專(zhuān)利名稱(chēng)：血纖維蛋白d-二聚體片段特異性的、來(lái)源于dd-3b6/22的人源化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及來(lái)源于動(dòng)物或禽類(lèi)物種或品系的載體分子，并且其在暴露于其他動(dòng)物或禽類(lèi)生物物種或品系的免疫系統(tǒng)時(shí)基本上是非免疫原性的。更特別地，本發(fā)明提供了脫敏的免疫交互式分子，并且甚至更特別地提供了用于診斷和治療的脫敏抗體。
背景技術(shù)：
本說(shuō)明書(shū)參考的出版物的書(shū)目詳細(xì)資料被收集在本說(shuō)明書(shū)的末尾。
本說(shuō)明書(shū)對(duì)任何現(xiàn)有技術(shù)的參考不是，也不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為，是該現(xiàn)有技術(shù)在任何國(guó)家中都構(gòu)成部分公知常識(shí)的認(rèn)可或任何形式的暗示。
纖維蛋白原是一種大的蛋白分子，通常以溶解狀態(tài)在血漿中循環(huán)。在凝血酶存在時(shí)，纖維蛋白原分子形成稱(chēng)之為血纖維蛋白的長(zhǎng)線(xiàn)狀聚合體，這是血塊的主要成分。
用纖溶酶消化后，纖維蛋白原形成被命名為A-E的片段。片段D和E是占主導(dǎo)地位的片段，并且D大約為E的兩倍。纖維蛋白原具有三結(jié)節(jié)(trinodular)形狀，其中片段E是中心組分，而片段D是末端細(xì)分。
血纖維蛋白和纖維蛋白原的纖溶酶消化產(chǎn)物可利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)來(lái)彼此區(qū)分。血纖維蛋白和因子X(jué)IIIa的交聯(lián)形成片段D的二聚體并稱(chēng)之為D-二聚體。因子X(jué)IIIa是一種在血纖維蛋白鄰近單體之間引入共價(jià)鍵的酶(Budzynski等，Blood 54(4)794-804，1979)。因子X(jué)IIIa是通過(guò)凝血酶催化切除血漿和血小板前體中的肽而被激活的。D-二聚體是大約為189,000道爾頓的分子，其在本質(zhì)上是由來(lái)源于通過(guò)γ鏈上的纖維蛋白原殘余物間的交聯(lián)鍵共價(jià)結(jié)合的不同血纖維蛋白分子的兩個(gè)片段D基元組成的。纖維蛋白原本身由6條鏈組成，具有兩拷貝的α、β和γ鏈。
另一個(gè)復(fù)合體(DD)E通過(guò)纖溶酶降解交聯(lián)的人血纖維蛋白而形成，并且包括兩個(gè)D片段和片段E的組合。
其它的交聯(lián)衍生物由Graeff和Halfer描述(Graeff和Halfer，″Detection and Relevance of Cross-linked Fibrin Derivatives inBlood″，Seminars in Thrombosis and Hemostatis 8(1)，1982)，并包括高分子量的交聯(lián)衍生物如DY、YY、XD、XY、DXD和YXD。
正常的止血或血液凝固包括維持血管內(nèi)成分的液態(tài)或懸浮狀態(tài)，而同時(shí)使得固相血液組分在血管損傷區(qū)域進(jìn)行局部沉積。在健康狀態(tài)下，人們假定，但從未經(jīng)實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)，在低級(jí)血管內(nèi)血纖維蛋白的沉積與纖維蛋白溶解或細(xì)胞噬菌作用對(duì)它的清除之間存在著平衡。
早期臨床觀察顯示一些重病患者出現(xiàn)大出血和大塊淤血的征兆，并且具有延長(zhǎng)的凝血時(shí)間和血小板減少癥。死后，在某些病例中，在微脈管系統(tǒng)中證明有血纖維蛋白血栓癥。這些血栓癥的擴(kuò)散性質(zhì)引起彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，因此也被稱(chēng)作消耗性凝血病。因此，凝血酶與疾病如深靜脈血栓癥(DVT)和肺栓塞(PE)有關(guān)。
疾病例如DIC、DVT和PE涉及凝血系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致血小板消耗、血栓產(chǎn)生、血纖維蛋白沉積以及繼發(fā)的纖維蛋白溶解。該過(guò)程的純生物學(xué)效應(yīng)反映了血纖維蛋白沉積和血纖維蛋白清除之間的平衡。所產(chǎn)生的臨床表現(xiàn)為當(dāng)凝血因子的損耗占主導(dǎo)地位時(shí)可能是大出血，或者由于在其它條件下血管閉塞的影響，為局部缺血性組織損傷。
DIC、DVT和PE已被報(bào)道是多種紊亂的繼發(fā)現(xiàn)象，特別是那些伴有并發(fā)的休克、酸毒癥和血氧不足癥的疾病。眾所公認(rèn)的臨床聯(lián)系有敗血癥、主要外傷、惡性瘤以及產(chǎn)科失調(diào)。最近，DVT被公認(rèn)為是在延長(zhǎng)的空中旅游或其它延長(zhǎng)的不運(yùn)動(dòng)期間出現(xiàn)的特殊問(wèn)題。在任何情況下，凝血程序的激活導(dǎo)致凝血蛋白和血小板的消耗，造成血纖維蛋白在微循環(huán)中的沉積。
理想地，疾病如DIC、DVT和PE的確診需要擴(kuò)散性血纖維蛋白沉積的直接證據(jù)。獲取多種直接的活組織檢查證據(jù)以區(qū)分局部性和全身性血纖維蛋白形成的實(shí)際困難，導(dǎo)致了取代為診斷終點(diǎn)的間接測(cè)試的發(fā)展。然而，這些測(cè)試對(duì)血管內(nèi)血纖維蛋白沉積綜合征不具有特異性。它們的特異性通過(guò)其它酶的作用被進(jìn)一步降低，這些酶雖然不能夠?qū)⒗w維蛋白原轉(zhuǎn)換為血纖維蛋白，但可以象凝血酶一樣導(dǎo)致血栓癥中所涉及的其它凝血因子發(fā)生類(lèi)似的改變。所有這些間接測(cè)試都基于凝血酶是唯一(蛇毒液除外)能夠在哺乳動(dòng)物中將纖維蛋白原轉(zhuǎn)換為血纖維蛋白的酶的原理。
而且，除了檢測(cè)循環(huán)的可溶性血纖維蛋白單體復(fù)合體存在的副凝固實(shí)驗(yàn)之外，沒(méi)有一種更特異的凝血酶特異性測(cè)試可容易地得到、或可用于診斷這些血纖維蛋白相關(guān)疾病的直接臨床應(yīng)用。這些測(cè)試包括FPA(血纖維蛋白肽A)測(cè)試，其中FPA通過(guò)特異性的RIA操作檢測(cè)，血纖維蛋白單體試驗(yàn)，纖維蛋白原凝膠排阻層析以及FPB(血纖維蛋白肽B)或凝血酶可增加的FPB測(cè)試。
生化非特異性的凝血酶作用測(cè)試包括凝血素時(shí)間(PT)、促凝血酶原激酶時(shí)間(A PTT)以及凝血酶凝結(jié)時(shí)間(TCT)測(cè)試。盡管經(jīng)?？捎糜趯?shí)踐，必須認(rèn)識(shí)到從這些測(cè)試獲得的信息在本質(zhì)上是非特異性的，起著不考慮病因?qū)W而測(cè)量凝結(jié)因子損耗的作用。
凝血因子試驗(yàn)也被發(fā)現(xiàn)是相對(duì)非特異性的，并且這包括輔因子V和VIII的分析以及纖維蛋白原水平的測(cè)試。
血纖維蛋白-纖維蛋白原降解產(chǎn)物的測(cè)試迄今還沒(méi)有被證明對(duì)于纖溶酶對(duì)血纖維蛋白的作用是特異性的，并且當(dāng)凝血酶沒(méi)有在先對(duì)纖維蛋白原分子作用而出現(xiàn)纖維蛋白原溶解時(shí)可產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。這些測(cè)試包括片斷D和E的測(cè)試。
對(duì)凝血酶介導(dǎo)的血小板相互作用或釋放進(jìn)行測(cè)試發(fā)現(xiàn)在本質(zhì)上是非特異性的。這包括血小板計(jì)數(shù)、血小板殘存以及血小板釋放測(cè)試。
還嘗試使用了與鑒定凝結(jié)因子有關(guān)的放射性標(biāo)記的纖維蛋白原，但發(fā)現(xiàn)費(fèi)時(shí)并且難于操作。
因此，診斷試驗(yàn)的功效在于其能夠預(yù)示疾病存在與否。對(duì)于診斷試驗(yàn)功效確定的研究，存在眾所公認(rèn)的基本設(shè)計(jì)原理，其使四項(xiàng)指數(shù)靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值能夠得以確定。第一個(gè)必要條件是采用適當(dāng)?shù)脑\斷標(biāo)準(zhǔn)。理想地，該標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)稍微超過(guò)臨床精確度，并且應(yīng)當(dāng)對(duì)疾病實(shí)體盡可能是特異性的。特別與DVT和PE有關(guān)的固有難點(diǎn)是許多常規(guī)可用的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)也缺乏診斷的特異性。低的血小板計(jì)數(shù)支持這些疾病的可能性，但也可能作為感染繼發(fā)的孤立發(fā)現(xiàn)而發(fā)生。相似的局限性適用于許多凝血試驗(yàn)。低纖維蛋白原血不能區(qū)分因纖溶酶或者彈性蛋白酶作用而產(chǎn)生的原發(fā)性纖維蛋白溶解和在凝血酶介導(dǎo)纖維蛋白原轉(zhuǎn)換為血纖維蛋白之后繼發(fā)的纖維蛋白溶解?；蛘?，可以利用凝血酶作用的敏感性試驗(yàn)，但其臨床應(yīng)用具有明顯的缺陷。一個(gè)例子是FPA試驗(yàn)，盡管其對(duì)凝血酶作用是特異性的，但異常靈敏，并可在非并發(fā)的靜脈血栓癥中檢測(cè)到局部化的血管內(nèi)凝血固而產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。提高的FPA水平的臨床重要性，即使伴有陽(yáng)性的副凝固試驗(yàn)，仍有爭(zhēng)議，特別是如果血小板計(jì)數(shù)、全局凝結(jié)試驗(yàn)及纖維蛋白原水平是正常的話(huà)。
鑒于這些理由，靈敏度、特異性以及預(yù)測(cè)值不能夠以標(biāo)準(zhǔn)的方式予以確定。這些紊亂的臨床表現(xiàn)是復(fù)雜和不可預(yù)知的。因此，可用診斷試驗(yàn)的應(yīng)用，最好結(jié)合不同的血管內(nèi)凝血臨床綜合病癥加以考慮。
鼠單克隆抗體3B6被公開(kāi)(美國(guó)專(zhuān)利No.4,758,524)。該抗體是D-二聚體特異性的，并代表了第一個(gè)凝結(jié)特異性的抗體。然而，利用這一抗體作為人類(lèi)全身診斷制劑的能力由于該分子的免疫原性而受到限制。因此，需要修飾3B6抗體以降低其在非鼠動(dòng)物和人類(lèi)中的免疫原性。
發(fā)明概述在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，除非上下文另有要求，措辭“包括(comprise)”，或者變化形式例如″comprises″或″comprising″，將被理解為意味著包含規(guī)定的元件或整體或者元件或整體組，而不是排除任何其它的元件或整體或者元件或整體組。
冠詞“一個(gè)(a)”或“一種(an)”在本文中用于指一個(gè)或多于一個(gè)(也就是至少一個(gè))合乎語(yǔ)法目的的物質(zhì)。作為例子，“一個(gè)元件”是指一個(gè)元件或不止一個(gè)元件。
在本發(fā)明的先導(dǎo)工作中，利用脫敏技術(shù)降低3B6抗體的免疫原性。這使得用于人類(lèi)的血栓癥成像診斷方法得以發(fā)展。此外，脫敏形式的3B6抗體允許其作為凝塊靶向制劑，將凝塊溶解劑或者凝塊成長(zhǎng)預(yù)防劑例如抗凝固劑遞送到凝塊部位。因此，本發(fā)明的脫敏分子起著將診斷和治療制劑遞送到靶部位例如凝塊的載體的作用。這些分子還可以具有它們自己的診斷和治療特征。脫敏形式3B6抗體的發(fā)展可應(yīng)用于一系列疾病例如DVT和PE中。此外，脫敏形式的3B6抗體可與計(jì)算機(jī)支持的斷層攝影術(shù)核醫(yī)學(xué)或平面成像技術(shù)例如CT、MRI或超聲波聯(lián)合使用。
因此，本發(fā)明提供了一種載體分子，一般地是一種免疫交互式分子的形式，而特別地是相對(duì)于親本分子被嵌合和/或突變的單克隆抗體，從而它在靶宿主例如人類(lèi)體內(nèi)表現(xiàn)出低的免疫原性。嵌合或突變的過(guò)程在這里被稱(chēng)之為脫敏。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫交互式分子例如單克隆抗體被人源化，已降低其在人體中的免疫原性。脫敏可以不同的方法進(jìn)行，但在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，單克隆抗體可變(v)區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被突變(例如取代)以降低MHC II對(duì)來(lái)源于該區(qū)的肽的識(shí)別。換句話(huà)說(shuō)，脫敏過(guò)程目的在于降低T-細(xì)胞表位介導(dǎo)的針對(duì)該抗體的免疫反應(yīng)。本發(fā)明最優(yōu)選的抗體是對(duì)D-二聚體表現(xiàn)出特異性的脫敏形式的鼠單克隆抗體3B6。脫敏形式3B6的產(chǎn)生允許發(fā)展主要用于人體內(nèi)血塊的全身凝塊靶向制劑。這允許其被作為成像制劑以及作為將凝塊溶解劑或者凝塊成長(zhǎng)預(yù)防劑例如抗凝劑遞送到凝塊部位的載體。
因此，該脫敏抗體可以單獨(dú)或作為一系列診斷和/或治療制劑的載體。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了免疫交互式分子的變體，它包括對(duì)交聯(lián)的血纖維蛋白衍生物具有特異性的部分，并且該部分來(lái)源于可得自動(dòng)物或禽類(lèi)生物的免疫交互式分子，其中的變體在來(lái)自相同或不同種類(lèi)的其它動(dòng)物或禽類(lèi)生物中表現(xiàn)出低的免疫原性。
優(yōu)選地，免疫交互式分子是單克隆抗體變體，包括對(duì)交聯(lián)的血纖維蛋白衍生物具有特異性的部分。
更優(yōu)選地，單克隆抗體是對(duì)人源D-二聚體以及其它交聯(lián)血纖維蛋白衍生物具有特異性、并且對(duì)纖維蛋白原或者包含片段D和E在內(nèi)的纖維蛋白原降解產(chǎn)物是非反應(yīng)性的鼠源單克隆抗體變體，其中的鼠源單克隆抗體變體在人體中基本上是非免疫原性的。
優(yōu)選地，抗體是對(duì)被單克隆抗體3B6所識(shí)別的表位具有特異性的脫敏抗體，并且包括來(lái)源于3B6單克隆抗體可變結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)，而且該脫敏抗體分子的其余的免疫球蛋白源部分是來(lái)源于其中該抗體待脫敏的宿主的免疫球蛋白或其類(lèi)似物。
因此，本發(fā)明提供了對(duì)被3B6單克隆抗體所識(shí)別的表位具有特異性的脫敏抗體分子，其中所述脫敏抗體可變結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)是來(lái)源于3B6單克隆抗體，其中所述3B6抗體可變區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被突變，以降低MHC II類(lèi)分子對(duì)來(lái)源于該區(qū)的肽的識(shí)別。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于人類(lèi)的脫敏鼠單克隆抗體3B6變體，在該3B6抗體的v區(qū)包括被設(shè)計(jì)成用以消除或減少v區(qū)的與MHC II類(lèi)分子結(jié)合的肽片段的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變。
脫敏的免疫交互式分子可單獨(dú)使用，或者作為將診斷和/或治療制劑遞送到靶部位例如血塊的載體。
因此，本發(fā)明考慮了在人類(lèi)患者體中檢測(cè)血塊的方法，通過(guò)向患者體內(nèi)引入用報(bào)道分子標(biāo)記的脫敏形式的鼠單克隆抗體3B6或其抗原結(jié)合片段，使該標(biāo)記抗體散布在整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)中，然后對(duì)患者進(jìn)行報(bào)道分子檢測(cè)方法以鑒定該抗體在凝塊中的位置。
在一個(gè)選擇的實(shí)施方案中，未標(biāo)記的脫敏形式的3B6，而標(biāo)記了具有抗-免疫球蛋白特異性的第二抗體。該抗體與第一個(gè)提及的抗體形成標(biāo)記復(fù)合體。
作為載體，脫敏載體可將任何凝塊結(jié)合分子連同其它診斷或治療制劑遞送到凝塊部位。
因此，本發(fā)明考慮對(duì)D-二聚體或其它交聯(lián)血纖維蛋白衍生物具有特異性的脫敏鼠單克隆抗體在制造凝塊成像制劑中的應(yīng)用。
而本發(fā)明的另一個(gè)方面考慮促進(jìn)人體內(nèi)血塊溶解或清除的方法，所述方法包括向所述人施用凝塊溶解或凝塊生長(zhǎng)預(yù)防有效量的對(duì)人源D-二聚體以及其它交聯(lián)血纖維蛋白衍生物具有特異性、并且對(duì)纖維蛋白原或者包含片段D和E在內(nèi)的纖維蛋白原降解產(chǎn)物是非反應(yīng)性的鼠源單克隆抗體變體，其中所述鼠源單克隆抗體變體在人體中基本上是非免疫原性的。其中所述單克隆抗體進(jìn)一步包括融合的、結(jié)合的或以其它方式連接在其上的凝塊溶解或凝塊生長(zhǎng)預(yù)防制劑。
本發(fā)明還有另一個(gè)方面涉及對(duì)人源D-二聚體以及其它交聯(lián)血纖維蛋白衍生物具有特異性、并且對(duì)纖維蛋白原或者包含片段D和E在內(nèi)的纖維蛋白原降解產(chǎn)物是非反應(yīng)性的鼠源單克隆抗體變體在制造用于溶解人體內(nèi)的血塊的藥劑中的用途，其中所述鼠源單克隆抗體變體在人體中基本上是非免疫原性的，并且所述抗體進(jìn)一步包括融合的、結(jié)合的或以其它方式聯(lián)接在其上的凝塊溶解或凝塊生長(zhǎng)預(yù)防制劑。
優(yōu)選的分子是用于人類(lèi)的脫敏鼠單克隆抗體3B6變體，并且包括含有選自于SEQ ID NO7/SEQ ID NO10、SEQ ID NO8/SEQ IDNO10、SEQ ID NO9/SEQ ID NO10、SEQID NO7/SEQ ID NO12、SEQ ID NO8/SEQ ID NO12、SEQ ID NO8/SEQ ID NO11、SEQ ID NO9/SEQ ID NO11、SEQ ID NO9/SEQ ID NO12以及SEQ ID NO7/SEQ ID NO11的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的重鏈和輕鏈v-結(jié)構(gòu)域的組合，或者由與上文列舉的每對(duì)中的一個(gè)或兩個(gè)核苷酸序列至少有70％相似性的核苷酸序列、或由在低嚴(yán)緊度條件下能夠與上文列舉的每對(duì)中的一個(gè)或兩個(gè)核苷酸序列或者其互補(bǔ)形式雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的組合。
脫敏備用的3B6抗體變體優(yōu)選包括含有選自SEQ ID NO1/SEQID NO4、SEQ ID NO2/SEQ ID NO4、SEQ ID NO3/SEQ ID NO4、SEQ ID NO1/SEQ ID NO6、SEQ ID NO2/SEQ ID NO6、SEQID NO2/SEQ ID NO5、SEQ ID NO3/SEQID NO5、SEQID NO3/SEQ ID NO6以及SEQ ID NO1/SEQ ID NO5的氨基酸序列的重鏈和輕鏈v-結(jié)構(gòu)域的組合，或者與上文列舉的每對(duì)中的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸序列至少有70％相似性的氨基酸序列的組合。
另一個(gè)優(yōu)選的3B6變體包括選自VHv5/VKv1、VHv6/VKv1、VHv7/VKv1、VHv5/VKv7、VHv6/VKv7、VHv6/VKv4、VHv7/VKv4、VHv7/VKv7以及VHv5/VKv4的重鏈和輕鏈v-結(jié)構(gòu)域的組合。
本發(fā)明的另一方面考慮了在人類(lèi)患者體內(nèi)檢測(cè)血塊的方法，通過(guò)向患者體內(nèi)引入用報(bào)道分子標(biāo)記的脫敏形式的鼠單克隆抗體3B6或其抗原結(jié)合片段，使該標(biāo)記抗體散布在整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)中，然后對(duì)患者進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助的斷層攝影術(shù)核醫(yī)學(xué)掃描來(lái)觀測(cè)凝塊。
而本發(fā)明的另一個(gè)方面考慮了在人類(lèi)患者體中檢測(cè)血塊的方法，通過(guò)向患者引入用報(bào)道分子標(biāo)記的脫敏形式的鼠單克隆抗體3B6或其抗原結(jié)合片段，使該標(biāo)記抗體散布在整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)中散布，然后對(duì)患者進(jìn)行平面凝塊成像術(shù)來(lái)觀測(cè)凝塊。
本發(fā)明的脫敏免疫交互式分子還可用于將抗凝固劑錨定在特定的部位。因此，這方面提供了將診斷或治療制劑組織特異性地錨定于例如凝塊上。此外，免疫交互式分子可被設(shè)計(jì)為具有多重特異性。舉例來(lái)說(shuō)，設(shè)計(jì)了包括一個(gè)凝塊特異性和另一個(gè)凝塊部位(例如細(xì)胞受體)特異性的雙特異性脫敏抗體。這使得抗體保留在凝塊的部位上。
在一個(gè)選擇方案中，設(shè)計(jì)了多步驟治療法，其中，舉例來(lái)說(shuō)，向凝塊靶向施用與抗凝固劑配位的脫敏3B6或其它交互式分子并形成復(fù)合體，然后給第一抗體和/或抗凝固劑定向施用第二抗體以促進(jìn)或監(jiān)測(cè)第一復(fù)合體。
脫敏的免疫交互式分子還可以被用于確定凝塊消散或凝塊消失的動(dòng)力學(xué)。這可用于更早地預(yù)測(cè)凝塊的出現(xiàn)或消失，因此，有助于確定何時(shí)開(kāi)始第二治療例如抗凝固劑治療的動(dòng)力學(xué)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括脫敏的免疫交互式分子以及成像和/或治療性標(biāo)記物。成像標(biāo)記物包括MRI、超聲波以及CT標(biāo)記物。治療制劑標(biāo)記物包括放射性同位素、抗凝結(jié)制劑以及細(xì)胞因子。
表1提供了整個(gè)主題說(shuō)明書(shū)中所用的序列標(biāo)識(shí)符概況。
表1序列標(biāo)識(shí)符概況
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是顯示(A)3B6單克隆抗體的圖解圖；(B)3B6結(jié)合于血塊的照片(×4,2000放大倍數(shù))。
圖2圖解描繪了用核標(biāo)記物(99mTc)標(biāo)記的3B6抗體。
圖3A圖表描繪顯示了給人類(lèi)循環(huán)系統(tǒng)施用3B699mTc。
圖3B照片描繪顯示了當(dāng)來(lái)自99mTc的放射線(xiàn)集中在凝塊部位時(shí)而對(duì)前腿中的血塊進(jìn)行的觀測(cè)。
圖4A、4B和4C繪畫(huà)描繪顯示了利用脫敏的3B6單克隆抗體進(jìn)行D-二聚體捕獲試驗(yàn)。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明部分建立在能夠提供一種來(lái)源于一種動(dòng)物或禽類(lèi)生物的而在相同或不同物種的另一種動(dòng)物或禽類(lèi)生物中基本上呈非免疫原性的免疫交互式分子的生物化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用上。該生物化學(xué)方法被稱(chēng)之為“脫敏”。本文所指的“脫敏”包括諸如互補(bǔ)決定性區(qū)域(CDR)移植、有關(guān)免疫交互式分子構(gòu)架區(qū)的“重塑”、以及可變(v)區(qū)的突變，都旨在降低免疫交互式分子在特定宿主中的免疫原性。在本案中，優(yōu)選的免疫交互式分子是抗體例如多克隆或單克隆抗體。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫交互分子是單克隆抗體，來(lái)源于一種動(dòng)物或禽類(lèi)生物，并且在相同或不同物種的另一種動(dòng)物或禽類(lèi)生物中表現(xiàn)出低的免疫原性。
本發(fā)明一般地涉及來(lái)源于一種動(dòng)物或禽類(lèi)物種或品系的載體分子，并且當(dāng)其暴露于其它動(dòng)物或禽類(lèi)物種或品系的免疫系統(tǒng)時(shí)基本上是非免疫原性的。載體分子可以本身表現(xiàn)出有益的診斷或治療特征，或者可以被用于將活性化合物(例如抗凝血制劑、放射性同位素)遞送到靶部位。一般地，載體分子是免疫交互式分子。更特別地，本發(fā)明涉及包括非鼠哺乳動(dòng)物化形式的、基本上不能夠在非鼠動(dòng)物特別是人體中誘導(dǎo)針對(duì)其本身的免疫應(yīng)答的脫敏鼠源單克隆抗體。更加特別地，本發(fā)明提供了脫敏形式的鼠單克隆抗體3B6，從而在對(duì)人類(lèi)施用后，其不能夠、或者表現(xiàn)出降低的、誘導(dǎo)針對(duì)其本身或其衍生物的實(shí)質(zhì)性免疫應(yīng)答的能力。脫敏的免疫交互式分子特別是本發(fā)明的抗體具有廣泛有益的診斷和治療應(yīng)用，例如檢測(cè)人類(lèi)循環(huán)系統(tǒng)中的血塊，以及作為凝塊靶向制劑遞送凝塊溶解制劑或凝塊生長(zhǎng)預(yù)防制劑如抗凝固劑。
包括人源化形式的脫敏主題單克隆抗體特別被用于診斷和治療疾病如深靜脈血栓癥和肺栓塞。本發(fā)明的分子特別被用作將活性化合物遞送到靶部位的制劑。這樣的活性化合物包括凝塊結(jié)合分子。
從而，本發(fā)明一方面提供了免疫交互式分子變體，所述變體包括對(duì)交聯(lián)的血纖維蛋白衍生物具有特異性的部分，并且該部分得自從一種動(dòng)物或禽類(lèi)生物的免疫交互式分子，其中所述變體在相同或不同物種的其它動(dòng)物或禽類(lèi)中表現(xiàn)出降低的免疫原性。
所上所述，優(yōu)選形式的免疫交互式分子是抗體，并且特別是單克隆抗體。
從而，本發(fā)明另一方面提供了單克隆抗體變體，包括對(duì)交聯(lián)的血纖維蛋白衍生物具有特異性的部分，并且該部分得自于從第一動(dòng)物或禽類(lèi)生物的單克隆抗體，其中所述變體在相同或不同物種的第二動(dòng)物或禽類(lèi)中表現(xiàn)出降低的免疫原性。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，單克隆抗體獲自鼠科動(dòng)物，并且相對(duì)于另一個(gè)鼠科動(dòng)物或不同物種的動(dòng)物如人脫敏化。鼠科動(dòng)物中的鼠單克隆抗體針對(duì)來(lái)源于血纖維蛋白原的非變性D-二聚體被募集。后者分子通過(guò)纖溶酶被消化，并產(chǎn)生一系列命名為片段A到E的片段。血纖維蛋白和因子X(jué)IIIa的交聯(lián)形成片段D的二聚體稱(chēng)之為D-二聚體。該D-二聚體是大約為189,000道爾頓的分子，并且包含通過(guò)γ鏈上的纖維蛋白原殘余物間的交聯(lián)鍵結(jié)合的兩個(gè)片段D基元。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及鼠源單克隆抗體變體，對(duì)人源D-二聚體以及其它交聯(lián)血纖維蛋白衍生物具有特異性、并且對(duì)纖維蛋白原或者包含片段D和E在內(nèi)的纖維蛋白原降解產(chǎn)物是非反應(yīng)性的，其中所述鼠源單克隆抗體變體在人體中基本上是非免疫原性的。
關(guān)于“基本上是非免疫原性”包括與親本抗體，也就是暴露于脫敏步驟之前的抗體相比，降低的免疫原性。術(shù)語(yǔ)“免疫原性”包括激起、誘發(fā)、或以其他方式促進(jìn)宿主動(dòng)物的體液和/或T-細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的能力。特別便利的免疫原性標(biāo)準(zhǔn)包括來(lái)源于抗體可變(v)區(qū)的氨基酸序列與MHC II類(lèi)分子相互作用、從而刺激或促進(jìn)T-細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，包括T-細(xì)胞輔助的體液應(yīng)答的能力。本發(fā)明考慮的免疫交互式分子特別是單克隆抗體包括提及的凝塊靶向制劑。
本文所提及的優(yōu)選的鼠源單克隆抗體是單克隆抗體3B6，其在美國(guó)專(zhuān)利No.4,758,524中被描述。
因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了脫敏形式的單克隆抗體3B6，其中所述脫敏3B6在人體中基本上是非免疫原性的。
而且，上下文中的“基本上是非免疫原性”是指脫敏3B6單克隆抗體在人體中誘導(dǎo)或促進(jìn)針對(duì)其本身的免疫應(yīng)答(在最初或隨后給藥后)的能力與脫敏前的鼠單克隆抗體3B6相比降低了。
雖然優(yōu)選的發(fā)明特別涉及與人類(lèi)有關(guān)的脫敏形式的3B6，本發(fā)明擴(kuò)展至對(duì)其它動(dòng)物或禽類(lèi)物種脫敏的、對(duì)D-二聚體和/或其它交聯(lián)血纖維蛋白衍生物具有相似特異性的這種抗體或另一種抗體。
本文涉及的其它交聯(lián)血纖維蛋白衍生物包括，舉例來(lái)說(shuō)，除了D-二聚體之外，還有D-二聚體衍生物以及包含D和E片段的復(fù)合體。后者包括(DD)E，并且是通過(guò)纖溶酶降解交聯(lián)的人血纖維蛋白形成的，并且包含兩個(gè)D片段和E片段的組合。其它的交聯(lián)衍生物包括DY、YY、XD、XY、DXD和YXD，其中字母表示被纖溶酶降解后形成的纖維蛋白原片段，其中X和Y不同，并且選自片段A到C以及E。優(yōu)選地，本主題發(fā)明的脫敏抗體是來(lái)源于對(duì)D-二聚體及其它交聯(lián)血纖維蛋白衍生物具有特異性的抗體，但其不與纖維蛋白原、包括片段D和片段E在內(nèi)的纖維蛋白原降解產(chǎn)物發(fā)生交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，產(chǎn)生抗體的克隆是用液相D-二聚體分子而不是固定化的D-二聚體挑選的，雖然通過(guò)任何一種形式的D-二聚體篩選的克隆都被考慮在本發(fā)明之內(nèi)。
優(yōu)選地，脫敏抗體對(duì)它的靶抗原表現(xiàn)出親和力，這與鼠單克隆抗體3B6表現(xiàn)出的親和力相似。
與抗原結(jié)合分子上的個(gè)別抗原結(jié)合部位和該抗原上其相應(yīng)部位之間的相互作用有關(guān)的“親和力”包括這種相互作用的強(qiáng)度。
“抗體”是指能夠與抗原結(jié)合、相互作用或以其它方式聯(lián)合的免疫球蛋白家族的蛋白。因此，抗體是抗原結(jié)合的分子?！翱贵w”是免疫交互式分子的一個(gè)例子，并且包括多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明優(yōu)選的免疫交互式分子為單克隆抗體?？贵w包括其部分，包括Fab部分和抗原結(jié)合決定簇。
術(shù)語(yǔ)“抗原”在本文是用來(lái)最廣義地指能夠在免疫應(yīng)答中起反應(yīng)和/或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。所指“抗原”包括抗原決定簇或表位。在該上下文中的抗原視為免疫交互式分子，并且更特別地，視為單克隆抗體。
任何對(duì)靶抗原具有結(jié)合親和力的分子被稱(chēng)之為“抗原結(jié)合分子”。應(yīng)當(dāng)理解該術(shù)語(yǔ)延及免疫球蛋白(例如多克隆或單克隆抗體)、免疫球蛋白片段以及由免疫球蛋白衍生的表現(xiàn)出抗原結(jié)合活性的蛋白骨架。術(shù)語(yǔ)“抗體”和“抗原結(jié)合分子”包括這些分子的脫敏形式。
而針對(duì)其可定向發(fā)生特定的免疫應(yīng)答的部分抗原分子被稱(chēng)之為“抗原決定簇”或“表位”，并且包括半抗原。典型地，在動(dòng)物體中，抗原同時(shí)呈遞幾個(gè)甚至許多抗原決定簇。“半抗原”是能夠與抗體特異性結(jié)合的物質(zhì)，但是不能或者僅能較差地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，除非結(jié)合到載體上。半抗原典型地包括單個(gè)的抗原決定簇或表位。
如上所述，盡管本發(fā)明優(yōu)選的抗體是用于人類(lèi)的脫敏形式的鼠單克隆抗體，本發(fā)明延及任何來(lái)源的和脫敏用于任何宿主的抗體。動(dòng)物和禽類(lèi)來(lái)源以及宿主的實(shí)例包括人類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)、家畜類(lèi)動(dòng)物(例如綿羊、奶牛、馬、豬、驢)、實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、家兔、豚鼠、倉(cāng)鼠)、陪伴動(dòng)物(例如狗、貓)、家禽類(lèi)(例如雞、鴨、鵝、火雞)以及獵禽(例如雉)。脫敏抗體或其部分還可以在非動(dòng)物組織例如植物中產(chǎn)生。植物特別被用作單鏈抗體的來(lái)源。
本發(fā)明的另一方面考慮生產(chǎn)對(duì)人D-二聚體或其它交聯(lián)血纖維蛋白衍生物的抗原決定簇具有特異性的脫敏單克隆抗體的方法，所述方法包括(i)獲取人交聯(lián)血纖維蛋白衍生物或者含有相同成分的提取物；(ii)在非人動(dòng)物中產(chǎn)生對(duì)所述交聯(lián)血纖維蛋白衍生物具有特異性、但不與片段D發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體；以及(iii)對(duì)所述非人源抗體進(jìn)行脫敏。
交聯(lián)血纖維蛋白衍生物可源自于任何合適的抗原提取，包括纖溶酶介導(dǎo)的血纖維蛋白血凝塊降解，或者通過(guò)凝血酶、因子X(jué)IIIa以及纖溶酶對(duì)纖維蛋白原同時(shí)作用，使有瞬時(shí)的血凝塊形成和隨后的血凝塊溶解。在后一種方法中，纖維蛋白原通過(guò)凝血酶和因子X(jué)IIIa的作用被轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白，并隨后用纖溶酶消化。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解血纖維蛋白衍生物或含有相同成分的提取物可獲自于非人動(dòng)物來(lái)源?？乖瓉?lái)源適宜地來(lái)自于生物樣品。
可從動(dòng)物中提取、不經(jīng)處理、處理、稀釋或濃縮的樣品被包括在術(shù)語(yǔ)“生物樣品”中。
上述獲取粗制抗原片段的方法代表體外方法。合適的體內(nèi)方法包括獲取動(dòng)物包括人的血清或者含有交聯(lián)血纖維蛋白衍生物的其它體液，并使該體液經(jīng)受PAGE步驟，其中基本上純的交聯(lián)血纖維蛋白衍生物被分離出來(lái)。
或者，交聯(lián)血纖維蛋白衍生物可從獲自患有嚴(yán)重血栓紊亂的患者的血清中純化，以Willner等，Biochemistry 212687-2692，1982所描述的利用凝膠過(guò)濾聯(lián)合離子交換層析的技術(shù)為基礎(chǔ)。
抗原(也就是D-二聚體或其它交聯(lián)血纖維蛋白衍生物)可通過(guò)任何合適的方法從生物樣品中分離。舉例來(lái)說(shuō)，分離可利用任何一種或多種抗原表面電荷性質(zhì)、大小、密度、生物活性及其對(duì)另一個(gè)實(shí)體的親和力(例如它結(jié)合或以其它方式聯(lián)合的另一個(gè)蛋白或化學(xué)化合物)。因而，舉例來(lái)說(shuō)，抗原從生物液中的分離可通過(guò)任何一種或多種超速離心、離子交換層析(例如陰離子交換層析、陽(yáng)離子交換層析)、電泳(例如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦)、分子大小分離(例如凝膠過(guò)濾、超濾)以及親和力介導(dǎo)的分離(例如免疫親和分離，包括但不限于，磁珠分離例如DynabeaTM分離、免疫層析、免疫沉淀)。所使用的分離技術(shù)的挑選可以取決于特定抗原的生物活性或物理性質(zhì)。
優(yōu)選地，從生物液中分離抗原保留了呈遞在抗原表面的構(gòu)象表位，從而適當(dāng)?shù)乇苊饬藢?dǎo)致抗原變性的技術(shù)的使用。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到維持或者盡可能接近地模仿抗原特有的生理?xiàng)l件(例如它們所獲自的生物液)的重要性，以確保與動(dòng)物接觸的抗原上的抗原決定簇或活性部位與天然抗原的是結(jié)構(gòu)上完全相同的。這確保在免疫動(dòng)物中能識(shí)別天然抗原的合適抗體的產(chǎn)生。在這種類(lèi)型的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原用親和分離、凝膠過(guò)濾及超濾的任何一種或多種從生物液中分離。
免疫及隨后單克隆抗體的產(chǎn)生可利用例如Khler和Milstein(Nature 256495-499，1975；Khler和Milstein，Eur.J；Immunol.6(7)511-519，1976)、Coligan等(Current Protocols in Immunology，JohnWiley&Sons，Inc.，1991-1997)或Toyama等(″Monoclonal Antibody，Experiment Manual″，published by Kodansha Scientific，1987)所描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行?；旧?，動(dòng)物用含有抗原的生物液或其片段通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法免疫，以產(chǎn)生抗體生產(chǎn)細(xì)胞，特別是抗體生產(chǎn)體細(xì)胞(例如B淋巴細(xì)胞)。然后這些細(xì)胞可從免疫動(dòng)物中取出用于無(wú)限增殖?？乖赡苄枰紫扰c較大的分子結(jié)合。后者是典型的高分子量的任何物質(zhì)，其上天然地或人工地交聯(lián)有非免疫原性或弱免疫原性的物質(zhì)(例如半抗原)以增強(qiáng)它的免疫原性。
抗體生產(chǎn)細(xì)胞的無(wú)限增殖可利用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，無(wú)限增殖可通過(guò)利用Epstein-Barr病毒(EBV)轉(zhuǎn)化的方法(Kozbor等，Methods in Enzymology 121140，1986)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體生產(chǎn)細(xì)胞利用細(xì)胞融合方法無(wú)限增殖(被記載在Coligan等，1991-1997中，同前)，這在單克隆抗體的生產(chǎn)中被廣泛使用。在這種方法中，具有產(chǎn)生抗體潛能的抗體生產(chǎn)體細(xì)胞，特別是B細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞系融合。這些體細(xì)胞可以源自于致敏動(dòng)物的淋巴結(jié)、脾和外周血，優(yōu)選地是嚙齒類(lèi)動(dòng)物例如小鼠和大鼠。在本發(fā)明的例示性實(shí)施方案中，利用了小鼠脾細(xì)胞。不過(guò)，可以利用大鼠、家兔、綿羊或山羊細(xì)胞，或者其它動(dòng)物物種的細(xì)胞替代。
已經(jīng)從淋巴細(xì)胞腫瘤建立了用于雜交瘤生產(chǎn)融合方法的特殊化骨髓瘤細(xì)胞系(Khler和Milstein，1976，同前；Shulman等，Nature276.-269-270，1978；Volk等，J ViroL 42(1)220-227，1982)。這些細(xì)胞系至少是由于三個(gè)原因而被建立。第一個(gè)是易化融合雜交瘤從未融合而相似地?zé)o限自我增生的骨髓瘤細(xì)胞中的挑選。通常，這通過(guò)利用具有酶缺陷、使其不能夠在支持雜交瘤生長(zhǎng)的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的骨髓瘤來(lái)完成。第二個(gè)原因起因于淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生其自身抗體的固有能力。為消除雜交瘤產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞抗體，利用了不能夠產(chǎn)生內(nèi)源性輕鏈胡重鏈免疫球蛋白鏈的骨髓瘤細(xì)胞系。選擇這些細(xì)胞系的第三個(gè)原因在于它們用于融合的適當(dāng)性和有效性。
許多骨髓瘤細(xì)胞系可用于產(chǎn)生融合細(xì)胞雜合子，包括，例如P3X63-Ag8、P3X63-AG8.653、P3/NS1-Ag4-1(NS-1)、Sp2/0-Agl4以及S194/5.XXO.Bu.1。P3X63-Ag8和NS-1細(xì)胞系已由Khler和Milstein(1976，同前)描述。Shulman等(1978，同前)建立了Sp2/0-Agl4骨髓瘤系。S194/5.XXO.Bu.1系由Trowbridge(J Exp.Med.148(1)313-323，1978)報(bào)道。
產(chǎn)生抗體生產(chǎn)脾或淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜合子的方法通常包括將體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞分別按10∶1的比例(盡管該比例從大約20∶1到大約1∶1變化)，在存在促進(jìn)細(xì)胞膜融合的一種制劑或數(shù)種制劑(化學(xué)、病毒或電)的條件下混合。融合方法已有描述(Khler和Milstein，1975，同前；Khler和Milstein，1976，同前；Gefter等，Somatic CellGenet.3231-236，1977；Volk等，1982，同前)。那些研究者所用的融合促進(jìn)制劑為仙臺(tái)病毒和聚乙二醇(PEG)。
由于融合操作以極低的頻率產(chǎn)生有活力的雜合子(例如，當(dāng)脾細(xì)胞用作為體細(xì)胞來(lái)源時(shí)，大概每1×105個(gè)脾細(xì)胞才能獲得一個(gè)雜合子)，優(yōu)選具有一種方法將融合細(xì)胞雜合子從其余的未融合細(xì)胞、特別是未融合的骨髓瘤細(xì)胞中挑選出來(lái)。在其它所產(chǎn)生的融合的細(xì)胞雜合子中檢測(cè)到所需的抗體生產(chǎn)雜交瘤的方法同樣是必要的。一般地，融合的細(xì)胞雜合子的挑選是通過(guò)在支持雜交瘤生長(zhǎng)但是防止未融合的骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)，其通常會(huì)繼續(xù)無(wú)限分裂。融合中所用的體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不能維持長(zhǎng)期的生存力，所以不構(gòu)成問(wèn)題。在本發(fā)明的實(shí)施例中，利用了骨髓瘤細(xì)胞缺乏的次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT-陰性)。這些細(xì)胞的挑選在黃嘌呤/氨基喋呤/胸腺嘧啶核苷(HAT)培養(yǎng)基中進(jìn)行，在該培養(yǎng)基中融合的細(xì)胞雜合子由于脾細(xì)胞的HPRT-陽(yáng)性基因型而存活。
利用具有不同遺傳缺陷(藥物敏感性等)、能夠在支持基因型感受態(tài)雜合子生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中被挑選出來(lái)的骨髓瘤細(xì)胞也是可能的。
需要數(shù)周選擇性地培養(yǎng)融合細(xì)胞雜合子。在該階段的早期，有必要鑒定那些產(chǎn)生所需抗體的雜合子，從而它們可以被隨后克隆并增殖。一般而言，10％左右的獲得的雜合子產(chǎn)生所需抗體，雖然從大約1到大約30％的范圍是不常見(jiàn)的。抗體生產(chǎn)雜合子的檢測(cè)可通過(guò)許多標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法中的任何一種來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括酶聯(lián)免疫試驗(yàn)以及放射免疫試驗(yàn)技術(shù)，例如如Kennet等((編輯)Monoclonal Antibodies andHybridomasA New Dimension in Biological Analyses，pp.376-384，Plenum Press，New York，1980)中所描述的。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用液相D-二聚體進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來(lái)挑選抗體-產(chǎn)生克隆。
所需融合細(xì)胞雜合子一經(jīng)挑選并克隆進(jìn)個(gè)體抗體生產(chǎn)細(xì)胞系中，每種細(xì)胞系就可以?xún)煞N標(biāo)準(zhǔn)方法中的任何一種加以增殖。雜交瘤細(xì)胞懸液可被注射到組織相容性動(dòng)物體中。被注射動(dòng)物隨之產(chǎn)生分泌由該融合的細(xì)胞雜合子所產(chǎn)生的特定單克隆抗體的腫瘤。該動(dòng)物的體液，例如血清或腹水，可被穿刺放液以提供高濃度的單克隆抗體。或者，個(gè)別細(xì)胞系可在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)容器中進(jìn)行體外增殖。含有高濃度單個(gè)特定單克隆抗體的培養(yǎng)基可通過(guò)移注、過(guò)濾或離心收集，然后純化。
細(xì)胞系通過(guò)任何合適的免疫檢測(cè)方法測(cè)試其檢測(cè)目的抗原的特異性。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞系可被等分到許多孔中并溫育，而來(lái)自每個(gè)孔的上清液通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、間接熒光抗體技術(shù)等進(jìn)行分析。鑒定產(chǎn)生能夠識(shí)別靶抗原但是不識(shí)別非靶表位的單克隆抗體的細(xì)胞系，然后直接在體外培養(yǎng)或注射到組織相容性動(dòng)物體中以形成腫瘤，并產(chǎn)生、收集和純化所需的抗體。
因此，本發(fā)明在第一步中提供了特異性地與D-二聚體或其他交聯(lián)血纖維蛋白衍生物相互作用的單克隆抗體。
如上文所指出的，非動(dòng)物細(xì)胞例如植物、酵母和/或微生物細(xì)胞也可被用于產(chǎn)生典型的單鏈抗體。在這個(gè)實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞被設(shè)計(jì)表達(dá)編碼抗體的一個(gè)鏈的核酸分子。
然后單克隆抗體經(jīng)受脫敏方法。這樣的過(guò)程可采取多種形式，包括與根據(jù)本發(fā)明制備的單克隆抗體具有相同或相似特異性的嵌合抗體的制備。嵌合抗體是其輕鏈和重鏈基因是典型地通過(guò)遺傳工程從屬于不同物種的免疫球蛋白可變和恒定區(qū)基因構(gòu)建的抗體。因此，根據(jù)本發(fā)明，一旦獲得產(chǎn)生所需單克隆抗體的雜交瘤，利用技術(shù)產(chǎn)生種間單克隆抗體，其中一個(gè)物種的結(jié)合區(qū)與另一個(gè)物種的抗體非結(jié)合區(qū)組合(Liu等，Proc./Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443，1987)。舉例來(lái)說(shuō)，來(lái)自非人(例如鼠)單克隆抗體的CDRs可被移植到人類(lèi)抗體上，從而“人源化”該鼠抗體(歐洲專(zhuān)利
發(fā)明者F·J·卡爾, A·A·漢密爾頓, F J 卡爾, 漢密爾頓 申請(qǐng)人:艾根生物醫(yī)學(xué)有限公司