異的抗體)。
表征為降低(相對于未患有疾病或病癥的受試者)水平或生物活性的疾病或病癥可用提高(即促進(jìn))活性的療法治療。上調(diào)活性的療法可以以治療或預(yù)防方式進(jìn)行?？梢允褂玫寞煼ò?但不僅限于)TORC肽或其類似物、衍生物片段或同源物；或提高生物利用率的激動劑。
本發(fā)明一方面提供通過向受試者施用調(diào)節(jié)TORC表達(dá)或至少一種TORC活性的物質(zhì)預(yù)防受試者與TORC表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病癥。有風(fēng)險患有異常TORC表達(dá)或活性引起或促成的疾病的受試者可通過例如如本文所述的診斷或預(yù)后測定的任何組合鑒定。預(yù)防藥的施用可在TORC異常的特征癥狀出現(xiàn)之前進(jìn)行，從而預(yù)防疾病或病癥，或可選地延遲其進(jìn)展。根據(jù)TORC異常的類型，可使用例如TORC激動劑或TORC拮抗劑用于治療受試者。適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)可根據(jù)本文所述篩選測定確定。
本發(fā)明另一方面涉及調(diào)節(jié)TORC表達(dá)或活性用于治療目的的方法。本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法涉及將細(xì)胞與物質(zhì)接觸，所述物質(zhì)調(diào)節(jié)一種或多種與該細(xì)胞相關(guān)的TORC蛋白活性的活性。調(diào)節(jié)TORC蛋白活性的物質(zhì)可以是本文所述的物質(zhì)，例如核酸或蛋白質(zhì)、TORC蛋白天然存在的同源配體、肽、TORC肽模擬物或其他小分子。
TORC多核苷酸和多肽本發(fā)明公開了TORC多核苷酸及其編碼的多肽。可如Iourgenko等(2003)和(年，月，日)提交的美國臨時申請No.xx/xxx，xxx所述，分離、表征并制備TORC多核苷酸。編碼人TORC1(GenBank登錄號AY360171)的多核苷酸見表1。
表1
1 aggaggagga ggtggcggcg agaagatggc gacttcgaac aatccgcgga aattcagcga61 gaagatcgcg ctgcacaatc agaagcaggc ggaggagacg gcggccttcg aggaggtcat121 gaaggacctg agcctgacgc gggccgcgcg gctccagctc cagaaatccc agtacctgca181 actgggcccc agccgaggcc agtactatgg cgggtccctg cccaacgtga accagatcgg241 gagtggcacc atggacctgc ccttccagcc cagcggattt ctgggggagg ccctggcagc301 ggctcctgtc tctctgaccc ccttccaatc ctcgggcctg gacaccagcc ggaccacccg361 gcaccatggg ctggtggaca gggtgtaccg ggagcgtggc cggctcggct ccccacaccg421 ccggcccctg tcagtggaca aacacggacg gcaggccgac agctgcccct atggcaccat481 gtacctctca ccacccgcgg acaccagctg gagaaggacc aattctgact ccgccctgca541 ccagagcaca atgacgccca cgcagccaga atcctttagc agtgggtccc aggacgtgca601 ccagaaaaga gtcttactgt taacagtccc aggaatggaa gagaccacat cagaggcaga661 caaaaacctt tccaagcaag catgggacac caagaagacg gggtccaggc ccaagtcctg721 tgaggtcccc ggaatcaaca tcttcccgtc tgccgaccag gaaaacacta cagccctgat781 ccccgccacc cacaacacag gggggtccct gcccgacctg accaacatcc acttcccctc841 cccgctcccg accccgctgg accccgagga gcccaccttc cctgcactga gcagctccag901 cagcaccggc aacctcgcgg ccaacctgac gcacctgggc atcggtggcg ccggccaggg961 aatgagcaca cctggctcct ctccacagca ccgcccagct ggcgtcagcc ccctgtccct1021 gagcacagag gcaaggcgtc agcaggcatc gcccaccctg tccccgctgt cacccatcac1081 tcaggctgta gccatggacg ccctgtctct ggagcagcag ctgccctacg ccttcttcac1141 ccaggcgggc tcccagcagc caccgccgca gccccagccc ccgccgcctc ctccacccgc1201 gtcccagcag ccaccacccc cgccaccccc acaggcgccc gtccgcctgc cccctggtgg1261 ccccctgttg cccagcgcca gcctgactcg tgggccacag ccgcccccgc ttgcagtcac1321 ggtaccgtcc tctctccccc agtccccccc agagaaccct ggccagccat cgatggggat1381 cgacatcgcc tcggcgccgg ctctgcagca gtaccgcact agcgccggct ccccggccaa1441 ccagtctccc acctcgccag tctccaatca aggcttctcc ccagggagct ccccgcaaca1501 cacttccacc ctgggcagcg tgtttgggga cgcgtactat gagcagcaga tggcggccag1561 gcaggccaat gctctgtccc accagctgga gcagttcaac atgatggaga acgccatcag1621 ctccagcagc ctgtacagcc cgggctccac actcaactac tcgcaggcgg ccatgatggg
1681 cctcacgggc agccacggga gcctgccgga ctcgcagcaa ctgggatacg ccagccacag1741 tggcatcccc aacatcatcc tcacagtgac aggagagtcc ccccccagcc tctctaaaga1801 actgaccagc tctctggccg gggtcggcga cgtcagcttc gactccgaca gccagtttcc1861 cctggacgaa ctcaagatcg accccctgac cctcgacgga ctgcacatgc tcaacgaccc1921 cgacatggtt ctggccgacc cagccaccga ggacaccttc cggatggacc gcctgtgagc1981 gggcacgccg gcaccctgcc gctcagccgt cccgacggcg cctccccagc ccggggacgg2041 ccgtgctccg tccctcgcca acggccgagc ttgtgattct gagcttgcaa tgccgccaag2101 cgccccccgc cagcccgccc ccggttgtcc acctcccgcg aagcccaatc gcgaggccgc2161 gagccgggcc gtccacccac ccgcccgccc agggctgggc tgggatcgga ggccgtgagc2221 ctcccgcccc tgcagaccct ccctgcactg gctccctcgc ccccagcccc ggggcctgag2281 ccgtcccctg taagatgcgg gaagtgtcag ctcccggcgt ggcgggcagg ctcaggggag2341 gggcgcgcat ggtccgccag ggctgtgggc cgtggcgcat tttccgactg tttgtccagc2401 tctcactgcc ttccttggtt cccggtcccc cagcccatcc gccatcccca gcccgtggtc2461 aggtagagag tgagccccac gccgccccag ggaggaggcg ccagagcgcg gggcagacgc2521 aaagtgaaat aaacactatt ttgacggcaa aaaaaaaaaa aaa(SEQ ID NO1)在表1顯示的序列中，編碼序列從位置26延伸至位置1978。
根據(jù)表1核苷酸序列預(yù)測的TORC1蛋白多肽序列見表2(GenBank登錄號AAQ98856.1)。
表21 matsnnprkf sekialhnqk qaeetaafee vmkdlsltra arlqlqksqy lqlgpsrgqy61 yggslpnvnq igsgtmdlpf qpsgflgeal aaapvsltpf qssgldtsrt trhhglvdrv121 yrergrlgsp hrrplsvdkh grqadscpyg tmylsppadt swrrtnsdsa lhqstmtptq181 pesfssgsqd vhqkrvlllt vpgmeettse adknlskqaw dtkktgsrpk scevpginif241 psadqentta lipathntgg slpdltnihf psplptpldp eeptfpalss ssstgnlaan301 lthlgiggag qgmstpgssp qhrpagvspl slstearrqq asptlsplsp itqavamdal
361 sleqqlpyaf ftqagsqqpp pqpqpppppp pasqqppppp ppqapvrlpp ggpllpsasl421 trgpqpppla vtvpsslpqs ppenpgqpsm gidiasapal qqyrtsagsp anqsptspvs481 nqgfspgssp qhtstlgsvf gdayyeqqma arqanalshq leqfnmmena isssslyspg541 stlnysqaam mgltgshgsl pdsqqlgyas hsgipniilt vtgesppsls keltsslagv601 gdvsfdsdsq fpldelkidp ltldglhmln dpdmvladpa tedtfrmdrl(SEQ ID NO2)編碼人TORC2(GenBank登錄號AY360172)的多核苷酸見表3。
表31 atctaggctg gggccgggtt cgcggtgctc gctgaggcgg cggtggctac ggctggagga61 gccgggccga ggccgcggcg gaggccgcgg ctggtactgg gagggtggca gggagggacg121 gggaaggaag atggcgacgt cgggggcgaa cgggcctggt tcggccacgg cctcggcttc181 caatccgcgc aaatttagtg agaagattgc gctgcagaag cagcgtcagg ccgaggagac241 ggcggccttc gaggaggtga tgatggacat cggctccacc cggttacagg cccaaaaact301 gcgactggca tacacaagga gctctcatta tggtgggtct ctgcccaatg ttaaccagat361 tggctctggc ctggccgagt tccagagccc cctccactca cctttggatt catctcggag421 cactcggcac catgggctgg tggaacgggt gcagcgagat cctcgaagaa tggtgtcccc481 acttcgccga tacacccgcc acattgacag ctctccctat agtcctgcct acttatctcc541 tcccccagag tctagctggc gaaggacgat ggcctggggc aatttccctg cagagaaggg601 gcagttgttt cgactaccat ctgcacttaa caggacaagc tctgactctg cccttcatac661 aagtgtgatg aaccccagtc cccaggatac ctacccaggc cccacacctc ccagcatcct721 gcccagccga cgtgggggta ttctggatgg tgaaatggac cccaaagtac ctgctattga781 ggagaacttg ctagatgaca agcatttgct gaagccatgg gatgctaaga agctatcctc841 atcctcttcc cgacctcggt cctgtgaagt ccctggaatt aacatctttc catctcctga901 ccagcctgcc aatgtgcctg tcctcccacc tgccatgaac acggggggct ccctacctga961 cctcaccaac ctgcactttc ccccaccact gcccaccccc ctggaccctg aagagacagc1021 ctaccctagc ctgagtgggg gcaacagtac ctccaatttg acccacacca tgactcacct
1081 gggcatcagc agggggcatg ggcctgggcc cggctatgat gcaccaggac ttcattcacc1141 tctcagccac ccatccctgc agtcctccct aagcaatccc aacctccagg cttccctgag1201 cagtcctcag ccccagcttc agggctccca cagccacccc tctctgcctg cctcctcctt1261 ggcctgccat gtactgccca ccacctccct gggccacccc tcactcagtg ctccggctct1321 ctcctcctcc tcttcctcct cctccacttc atctcctgtt ttgggcgccc cctcttaccc1381 tgcttctacc cctggggcct ccccccacca ccgccgtgtg cccctcagcc ccctgagttt1441 gctcgcgggc ccagccgacg ccagaaggtc ccaacagcag ctgcccaaac agttttcgcc1501 aacaatgtca cccaccttgt cttccatcac tcagggcgtc cccctggata ccagtaaact1561 gtccactgac cagcggttac ccccctaccc atacagctcc ccaagtctgg ttctgcctac1621 ccagccccac accccaaagt ctctacagca gccagggctg ccctctcagt cttgttcagt1681 gcagtcctca ggtgggcagc ccccaggcag gcagtctcat tatgggacac cgtacccacc1741 tgggcccagt gggcatgggc aacagtctta ccaccggcca atgagtgact tcaacctggg1801 gaatctggag cagttcagca tggagagccc atcagccagc ctggtgctgg atccccctgg1861 cttttctgaa gggcctggat ttttaggggg tgaggggcca atgggtggcc cccaggatcc1921 ccacaccttc aaccaccaga acttgaccca ctgttcccgc catggctcag ggcctaacat1981 catcctcaca ggggactcct ctccaggttt ctctaaggag attgcagcag ccctggccgg2041 agtgcctggc tttgaggtgt cagcagctgg attggagcta gggcttgggc tagaagatga2101 gctgcgcatg gagccactgg gcctggaagg gctaaacatg ctgagtgacc cctgtgccct2161 gctgcctgat cctgctgtgg aggagtcatt ccgcagtgac cggctccaat gagggcacct2221 catcaccatc cctcttcttg gccccatccc ccaccaccat tcctttcctc ccttccccct2281 ggcaggtaga gactctactc tctgtcccca gatcctcttt ctagcatgaa tgaaggatgc2341 caagaatgag aaaaagcaa(SEQ ID NO3)在表3所示序列中，編碼序列從位置131延伸至位置2212。
基于表2的核苷酸序列預(yù)測的TORC2蛋白的多肽序列顯示在表4中(GenBank登錄號AAQ98857.1)
表41 matsgangpg satasasnpr kfsekialqk qrqaeetaaf eevmmdigst rlqaqklrla61 ytrsshyggs lpnvnqigsg laefqsplhs pldssrstrh hglvervqrd prrmvsplrr121 ytrhidsspy spaylspppe sswrrtmawg nfpaekgqlf rlpsalnrts sdsalhtsvm181 npspqdtypg ptppsilpsr rggildgemd pkvpaieenl lddkhllkpw dakklsssss241 rprscevpgi nifpspdqpa nvpvlppamn tggslpdltn lhfppplptp ldpeetayps301 lsggnstsnl thtmthlgis rghgpgpgyd apglhsplsh pslqsslsnp nlqaslsspq361 pqlqgshshp slpasslach vlpttslghp slsapalsss ssssstsspv lgapsypast421 pgasphhrrv plsplsllag padarrsqqq lpkqfsptms ptlssitqgv pldtsklstd481 qrlppypyss pslvlptqph tpkslqqpgl psqscsvqss ggqppgrqsh ygtpyppgps541 ghgqqsyhrp msdfnlgnle qfsmespsas lvldppgfse gpgflggegp mggpqdphtf601 nhqnlthcsr hgsgpniilt gdsspgfske iaaalagvpg fevsaaglel glgledelrm661 eplgleglnm lsdpcallpd paveesfrsd rlq(SEQ ID NO4)編碼人TORC3的多核苷酸(GenBank登錄號AY360173)見表5。
表51 attcgccatg gccgcctcgc cgggctcggg cagcgccaac ccgcggaagt tcagtgagaa61 gatcgcgctg cacacgcaga gacaggccga ggagacgcgg gccttcgagc agctcatgac121 cgacctcacc ctgtcgcggg ttcaatttca gaagcttcag caactgcgcc ttacacagta181 ccatggagga tccttaccaa atgtgagcca gctgcggagc aatgcgtcag agtttcagcc241 gtcatttcac caagctgata atgttcgggg aacccgccat cacgggctgg tggagaggcc301 atccaggaac cgcttccacc ccctccaccg aaggtctggg gacaagccag ggcgacaatt361 tgatggtagt gcttttggag ccaattattc ctcacagcct ctggatgaga gttggccaag421 gcagcagcct ccttggaaag acgaaaagca tcctgggttc aggctgacat ctgcacttaa481 caggaccaat tctgattctg ctcttcacac gagtgctctg agtaccaagc cccaggaccc541 ctatggagga gggggccagt cggcctggcc tgccccatac atggggtttt gtgatggtga
601 gaataatgga catggggaag tagcatcttt ccctggccca ttgaaagaag agaatctgtt661 aaatgttcct aagccactgc caaaacaact gtgggagacc aaggagattc agtccctgtc721 aggacgccct cgatcctgtg atgttggagg tggcaatgct tttccacata atggtcaaaa781 cctaggcctc tcacccttct tggggacttt gaacactgga gggtcattgc cagatctaac841 caacctccac tactcgacac ccctgccagc ctccctggac accaccgacc accactttgg901 cagtatgagt gtggggaata gtgtgaacaa catcccagct gctatgaccc acctgggtat961 aagaagctcc tctggtctcc agagttctcg gagtaacccc tccatccaag ccacgctcaa1021 taagactgtg ctttcctctt ccttaaataa ccacccacag acatctgttc ccaacgcatc1081 tgctcttcac ccttcgctcc gtctgttttc ccttagcaac ccatctcttt ccaccacaaa1141 cctgagcggc ccgtctcgcc gtcggcagcc tcccgtcagc cctctcacgc tttctcctgg1201 ccctgaagca catcaaggtt tcagcagaca gctgtcttca accagcccac tggccccata1261 tcctacctcc cagatggtgt cctcagaccg aagccaactt tcctttctgc ccacagaagc1321 tcaagcccag gtgtcgccgc caccccctta ccctgcaccc caggagctca cccagcccct1381 cctgcagcag ccccgcgccc ctgaggcccc tgcccagcag ccccaggcag cctcctcact1441 gccacagtca gactttcagc ttctcccggc ccagggctca tctttgacca acttcttccc1501 agatgtgggt tttgaccagc agtccatgag gccaggccct gcctttcctc aacaggtgcc1561 tctggtgcaa caaggttccc gagaactgca ggactctttt catttgagac caagcccgta1621 ttccaactgc gggagtctcc cgaacaccat cctgccagaa gactccagca ccagcctgtt1681 caaagacctc aacagtgcgc tggcaggcct gcctgaggtc agcctgaacg tggacactcc1741 atttccactg gaagaggagc tgcagattga acccctgagc ctggatggac tcaacatgtt1801 aagtgactcc agcatgggcc tgctggaccc ctctgttgaa gagacgtttc gagctgacag1861 actgtgaaca gaaggcagtg gaacagaaga atgtttttct gcaacagcca aaatagaatg1921 gaatagaatg aagccagctg ataccacggg ctttcgttat cttgacatag aaggaagcag1981 tgccacggct ccagggtttc agatgagatc ccatctcaga cactgtggct tcctccagat2041 cacacagctt tgtactgcct ctcccgcctg tggccaaagt cgtgttgcag caggcaggct2101 gcttggagct tcccatgaac tggaaagctc acctccactg catcttttta ctggccatcc2161 agtcagccga tgtgtaagag taggaaatac tgtgtcactg gaggccctcc gtagcattgg2221 g
(SEQ ID NO5)在表5所示的序列中，編碼序列從位置8延伸至位置1867。
根據(jù)表3的核苷酸序列推測的TORC3蛋白的多肽序列顯示在表6中(GenBank登錄號AAQ98858.1)。
表61 maaspgsgsa nprkfsekia lhtqrqaeet rafeqlmtdl tlsrvqfqkl qqlrltqyhg61 gslpnvsqlr snasefqpsf hqadnvrgtr hhglverpsr nrfhplhrrs gdkpgrqfdg121 safganyssq pldeswprqq ppwkdekhpg frltsalnrt nsdsalhtsa lstkpqdpyg181 gggqsawpap ymgfcdgenn ghgevasfpg plkeenllnv pkplpkqlwe tkeiqslsgr241 prscdvgggn afphngqnlg lspflgtlnt ggslpdltnl hystplpasl dttdhhfgsm301 svgnsvnnip aamthlgirs ssglqssrsn psiqatlnkt vlssslnnhp qtsvpnasal361 hpslrlfsls npslsttnls gpsrrrqppv spltlspgpe ahqgfsrqls stsplapypt421 sqmvssdrsq lsflpteaqa qvsppppypa pqeltqpllq qprapeapaq qpqaasslpq481 sdfqllpaqg ssltnffpdv gfdqqsmrpg pafpqqvplv qqgsrelqds fhlrpspysn541 cgslpntilp edsstslfkd lnsalaglpe vslnvdtpfp leeelqiepl sldglnmlsd601 ssmglldpsv eetfradrl(SEQ ID NO6)本文和權(quán)利要求中使用術(shù)語“TORC”多核苷酸、“TORCX多核苷酸”(其中“X”值為1，2或3)和類似的術(shù)語和短語通常是指表1、3和5中所示核苷酸序列或其互補(bǔ)物，以及編碼多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列與表2、4或6中給出的氨基酸序列至少80％相同，或至少85％相同，或至少90％相同，或至少95％相同，或至少97％相同，或至少98％相同，或至少99％相同；或指本段描述的任何核苷酸序列的片段；或指與本段所述任何核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，TORC多核苷酸指本段上述多核苷酸，其中上述片段編碼多肽的成熟形式。TORC多核苷酸還指該段上述多核苷酸或其互補(bǔ)物，其中編碼多肽中的變體氨基酸殘基是非關(guān)鍵性的或是保守取代。TORC多核苷酸還指編碼融合蛋白的多核苷酸，其中多核苷酸包括本段上述第一TORC多核苷酸和融合至該第一多核苷酸5’或3’末端的編碼第二種多肽的第二多核苷酸。
本文和權(quán)利要求中使用術(shù)語“TORC”多肽、“TORCX多肽”(其中“X”值為1，2或3)和類似的術(shù)語和短語通常是指表2、4和6中所示氨基酸序列以及多肽，所述多肽的氨基酸序列與表2、4或6中給出的氨基酸序列或與多肽至少80％相同，或至少85％相同，或至少90％相同，或至少95％相同，或至少97％相同，或至少98％相同，或至少99％相同；或指其氨基序列斷為本段描述的任何氨基酸序列的片段的多肽。此外，TORC多肽指本段上述多肽，其中上述片段編碼多肽的成熟形式。TORC多肽還指該段上述多肽，其中編碼多肽中的變體氨基酸殘基是非關(guān)鍵性的或是保守取代。TORC多肽還指編碼融合蛋白的多肽，其中多肽包括本段上述第一TORC多肽和融合至第一多肽5’和3’末端的第二多肽的第二多肽。
實施例材料和方法下列材料和方法用在下文所述實施例中。
試劑、儀器和培養(yǎng)條件。所有的細(xì)胞系在37℃含5％CO2的潮濕培養(yǎng)箱中補(bǔ)充有10％胎牛血清、青霉素/鏈霉素(Invitrogen#15140-122)和MEM非必需氨基酸(Invitrogen#11140-050)的Dulbecco′s改良的Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen，Carisbad，CA#11995-065)上培養(yǎng)。細(xì)霉素B、洛諾霉素(ionomycin)、雷帕霉素和環(huán)孢素A得自EMD Biosciences Inc.，San DiegoCA。佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸(PMA；Sigma#P3766))、圓弧偶氮酸(Sigma#C1530)、弗司扣林(forskolin)(Sigma#F3917)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、二丁酰環(huán)-AMP(db-cAMP)得自Sigma，St.Louis，MO。異丙腎上腺素(cat#195263)得自MP Biomedicals，Inc.，Irvine，CA。FK506得自Novartis(CGP048123-NX1，Novartis-Basel 81402076)。DNA轉(zhuǎn)染使用Fugene6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)，siRNA轉(zhuǎn)染使用Oligofectamine(Invitrogen#12252-011)按照各自制造商方案進(jìn)行。細(xì)胞暴露于紫外Stratalinker 2400(Stratagene，La Jolla，CA)中1焦耳/cm2的254nm紫外光中。熒光素酶報告基因pCRE-Luc、pNFAT-TA-Luc和pNFKB-Luc得自BD Biosciences，Inc.，San Jose，CA。轉(zhuǎn)運篩選中使用的cDNA集合含有得自諾華研究基金會基因組研究所(Genomics Institute ofthe Novartis Research Foundation)哺乳動物基因組集合(MammalianGenome Collection)(MGC)(可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)的約7,000個全長人和鼠cDNA。
TORC cDNA的核苷酸序列。編碼TORC蛋白的核苷酸序列可得自GenBank登錄號AY360171(hTORC1)、AY360172(hTORC2)和AY360173(hTORC3)。
質(zhì)粒構(gòu)建和病毒生產(chǎn)。FLAG-TORC1表達(dá)質(zhì)粒pCMV-FLAG-TORC1使用下列引物通過PCR擴(kuò)增人TORC1編碼區(qū)并將該產(chǎn)物克隆進(jìn)pFlag-CMV4(Sigma)的HinDIII和BamHI位點產(chǎn)生5’-GTA AAG CTT ATG GCG ACT TCG AAC AAT CCG-3’(SEQ IDNO7)，和5’-CGT GGA TCC TCA GTC CAT CCG GAA GGT GTC CTC-3’(SEQ ID NO8)。
TORC1-eGFP表達(dá)質(zhì)粒pCMV-TORC1-eGFP使用下列引物通過PCR擴(kuò)增人TORC1編碼區(qū)并克隆進(jìn)pEGFP-N1(BD Biosciences)的BglII和BamHI位點中產(chǎn)生5’-CGC GAG ATC TAT GGC GAC TTC GAA CAA TCCG-3’(SEQID NO9)，和5’-ATA GGA TCC GTC CAT CCG GAA GGT GTC CTC-3’(SEQ IDNO10)。
TORC2-eGFP表達(dá)質(zhì)粒pCMV-TORC2-eGFP使用下列引物PCR擴(kuò)增人TORC2編碼區(qū)并將所得產(chǎn)物克隆進(jìn)pEGFP-N1(U-4153 p35-55)的NheI和EcoRI位點中產(chǎn)生5’TTC TTT CGC TAG CGA GGC GAC GTC GGG GGC GAA CGGGCCT 3’(SEQ ID NO11)和5’GAA CTG CAG AAT TCG TTG GAG CCG GTC ACT GCG GAATGA3’(SEQ ID NO12)。
TORC3-eGFP表達(dá)質(zhì)粒pCMV-TORC3-eGFP使用下列引物通過PCR擴(kuò)增TORC3編碼區(qū)并將所得PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pEGFP-N1(U-4153p35-55)的NheI和EcoRI位點內(nèi)產(chǎn)生5’TTC TTT CGC TAG CGA TGG CCG CCT CGC CGG GCT CGGGCA3’(SEQ ID NO13)和5’GAA CTG CAG AAT TCG CAG TCT GTC AGC TCG AAA CGTCTC 3’(SEQ ID NO14)。
顯性失活TORC1表達(dá)載體pTORC1(1-44)-eGFP使用下列引物通過PCR擴(kuò)增TORC1編碼頭44個氨基酸的編碼區(qū)并將所得產(chǎn)物克隆進(jìn)pEGFP-N1(U-4153 p116-117)的NheI和EcoRI位點產(chǎn)生5’TCC CTT GCT AGC GCC ACC ATG GCG ACT TCG AAC AATCCG CGGAAA 3’(SEQ ID NO15)和5’CTT TCT CAG AAT TCG CTG GAG CCG CGC GGC CCG CGTCAG GCT 3’(SEQ ID NO16)。
組成型活性神經(jīng)鈣蛋白表達(dá)構(gòu)建體pCI-neo-CnA*-HA(Molkentin等，1998)得自Eric Olson，University of Texas Southwestern Medical Center，Dallas TX。
cDNA篩選。轉(zhuǎn)染前24小時將HeLa細(xì)胞以1,200細(xì)胞/孔鋪在384-孔平板上30ul培養(yǎng)基中。對每批384孔平板，將35ugpCMV-TORC1-eGFP稀釋進(jìn)10ml OPTI-MEM中，然后加入562ulFugene6。向含有4ul約7.5ng/ul cDNA表達(dá)質(zhì)粒的OPTI-MEM的cDNA印模(stamp)中加入3ul該混合物，并最終將整個混合物添加入HeLa細(xì)胞。48小時后，從平板中取出培養(yǎng)基并將平板浸入-20℃的100％甲醇中20分鐘，去除甲醇并在室溫干燥平板。核以每孔25ul PBS中的5ug/ml Hoechst染料染色15分鐘，然后用PBS洗滌3次。使用Cellomics ArrayScan II獲得每孔的細(xì)胞圖像，并使用胞質(zhì)至胞核轉(zhuǎn)運(Cytoplasm to NuclearTranslocation)算法確定細(xì)胞質(zhì)和核中TORC1-GFP的量。
穩(wěn)定TORC-eGFP細(xì)胞系的建立。用pCMV-TORC1-eGFP轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞并用700ug/ml遺傳霉素選擇穩(wěn)定的整合體。分離并擴(kuò)增表達(dá)TORC1-eGFP的單個菌落(HhTORC1eGFP細(xì)胞)。
用AseI限制性內(nèi)切酶線性化的pCMV-TORC1-eGFP、pCMV-TORC2-eGFP或pCMV-TORC3-eGFP轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并用700ug/ml遺傳霉素選擇產(chǎn)生表達(dá)TORC-eGFP細(xì)胞群的穩(wěn)定整合體。這些分別稱為293hTORC1、293hTORC2或293hTORC3細(xì)胞。所有穩(wěn)定的TORC-eGFP細(xì)胞系進(jìn)行熒光激活的細(xì)胞分選，以去除不發(fā)熒光的細(xì)胞。
共聚焦顯微術(shù)。涂有HhTORC1eGFP的四孔玻璃載片分別用0.38ugpCMV-SPORT6或相應(yīng)cDNA質(zhì)粒與0.13ug p3x-FLAG-CMV-7-BAP(Sigma#C-7472)共轉(zhuǎn)染作為轉(zhuǎn)染對照。24小時后置換培養(yǎng)基，48小時后用PBS中的4％甲醛在室溫固定細(xì)胞10分鐘，并用PBS中的0.2％TritonX-100透化2分鐘。用PBS中3％的BSA封閉細(xì)胞1小時，并與抗FLAG單克隆抗體(Sigma#F-3165)孵育，然后用抗小鼠AlexaFluor 647抗體(Molecular Probes，Eugene OR，Cat.#A-21463)和Hoechst 33342染料(Molecular Probes#H3570)染色。
TORC抗體。制造肽抗原并用于免疫兔以產(chǎn)生多克隆抗體，然后將所述多克隆抗體從原始肽中親和純化。用于各抗體的抗原為抗TORC1-PAS2769-2770CSPHRRPLSVDKHGR(SEQ ID NO17)；抗TORC1-1BENPGQPSMGIDIASC(SEQ ID NO18)；抗TORC1-2ACPATEDTFRMDRL(SEQ ID NO19)；抗TORC1-EPO31350KQAWDTKKTGSRPKSC(SEQ ID NO20)；和抗TORC2-1cKSCNCDPAVEESFRSDRLQ(SEQ ID NO21)。
抗TORC1-EPO31350由Eurogentec North America Inc.，San Diego，CA制造；抗TORC1-PAS2769-2770由ProSciInc.，Poway CA制造；其余的抗體由Zymed Laboratories，Inc.，San Francisco CA制造。
免疫組織化學(xué)。用DMSO或50uM弗司扣林處理來自HEK93的細(xì)胞90分鐘，在-20℃用100％甲醇固定20分鐘，然后干燥并用PBS中的5％BSA/10％山羊血清/0.1％Tween-20在室溫封閉3小時。細(xì)胞與1∶4000稀釋的抗TORC2抗體1cKSCN孵育。然后用抗兔AlexaFluor 488(MolecularProbes#A21441)和Hoechst染料染色細(xì)胞，之后顯微鏡檢。
siRNA轉(zhuǎn)染。6000HeLa細(xì)胞同時涂布，并用90ng pCRE-luc或pNFKB-luc和10ng海腎熒光素酶質(zhì)粒與每孔0.3μl Fugene6在96孔板中轉(zhuǎn)染。24小時后使用Oligofectamine轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，缺乏抗生素的培養(yǎng)基中siRNA終濃度為20nM，siRNA轉(zhuǎn)染后24小時將培養(yǎng)基換為含有抗生素的培養(yǎng)基。siRNA轉(zhuǎn)染后48小時換為含有多種化合物的培養(yǎng)基，并在與化合物過夜孵育后確定熒光素酶活性。使用的siRNA為非特異性對照5′-UAG CGA CUA AAC ACA UCA AUU-3′(SEQ IDNO22；Dharmacon，Dallas TX，#D-001210-01-05)；GL3熒光素酶5′-CTT ACG CTG AGT ACT TCG A-3′(SEQ ID NO23；Dharmacon #D-001400-01-05)；TORC1 5′-CCG GCA ACC UCG CGG CCA AUU-3′(SEQ ID NO24；Dharmacon#D-014026-03)；TORC2 5′-CGA CUA CCA UCU GCA CUU AUU-3′(SEQ ID NO25；Dharmacon#D-018947-02)；和TORC3 5′-CAA CGC AUC UGC UCU UCA CUU-3′(SEQ ID NO26；Dharmacon#D-014210-04)。
果蠅方法。Gal4應(yīng)答構(gòu)建體UAS-GFP-TORC通過從pEGFP-N1載體(Clontech#6085-1)中PCR克隆eGFP基因，并將來自果蠅基因組DNA的dTORC基因PCR克隆進(jìn)pUAST載體(Brand和Perrimon，1993)產(chǎn)生。通過P元件種系轉(zhuǎn)化將該構(gòu)建體注入果蠅胚胎中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因系(Rubin和Spradling，1982)。為了誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，將含有UAS-GFP-TORC的果蠅與含有來自Bloomington Stock Center，University of Indiana，Bloomington，IN的HS-Gal4構(gòu)建體的果蠅雜交。將幼蟲在25℃熱激，并將來自晚期三齡幼蟲的唾液腺在PBS中進(jìn)行解剖，置于含有多種化學(xué)物質(zhì)處理的96孔板中的Sang M3培養(yǎng)基(Sigma#S3652)中。使用Nikon EclipseTE2000-E熒光顯微鏡將腺體成像。拍攝100×放大率的圖像。
實施例1.TORC蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。
用FLAG-TORC1(圖1，圖A和B)或TORC1-eGFP(圖C和D)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。細(xì)胞不處理(圖A和C)或用10nM細(xì)霉素B(LMB)，一種CRM1介導(dǎo)的蛋白質(zhì)核輸出真菌抑制劑，處理90分鐘(圖B和D)。FLAG標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過免疫熒光成像，而eGFP標(biāo)記的蛋白質(zhì)直接通過熒光成像。盡管TORC蛋白質(zhì)顯示為CREB1-共激活劑(Iourgenko等，2003)，使用FLAG表位的蛋白質(zhì)免疫熒光發(fā)現(xiàn)主要存在于HeLa細(xì)胞質(zhì)中(圖1，圖A)。使用TORC1eGFP融合蛋白來自eGFP的直接熒光也得到了類似的結(jié)果(TORC1-eGFP；圖1，圖C)。由于大量的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)受核輸出或刺激介導(dǎo)的輸入的調(diào)節(jié)，在用LMB處理后研究TORC1的定位。接觸LMB后90分鐘發(fā)現(xiàn)TORC1融合蛋白主要存在于核內(nèi)(圖1，分別為圖B和D)。各標(biāo)記的構(gòu)建體看來保留了類似于未標(biāo)記TORC構(gòu)建體的激活CRE依賴性轉(zhuǎn)錄的能力(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例2.TORC2和TORC3蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。
還研究了人TORC2和TORC3的定位。HeLa細(xì)胞和HEK293細(xì)胞都用pCMV-TORC2-eGFP或pCMV-TORC3-eGFP轉(zhuǎn)染。作為eGFP融合物表達(dá)時，TORC2和TORC3組成型存在于HeLa細(xì)胞核內(nèi)(圖2)。然而，在HEK293細(xì)胞中表達(dá)時，TORC2-eGFP和TORC3-eGFP融合蛋白均大量(盡管非唯一的)存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖1，分別為圖E和G，其顯示熒光主要在核外)。
如HeLa細(xì)胞中的TORC1(實施例1)一樣，LMB處理引起蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中的聚集，其顯示發(fā)熒光(圖1，分別為圖F和H)?？傻贸鼋Y(jié)論，即三種人TORC的亞細(xì)胞定位受核輸出調(diào)節(jié)(實施例1和2中TORC蛋白的定位看來并非轉(zhuǎn)染或標(biāo)記的矯作物)。首先，無論TORC1表達(dá)為帶有N端FLAG表位標(biāo)簽或C端eGFP標(biāo)記，轉(zhuǎn)運和輸出是類似的。其次，用eGFP單獨轉(zhuǎn)染后未觀察到轉(zhuǎn)運(數(shù)據(jù)未顯示)。最后如下文所述，未發(fā)現(xiàn)處理引起細(xì)胞質(zhì)堿性磷酸酶基因轉(zhuǎn)運的出現(xiàn)(實施例4和7)。
實施例3.鑒定誘導(dǎo)TORC1核聚集的cDNA。
為了鑒定調(diào)節(jié)TORC轉(zhuǎn)運的細(xì)胞信號，開發(fā)了高復(fù)雜性篩選以鑒定引起核內(nèi)TORC1-eGFP聚集的基因。HeLa細(xì)胞用TORC1-eGFP與來自MGC全長集合的約7,000個獨立的cDNA表達(dá)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染(Strausberg等，2002)。轉(zhuǎn)染48小時后固定細(xì)胞，并使用Cellomics ArrayScan II自動顯微鏡確定細(xì)胞質(zhì)和核中eGFP熒光的相對量。為了提供TORC1-eGFP轉(zhuǎn)運的陽性對照，固定前用LMB處理每個384孔細(xì)胞培養(yǎng)物平板中的一個孔。通過繪制胞核-胞質(zhì)熒光差異監(jiān)測轉(zhuǎn)運。經(jīng)由LMB的轉(zhuǎn)運事實上在所有的對照孔中檢測到(圖3，“X”)。
從具有高胞核-胞質(zhì)熒光差異的克隆中回收可能的活性cDNA并在后續(xù)測定中再檢測。來自該篩選的最高得分可再現(xiàn)樣品為編碼鼠瞬時型受體電勢陽離子通道亞家族V成員6(TRPV6cDNA克隆MGC27673IMAGE4911355)和鼠cAMP依賴性蛋白激酶催化性α亞單位(PKAcDNA克隆MGC6169 IMAGE3497908)的質(zhì)粒。應(yīng)該注意一些其他的cDNA也證實它們誘導(dǎo)標(biāo)記的TORC1蛋白轉(zhuǎn)運的能力。
實施例4.驗證TRPV6和PKA的作用。
為了驗證TRPV6和PKA誘導(dǎo)TORC1-eGFP轉(zhuǎn)運至核(實施例3)，用空表達(dá)載體pCMV-SPORT6(圖4，圖A)或包含TRPV6(圖B)或PKA(圖C)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)TORC1-eGFP的HeLa細(xì)胞。進(jìn)行共聚焦顯微術(shù)；在原始彩色的顯微照片中，堿性磷酸酶染色(粉色)標(biāo)記轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、核DNA染色為藍(lán)色，而TORC1-eGFP熒光為綠色。在圖4中，使用空載體的對照(圖A)顯示一個細(xì)胞(下邊右側(cè))具有粉色的細(xì)胞質(zhì)，指示轉(zhuǎn)染成功。該細(xì)胞具有藍(lán)色的核染色，核中和核附近為淺綠(下邊右側(cè)部分)。在圖B中(TRPV6)右側(cè)的三個細(xì)胞有細(xì)胞質(zhì)粉色染色，其中上邊兩個具有清晰的綠色核；下邊的細(xì)胞具有藍(lán)綠色核。圖C(PKA)中中央的大細(xì)胞具有粉色的細(xì)胞質(zhì)和綠色的核。這些結(jié)果顯示這些cDNA克隆的基因產(chǎn)物誘導(dǎo)核中TORC1-eGFP的聚集。TRPV6引起事實上所有TORC1-eGFP移至核內(nèi)，而PKA只引起部分TORC1-eGFP在核內(nèi)聚集。這些觀察結(jié)果說明TORC1轉(zhuǎn)運至核內(nèi)是受調(diào)節(jié)的事件，并提示TORC活性可被cAMP和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)。
TRPV6和PKA還誘導(dǎo)TORC2和TORC3在HEK293細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運，然而僅僅PKA的活性就足以誘導(dǎo)TORC2和TORC3的核內(nèi)聚集，而無需同時以LMB封閉核輸出(實施例5)。
實施例5.TORC蛋白轉(zhuǎn)運對cAMP的依賴性。
PKA誘導(dǎo)TORC 1轉(zhuǎn)運提示cAMP可能些同地通過磷酸化激活CREB和通過核轉(zhuǎn)運激活TORC。為了評估該可能性，將穩(wěn)定表達(dá)TORC1-eGFP的HeLa細(xì)胞暴露于未處理(圖5，圖A)、50μM弗司扣林和100uM IBMX(圖B)或1mM db-cAMP(圖C)2小時。發(fā)現(xiàn)通過這些處理提高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，引起eGFP熒光在核內(nèi)顯著出現(xiàn)(圖B和C)，說明與僅顯示細(xì)胞質(zhì)熒光的未處理對照相比，TORC1-eGFP在HeLa細(xì)胞中的部分轉(zhuǎn)運(圖5，圖A)。類似的，穩(wěn)定表達(dá)TORC2-eGFP(圖5，圖D和E)或TORC3-eGFP(圖F和G)的HEK293細(xì)胞未處理(圖D和F)或用25μM弗司扣林處理1小時(圖E和G)。從圖E和G中熒光顯微術(shù)結(jié)果可以看出，僅通過弗司扣林處理，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中TORC2-eGFP和TORC3-eGFP就轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核。
另外，TORC2-eGFP(數(shù)據(jù)未顯示)和TORC3-eGFP(圖5，圖H)在用PKA共轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中聚集。
內(nèi)源TORC2的定位在野生型HEK293細(xì)胞中通過弗司扣林接觸后免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行研究。HEK293細(xì)胞未處理(圖6，圖A和B)，或用50μM弗司扣林處理90分鐘(圖C和D)?？筎ORC2染色顯示在圖A和C中，相應(yīng)的Hoechst染色見圖B和D。未處理的細(xì)胞顯示細(xì)胞各處的彌散染色，而接觸弗司扣林的細(xì)胞主要顯示核免疫組織化學(xué)染色，與Hoechst染色核觀察到的不同。因此，所有TORC的亞細(xì)胞定位顯示受細(xì)胞內(nèi)cAMP水平調(diào)節(jié)。
應(yīng)該注意因為TORC蛋白的低水平表達(dá)和可利用抗體試劑的性質(zhì)，評估的其內(nèi)源轉(zhuǎn)運是困難的。盡管目前產(chǎn)生的抗體容易識別過表達(dá)的蛋白質(zhì)，但TORC1抗體可以低敏感度識別內(nèi)源蛋白而TORC3抗血清不能檢測內(nèi)源蛋白。
實施例6.通過G蛋白偶聯(lián)受體刺激TORC轉(zhuǎn)運為了評估內(nèi)源G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)刺激是否誘導(dǎo)TORC轉(zhuǎn)運，用異丙腎上腺素(β2腎上腺素受體激動劑)處理穩(wěn)定表達(dá)多種TORC-eGFP融合物的HEK293細(xì)胞1小時。如圖7所示，未處理的穩(wěn)定表達(dá)TORC1-eGFP的HEK293細(xì)胞(圖A)以及單獨用10nM LMB(圖B)或單獨用160nM異丙腎上腺素(圖C)處理的細(xì)胞顯示來源于胞質(zhì)的eGFP熒光。僅有用異丙腎上腺素加LMB(圖D)處理引起主要從核中發(fā)出熒光。
在穩(wěn)定表達(dá)TORC2-eGFP或TORC3-eGFP的HEK293細(xì)胞的情況下，與未處理細(xì)胞的胞質(zhì)熒光(分別為圖E和G)相比，僅用160nM異丙腎上腺素處理時從核中發(fā)出熒光(圖7，分別為圖F和H)。因此僅在存在LMB時TORC1-eGFP應(yīng)答于異丙腎上腺素處理而轉(zhuǎn)運至核中，而僅有異丙腎上腺素對于TORC2-eGFP和TORC3-eGFP的核轉(zhuǎn)運就已經(jīng)足夠。
與HeLa細(xì)胞相反，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中，TORC1-eGFP的輸入很緩慢，并且同時需要LMB和弗司扣林以及IBMX或異丙腎上腺素處理(數(shù)據(jù)未顯示)，提示同時需要輸入信號和阻斷輸出。
實施例7.TORC以神經(jīng)鈣蛋白依賴性方式應(yīng)答于鈣而轉(zhuǎn)運。
TRPV6是懷疑(但未證實)為與庫容性鈣內(nèi)流(CCE)和鈣信號傳導(dǎo)(Cui等，2002)相關(guān)的鈣庫控制的鈣通道。這特別有意義，因為CCE是活化和誘導(dǎo)另一轉(zhuǎn)錄因子——活化T細(xì)胞核因子——的核轉(zhuǎn)運所必需的(NF-AT綜述參閱Hogan等，2003)。NF-AT含有由磷酸化失活的核定位信號；NF-AT的核輸入需要由鈣依賴性磷酸酶神經(jīng)鈣蛋白進(jìn)行去磷酸化。NF-AT還含有神經(jīng)鈣蛋白調(diào)節(jié)的核輸出序列(NES)(Zhu和Mekeon 1999)。神經(jīng)鈣蛋白是免疫抑制藥物環(huán)孢素A(CsA)和FK506的靶標(biāo)，有效阻斷NF-AT刺激依賴性地轉(zhuǎn)運至核。
為了確定TORC的轉(zhuǎn)運是否還受到胞內(nèi)鈣水平的調(diào)節(jié)，研究了TORC蛋白應(yīng)答于鈣離子載體洛諾霉素或肌質(zhì)-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATPase圓弧偶氮酸(CPA)的定位(圖8)。使穩(wěn)定表達(dá)TORC-eGFP的HeLa細(xì)胞接觸DMSO載體(圖A)、1μM洛諾霉素(圖B)或10μM CPA(圖C)1小時。如eGFP熒光所示，與單獨用DMSO觀察到的胞質(zhì)熒光相比，洛諾霉素和CPA都可誘導(dǎo)TORC1-eGFP在核中的累積。
圖D、E和F也顯示使用1μM洛諾霉素進(jìn)行的處理。預(yù)接觸6.4nMFK506(圖D)或5μM CsA(圖E)1小時之后，eGFP熒光仍然保留在胞質(zhì)中，表明應(yīng)答于洛諾霉素的轉(zhuǎn)運完全被這些物質(zhì)阻斷。用2μM雷帕霉素(不抑制神經(jīng)鈣蛋白的親免素結(jié)合化合物)進(jìn)行的處理(圖F)不阻斷轉(zhuǎn)運，這可以從強(qiáng)核熒光看出來。應(yīng)答于洛諾霉素的轉(zhuǎn)運被CsA和FK506完全阻斷，但不被雷帕霉素阻斷的事實提示神經(jīng)鈣蛋白與鈣誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)運有關(guān)。
還通過研究轉(zhuǎn)染活化形式的神經(jīng)鈣蛋白之后TORC1-eGFP的定位來進(jìn)一步測試了神經(jīng)鈣蛋白在TORC轉(zhuǎn)運中的作用(圖9)。用空表達(dá)載體(圖A)或表達(dá)組成型活性形式神經(jīng)鈣蛋白的質(zhì)粒(圖B)瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)TORC1-eGFP的HeLa細(xì)胞。在圖A中，四個下方細(xì)胞顯示藍(lán)色核和微帶粉色(堿性磷酸酶轉(zhuǎn)染對照的染色)的綠色胞質(zhì)。圖B中的所有細(xì)胞都在胞質(zhì)中顯示淺粉色胞質(zhì)染色和強(qiáng)綠色熒光，在所有細(xì)胞中都勝過了藍(lán)色核染色。因此表達(dá)活性神經(jīng)鈣蛋白誘導(dǎo)TORC1-eGFP在核中的累積，模擬了TRPV6或洛諾霉素的效果。還發(fā)現(xiàn)在HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染活化的神經(jīng)鈣蛋白誘導(dǎo)TORC2和TORC3的轉(zhuǎn)運(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例8.TRPV6調(diào)節(jié)TORC的轉(zhuǎn)運。
為了確定TRPV6表達(dá)是否也足以激活NF-AT信號傳導(dǎo)，用空載體或與NF-AT依賴性熒光素酶報道基因組合的TRPV6表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在報道基因測定之前18個小時加入3μM CsA。發(fā)現(xiàn)熒光素酶顯示TRPV6激活NF-AT(圖10)。這種激活被CsA抑制，與TRPV6通過活化神經(jīng)鈣蛋白激活NF-AT的假說一致。因此，TORC轉(zhuǎn)運以與NF-AT相似的方式受到調(diào)節(jié)，并顯示代表了神經(jīng)鈣蛋白和親免素結(jié)合免疫抑制劑的新靶標(biāo)。相信這是首次證明TRPV6表達(dá)足以活化神經(jīng)鈣蛋白，因此它可以在T細(xì)胞活化中發(fā)揮作用。
實施例9.TORC轉(zhuǎn)運的鈣依賴性活化。
在穩(wěn)定表達(dá)的HEK293細(xì)胞中研究了鈣信號傳導(dǎo)對三種人TORC-eGFP融合蛋白核轉(zhuǎn)運的影響。TORC2-eGFP和TORC3-eGFP確實應(yīng)答于LMB接觸而在核中累積，但速率遠(yuǎn)低于HeLa細(xì)胞。TORC3-eGFP在接觸LMB約90分鐘后變成主要在核中，TORC2-eGFP在接觸LMB 120分鐘后變成主要在核中。另一方面，在HeLa細(xì)胞中，TORC1在少于30分鐘內(nèi)接近轉(zhuǎn)運完全(數(shù)據(jù)未顯示)。
使穩(wěn)定表達(dá)TORC1-eGFP、TORC2-eGFP或TORC3-eGFP的HEK293細(xì)胞接觸10nM LMB、10μM洛諾霉素、10nM LMB和10uM洛諾霉素或者10nM LMB、10μM洛諾霉素和5μM CsA(圖11)。處理進(jìn)行45分鐘，CsA處理包括15分鐘1μM CsA的預(yù)接觸。如eGFP熒光顯微術(shù)所示，當(dāng)細(xì)胞僅接觸洛諾霉素或LMB 45分鐘時，三種TORC中的每一種在HEK293細(xì)胞中均顯示微弱的轉(zhuǎn)運至核或不轉(zhuǎn)運至核。但洛諾霉素和LMB兩者的組合引起所有三種TORC-eGFP融合蛋白高效轉(zhuǎn)運至核(圖11)。因此，HEK293細(xì)胞中鈣誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)運似乎同時需要正信號以及對核輸出的抑制。有意思的是，三種TORC對CsA的敏感性不同。TORC1-eGFP的核累積被CsA完全阻斷，而TORC2-eGFP和TORC3-eGFP蛋白分別被CsA部分影響或無影響(圖11)。因此，盡管所有的三種TORC轉(zhuǎn)運都應(yīng)答于鈣信號傳導(dǎo)，但調(diào)節(jié)TORC2和TORC3轉(zhuǎn)運的機(jī)制可能與TORC1不同，至少在HEK293細(xì)胞中如此。還應(yīng)該指出，核輸入和輸出的動力學(xué)可以解釋在核中累積不同的TORC對誘導(dǎo)劑和LMB組合的不同需要。
實施例10.TORC轉(zhuǎn)運對其他刺激的依賴性。
引起CREB磷酸化和CRE依賴性轉(zhuǎn)錄的若干其他刺激的效應(yīng)也引起TORC轉(zhuǎn)運的協(xié)同誘導(dǎo)。穩(wěn)定表達(dá)TORC1-eGFP的HeLa細(xì)胞為未處理(圖12，圖A和D)或僅接觸紫外光(1焦耳/cm2)(圖B)或在存在10μMCsA(圖C)、10μM PMA(圖E)或10μM PMA和5μM CsA(圖F)的情況下接觸紫外光。接觸紫外光10分鐘或接觸PMA 1小時后獲得圖像。紫外光輻照細(xì)胞(圖12，圖B，與圖A相比)和蛋白激酶C(PKC)激動劑佛波醇-12-肉豆蔻酸-113-乙酸(PMA)均誘導(dǎo)TORC1-eGFP在核中累積(圖E，與圖D相比)。UV和PMA引起的轉(zhuǎn)運都被CsA處理阻斷(分別為圖C和F)，證明這些應(yīng)答都需要神經(jīng)鈣蛋白。TORC應(yīng)答于cAMP的轉(zhuǎn)運對CsA不敏感(數(shù)據(jù)未顯示)，顯示至少兩種獨立的途徑調(diào)節(jié)TORC蛋白的亞細(xì)胞定位。
實施例11.TORC核轉(zhuǎn)運足以誘導(dǎo)CRE介導(dǎo)的基因表達(dá)。
為了確定TORC1過表達(dá)和定位對基因表達(dá)的影響，使用含有CRE依賴性啟動子的熒光素酶報道基因在未轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)TORC1-eGFP的HeLa細(xì)胞中比較CRE依賴性轉(zhuǎn)錄。用10nM LMB、10μM CsA、5μM洛諾霉素、10μM PMA或所示組合刺激HeLa細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)TORC1-eGFP的HeLa細(xì)胞18小時(圖13)。Western分析和實時PCR分析都表明HeLa細(xì)胞表達(dá)TORC1，但水平極低，而TORC1-eGFP穩(wěn)定細(xì)胞系產(chǎn)生顯著更多的TORC1蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。如圖13所示，未處理的幼稚HeLa細(xì)胞和轉(zhuǎn)染的HeLaTORC1-eGFP顯示相似水平的CRE驅(qū)動的熒光素酶，LMB處理僅在HeLaTORC1-eGFP細(xì)胞中引起顯著降低。這提示TORC1-eGFP移動至核足以活化CRE驅(qū)動的基因表達(dá)。此外，洛諾霉素和PMA在幼稚HeLa細(xì)胞中引起中等水平的活化，這些物質(zhì)在HeLaTORC1-eGFP中顯示高于10倍提高的CRE熒光素酶誘導(dǎo)。此外，洛諾霉素的誘導(dǎo)被CsA完全阻斷。PMA活化被CsA部分阻斷(數(shù)據(jù)未顯示)，提示PMA可能同時以神經(jīng)鈣蛋白依賴性和非依賴性的機(jī)制誘導(dǎo)TORC活性。因此，過表達(dá)TORC1有效增強(qiáng)CRE驅(qū)動基因表達(dá)的活化，LMB使外源TORC1移動至核不足以誘導(dǎo)CRE驅(qū)動的基因表達(dá)。因此，過表達(dá)TORC1以神經(jīng)鈣蛋白依賴性方式有效增強(qiáng)CRE驅(qū)動基因表達(dá)的活化。相信這些觀察結(jié)果提供了解釋CsA和FK506抑制部分CREB應(yīng)答基因表達(dá)這一前期發(fā)現(xiàn)的機(jī)制(Siemann等1999)。
實施例12.使用siRNA敲低TORC。
為了確定TORC功能是否是通過鈣信號傳導(dǎo)進(jìn)行活化所必需的，用siRNA抑制TORC1和TORC2表達(dá)。使用TORC1和TORC2特異性抗體通過western印跡分析鑒定顯著阻斷人TORC1和TORC2蛋白表達(dá)的siRNA(數(shù)據(jù)未顯示)。用CRE-熒光素酶質(zhì)?；騈FKB-熒光素酶質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，其后用20nM特異于熒光素酶(GL3)、TORC1(T1)、TORC2(T2)或者TORC1和TORC2(T1/T2)的siRNA以及對照非特異性siRNA轉(zhuǎn)染。siRNA轉(zhuǎn)染48小時后，用DMSO、50μM弗司扣林和100μM IBMX、10μM洛諾霉素或含10uM PMA的10μM洛諾霉素處理每種共轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備物(圖14)。使用抗pGL3 siRNA作為siRNA轉(zhuǎn)染和效率的陽性對照。
單獨敲低TORC1或TORC2足以通過洛諾霉素降低CRE活化。單獨的TORC1 siRNA抑制PMA和洛諾霉素的誘導(dǎo)，而TORC2 siRNA的影響很小。同時轉(zhuǎn)染TORC1和TORC2 siRNA時，針對所有刺激均觀察到最大抑制。這些影響是特異性的，因為TORC siRNA對洛諾霉素和PMA誘導(dǎo)的NF-κB依賴性熒光素酶報道基因根本沒有影響(圖14)，對SV40驅(qū)動的海腎熒光素酶報道基因的本底表達(dá)也沒有任何影響。
用抗GFP特異性siRNA或者TORC1和TORC2特異性siRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，接著用DMSO、洛諾霉素或者弗司扣林和IBMX誘導(dǎo)20分鐘，其后裂解。通過western印跡分析顯示siRNA阻斷TORC1和TORC2蛋白產(chǎn)生(圖15)。應(yīng)該指出，弗司扣林/IBMX對CRE表達(dá)的誘導(dǎo)僅被TORC1和TORC2 siRNA中度阻斷。對弗司扣林/IBMX誘導(dǎo)的弱抑制可能是因為siRNA的阻斷不足或者是因為在HeLa細(xì)胞中表達(dá)所有三種人TORC蛋白。在還包括TORC3 siRNA時，觀察到了對CRE活化的更徹底的抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。在這些實驗中，由于缺乏質(zhì)量足夠高的抗體，因此不可能確認(rèn)對TORC3蛋白表達(dá)的抑制。阻斷TORC1和TORC2表達(dá)對通過洛諾霉素或弗司扣林/IBMX的CREB1磷酸化沒有影響(圖15)，這與TORC不依賴于CREB磷酸化而活化CRE驅(qū)動的表達(dá)的先期數(shù)據(jù)一致。
該實施例中報道的實驗顯示TORC對于鈣誘導(dǎo)的CRE驅(qū)動的表達(dá)是必要的。
實施例13.TORC的顯性失活突變構(gòu)建體使用多種siRNA和阻斷多種TORC的需要使siRNA的結(jié)果(實施例12)變得復(fù)雜。為了更便利地高效阻斷所有的TORC蛋白，設(shè)計了顯性干擾TORC蛋白，它將高度保守的TORC1 44個氨基酸CREB結(jié)合結(jié)構(gòu)域與eGFP融合(T1-44eGFP)。為了高效阻斷全部TORC蛋白的活性，設(shè)計了將特異性阻斷全部TORC與CREB1的相互作用的顯性干擾蛋白。TORC蛋白的CREB1相互作用結(jié)構(gòu)域存在于TORC1的前44個氨基酸中。代表TORC1基因第一外顯子的N端44個氨基酸在所有哺乳動物、線蟲和果蠅TORC蛋白中幾乎100％保守，而與任何其他蛋白幾乎沒有同源性或相似性(Iourgenko等，2003)。當(dāng)這44個氨基酸與eGFP作為融合蛋白表達(dá)(T1(1-44)eGFP)時，HhTORC1細(xì)胞中增強(qiáng)的CRE應(yīng)答被高效阻斷，全部三種TORC對CRE激活的活性都被抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。用eGFP對照或者TORC1(1-44)eGFP與CRE-熒光素酶(圖16，圖A)或NFKB-熒光素酶(圖B)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，之后用50μM弗司扣林/100μM IBMX或5μM洛諾霉素進(jìn)行刺激。在圖C中，用CRE-熒光素酶和β2-腎上腺素受體(β2AR)與空CMV載體、eGFP或TORC1(1-44)-eGFP融和物的組合轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并接觸異丙腎上腺素18小時.顯性失活T1(1-44)eGFP也高效阻斷CRE通過弗司扣林/BIMX或洛諾霉素和PMA的活化(圖16，圖A)。這種活性是特異性的，因為對單獨的eGFP的表達(dá)沒有影響，而且T1(1-44)eGFP對通過洛諾霉素和PMA實現(xiàn)的NF-κB報道基因活化沒有影響(圖16，圖B)。如圖16的圖C所示，T1(1-44)eGFP強(qiáng)烈抑制β2-腎上腺素受體(β2AR)和異丙腎上腺素對CRE-熒光素酶的誘導(dǎo)，而eGFP則不然。因此阻斷TORC功能也阻止通過Gs相關(guān)GPCR使用異丙腎上腺素實現(xiàn)的CRE活化?？梢缘贸鼋Y(jié)論，這證明TORC功能對CRE應(yīng)答的活化是充分且必要的。
實施例14.TORC轉(zhuǎn)運是進(jìn)化上保守的調(diào)節(jié)機(jī)制。
產(chǎn)生了eGFP與果蠅TORC(dTORC)蛋白的融合物。對表達(dá)dTORC-eGFP轉(zhuǎn)基因的果蠅幼蟲唾液腺進(jìn)行以下處理未處理1小時(圖17，圖A)；接觸5μM洛諾霉素1小時(圖B)；5μM洛諾霉素與10μM CsA1小時(圖C)；未處理4小時(圖D)；100μM db-cAMP 4小時(圖E)。通過顯微術(shù)研究自表達(dá)dTORC融和蛋白的轉(zhuǎn)基因幼蟲解剖的唾液腺。在唾液腺的所有細(xì)胞中dTORC-eGFP都定位于胞質(zhì)中(圖17，圖A和D)。使轉(zhuǎn)基因唾液腺接觸洛諾霉素或db-cAMP誘導(dǎo)dTORC-eGFP轉(zhuǎn)運入核(分別為圖B和E)。洛諾霉素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)運被CsA阻斷(圖C)。因此，與人細(xì)胞一樣，果蠅中TORC的定位受cAMP和鈣的調(diào)節(jié)。因此，這種TORC在細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞定位的調(diào)節(jié)是高度保守的修飾CREB信號傳導(dǎo)的機(jī)制。
實施例15.神經(jīng)元細(xì)胞中TORC蛋白的亞細(xì)胞定位。
建立了通過神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)顯示神經(jīng)元表型的選自HCN-1A(皮質(zhì)神經(jīng)元)、HCN-2(皮質(zhì)神經(jīng)元)、DBTRG-05MG(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)的人腦細(xì)胞系(均可得自ATCC)或鼠原代背根神經(jīng)節(jié)外植體神經(jīng)元(Araki等(2004)Science 3051010-1013)培養(yǎng)物。用pCMV-TORC1-eGFP、pCMV-TORC2-eGFP或pCMV-TORC3-eGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24-48小時后使用熒光顯微術(shù)研究eGFP定位。在LMB存在下復(fù)查結(jié)果。這些結(jié)果表征了神經(jīng)元細(xì)胞中TORC蛋白的亞細(xì)胞定位。
實施例16.鑒定調(diào)節(jié)腦細(xì)胞中TORC相關(guān)過程活性的物質(zhì)。
建立培養(yǎng)中的神經(jīng)元細(xì)胞或神經(jīng)元表型細(xì)胞(實施例15)，并用pCMV-TORC1-eGFP、pCMV-TORC2-eGFP或pCMV-TORC3-eGFP進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將培養(yǎng)物分成兩部分，其中僅有一部分用候選TORC效應(yīng)劑處理。通常存在候選物的文庫，如組合文庫。在多孔板中用文庫的多個成員處理轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物。為了選擇具有最強(qiáng)的調(diào)節(jié)活性的物質(zhì)，可以用已知促進(jìn)TORC蛋白在胞質(zhì)中累積的物質(zhì)預(yù)處理培養(yǎng)物，或者用已知促進(jìn)TORC蛋白在核中累積的物質(zhì)預(yù)處理培養(yǎng)物?？梢哉{(diào)整這些物質(zhì)的濃度，從而使其處于促進(jìn)其效應(yīng)的效率中點或附近。使用熒光顯微術(shù)檢查TORC蛋白-eGFP融合物的亞細(xì)胞定位，并與來源培養(yǎng)物中用該物質(zhì)處理但不用候選物質(zhì)處理的部分進(jìn)行比較。將與培養(yǎng)物未處理部分相比誘導(dǎo)顯著效應(yīng)的候選物質(zhì)鑒定為該測定的生物效應(yīng)物質(zhì)。
通用方法在實施例17至23公開的實驗中使用以下方法和物質(zhì)。
細(xì)胞培養(yǎng)從2至3周齡FVB雄性小鼠中分離初級肌細(xì)胞。在含有20％熱滅活FBS(Hyclone，cat# 30070.03)、100U/ml青霉素-100μg/ml鏈霉素(Gibco，cat# 15140-122)、1×Normocin(Invivogen，cat# ant-nr-1)和2.5ng/ml bFGF(Invitrogen，cat# 13256-029)的Ham’s F10(Gibco，cat#11550-043)中培養(yǎng)成肌細(xì)胞。當(dāng)達(dá)到80％匯合時，轉(zhuǎn)換成含有5％馬血清(Hyclone，cat# SH30074)的DMEM(Gibco，cat# 11965-092)誘導(dǎo)分化。
轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性測量在含10％FBS的DMEM中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。以7000個細(xì)胞/孔將其鋪在96孔板中，6小時后使用Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche，cat# NC916732)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用于轉(zhuǎn)染的DNA和Fungene 6的量分別為163 ng和0.325μl。轉(zhuǎn)染后48或72小時裂解細(xì)胞，按照提供商的說明書使用Dual-Glo熒光素酶測定系統(tǒng)(Promega，cat# PRE2943-0)測量熒光素酶活性。
用慢病毒或腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)以1.3×105細(xì)胞/孔將HeLa細(xì)胞鋪在6孔板中。在每個孔中加入2ml含有0.5ml TORC1或STOP(對照)慢病毒、8mg/ml聚凝胺(Polybrene)(Sigma，cat# H9268)和10mM Hepes的培養(yǎng)基，將平板以1000g離心30分鐘以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。24小時后移去培養(yǎng)基并換成含10％FBS的DMEM。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后24、48或72小時收獲細(xì)胞。用TORC2、TORC3或GFP(對照)腺病毒(4×108顆粒/孔于6孔板中)感染初級肌細(xì)胞(分化后1天)。每天更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)后24或48小時收獲細(xì)胞。
RNA提取和基因表達(dá)的實時PCR分析使用Trizol(Invitrogen，cat#15596-026)從細(xì)胞中提取總RNA。使用Superscript II RNase H逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，cat# 18064-022)以1mg總RNA進(jìn)行cDNA合成。使用合成的cDNA和對靶基因具有特異性的引物/探針集合通過實時PCR測定靶基因的相對表達(dá)。通過比較靶基因/18S rRNA計算相對mRNA表達(dá)水平。細(xì)胞色素氧化酶亞基II(CoxII)的Taqman探針序列為5’-TCAAGCAACAGTAACATCAAACCGACCA-3’(SEQ ID NOXX)。CoxII的Taqman引物序列為5’-CCATCCCAGGCCGACTAA-3’(SEQ IDNOXX)(正向)和5’-CAGAGCATTGGCCATAGAATAACC-3’(SEQ IDNOXX)(反向)。CoxII的探針和引物分別得自Sigma Genosys和AppliedBiosystems。其他基因的Taqman引物/探針集合得自Applied Biosystems(下文列出)人和小鼠細(xì)胞色素c(Hs01588973_m1；Mm01621048_s1)人和小鼠PGC-1α(Hs00173304_m1；Mm00447183_m1)小鼠ERRα(Mm00433143_m1)小鼠異檸檬酸脫氫酶(Mm00499674_m1)18S(cat#4310893E)。
蛋白質(zhì)提取和Western印記使用補(bǔ)充了Complete Mini蛋白酶抑制劑混合物(Roche，cat#DCTC0)的細(xì)胞抽提緩沖液(Biosurce，cat# FNN0011)裂解細(xì)胞。將50μg細(xì)胞裂解液用于Western印記分析。TORC1抗體得自Mark Labow(FGA)，以1∶2000的稀釋度使用?？刮⒐艿鞍?Abcam，cat#ab3194)和V5(Invitrogen，cat#960-25)的抗體分別以1∶3000和1∶5000使用。二抗山羊抗兔IgG(cat#31460)和山羊抗小鼠IgG(cat#31430)購自Pierce，以1∶10000的稀釋度使用。
脂肪酸氧化在含有114mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4和0.5％無脂肪酸BSA的非碳酸緩沖液中用36μM14C-軟脂酸(ARC，cat#ARC-172A)標(biāo)記細(xì)胞2小時。定量由細(xì)胞產(chǎn)生的14CO2，并用作脂肪酸氧化速率的指標(biāo)。
細(xì)胞呼吸用胰蛋白酶處理細(xì)胞并重懸于含有25mM葡萄糖和1mM丙酮酸以及2％無脂肪酸BSA的PBS中。使用Clark電極測量未處理和用寡霉素和CCCP處理的細(xì)胞呼吸。各測量使用300,000,000 Hela細(xì)胞或50,000,000初級肌細(xì)胞。寡霉素的濃度為2μg/ml，而Hela細(xì)胞及初級肌細(xì)胞的CCCP濃度分別為2μM和2-5μM。
實施例17TORCl的異位表達(dá)提高HeLa細(xì)胞中線粒體基因表達(dá)和線粒體氧化能力。圖18圖解說明了用pGL3-basic-2kb-PGC1α-Luc、phRL-SV40(作為轉(zhuǎn)染效率的對照)與標(biāo)示的多種cDNA構(gòu)建體一起轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的結(jié)果。在轉(zhuǎn)染后48小時裂解細(xì)胞并測定熒光素酶活性。計算螢火蟲發(fā)光(ff)與海腎發(fā)光(RL)的比值(均值±SEM)，表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素酶，并用作PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄的指標(biāo)。TORC1誘導(dǎo)PGC-1α啟動子轉(zhuǎn)錄，如報道蛋白的表達(dá)所示。CREB顯性失活抑制劑ACREB的存在降低TORC1的影響，從而說明TORC1通過CREB機(jī)制發(fā)揮功用。
實施例18圖19證明TORC1的異位表達(dá)提高PGC-1α和細(xì)胞色素c的表達(dá)，提示其誘導(dǎo)線粒體發(fā)生。細(xì)胞色素c是公認(rèn)的線粒體水平生物標(biāo)志。用對照慢病毒(Stop或GFP)或TORC1慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)HeLa細(xì)胞。A.轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時從細(xì)胞提取總蛋白，并進(jìn)行Western印記分析，以測定PGC-1α蛋白的表達(dá)。B.在轉(zhuǎn)導(dǎo)后24、48和72小時從細(xì)胞提取總RNA，進(jìn)行qPCR分析，以測定內(nèi)源PGC-1α(B)和細(xì)胞色素c(C)mRNA的表達(dá)水平。
實施例19圖20證明TORC1的異位表達(dá)提高HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞呼吸。用對照(Stop)或TORC1慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)HeLa細(xì)胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時使用Clark電極測定細(xì)胞呼吸。寡霉素(MP Biomedicals；ATP合酶抑制劑)和CCCP(Sigma；電子傳遞鏈解偶聯(lián)劑)的濃度分別為2μg/ml和2μM。在TORC1表達(dá)后觀察到提高的細(xì)胞呼吸。
實施例20在小鼠初級肌細(xì)胞中TORC2和TORC3的異位表達(dá)提高線粒體基因表達(dá)和線粒體氧化能力。圖21圖解說明了TORC1、TORC2和TORC3中的每一種都活化PGC-1α基因的轉(zhuǎn)錄。用pGL3-basic-2kb-PGC1-Luc、phRL-SV40(作為轉(zhuǎn)染效率的對照)與標(biāo)示的多種cDNA構(gòu)建體一起轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時裂解細(xì)胞并測定熒光素酶活性。計算螢火蟲發(fā)光(ff)與海腎發(fā)光(RL)的比值(均值±SEM)，表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素酶，并用作PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄的指標(biāo)。N＝6，*P＜0.05(TORC1、2、3相對于載體)。
實施例21在圖22中顯示TORC2或TORC3的異位表達(dá)在初級肌細(xì)胞中提高PGC-1α和線粒體標(biāo)志物的表達(dá)。用TORC2、TORC3或GFP腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)初級肌細(xì)胞。A.轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時從細(xì)胞提取總蛋白并進(jìn)行Western印記分析，以測定異位TORC2和TORC3蛋白的表達(dá)。用于檢測異位TORC2和TORC3蛋白的一抗和二抗分別為V5和山羊抗兔IgG。B-C.轉(zhuǎn)導(dǎo)后24和48小時從細(xì)胞提取總RNA并進(jìn)行qPCR分析，以測定內(nèi)源PGC-1α(B)和PGC-1α靶基因(C)的表達(dá)水平，所述靶基因包括ERRα和線粒體標(biāo)志物、細(xì)胞色素C(CytC)、線粒體氧化酶亞基II(CoxII)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)。N＝3，*P＜o(jì).05(TORC2或TORC3相對于GFP)。
實施例22圖23顯示TORC2或TORC3的異位表達(dá)在小鼠初級肌細(xì)胞中提高脂肪酸氧化。用TORC2、TORC3或GFP腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)初級肌細(xì)胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時進(jìn)行14C-軟脂酸氧化。N＝3，*P＜0.05。該功能測定還證實了TORC蛋白在線粒體生物發(fā)生中的作用。
實施例23在圖24中顯示TORC2或TORC3的異位表達(dá)提高小鼠初級肌細(xì)胞的細(xì)胞呼吸。用TORC2、TORC3或GFP腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)初級肌細(xì)胞48小時。對未處理(本底)或者寡霉素或CCCP處理測量細(xì)胞呼吸。N＝3，*p＜0.05(TORC相對于GFP)。
實施例1-14展示的數(shù)據(jù)提示在神經(jīng)元中TORC活性、表達(dá)或核轉(zhuǎn)運的激動劑本身可誘導(dǎo)或增強(qiáng)CREB介導(dǎo)的過程。由于已知cAMP和CREB介導(dǎo)的應(yīng)答與大量病理和生理過程關(guān)聯(lián)，因此TORC活性的修飾劑可能具有多種應(yīng)用。TORC激動劑可用于增強(qiáng)記憶，治療抑郁、情緒紊亂或精神分裂癥。已知CREB功能的喪失與神經(jīng)退化關(guān)聯(lián)，阻斷CREB功能引起神經(jīng)元細(xì)胞死亡和凋亡。此外，在亨廷頓病中，認(rèn)為沉淀的核包涵體使CBP隔離，從而也會阻斷CREB活性(Sugars等，2003；Kazantsev 1999)。在這種情況下，通過TORC激動劑恢復(fù)CREB可誘導(dǎo)的基因表達(dá)同樣也具有臨床實用性。
該實施例還鑒定了TRPV6高效誘導(dǎo)神經(jīng)鈣蛋白依賴性誘導(dǎo)NF-AT驅(qū)動基因表達(dá)的能力。如上文所述，懷疑TRPV6組成鈣庫控制的鈣通道，或者為其一部分，所述鈣通道是應(yīng)道是應(yīng)答胞內(nèi)鈣濃度瞬時提高而活化神經(jīng)鈣蛋白所必需的。TRPV6可以以CsA敏感性方式誘導(dǎo)TORC轉(zhuǎn)運以及NF-AT驅(qū)動的基因表達(dá)這一觀察結(jié)果強(qiáng)烈支持了TRPV6在NF-AT驅(qū)動過程(如心臟肥大和T細(xì)胞活化)中的作用。
TORC移動至核提供了鑒定cAMP或鈣介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的高效經(jīng)濟(jì)的通用方法。有多種測定可用于研究細(xì)胞培養(yǎng)物中的cAMP水平或鈣介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的活化。然而，多數(shù)使用報道基因或ELISA型測定的這些方法都很昂貴、費時并且難于以高通量方式應(yīng)用于個體細(xì)胞。TORC轉(zhuǎn)運的顯像允許以高通量形式鑒定個體細(xì)胞cAMP和鈣信號傳導(dǎo)的修飾劑。
最后，由于已經(jīng)證明TORC1轉(zhuǎn)運足以誘導(dǎo)和增強(qiáng)CREB介導(dǎo)的表達(dá)，因此誘導(dǎo)TORC核轉(zhuǎn)運的化合物可有益于作為記憶增強(qiáng)劑或作為神經(jīng)保護(hù)劑，而阻斷TORC核轉(zhuǎn)運的化合物可用于治療動脈硬化。
參考文獻(xiàn)Arias J，Alberts AS，Brindle P，Claret FX，Smeal T，Karin M，F(xiàn)eramisco J，Montminy M.1994.Activation of cAMP and mitogen responsive genesrelies on a common nuclear factor.Nature.370226-9.
Bodor，J.，Bodorova，J.和Gres，R.E.(2000).Suppression of T cell functiona potential role for transcriptional reporessor ICER.Journal of leukocyteBiol.67774-779.
Bourtchuladze，R.，F(xiàn)renguelli，B.，Blendy，J.，Cioffi，D.，Schutz，G.和Silva，A.J.(1994).Deficient long-term memory in mice with a targeted mutationof the cAMP-responsive element-binding protein.Cell 79，59-68.
Brand，A.H.and Perrimon，N.，1993.Targeted gene expression as a meansof altering cell fates and generating dominant phenotypes.Development118401-415.
Brindle P，Nakajima T，Montminy M.1995.Multiple protein kinaseA-regulated events are required for transcriptional indnction by cAMP.Proc Natl Acad Sci U S A.9210521-5.
Chao J，Nestler EJ.(2004).Molecular neurobiology of drug addiction.Annu Rev Med.2004；55113-32.
Chrivia JC，Kwok RP，Lamb N，Hagiwara M，Montminy MR，GoodmanRH.1993.Phosphorylated CREB binds specificallyto the nuclear proteinCBP.Nature 365855-9.
Conkright MD，Canettieri G，Screaton R，Guzman E，Miraglia L，Hogenesch JB，Montminy M.TORCstransducers of regulated CREBactivity.Mol Cell；12413-23.
Cui J，Bian JS，Kagan A，McDona1d TV.(2002).CaT1 contributes to thestores-operated calcium current in Jurkat T-lymphocytes.J Biol Chem.27747175-83.
Deak，M.，Clifton，A.D.，Lucocq，L.M.和Alessi，D.R.(1998).Mitogen-and stress-activated protein kinase-1(MSK1)is directly activated byMAPK and SAPK2/p38，and may mediate activation of CREB.Embo J 17，4426-4441.
Du，K.和Montminy，M.(1998).CREB is a regulatory target for the proteinkinase Akt/PKB.J Biol Chem 273，32377-32379.
Gau D，Lemberger T，von Gall C，Kretz O，Le Minh N，Gass P，Schmid W，Schibler U，Korf HW， Schutz G.2002.Phosphorylation of CREB Ser142regulates light-induced phase shifts of the circadian clock.Neuron.34245-53.
Gonzalez，G.A.和Montminy，M.R.(1989).Cyclic AMP stimulatessomatostatin gene transcription by phosphorylation of CREB at serine 133.Cell 59，675-680.
Herzig，S.，Long，F(xiàn).，Jhala，U.，Hedrick，S，Quinn，R，Bauer，A.，Rudolph，D，Schutz，G.，‘Yoon，C.，Puigserver，P.，Spiegelman，B.and Montminy，M.(2001).CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivatorPGC-1.Nature，413179-183.
Hogan PG，Chen L，Nardone J，Rao A.(2003).Transcriptional regulationby calcium，calcineurin，and NFAT.Genes Dev.2003年9月15；17(18)2205-32.
Iourgenko V，Zhang W，Mickanin C，Daly I，Jiang C，Hexham JM，OrthAP，Miraglia L，Meltzer J，Garza D，Chirn GW，McWhinnie E，Cohen D，Skelton J，Terry R，Yu Y，Bodian D，Buxton FP，Zhu J，Song C，LabowMA..2003.Identiffcation of a family of cAMP response element-bindingprotein coactivators by genome-scale functional analysis in mammaliancells.Proc Natl Acad Sci U S A.2003年10月14；100(21)12147-52Jackson T，Ramaswami M.(2003).Prospects of memory-modifying drugsthat target the CREB pathway.Curr Opin Drug Discov Devel.2003年9月；6(5)712-9.
Kazantsev A，Preisinger E，Dranovsky A，Goldgaber D，Housman D.(1999).Insoluble detergent-resistant aggregates form between pathologicaland nonpathological lengths of polyglutamine in mammalian cells.ProcNatl Acad Sci U S A.1999年9月28日；96(20)11404-9.
Lonze，B.和Ginty，D.(2002).Function and Regulation of CREB FamilyTranscription Factors in the Nervous System.Neuron 35，605.
Lonze，B.，Riccio，A.，Cohen，S.和Ginty，D.D.(2002).Apoptosis，axonalgrowth defects，and degeneration of peripheral neurons in mice lackingCREB.Neuron 34，371-385.
Mantamadiotis，T.，Lemberger，T.，Bleckmann，S.C.，Kern，H.，Kretz，O.，Martin Villalba，A.，Tronche，F(xiàn).，Kellendonk，C.，Gau，D.，Kapfhammer，J.等(2002).Disruption of CREB function in brain leads toneurodegeneration.Nat Genet 31，47-54.
Mayr，B.和Montminy，M.(2001).Transcriptional regulation by thephosphorylation-dependent factor CREB.Nat Rev Mol Cell Biol 2，599-609.
Molkentin JD，Lu JR，Antos CL，Markham B，Richardson J，Robbius J，Grant SR，Olson EN.(1998).A calcineurin-dependent transcriptionalpathway for cardiac hypertrophy.Cell.；93215-28.
Moore MS，DeZazzo J，Luk AY，Tully T，Singh CM，Heberlein U.(1998)Ethanol intoxication in DrosophilaGenetic and pharmacological evidencefor regulation by the cAMP signaling pathway.Cell.1998年6月12日；93(6)997-1007.
Ono H，Ichiki T，F(xiàn)ukuyama K，Iino N，Masuda S，Egashira K，Takeshita A.(2002).Arterioscler Thromb Vasc Biol.2004年7月8日[電子出版早于印刷日].
Rubin，G.M.and Spradling，A.C.，1982. Genetic transformation ofDrosophila with transposable element vectors.Science 218348-353.
Rudolph，D.，Tafuri，A.，Gass，P.，Hammerling，G.J.，Arnold，B.和Schutz，G.(1998).Impaired fetal T cell development and perinatal lethality in micelacking the cAMP response element binding protein.Proc Natl Acad Sci US A 95，4481-4486.
Shaywitz，A.J.和Greenberg，M.E.(1999).CREBa stimulus-inducedtranscription factor activated by a diverse array of extracellular signals.Annu Rev Biochem 68，821-861.
Siemann G，Blume R，Grapentin D，Oetj en E，Schwaninger M，Knepel W.(1999).Mol Pharmacol55，1094-1100.
Strausberg，R.L.，F(xiàn)eingold，E.A.，Grouse，L.H.，Derge，J.G.，Klausner，R.D.，Collins，F(xiàn).S.，Wagner，L.，Shenmen，C.M.，Schuler，G.D.，Altschul，S.F.等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A99，16899-16903.
Sugars KL，Brown R，Cook LJ，Swartz J，Rubinsztein DC.(2003)Decreased cAMP response element-mediated transcriptionan early eventin exon 1 and full-length cell models of Huntington′s disease thatcontributes to polyglutamine pathogenesis.J Biol Chem.2004 Feb6；279(6)4988-99.電子出版2003年11月18日Tully T，Bourtchouladze R，Scott R，Tallman J.(2003).Targeting theCREB pathway for memory enhancers.Nat Rev Drug Discov.2003年4月；2(4)267-77.
Valverde O，Mantamadiotis T，Torrecilla M，Ugedo L，Pineda J，Bleckmann S，Gass P，Kretz O，Mitchell JM，Schutz G，Maldonado R.(2004).Modulation 0f anxiety-like behavior and morphine dependence inCREB-deficient mice.Neuropsychopharmacology.2004年6月；29(6)1122-33.
West，A.E.，Chen，W.G.，Dalva，M.B.，Dolmetsch，R.E.，Kornhauser，J.M.，Shaywitz，A.J.，Takasu，M.A.，Tao，X.和Greenberg，M.E.(2001).Calciumregulation of neuronal gne expression.Proc.Natl.Acad. Sci9811024-11031.
Xing，J.，Kornhauser，J.M.，Xia，Z.，Thiele，E.A.和Greenberg，M.E.(1998).Nerve growth factor activates extracellular signal-regulated kinaseand p38 mitogen-activated protein kinase pathways to stimulate CREBserine 133 phosphorylation.Mol Cell Biol 18，1946-1955.
Yin JC，Wallach JS，Del Vecchio M，Wilder EL，Zhou H，Quinn WG，TullyT.(1994).Induction of a dominant negative CREB transgene specificallyblocks long-term memory in Drosophlla.Cell；7949-58Zhu J，McKeon F.(1999).NF-AT activation requires suppression ofCrm1-dependent export by calcineurin.Nature.1999年3月18日；398(6724)256-60.
權(quán)利要求
1.鑒定細(xì)胞中CREB啟動過程的調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括使細(xì)胞接觸調(diào)節(jié)TORC多肽在細(xì)胞的亞細(xì)胞區(qū)室中累積的物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述物質(zhì)為離子載體、胞內(nèi)cAMP濃度刺激劑、胞內(nèi)鈣濃度刺激劑或蛋白激酶活性刺激劑。
3.修飾細(xì)胞中TORC相關(guān)過程的方法，包括使細(xì)胞接觸促進(jìn)TORC多肽在細(xì)胞的亞細(xì)胞級分中累積的物質(zhì)。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述物質(zhì)為親免素結(jié)合劑。
5.調(diào)節(jié)細(xì)胞中CREB啟動過程的方法，包括使細(xì)胞接觸調(diào)節(jié)細(xì)胞中TORC多肽表達(dá)的物質(zhì)。
6.權(quán)利要求5所述方法，其中所述物質(zhì)包括反義寡核苷酸、干擾寡核苷酸、微小寡核苷酸、三螺旋核酸、核酶、RNA適體、雙鏈或單鏈RNA、肽模擬物、含有肽模擬物編碼序列的多核苷酸、或其中任意兩種或多種的混合物。
7.在受試者中基本抑制疾病或病理病癥的發(fā)展、治療或改善疾病或病理病癥的方法，所述疾病或病理病癥與細(xì)胞中CREB啟動過程的水平異常相關(guān)，包括對受試者施用一種或多種治療有效劑量調(diào)節(jié)TORC多肽在細(xì)胞亞細(xì)胞區(qū)域累積的物質(zhì)。
8.權(quán)利要求7所述方法，其中所述物質(zhì)為親免素結(jié)合劑。
9.權(quán)利要求7所述方法，其中所述物質(zhì)為離子載體、胞內(nèi)cAMP濃度刺激劑、胞內(nèi)鈣濃度刺激劑或蛋白激酶活性刺激劑。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述TORC調(diào)節(jié)劑包括一種或多種針對TORC蛋白的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段抑制所述TORC蛋白的活性。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述TORC調(diào)節(jié)劑包括一種或多種TORC蛋白的肽模擬物，其中所述肽模擬物抑制所述TORC蛋白的活性。
12.在受試者中基本抑制疾病或病理病癥的發(fā)展、治療或改善疾病或病理病癥的方法，所述疾病或病理病癥與細(xì)胞中TORC激活及CREB啟動過程的水平異常相關(guān)，包括對受試者施用一種或多種治療有效劑量調(diào)節(jié)TORC多肽在細(xì)胞中表達(dá)的物質(zhì)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述調(diào)節(jié)物質(zhì)包括反義寡核苷酸、干擾寡核苷酸、微小寡核苷酸、三螺旋核酸、核酶、RNA適體、雙鏈或單鏈RNA、肽模擬物、包含肽模擬物編碼序列的多核苷酸、或其中任意兩種或多種的混合物。
14.鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞中CREB啟動過程活性的物質(zhì)的方法，包括a)將TORC多肽引入第一細(xì)胞和參照細(xì)胞；b)使第一細(xì)胞接觸物質(zhì)；和c)測定與未接觸該物質(zhì)的參照細(xì)胞中TORC多肽的生物功能相比，第一細(xì)胞中TORC多肽的生物功能是否受到調(diào)節(jié)；其中如果發(fā)生這樣的功能調(diào)節(jié)，則鑒定到調(diào)節(jié)劑。
15.權(quán)利要求14的方法，其中生物功能包括調(diào)節(jié)TORC多肽在多種亞細(xì)胞區(qū)室中的分布。
16.檢測樣品中TORC多肽的存在或?qū)ζ溥M(jìn)行定量的方法，包括步驟a)提供懷疑含有TORC多肽的樣品；b)在確保TORC多肽與特異性結(jié)合劑結(jié)合的條件下，使多肽接觸結(jié)合TORC多肽的特異性結(jié)合劑；和c)檢測與TORC多肽結(jié)合的特異性結(jié)合劑的存在或?qū)ζ溥M(jìn)行定量。
17.權(quán)利要求16所述方法，其中樣品來自細(xì)胞的亞細(xì)胞級分。
18.測定樣品中TORC多肽的量與參照中TORC多肽的量是否不同的方法，其中所述方法包括步驟a)提供懷疑包含TORC多肽的樣品；b)在確保TORC多肽與特異性結(jié)合劑結(jié)合的條件下，使樣品接觸結(jié)合TORC多肽的特異性結(jié)合劑；和c)測定在與步驟b)中相同的條件下，與樣品結(jié)合的特異性結(jié)合劑的量和與參照結(jié)合的特異性結(jié)合劑的量是否不同，其中參照包括標(biāo)準(zhǔn)或參照量的TORC多肽。
19.權(quán)利要求18所述方法，其中樣品來自細(xì)胞的亞細(xì)胞級分。
20.在第一受試者中促成診斷或預(yù)后疾病或病理的方法，其中在該病理中TORC多肽的亞細(xì)胞定位已知與非病理狀態(tài)下TORC多肽的亞細(xì)胞定位不同，該方法包括步驟a)提供懷疑包含TORC多肽的來自第一受試者的樣品；b)在確保TORC多肽與特異性結(jié)合劑結(jié)合的條件下，使樣品接觸與權(quán)利要求16所述結(jié)合多肽的特異性結(jié)合劑；和c)測定在與步驟b)中相同的條件下，與樣品結(jié)合的特異性結(jié)合劑的量和與參照結(jié)合的特異性結(jié)合劑的量是否不同，其中參照由已知不患有該病理的第二受試者提供；從而促成診斷或預(yù)后病理，或促成開發(fā)其治療策略。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中樣品來自細(xì)胞的亞細(xì)胞級分。
22.鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞中TORC多肽活性的物質(zhì)的方法，包括a.使第一細(xì)胞接觸物質(zhì)；b.使參照細(xì)胞接觸對照物質(zhì)；和c.測定與參照細(xì)胞相比，第一細(xì)胞中TORC多肽的亞細(xì)胞區(qū)室化是否發(fā)生改變；其中誘導(dǎo)第一細(xì)胞中TORC多肽亞細(xì)胞區(qū)室化相對于所述參照細(xì)胞改變的物質(zhì)為調(diào)節(jié)細(xì)胞中TORC多肽活性的物質(zhì)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述TORC多肽選自TORC1、TORC2和TORC3。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述亞細(xì)胞區(qū)室化的改變?yōu)楹宿D(zhuǎn)運。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述第一細(xì)胞和所述參照細(xì)胞各自包含重組TORC多肽。
26.在權(quán)利要求22的方法中最初鑒定的化合物的用途，所述化合物作為調(diào)節(jié)TORC多肽活性的物質(zhì)用于治療選自抑郁、心境障礙、精神分裂癥、神經(jīng)變性疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病和亨廷頓病的疾病，或者作為神經(jīng)保護(hù)劑，或者用于增強(qiáng)記憶。
27.在權(quán)利要求22的方法中最初鑒定的化合物的用途，所述化合物作為調(diào)節(jié)TORC多肽活性的物質(zhì)用于治療選自動脈硬化、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、病理性血管發(fā)生、糖尿病、高血壓、慢性痛、炎性疾病和自身免疫性疾病的疾病。
28.在權(quán)利要求22的方法中最初鑒定的作為調(diào)節(jié)TORC多肽活性的物質(zhì)的化合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療選自抑郁、心境障礙、精神分裂癥、神經(jīng)變性疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病和亨廷頓病、動脈硬化、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、病理性血管發(fā)生、糖尿病、高血壓、慢性痛、炎性疾病和自身免疫性疾病的疾病，或者用作神經(jīng)保護(hù)劑，或用于增強(qiáng)記憶。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用CREB(TORC)相關(guān)多核苷酸、多肽或TORC特異性抗體的傳感器的一系列方法。此外，本發(fā)明涉及TORC相關(guān)多核苷酸、多肽或TORC特異性抗體組合物，包括TORC野生型序列變體。示例性方法包括刺激細(xì)胞中TORC相關(guān)過程的方法以及抑制細(xì)胞中TORC相關(guān)過程的方法和抑制細(xì)胞中TORC相關(guān)過程的方法。本發(fā)明還公開了基本抑制患者疾病或病理病癥發(fā)生、治療或改善患者疾病或病理病癥的方法，所述疾病或病理病癥與細(xì)胞中TORC激活過程的水平異常相關(guān)，所述方法包括對受試者施用一種或多種治療有效劑量的調(diào)節(jié)TORC多肽在細(xì)胞的亞細(xì)胞區(qū)域中累積的物質(zhì)或抑制細(xì)胞中TORC表達(dá)的物質(zhì)。在另一方面公開了調(diào)節(jié)細(xì)胞中TORC相關(guān)過程活性的物質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明涉及檢測樣品中TORC多肽的存在或?qū)ζ涠康姆椒?。在另一方面，公開了測定樣品中TORC多肽的量是否與參照中TORC多肽的量不同的方法。本發(fā)明的另一方面涉及促進(jìn)在第一患者中診斷或預(yù)后疾病或病理的方法或開發(fā)其治療策略的方法，其中已知病理中TORC多肽的亞細(xì)胞定位與非病理狀態(tài)下TORC多肽的亞細(xì)胞定位不同。
文檔編號A61K39/395GK101090912SQ200580044519
公開日2007年12月19日 申請日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月25日
發(fā)明者M·比廷杰, M·A·拉博 申請人:諾瓦提斯公司