專利名稱：牛表皮生長(zhǎng)因子的核酸序列和蛋白質(zhì)序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛表皮生長(zhǎng)因子的核酸和蛋白質(zhì)序列。
背景技術(shù)：
近年來，高度競(jìng)爭(zhēng)的市場(chǎng)和對(duì)環(huán)境的關(guān)注鼓勵(lì)研究者發(fā)展改善家畜和乳制品生產(chǎn)效率的技術(shù)。然而，對(duì)于動(dòng)物福利問題以及食品生產(chǎn)更大的公眾關(guān)注提示，效率改善應(yīng)該在不損害動(dòng)物健康和福利的情況下完成。最近在許多動(dòng)物系統(tǒng)中的發(fā)現(xiàn)提示，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)可以在家畜和乳制品生產(chǎn)中用作飼料添加劑，刺激腸細(xì)胞早熟以分泌合適譜系的消化酶；增加營(yíng)養(yǎng)吸收；以及預(yù)防或治療腸感染。
EGF是由53個(gè)氨基酸組成的6kDa多肽，衍生自一種約1,200個(gè)氨基酸的前體蛋白質(zhì)(Carpenter和Cohen，1979)。它天然存在于唾液、腸分泌物和其它體液中，并在初乳和乳中大量產(chǎn)生(Donovan和Odle，1994)。EGF刺激人胎兒胃的生長(zhǎng)和成熟。由于大多數(shù)物種的初乳中EGF含量高，并且在腸內(nèi)存在EGF受體，因此有人已經(jīng)提出EGF(和其它生長(zhǎng)因子)也對(duì)早期出生后胃腸發(fā)育有貢獻(xiàn)(Donovan和Odle，1994)。
EGF可能涉及調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)攝入。在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)，EGF增加電解質(zhì)、葡萄糖和脯氨酸穿過空腸刷狀緣膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。在小豬體內(nèi)，EGF通過增加蔗糖酶和麥芽糖酶的活性，同時(shí)不顯著影響乳糖酶和堿性磷酸酶的活性，促進(jìn)腸細(xì)胞功能的成熟(歸于Wilson等的國(guó)際申請(qǐng)第WO 88/04180號(hào))。因此，應(yīng)用EGF作為飼料添加劑以促進(jìn)生長(zhǎng)是有利的。
腸型大腸桿菌病或家畜腹瀉病是由病原體大腸桿菌(Escherichiacoli)引起的細(xì)菌感染。家畜腹瀉病在新生的和年幼的家畜中普遍存在，對(duì)于農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)有相當(dāng)影響。在有限區(qū)域內(nèi)年幼動(dòng)物過于擁擠通常伴隨著家畜腹瀉病爆發(fā)，其特征在于腹瀉、脫水和最后死亡。接受乳替代物的乳牛犢對(duì)于家畜腹瀉病比用母牛乳飼養(yǎng)的乳牛犢更敏感，由于感染引起的患病率高達(dá)75％。
由于目前缺乏針對(duì)家畜腹瀉病的疫苗，因此需要有效治療例如EGF。補(bǔ)充EGF改善感染輪狀病毒的小豬的腸功能(Zijlstra等，1994)。此外，口服給予EGF降低兔的腸感染率，并防止感染引起的體重增重?fù)p失(Buret等，1997)。歸于Buret等的美國(guó)專利第5,753,622號(hào)公開通過口服給予EGF或在動(dòng)物飼料中間接給予EGF，治療家畜腹瀉病和其它病原性感染，以及增加體重增重的方法。在大多數(shù)這些以前的研究中，使用來自與受體不同物種的EGF；然而，原則上優(yōu)選同一物種的EGF，以避免不希望的副效應(yīng)。為在乳牛生產(chǎn)和肉牛生產(chǎn)中應(yīng)用，優(yōu)選使用牛EGF(bEGF)。
一種飼料添加劑或補(bǔ)充劑必須具有經(jīng)濟(jì)性，才能得到生產(chǎn)者的廣泛應(yīng)用。由于分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的發(fā)展，有效生產(chǎn)大量用于研究、治療和工業(yè)應(yīng)用的外源蛋白。可以將編碼所需蛋白的基因從不符合生產(chǎn)實(shí)際的生物轉(zhuǎn)移到微生物、植物或動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其中最通常使用微生物表達(dá)外源蛋白，因?yàn)樗鼈円子谏L(zhǎng)和容易進(jìn)行遺傳操作。已經(jīng)在酵母中表達(dá)人EGF，產(chǎn)率為40ng/mg蛋白(歸于Barr等的美國(guó)專利第5,096,825號(hào))，已經(jīng)通過酵母巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)生產(chǎn)小鼠EGF，產(chǎn)率為450μg/ml培養(yǎng)基(Clare等，1991)。
以前已經(jīng)從小鼠、大鼠、豬、馬和人中克隆出編碼成熟EGF蛋白的互補(bǔ)DNA序列(Gray等，1983；Simpson等，1985；Kim等，2001；Stewart等，1994；Bell等，1986)。推導(dǎo)的氨基酸序列相互之間顯示55％到85％的同一性，關(guān)鍵結(jié)構(gòu)殘基驚人地保守，尤其是三個(gè)甘氨酸(殘基18、36和39)、六個(gè)半胱氨酸殘基(殘基6、14、20、31、33和42)以及酪氨酸37。推測(cè)其它殘基上的變化造成用抗血清和核酸探針觀察到的物種間非常低的交叉反應(yīng)性。已經(jīng)從人、豬和小鼠中克隆出編碼所述前體蛋白的cDNA序列。
雖然以前已經(jīng)如所述從不同來源克隆出編碼成熟EGF蛋白的cDNA序列，但以前還沒有從牛的來源獲得編碼成熟EGF蛋白的DNA序列。然而，bEGF可能在以下幾個(gè)方面有益于乳牛生產(chǎn)和肉牛生產(chǎn)促進(jìn)生長(zhǎng)；預(yù)防或治療腸感染；增加營(yíng)養(yǎng)吸收；以及加速未成熟腸細(xì)胞的發(fā)育。對(duì)于所述潛在的商業(yè)應(yīng)用，希望應(yīng)用來自牛來源的EGF，以避免可能損害動(dòng)物健康和福利的不希望的副效應(yīng)。因此，需要獲得編碼成熟bEGF蛋白的DNA序列并在重組系統(tǒng)中成功產(chǎn)生bEGF。
一般地說，人序列和牛序列之間的同源性允許應(yīng)用人探針或引物獲得對(duì)應(yīng)的bEGF DNA序列。然而，發(fā)現(xiàn)編碼bEGF DNA和蛋白序列的序列與其它物種的所述序列有很大不同，這造成試圖克隆bEGF DNA序列時(shí)的最初困難，并解釋了為什么該序列仍然沒有得到成功克隆，盡管這樣的發(fā)明有誘人的商業(yè)應(yīng)用。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供編碼牛表皮生長(zhǎng)因子(bEGF)的DNA序列以及所編碼的蛋白的序列。SEQ ID NO8和9分別描述所述bEGF基因的部分DNA序列以及所編碼的bEGF蛋白的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO10和11分別提供編碼所述成熟bEGF蛋白的DNA序列以及所述成熟bEGF蛋白的推導(dǎo)氨基酸序列。
因此，本發(fā)明廣泛地提供編碼bEGF多肽的分離的核酸，其中所編碼的多肽包含選自以下的氨基酸序列a)在SEQ ID NO9中描述的氨基酸序列；b)在SEQ ID NO11中描述的氨基酸序列；和c)與SEQ ID NO9中所述氨基酸序列或SEQ ID NO11所述氨基酸序列有至少55％、更優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少65％、更優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選至少99％同源性的在功能上等價(jià)的氨基酸序列。本發(fā)明還包括牛表皮生長(zhǎng)因子分離的多肽的片段，其中所述片段包含與SEQ ID NO11所述氨基酸序列在功能上等價(jià)的多肽。
在本發(fā)明的再一方面，提供編碼bEGF多肽的分離的核酸，其中所述核酸包含選自以下的核苷酸序列a)在SEQ ID NO8中描述的核苷酸序列；b)在SEQ ID NO10中描述的核苷酸序列；和c)與SEQ ID NO9中所述氨基酸序列或SEQ ID NO10所述核苷酸序列有至少75％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選至少99％同源性的在功能上等價(jià)的核苷酸序列。本發(fā)明還包括編碼牛表皮生長(zhǎng)因子多肽的分離的核酸的片段，其中所述片段包含與SEQ ID NO10所述核苷酸序列在功能上等價(jià)的核苷酸序列。
在又一方面，本發(fā)明提供包含編碼bEGF多肽的核酸分子的載體和細(xì)胞，以及生產(chǎn)所編碼的多肽的方法。
本發(fā)明還包括表達(dá)構(gòu)建物，所述表達(dá)構(gòu)建物構(gòu)成與能夠在合適宿主中指導(dǎo)bEGF表達(dá)的控制序列有效連接的編碼bEGF的核酸。
本發(fā)明還包括已經(jīng)用編碼所述bEGF多肽的DNA轉(zhuǎn)化以及表達(dá)所述DNA的宿主細(xì)胞，還包括生產(chǎn)所述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。
本發(fā)明還包括針對(duì)所述bEGF多肽或其片段產(chǎn)生的單克隆抗體和多克隆抗體。
在家畜生產(chǎn)和乳品生產(chǎn)中，可以使用所述bEGF多肽或其功能等價(jià)片段作為家畜飼料中的補(bǔ)充劑，以促進(jìn)生長(zhǎng)；預(yù)防或治療腸感染，尤其是腸病原性大腸桿菌感染，如腸型大腸桿菌病、賈第鞭毛蟲病和家畜腹瀉?。辉黾訝I(yíng)養(yǎng)吸收；以及刺激腸細(xì)胞早熟以分泌合適譜系的消化酶。
在另一個(gè)更廣的方面，本發(fā)明提供通過給予bEGF多肽改善動(dòng)物生長(zhǎng)的方法以及預(yù)防和治療動(dòng)物腸感染的方法。因此，本發(fā)明提供包含選自以下的制備物的飼料添加劑a)由核酸編碼的bEGF多肽；b)由核酸編碼的bEGF多肽，其中所述bEGF多肽與惰性或活性成分組合；c)微生物或植物組織，其中所述微生物或所述植物組織表達(dá)由核酸編碼的bEGF多肽；和d)從所述微生物或所述植物組織獲得的培養(yǎng)基或提取物，其中所述培養(yǎng)基或所述提取物包含核酸編碼的bEGF多肽。
在又一個(gè)更廣的方面，本發(fā)明提供飼料組合物，所述飼料組合物包含與編碼bEGF的核酸所編碼的bEGF多肽組合或用所述bEGF多肽處理的飼料。
在本文和權(quán)利要求中，下面陳述的術(shù)語和詞組有下面定義。
“抗體”包括單克隆抗體和多克隆抗體。
“?！敝概喛?Bovinae)的物種，其中包括Bison bison(美洲野牛，水牛)、Bison bonasus(歐洲野牛)、Bos frontalis(大額牛)、Bos indicus(瘤牛)、Bos taurus(普通牛)、Boselaphus tragocamelus(藍(lán)牛羚)、Bubalusbubalis(水牛)、Syncerus caffer(非洲水牛，南非水牛)、Taurotragusderbianus(德氏大羚羊)、Taurotragus oryx(大羚羊)、Tragelaphus angasii(旋角羚)、Tragelaphus eurycerus、Tragelaphus imberbis(小彎角羚)、Tragelaphus scriptus(羚羊)、Tragelaphus spekii(澤羚)、Tragelaphusstrepsiceros(大彎角羚)。
“環(huán)化”指線性化DNA末端連接形成共價(jià)閉合環(huán)狀分子或“環(huán)狀DNA”。
“編碼序列”指編碼蛋白氨基酸序列或功能RNA(如tRNA或rRNA)的基因部分。
“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)序列”指與另一個(gè)核苷酸序列按照沃森-克里克堿基配對(duì)規(guī)則形成氫鍵鍵合雙螺旋的核苷酸序列。例如，5′-AAGGCT-3′的互補(bǔ)堿基序列是3′-TTCCGA-5′。
“常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)”指以指數(shù)方式擴(kuò)增靶DNA片段的技術(shù)，由此將引物設(shè)計(jì)成為與DNA的相對(duì)鏈雜交，在兩個(gè)引物之間進(jìn)行延伸。
“簡(jiǎn)并的”或“簡(jiǎn)并性”指遺傳密碼的特性，由此一個(gè)以上的密碼子可以確定一個(gè)特定的氨基酸。
“下游”指DNA或RNA中任何位點(diǎn)的3′側(cè)。
“腸型大腸桿菌病”指由腸產(chǎn)毒性(產(chǎn)生毒素的)大腸桿菌菌株引起的感染。所述大腸桿菌菌株附著在小腸表面并大量擴(kuò)增，分泌導(dǎo)致嚴(yán)重消化改變的腸毒素，引起臨床上的腹瀉、脫水和高死亡率。
“腸病原性”指傾向于在腸道內(nèi)產(chǎn)生疾病。
“外顯子”指編碼蛋白特定結(jié)構(gòu)域的真核基因區(qū)段。
“表達(dá)”指基因轉(zhuǎn)錄成為結(jié)構(gòu)RNA(rRNA，tRNA)，或轉(zhuǎn)錄成為信使RNA(mRNA)并隨后翻譯成為蛋白。
與bEGF“功能等價(jià)”的氨基酸序列是這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代進(jìn)行修飾，或通過添加和/或缺失氨基酸進(jìn)行修飾，或者其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸受到化學(xué)修飾，但仍然保留bEGF的活性?！肮δ艿葍r(jià)”的核苷酸序列是那些編碼在實(shí)質(zhì)上具有bEGF相同生物活性的多肽的核苷酸序列。
“賈第鞭毛蟲病”指鞭毛原生動(dòng)物(賈第鞭毛蟲屬(Giardia))感染或由鞭毛原生動(dòng)物引起的疾病，其特征通常是腹瀉。
兩個(gè)核酸序列在下面情況下相互是“異源的”所述序列來自不同生物(不論所述生物是否同一物種)，只要所述序列并不同時(shí)天然出現(xiàn)在同一生物的同一排列中。
兩個(gè)多核苷酸或多肽在下列情況下是“同源的”或“相同的”當(dāng)所述核苷酸序列或所述兩個(gè)序列中的氨基酸殘基分別如本文所述按照最大對(duì)應(yīng)性排列時(shí)相同。一般如下進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸或多肽之間的序列比較在一個(gè)比較窗口上比較所述兩個(gè)序列的各部分，鑒定和比較具有序列相似性的局部區(qū)域。所述比較窗口通常從約20個(gè)到約200個(gè)連續(xù)的核苷酸或連續(xù)的氨基酸殘基。如下確定多核苷酸和多肽的“序列同一性百分率”或“序列同源性百分率”在一個(gè)比較窗口上比較兩個(gè)最佳排列的序列，其中所述比較窗口內(nèi)的多核苷酸或多肽序列部分與用于最佳排列所述兩個(gè)序列的參考序列(不包含添加或缺失)相比可能包括添加或缺失(即缺口)。如下計(jì)算百分率(a)確定兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目，得到匹配位置數(shù)量；(b)用所述匹配位置的數(shù)目除以所述比較窗口中位置的總數(shù)；然后(c)該結(jié)果乘以100，產(chǎn)生序列同一性的百分率。
可以通過已知算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)形式或通過檢查來最佳排列序列以進(jìn)行比較。從Ausubel等(1990)可以找到提供商業(yè)軟件和免費(fèi)軟件的列表。容易得到的序列比較算法和多序列排列對(duì)比算法分別是Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等，1997)和ClustalW程序。其它合適的程序包括Wisconsin Genetics軟件包(Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。為更加肯定，在本文和權(quán)利要求中，氨基酸序列的“序列同一性百分率”或“序列同源性百分率”根據(jù)使用如本文所述BLASTP程序的默認(rèn)值確定的最佳序列排列對(duì)比來確定。
如在下文將更詳細(xì)討論的，也可以通過DNA雜交分析測(cè)定核苷酸序列之間的同源性，其中雙鏈DNA雜種的穩(wěn)定性依賴于出現(xiàn)的堿基配對(duì)的程度。高溫和/或低鹽含量的條件降低所述雜種的穩(wěn)定性，可以對(duì)所述條件加以變化，以預(yù)防具有低于選定同源性程度的序列退火。
“宿主細(xì)胞”包括動(dòng)物宿主細(xì)胞、植物宿主細(xì)胞、酵母宿主細(xì)胞、真菌宿主細(xì)胞、原生動(dòng)物宿主細(xì)胞和原核宿主細(xì)胞。
“腸感染”指包括但不限于腸病原性大腸桿菌感染，例如腸型大腸桿菌病、賈第鞭毛蟲病和家畜腹瀉病。
“內(nèi)含子”指基因中的間插序列。它被轉(zhuǎn)錄，但在mRNA翻譯前被切除。
“反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”指用于擴(kuò)增在已知序列的核心區(qū)側(cè)翼未知DNA序列的技術(shù)，由此用合適的限制酶消化DNA，然后環(huán)化，并設(shè)計(jì)引物以便延伸向外進(jìn)行并使產(chǎn)物包含所述已知序列上游和下游的序列。
“分離的”指“通過人的勞動(dòng)”從自然狀態(tài)改變。假如“分離的”組合物或物質(zhì)天然存在，它已經(jīng)受到改變或從其天然環(huán)境中取出，或者兩種情況都發(fā)生。例如，在生活動(dòng)物體內(nèi)天然存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但從其天然狀態(tài)的共存材料中分離的同樣多核苷酸或多肽是“分離的”，與本文使用的所述術(shù)語一樣。
“家畜”包括，例如，乳牛和肉牛、豬、山羊和綿羊。該術(shù)語包括年幼和成年的動(dòng)物。
“多核苷酸”或“核酸”指脫氧核糖核苷酸的線性序列(在DNA中)或核糖核苷酸的線性序列(在RNA中)，其中一個(gè)核苷酸的戊糖的3′碳通過磷酸基團(tuán)連接鄰近核苷酸的戊糖的5′碳?！岸嚯摹被颉昂怂帷笨赡馨―NA(其中包括cDNA、基因組DNA組和合成DNA)或RNA，DNA或RNA可以是雙鏈或單鏈的，如果是單鏈的，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。
“多核苷酸構(gòu)建物”指從天然基因分離的核酸分子，或者已經(jīng)受到修飾而包含以非天然方式組合和并列的核酸區(qū)段的核酸分子。
兩個(gè)DNA序列在下面情況下“有效連接”所述連接的性質(zhì)并不干擾所述序列實(shí)現(xiàn)它們相互之間的正常功能。例如，假如一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)能夠?qū)崿F(xiàn)一個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則所述啟動(dòng)子與所述編碼序列有效連接。
“多肽”指通過肽鍵連接的氨基酸線性聚合物。
“啟動(dòng)子”指順式作用的DNA序列，一般長(zhǎng)80-120個(gè)堿基對(duì)，位于基因起始位點(diǎn)的上游，RNA聚合酶可以結(jié)合所述序列并起始正確轉(zhuǎn)錄。
“重組”核酸分子，例如重組DNA分子，指在體外通過連接兩個(gè)或多個(gè)非同源DNA分子而形成的新型核酸序列(例如在其克隆位點(diǎn)或其多接頭內(nèi)包含一個(gè)或多個(gè)外源DNA的插入片段的重組質(zhì)粒)。
“家畜腹瀉病”指動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間的腹瀉。
“沉默改變”指包含例如不改動(dòng)多核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的改變。
“轉(zhuǎn)化”指通過外部應(yīng)用來自不同基因型的另一細(xì)胞的純化的重組DNA，導(dǎo)致其被攝入并整合進(jìn)接受者細(xì)胞的基因組，從而定向修飾所述細(xì)胞的基因組。在細(xì)菌中，重組DNA并不整合進(jìn)細(xì)菌染色體，而是作為質(zhì)粒自主復(fù)制。
“轉(zhuǎn)基因”指已經(jīng)在種系中引入外源DNA的生物。
“轉(zhuǎn)基因植物”包括繼續(xù)攜帶所述外源DNA的所有后代、雜種和其雜交物，不論是有性繁殖或無性繁殖獲得，并且包括轉(zhuǎn)基因植物、植物組織和植物細(xì)胞。
“上游”指DNA或RNA中任何位點(diǎn)的5′側(cè)。
基因的“變體”或“變異”指編碼同樣蛋白的核苷酸序列或編碼具有bEGF活性的等價(jià)蛋白的核苷酸序列。
蛋白的“變體”或“變異”指bEGF蛋白或其片段的變體(包括衍生物或類似物)。所述變體可以與所述bEGF蛋白在氨基酸序列上由于任何組合的一個(gè)或多個(gè)取代、添加、缺失、融合和截短而有所不同。
“載體”指能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制并接受外源DNA的核酸分子。載體攜帶其自身的復(fù)制原點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)可以用于插入外源DNA的限制性內(nèi)切核酸酶獨(dú)特識(shí)別位點(diǎn)、一般還有選擇標(biāo)記例如編碼抗生素抗性的基因、以及常常有用于表達(dá)插入DNA的識(shí)別序列(如啟動(dòng)子)。常用載體包括但不限于噬菌體、粘粒、桿狀病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒載體和質(zhì)粒載體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B是牛EGF的DNA編碼序列部分(SEQ ID NO8)與來自小鼠、豬和人的對(duì)應(yīng)EGF序列的序列排列對(duì)比。所述EGF序列的來源是1)小鼠(Gray等，1983；GenBank登記號(hào)J00380)核苷酸3108-3539，SEQ ID NO24；和2)豬(Kim等，2001；GenBank登記號(hào)AF336151)核苷酸3172-3606，SEQ ID NO25；和3)人(Bell等，1986；GenBank登記號(hào)X04571)核苷酸3170-3607，SEQ ID NO26。
圖2顯示編碼成熟bEGF蛋白的DNA編碼序列(SEQ ID NO10)與對(duì)應(yīng)小鼠序列(核苷酸3282-3440，SEQ ID NO27)、豬序列(核苷酸3346-3504，SEQ ID NO28)和人序列(核苷酸3347-3505，SEQ ID NO29)的排列對(duì)比。
圖3顯示推導(dǎo)的bEGF蛋白序列(SEQ ID NO9)與對(duì)應(yīng)小鼠EGF蛋白序列(殘基919-1063，SEQ ID NO30)、豬EGF蛋白序列(殘基912-1056，SEQ ID NO31)和人EGF蛋白序列(殘基912-1057，SEQ IDNO32)的排列對(duì)比。
圖4是推導(dǎo)的成熟bEGF蛋白(SEQ ID NO11)與對(duì)應(yīng)小鼠成熟EGF蛋白(殘基977-1029，SEQ ID NO33)、豬成熟EGF蛋白(殘基970-1022，SEQ ID NO34)和人成熟EGF蛋白(殘基970-1022，SEQ IDNO35)的排列對(duì)比。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述EGF是有53個(gè)氨基酸的小多肽，從更大的前體蛋白產(chǎn)生。所述前體蛋白由一個(gè)跨越110kb的DNA編碼，所述DNA中24個(gè)短外顯子被各種大小的多個(gè)內(nèi)含子分開。切除所述內(nèi)含子后，產(chǎn)生含約4,700堿基對(duì)的mRNA，所述mRNA編碼含約1,200個(gè)氨基酸的前體蛋白。通過切除所述前體蛋白的氨基酸殘基977到1029，產(chǎn)生成熟人EGF蛋白，所述切除的部分由外顯子20的3′最后95個(gè)核苷酸以及外顯子21的5′頭64個(gè)核苷酸編碼，對(duì)應(yīng)于所述mRNA的核酸3347-3505(Bell等，1986)。
I.bEGF的核酸序列和多肽序列首先從牛血中分離基因組DNA(實(shí)施例1)。為克隆編碼bEGF的序列，在一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中，在牛總基因組DNA存在下使用SEQ ID NO1和2的引物(實(shí)施例2)。SEQ ID NO1的引物包括人EGF cDNA序列的核苷酸3215-3237，因此位于成熟EGF蛋白編碼序列的上游。設(shè)計(jì)該引物，使得通過混合核苷酸堿基以適應(yīng)潛在的簡(jiǎn)并性。SEQ ID NO2的引物也有簡(jiǎn)并性，包括人EGF cDNA序列的核苷酸3377-3400，因此在成熟區(qū)內(nèi)。使用這兩個(gè)引物，獲得一個(gè)1456堿基對(duì)的片段(SEQ ID NO3)，然后克隆并測(cè)序該片段。根據(jù)使用2.0版BLAST算法(Altschul等，1997)對(duì)DNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的類似性搜索顯示，該片段與小鼠和人EGF DNA序列有顯著同源性，包含外顯子19的56個(gè)堿基對(duì)、一個(gè)1320堿基對(duì)的內(nèi)含子以及外顯子20的80個(gè)堿基對(duì)，其中包括編碼成熟EGF蛋白NH2末端的前十個(gè)氨基酸的30個(gè)堿基對(duì)。
發(fā)明人克隆編碼成熟EGF蛋白剩余部分的DNA序列的最初策略是使用一種從上述序列設(shè)計(jì)得到的牛特異性5′引物以及一種從其它物種在所述成熟區(qū)下游的序列設(shè)計(jì)得到的3′引物；然而，該策略并不成功，因?yàn)樵S多受測(cè)的引物組合可能不與bEGF序列退火和擴(kuò)增bEGF序列。因此，懷疑當(dāng)使用從其它物種的序列設(shè)計(jì)得到的引物時(shí)，不允許成功擴(kuò)增在所述成熟區(qū)下游的bEGF序列。然后使用擴(kuò)增未知側(cè)翼序列的反向PCR。在常規(guī)PCR中，設(shè)計(jì)引物與DNA相對(duì)的兩條鏈雜交，延伸在兩個(gè)引物之間進(jìn)行。在反向PCR中，使DNA環(huán)化，設(shè)計(jì)引物使得延伸向外進(jìn)行，產(chǎn)物包含已知序列上游和下游的序列(Ochman等，1988；Benkel和Fong，1996)。
為擴(kuò)增如上獲得的bEGF序列上游和下游的DNA序列，在分別進(jìn)行的反應(yīng)中用特異性限制酶消化牛基因組DNA，然后稀釋到低濃度，進(jìn)行連接(實(shí)施例3)。在低濃度下，有利于分子內(nèi)連接，產(chǎn)生DNA環(huán)。選擇限制酶BamH I、EcoR I、Hind III和Sac I，因?yàn)樗鼈兌甲R(shí)別六堿基對(duì)序列；因此，消化時(shí)產(chǎn)生的平均序列大小是4kb，所述片段可以容易地用長(zhǎng)范圍聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。此外，根據(jù)以前獲得的序列，在外顯子19和20之間的內(nèi)含子5′末端附近有一個(gè)BamH I位點(diǎn)；因此，假如用BamH I消化基因組DNA，環(huán)化，然后用從所述BamH I位點(diǎn)下游序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，那么得到的片段包含從所述BamH I位點(diǎn)到內(nèi)含子內(nèi)下一個(gè)BamH I位點(diǎn)下游的序列(圖4)。在以前獲得的序列中沒有其它三種限制酶的識(shí)別位點(diǎn)；因此，擴(kuò)增產(chǎn)物包含所述已知序列上游往上到第一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的序列以及所述已知序列下游往下到下一個(gè)限制位點(diǎn)的序列。
使用SEQ ID NO4和5的引物(分別是SEQ ID NO3的核苷酸1184-1204以及1070-1090)擴(kuò)增用上述酶消化的DNA。然后以所述第一個(gè)反應(yīng)的等分物作為模板，應(yīng)用SEQ ID NO6和7的引物(SEQ IDNO3的核苷酸1413-1434和375-394)。設(shè)計(jì)這些引物擴(kuò)增用SEQ IDNO4和5的引物擴(kuò)增的序列內(nèi)部的片段，該嵌套反應(yīng)證實(shí)第一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增的序列包含EGF序列。擴(kuò)增用Sac I消化的DNA，在瓊脂糖凝膠上產(chǎn)生約7,500bp的單一帶，而該材料的嵌套擴(kuò)增產(chǎn)生預(yù)期的更小的非常濃的帶。然后克隆并測(cè)序該產(chǎn)物(SEQ ID NO8；實(shí)施例3)。使用2.0版BLAST算法(Altschul等，1997)根據(jù)相似性搜索DNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，指出該DNA片段與其它物種的EGF序列有顯著同源性。該片段包括內(nèi)含子的483個(gè)核苷酸、外顯子19、以前鑒定的含1,320個(gè)堿基對(duì)的內(nèi)含子、外顯子20、一個(gè)含4.8千堿基的內(nèi)含子和外顯子21的158個(gè)核苷酸。因此，該片段包含與以前鑒定的那些序列同源的序列，以及其它的序列，包括那些編碼牛成熟EGF蛋白剩余部分的序列。
人是唯一可以獲得EGF基因從外顯子19到21的基因組序列(包括內(nèi)含子)的物種，所述基因組序列包括在從人染色體4獲得的127kb克隆中(Stone等，1998；GenBank登記號(hào)AC004050)。外顯子19在牛和人中有124個(gè)堿基對(duì)；外顯子20在牛中有145個(gè)堿基對(duì)，在人中有149個(gè)堿基對(duì)。由于本發(fā)明的?？寺〔话ㄍ怙@子21的完整序列，其大小不能與人外顯子21進(jìn)行比較。內(nèi)含子大小有更多差異，因?yàn)橥怙@子19和20之間的內(nèi)含子在人中有1362個(gè)堿基對(duì)，在牛中有5171個(gè)堿基對(duì)。外顯子20和21之間的內(nèi)含子在人中有4799個(gè)堿基對(duì)，在牛中有5171個(gè)堿基對(duì)。在牛內(nèi)含子中看起來有SINE序列插入；然而，內(nèi)含子序列的剩余部分顯示與人內(nèi)含子有顯著同源性。
圖1顯示牛EGF序列與人、豬和鼠的EGF序列的排列對(duì)比。使用2.0版BLAST算法成對(duì)比較這些序列，牛核酸序列與人、豬和鼠核酸序列之間的總同源性分別是70％、73％和64％。這些序列不同區(qū)之間的同源性水平有所不同；例如，當(dāng)僅比較成熟蛋白的核酸序列(圖2)時(shí)，牛序列(SEQ ID NO9)與人、豬和鼠序列之間的同源性分別是64％、66％和59％。然而，當(dāng)僅比較成熟蛋白編碼序列上游的核酸序列時(shí)，牛序列與人、豬和鼠序列之間的同源性分別是82％、85％和72％。
如上獲得的bEGF基因外顯子序列編碼SEQ ID NO10的推導(dǎo)蛋白。圖3顯示所述推導(dǎo)的bEGF蛋白序列與人、豬和鼠EGF序列的排列對(duì)比。當(dāng)使用2版BLAST算法成對(duì)比較時(shí)，牛推導(dǎo)蛋白序列與人、豬和鼠推導(dǎo)蛋白序列之間的總同源性是49％、51％和46％?？紤]有相似特征的氨基酸(來自同一組)時(shí)，與人、豬和鼠的同源性分別是66％、69％和62％。與核酸序列的情況相同，序列不同區(qū)之間的同源性水平有所不同；例如，當(dāng)僅比較成熟蛋白時(shí)(SEQ ID NO11是牛序列；圖4)，牛蛋白序列與人、豬和鼠蛋白序列之間的同源性分別是39％、36％和36％(當(dāng)考慮相似氨基酸時(shí)是65％、62％和60％)。然而，當(dāng)僅比較成熟蛋白上游的序列時(shí)，牛序列與人、豬和鼠序列之間的同源性分別是66％、73％和61％(當(dāng)考慮相似氨基酸時(shí)是78％、84％和73％)。
推導(dǎo)的成熟bEGF蛋白的計(jì)算分子量為6112.10Da，包含在其它物種中對(duì)于蛋白結(jié)構(gòu)看起來重要的特定氨基酸，即位置17、36和39的甘氨酸(其它物種中位置18、36和39)以及酪氨酸37。在人EGF中，酪氨酸13、22和29相互接近(Cooke等，1987)。在推導(dǎo)的bEGF蛋白中，存在酪氨酸13和22，也是芳香族氨基酸的苯丙氨酸29，5半胱氨酸對(duì)應(yīng)于其它已知EGF中的6。蛋白中的二硫鍵不是蛋白鏈獨(dú)特折疊的主要原因，而是增加已經(jīng)穩(wěn)定的構(gòu)象的穩(wěn)定性的裝置(Watson等，1985)。推導(dǎo)的bEGF蛋白也是鼠EGF的同源物，折疊識(shí)別指出一致分?jǐn)?shù)為44.8證明了這一點(diǎn)。高于12的分?jǐn)?shù)在超過80％的時(shí)間里得到正確預(yù)測(cè)(Fisher，2000)。
對(duì)序列SEQ ID NO8的分析揭示在外顯子19(成熟區(qū)的上游)有一個(gè)符合讀框的TGA密碼子。TGA是遺傳密碼中三個(gè)鏈終止密碼子之一，還可以編碼硒代半胱氨酸，即第二十一個(gè)氨基酸(Nasim等，2000；Tate等，1999)。在來自其它物種的EGF基因中，對(duì)應(yīng)的密碼子是編碼半胱氨酸的TGC；因此，硒代半胱氨酸的存在將構(gòu)成保守性取代。在本發(fā)明中，進(jìn)行?；蚪MDNA的DNA印跡分析，確定牛基因組中EGF基因的拷貝數(shù)(實(shí)施例4)。假如看起來僅存在一個(gè)拷貝，那么可以合理地假設(shè)獲得的序列來自有功能的EGF基因，并且前體蛋白是硒代蛋白。用限制酶BamH I、EcoR I、Hind III、Sac I和XbaI在分別進(jìn)行的反應(yīng)中消化?；蚪MDNA。在瓊脂糖凝膠的不同道分離三十五μg每種消化物。將所述DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜，與用32P-dCTP標(biāo)記的SEQ ID NO3的片段雜交，洗滌，然后對(duì)X射線底片曝光三天。所述引物與每種消化物的單一帶雜交，強(qiáng)烈提示在牛基因組中僅有EGF的一個(gè)拷貝。
因此，本發(fā)明的一方面是分離、純化或富集的包含SEQ ID NO9的序列核酸以及與其互補(bǔ)的序列。所述分離、純化或富集的核酸可以包含DNA，其中包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。所述DNA可以是雙鏈的或單鏈的，如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。或者，所述分離、純化或富集的核酸可以包括RNA。
可以使用幾種方法分離包含SEQ ID NO9的序列的基因組DNA，所述方法例如用所述SEQ ID NO4和5的引物以及SEQ IDNO6或7的引物，對(duì)用Sac I消化的?；蚪MDNA進(jìn)行反向PCR。也可以根據(jù)牛序列設(shè)計(jì)其它引物組合，通過對(duì)用Sac I或其它限制酶消化的基因組DNA進(jìn)行反向PCR，分離SEQ ID NO9的DNA。也可以通過常規(guī)PCR，例如使用SEQ ID NO6和14的引物分別作為正向引物和反向引物，獲得SEQ ID NO9的基因組序列。
其次，可以通過常規(guī)PCR，在分別進(jìn)行的反應(yīng)中擴(kuò)增來自外顯子20和21的序列，從而分離包含SEQ ID NO9的序列的基因組DNA；例如使用SEQ ID NO6和12的引物分別作為正向引物和反向引物，擴(kuò)增外顯子20。使用SEQ ID NO13和14分別作為正向引物和反向引物，擴(kuò)增外顯子21，然后連接得到的兩個(gè)片段。
第三，可以用從SEQ ID NO8序列的片段制備的探針與基因組文庫(kù)在允許所述探針特異性雜交相關(guān)序列的條件下接觸，分離包含SEQ ID NO9的序列的基因組DNA。通過用放射性同位素、熒光染料或能夠催化可檢測(cè)產(chǎn)物形成的酶標(biāo)記所述探針，可以檢測(cè)所述探針與相關(guān)序列的核酸的雜交。用于篩選基因組文庫(kù)的程序已經(jīng)由Ausubel等(1990)和Sambrook等(1989)描述。
可以通過逆轉(zhuǎn)錄PCR分離編碼bEGF的互補(bǔ)DNA。在本發(fā)明中，分離編碼成熟bEGF蛋白的cDNA片段以及上游和下游的序列，證實(shí)獲得的基因組序列被轉(zhuǎn)錄(實(shí)施例5)。用SEQ ID NO14的引物逆轉(zhuǎn)錄牛腎mRNA。在逆反錄后，cDNA應(yīng)用于使用SEQ ID NO16和14的引物分別作為正向和反向引物的PCR反應(yīng)中。在瓊脂糖凝膠上觀察到幾種產(chǎn)物。從凝膠上切出一條稍大于400堿基對(duì)的帶，純化，并使用所述DNA作為兩個(gè)分別進(jìn)行的PCR反應(yīng)的模板，即一個(gè)反應(yīng)分別使用SEQ ID NO16和12的引物作為正向和反向引物；另一個(gè)反應(yīng)分別使用SEQ ID NO15和14的引物作為正向和反向引物?？寺『蜏y(cè)序獲得的片段。發(fā)現(xiàn)組合的序列(SEQ ID NO17)與對(duì)應(yīng)的基因組序列98％同源。差別(411個(gè)核苷酸中有6個(gè)核苷酸的差別)可能是由于使用來自不同動(dòng)物的組織分離基因組DNA和RNA。當(dāng)與從基因組序列推導(dǎo)的蛋白進(jìn)行比較時(shí)，從cDNA序列推導(dǎo)獲得的成熟蛋白序列上有兩個(gè)氨基酸改變是明顯的，即在位置18用谷氨酰胺取代精氨酸，在位置32用谷氨酰胺取代組氨酸。
或者，通過篩選從表達(dá)EGF基因的牛組織構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，分離編碼bEGF的互補(bǔ)DNA序列。然后使所述cDNA文庫(kù)與包含EGF編碼序列或EGF編碼序列片段的探針在允許所述探針特異性雜交互補(bǔ)序列的條件下接觸。然后檢測(cè)和分離與所述探針雜交的互補(bǔ)DNA。然后通過蛋白質(zhì)印跡分析或PCR分析鑒定表達(dá)EGF的牛組織。
可以通過常規(guī)DNA合成儀合成產(chǎn)生編碼成熟bEGF蛋白的序列(SEQ ID NO9)，由此SEQ ID NO9的片段或部分可以用作產(chǎn)生對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)序列的中間體。因此SEQ ID NO9的分離、純化或富集的核酸可以用于制備SEQ ID NO11的肽。
眾所周知并非全長(zhǎng)的蛋白常常具有完整蛋白的功能。缺乏N末端部分、內(nèi)部部分或C末端部分的截短蛋白可能保留全長(zhǎng)蛋白的全部或部分生物學(xué)活性和/或酶促活性；例如，在COOH端缺乏最后五個(gè)氨基酸的人EGF保留其抑制胃酸分泌的能力，而缺乏多達(dá)三個(gè)N末端殘基的大鼠EGF具有天然蛋白的相同活性(Hollenberg和Gregory1980；Simpson等，1985)。因此，編碼保留完整bEGF蛋白活性的內(nèi)部缺失或截短的bEGF蛋白的SEQ ID NO9的片段在本發(fā)明的范圍內(nèi)。制備截短蛋白以及帶有內(nèi)部缺失的蛋白的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的?？梢允褂美鏒NA合成/細(xì)胞增殖測(cè)定來檢驗(yàn)截短或內(nèi)部缺失的bEGF的活性。
本發(fā)明的另一方面是編碼bEGF蛋白或片段的分離、純化或富集的核酸，所述bEGF片段包含成熟bEGF蛋白的至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸。這些核酸的編碼序列可以與bEGF蛋白的編碼序列相同，或者是不同的編碼序列，所述不同的編碼序列由于本領(lǐng)域內(nèi)已知的遺傳密碼戎余性或簡(jiǎn)并性(Lewin，1997)的結(jié)果，編碼bEGF蛋白或者包含bEGF蛋白的至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。
所述編碼成熟bEGF蛋白的分離、純化或富集的核酸可以包括但不限于僅是成熟bEGF蛋白的編碼序列；成熟bEGF蛋白的編碼序列以及其它編碼序列，例如前導(dǎo)序列或前體蛋白序列；或者成熟bEGF蛋白的編碼序列和非編碼序列，例如內(nèi)含子或編碼序列5′和/或3′的非編碼序列。
或者，可以使用定點(diǎn)誘變或其它已知技術(shù)(Ausubel等，1990)誘變bEGF的核酸序列，在成熟bEGF蛋白中引入沉默改變，即不改變所述多核苷酸所編碼的氨基酸序列的改變。為引入宿主生物優(yōu)選的密碼子，由此增加包含編碼所述多肽的載體的宿主細(xì)胞生產(chǎn)所述多肽的水平，這樣的改變是合乎需要的。
可以在蛋白序列中制造某些氨基酸取代而不影響蛋白功能。因此，本發(fā)明也涉及帶有核苷酸改變的多核苷酸，所述核苷酸改變導(dǎo)致成熟bEGF蛋白中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短?？梢允褂枚c(diǎn)誘變、隨機(jī)化學(xué)誘變、外切核酸酶III缺失和其它重組DNA技術(shù)(Ausubel等，1990)引入所述核苷酸改變。得到的變體可能表現(xiàn)bEGF的生物學(xué)性質(zhì)；例如，在位置13用苯丙氨酸取代酪氨酸對(duì)于人EGF結(jié)合其受體幾乎沒有影響(Tadaki和Niyogi，1993)?；蛘?，所述核苷酸改變可以是天然等位基因變體，所述天然等位基因變體通過鑒定與探針特異性雜交的牛來源核酸而分離，所述探針包含SEQ IDNO9的至少20個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少60個(gè)、更優(yōu)選至少70個(gè)、更優(yōu)選至少80個(gè)、更優(yōu)選至少90個(gè)、更優(yōu)選至少100個(gè)、更優(yōu)選至少110個(gè)、更優(yōu)選至少120個(gè)、更優(yōu)選至少130個(gè)、更優(yōu)選至少140個(gè)、更優(yōu)選至少150個(gè)、最優(yōu)選至少159個(gè)連續(xù)堿基或與其互補(bǔ)的序列。
可以在低嚴(yán)謹(jǐn)條件、中等嚴(yán)謹(jǐn)條件或高嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交。簡(jiǎn)要地說，首先將包含固定化變性核酸的聚合物膜在含0.9M NaCl，50mM NaH2PO4，pH 7.0，5.0mM Na2EDTA，0.5％SDS，10X Denhardt’s和0.5mg/ml聚核糖腺苷酸的溶液中45℃下預(yù)雜交30分鐘。然后在溶液中加入約2×107cpm(比活4-9×108cpm/μg)用32p末端標(biāo)記的寡核苷酸探針。溫育12-16小時(shí)后，所述膜在含0.5％SDS的1X SET(150mM NaCl，20mM Tris-鹽酸，pH 7.8，1mM Na2EDTA)中室溫下洗滌30分鐘，然后在寡核苷酸探針的Tm-10℃下在新鮮1X SET中洗滌30分鐘。然后所述膜對(duì)放射自顯影底片曝光，檢測(cè)雜交信號(hào)。
通過改變雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，可以鑒定和分離對(duì)于所述探針有不同水平同源性的核酸。通過在低于所述探針熔解溫度(Tm)下的不同溫度進(jìn)行雜交，可以改變嚴(yán)謹(jǐn)性，探針的熔解溫度可以使用下式計(jì)算對(duì)于長(zhǎng)度大于100個(gè)核苷酸的探針，使用下式計(jì)算TmTm＝81.5-16.6(log[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是所述探針的長(zhǎng)度。假如在含有甲酰胺的溶液中進(jìn)行雜交，可以使用等式Tm＝81.5-16.6(log[Na+])+0.41(G+C數(shù))-0.63(％甲酰胺)-(600/N)計(jì)算Tm，其中N是所述探針的長(zhǎng)度。
可以在6X SSC，5X Denhardt’s試劑，0.5％SDS，100μg/ml變性的片段化鮭魚精子DNA；或者6X SSC，5X Denhardt’s試劑，0.5％SDS，100μg/ml變性的片段化鮭魚精子DNA，50％甲酰胺中進(jìn)行預(yù)雜交。SSC和Denhardt’s溶液的配方可以在Sambrook等(1989)中找到。
通過在上述預(yù)雜交溶液中加入可檢測(cè)探針，進(jìn)行雜交。當(dāng)所述探針包含雙鏈DNA時(shí)，在加入所述預(yù)雜交溶液中前使其變性。所述膜與所述雜交溶液接觸足夠時(shí)間，允許所述探針與包含互補(bǔ)或同源序列的cDNA或基因組DNA雜交。對(duì)于長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的探針，可以在Tm以下15-25℃進(jìn)行雜交。對(duì)于更短的探針例如寡核苷酸探針，可以在Tm以下5-10℃進(jìn)行雜交。對(duì)于在6X SSC中進(jìn)行的雜交，優(yōu)選在約68℃下進(jìn)行雜交。對(duì)于在含50％甲酰胺的溶液中進(jìn)行的雜交，優(yōu)選在約42℃下進(jìn)行雜交。所有前面的雜交條件都被認(rèn)為是高嚴(yán)謹(jǐn)性。
雜交后，所述膜首先在2X SSC，0.1％SDS中室溫下洗滌15分鐘；然后用0.1X SSC，0.5％SDS在室溫下洗滌30分鐘到1小時(shí)；然后在0.1X SSC，0.5％SDS中雜交溫度下洗滌；最后用0.1X SSC在室溫下洗滌。對(duì)于寡核苷酸探針，推薦使用更短的洗滌時(shí)間。通過放射自顯影或其它常規(guī)技術(shù)鑒定已經(jīng)與所述探針雜交的核酸。
為獲得與所述可檢測(cè)探針同源性降低的核酸，可以使用更低嚴(yán)謹(jǐn)性的條件；例如，在含約1M Na+濃度的雜交緩沖液中，雜交溫度以5℃的增量從68℃降到42℃。雜交后，用2X SSC，0.5％SDS在雜交溫度下洗滌所述膜。所述條件在50℃以上被認(rèn)為是“中等”嚴(yán)謹(jǐn)性，在50℃以下被認(rèn)為是“低”嚴(yán)謹(jǐn)性。
或者，可以在42℃下，在含甲酰胺的緩沖液例如6X SSC中進(jìn)行雜交。在這種情況下，雜交溶液中的甲酰胺含量可以按5％的增量從50％降到0％，以鑒定與所述探針有更低水平同源性的克隆。雜交后，用6X SSC，0.5％SDS在50℃洗滌所述膜。所述條件在25％甲酰胺以上被認(rèn)為是“中等”嚴(yán)謹(jǐn)性，在25％甲酰胺以下被認(rèn)為是“低”嚴(yán)謹(jǐn)性。
因此，可以使用所述方法分離核酸，所述核酸包含與bEGF序列或者與包含其至少20個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少60個(gè)、更優(yōu)選至少70個(gè)、更優(yōu)選至少80個(gè)、更優(yōu)選至少90個(gè)、更優(yōu)選至少100個(gè)、更優(yōu)選至少110個(gè)、更優(yōu)選至少120個(gè)、更優(yōu)選至少130個(gè)、更優(yōu)選至少140個(gè)、更優(yōu)選至少150個(gè)、最優(yōu)選至少159個(gè)連續(xù)堿基的片段以及與其互補(bǔ)的序列有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％同源性的序列?？梢允褂?版BLASTN按默認(rèn)參數(shù)測(cè)量同源性(Altschul等，1990)。此外，可以使用上述程序分離核酸，根據(jù)笫2版BLASTX測(cè)定，所述核酸編碼與bEGF蛋白或包含其至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸的bEGF蛋白片段有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同源性的多肽。
SEQ ID NO9的分離、純化或富集的核酸、與其互補(bǔ)的序列、或包含SEQ ID NO9的至少20個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少60個(gè)、更優(yōu)選至少70個(gè)、更優(yōu)選至少80個(gè)、更優(yōu)選至少90個(gè)、更優(yōu)選至少100個(gè)、更優(yōu)選至少110個(gè)、更優(yōu)選至少120個(gè)、更優(yōu)選至少130個(gè)、更優(yōu)選至少140個(gè)、更優(yōu)選至少150個(gè)、最優(yōu)選至少159個(gè)連續(xù)堿基的片段或者與其互補(bǔ)的序列可以用作探針，鑒定和分離編碼SEQ ID NO11的多肽或其變體的cDNA。在所述程序中，從表達(dá)bEGF基因的牛組織提取的RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)，然后與包含編碼序列的探針在允許所述探針與互補(bǔ)序列雜交的條件下接觸，隨后檢測(cè)和分離所述互補(bǔ)序列。改變用于鑒定EGF cDNA的雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，就能夠鑒定和分離出與所述探針具有不同同源性水平的核酸。也可以在使用以牛RNA作為模板合成的cDNA的PCR反應(yīng)中，用從所述編碼序列或其片段設(shè)計(jì)的引物分離變體cDNA。
本發(fā)明的另一方面是分離的或純化的bEGF蛋白或包含其至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。可以如本文所述通過在重組宿主中表達(dá)bEGF DNA序列，獲得bEGF蛋白或其片段。
或者，可以通過常規(guī)肽合成儀合成生產(chǎn)bEGF蛋白或包含其至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。所述片段可以作為通過肽合成生產(chǎn)對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)bEGF蛋白的中間體。
或者，也可以使用從DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄的mRNA獲得bEGF蛋白或其片段，所述DNA構(gòu)建物包含與編碼bEGF蛋白或其片段的核酸連接的啟動(dòng)子?？梢栽谶M(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前線性化所述DNA構(gòu)建物。然后轉(zhuǎn)錄的mRNA與合適的無細(xì)胞翻譯提取物如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物溫育，產(chǎn)生bEGF蛋白或其片段。
此外，可以通過生物化學(xué)富集或純化程序獲得bEGF多肽或其片段?？梢酝ㄟ^蛋白水解消化和/或微測(cè)序確定潛在同源多肽或片段的序列?？梢允褂贸绦蚶?版BLASTP，比較預(yù)期同源多肽或片段的序列與推導(dǎo)的bEGF蛋白或包含其至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。
本發(fā)明還涉及bEGF蛋白的變體(包括衍生物或類似物)或包含其至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的變體。所述變體在氨基酸序列上可能由于任何組合的一個(gè)或多個(gè)取代、添加、缺失、融合和截短而與bEGF蛋白不同。
所述變體可以是天然的或者用定點(diǎn)誘變、隨機(jī)化學(xué)誘變、外切酶III缺失程序和標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)在體外產(chǎn)生?；蛘?，可以使用化學(xué)合成或修飾程序產(chǎn)生所述變體、片段、類似物或衍生物。
所述bEGF蛋白的變體可以是其中bEGF蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基受到保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)取代的變體，并且所述受到取代的氨基酸殘基可以是或者不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。保守取代涉及用具有相似特征的另一氨基酸取代多肽的中的給定氨基酸，典型的取代如下●用另一脂肪族氨基酸取代脂肪氨基酸例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；●用蘇氨酸取代絲氨酸，或者相反；●用另一酸性殘基取代酸性殘基如天冬氨酸或谷氨酸；用另一帶有酰胺基團(tuán)的殘基取代帶有酰胺基團(tuán)的殘基如天冬酰胺或谷氨酰胺；●用另一堿性殘基取代堿性殘基如賴氨酸或精氨酸；和●用另一芳香族殘基取代芳香族殘基如苯丙氨酸或酪氨酸。
其它變體是那些牛EGF蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基基團(tuán)的變體。
還有其它變體是那些其中在多肽中融合添加的氨基酸，例如前導(dǎo)序列、分泌序列或者便利蛋白純化、富集或穩(wěn)定的序列。
在一些實(shí)施方案中，所述片段、衍生物或類似物包括前體序列，以便可以通過切割所述前體部分產(chǎn)生有活性的肽，激活所述片段、衍生物或類似物。
本發(fā)明的另一方面是多肽或其片段，所述多肽或其片段與bEGF蛋白或包含其至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸的片段有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同源性。
可以使用程序例如2版BLASTP以默認(rèn)參數(shù)確定同源性，所述程序排列對(duì)比進(jìn)行比較的多肽或片段，并確定它們之間同源性的程度。應(yīng)當(dāng)知道氨基酸“同源性”包括以前所述的保守氨基酸取代?？梢酝ㄟ^使用本文討論的技術(shù)分離編碼它們的核酸，獲得與bEGF蛋白或其片段有同源性的多肽或片段。
也可以使用bEGF蛋白或包含其至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸的片段產(chǎn)生特異性結(jié)合所述蛋白或片段的抗體。為檢測(cè)組織或體液樣品中的EGF，使所述樣品接觸所述抗體，然后或者通過用可檢測(cè)熒光標(biāo)記、酶促標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記來標(biāo)記所述抗體，或者用具有所述標(biāo)記的第二抗體標(biāo)記所述抗體，測(cè)定所述樣品的結(jié)合能力。用于檢測(cè)樣品中bEGF的已知測(cè)定包括ELISA、夾心法測(cè)定、放射免疫測(cè)定以及蛋白質(zhì)印跡。
如下獲得針對(duì)bEGF蛋白或包含其至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的多克隆抗體直接將所述蛋白或片段注射或給予動(dòng)物。然后使獲得的抗體結(jié)合蛋白本身；因此，甚至可以用僅編碼所述蛋白片段的序列產(chǎn)生結(jié)合全長(zhǎng)天然蛋白的抗體。然后可以使用所述抗體從表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞中分離所述蛋白。
為制備單克隆抗體，可以使用提供通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的任何方法，例如雜交瘤技術(shù)、trioma技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以及EBV雜交瘤技術(shù)。
因此，一般性針對(duì)bEGF蛋白或包含其至少7個(gè)、更優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)、更優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少30個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)、更優(yōu)選至少40個(gè)、更優(yōu)選至少45個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)、更優(yōu)選至少51個(gè)、最優(yōu)選至少52個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的抗體可以用于檢測(cè)牛組織和體液中的EGF蛋白，以及從其它生物(優(yōu)選反芻動(dòng)物)篩選相似蛋白。從?；蚱渌雌c動(dòng)物組織或體液提取蛋白后，使蛋白與所述抗體接觸，然后通過以前描述的任何程序檢測(cè)那些特異性結(jié)合的蛋白。
本發(fā)明的bEGF基因可以用于異源雜交以及允許從其它哺乳動(dòng)物分離EGF編碼基因的PCR實(shí)驗(yàn)。
II.過量表達(dá)bEGF蛋白可以將已經(jīng)特征化的bEGF編碼序列引入多種表達(dá)系統(tǒng)以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。重組DNA技術(shù)已經(jīng)便利有效生產(chǎn)肽激素例如EGF?？梢允褂霉I(yè)化微生物菌株(例如黑曲霉(Aspergillus niger)、無花果曲霉(Aspergillus ficuum)、盛泡曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Mucor miehei、乳酸克魯維酵母(Kluyverromyces lactic)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)或者植物宿主(如雙低油菜(canola)、大豆、玉米、番茄)生產(chǎn)bEGF。所有系統(tǒng)使用相似方法，由此裝配表達(dá)構(gòu)建物以包括目的蛋白編碼序列以及控制序列如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止子，以及需要包括的信號(hào)序列和選擇標(biāo)記。
為獲得bEGF的細(xì)胞外表達(dá)，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物利用分泌信號(hào)序列，如果希望進(jìn)行胞質(zhì)表達(dá)，則不需要該序列。啟動(dòng)子和信號(hào)序列在宿主細(xì)胞內(nèi)有功能，并且提供所述編碼序列產(chǎn)物的表達(dá)和分泌。包括轉(zhuǎn)錄終止子以保證有效轉(zhuǎn)錄。在所述表達(dá)構(gòu)建物中也可以包括增加表達(dá)或蛋白純化的輔助序列。
可以在大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母中表達(dá)牛EGF(實(shí)施例6)。如下制備僅包含成熟蛋白編碼序列的DNA片段分別用SEQ ID NO6和12的引物；SEQ ID NO13和14的引物擴(kuò)增在5kb內(nèi)含子兩側(cè)編碼成熟蛋白的序列，然后用接頭引物(SEQ ID NO15)連接所述兩種產(chǎn)物。將最終產(chǎn)物克隆進(jìn)大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體。
合適載體應(yīng)該能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制并接受外源DNA。一個(gè)載體攜帶其本身的復(fù)制原點(diǎn)、可用于插入外源DNA的一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶單一識(shí)別位點(diǎn)，以及常常還有用于表達(dá)插入DNA的識(shí)別序列(如啟動(dòng)子)。也可以包括選擇標(biāo)記，以允許選擇攜帶所需構(gòu)建物的細(xì)菌細(xì)胞；例如，合適的原核選擇標(biāo)記包括那些賦予抗生素(如氨芐青霉素)抗性的選擇標(biāo)記?？梢赃x擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適載體，常用載體包括但不限于噬菌體、粘粒、桿狀病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒載體和質(zhì)粒載體。提供下面質(zhì)粒載體作為例子pEQ40，或者pET系列的質(zhì)粒如pET26。然而，可以使用任何質(zhì)粒載體，只要所述質(zhì)粒載體在宿主中可復(fù)制并且有活力。
一旦已經(jīng)組裝合適載體，可以利用多種技術(shù)將外源DNA引入宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^電穿孔將所述載體或表達(dá)構(gòu)建物引入大腸桿菌，以及通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或電穿孔引入巴斯德畢赤酵母。對(duì)于電穿孔，細(xì)胞用無菌水洗滌，然后重懸浮于低電導(dǎo)率溶液(如1M山梨糖醇溶液)。對(duì)所述細(xì)胞懸浮液應(yīng)用高電壓電擊，在細(xì)胞膜上產(chǎn)生瞬時(shí)的孔，轉(zhuǎn)化DNA通過該孔進(jìn)入細(xì)胞。在巴斯德畢赤酵母中，所述表達(dá)構(gòu)建物通過同源重組整合進(jìn)aox 1(乙醇氧化酶)位點(diǎn)，穩(wěn)定地維持。通過應(yīng)用所述表達(dá)構(gòu)建物或載體攜帶的選擇標(biāo)記鑒定攜帶所述載體或表達(dá)構(gòu)建物的宿主細(xì)胞，然后通過雜交、PCR、抗體或其它技術(shù)證實(shí)目的基因的存在?？梢栽谝后w或半固體培養(yǎng)基上，通過例如分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵等技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞。在針對(duì)最大投入產(chǎn)出比(product-to-cost ratio)優(yōu)化的條件下，繁殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過操作培養(yǎng)參數(shù)例如溫度、pH、通氣和培養(yǎng)基組成，可以增加產(chǎn)物產(chǎn)量。小心操作和監(jiān)測(cè)重組高表達(dá)大腸桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)條件，可能導(dǎo)致培養(yǎng)物生物量和蛋白產(chǎn)量分別為150g(濕重)細(xì)胞/l以及5g不溶蛋白/l?？梢允褂玫蜐舛鹊鞍酌敢种苿?如苯甲基磺酰氟或抑胃肽)減少過量表達(dá)的蛋白的蛋白水解，或者可以使用蛋白酶缺陷型宿主細(xì)胞減少或消除蛋白降解。對(duì)于微生物表達(dá)，可能也希望生產(chǎn)融合蛋白，以便利純化或保護(hù)bEGF免受蛋白水解降解。
發(fā)酵后，通過下游工藝?yán)珉x心和過濾從培養(yǎng)基中取出微生物細(xì)胞。假如所需產(chǎn)物是分泌型的，則可以從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中提取所需產(chǎn)物。在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的情況下，收獲細(xì)胞，通過使用機(jī)械力、超聲處理、酶、化學(xué)試劑和/或高壓破碎細(xì)胞，釋放所述產(chǎn)物。在高表達(dá)大腸桿菌系統(tǒng)中出現(xiàn)的不溶產(chǎn)物的生產(chǎn)可能便利產(chǎn)物純化。通過離心從破碎的細(xì)胞中提取產(chǎn)物包涵體，用含低濃度變性劑(如0.5-6M尿素、0.1-1％SDS或0.5-4.0M胍-HCl)的緩沖液洗滌，除去污染蛋白。洗出的包涵體溶解于含6-8M尿素、1-2％SDS或4-6M胍-HCl的溶液中，然后通過在透析過程中緩慢除去變性劑，復(fù)性溶解的產(chǎn)物。
也可以在植物細(xì)胞如番茄或甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)中表達(dá)牛EGF。將所述表達(dá)構(gòu)建物插入能夠在根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)中復(fù)制的二元載體，并帶動(dòng)轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞。將所得的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進(jìn)根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞，然后將所述表達(dá)構(gòu)建物通過所述二元載體∷表達(dá)構(gòu)建物的接合帶動(dòng)轉(zhuǎn)移(conjugal mobilization)轉(zhuǎn)移進(jìn)甘藍(lán)型油菜葉細(xì)胞。所述表達(dá)構(gòu)建物隨機(jī)整合進(jìn)所述植物細(xì)胞基因組。
選擇和篩選后，可以使用已知方法將轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生成為整株植株，并培育和培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物的品種系。通過研磨、勻漿和/或化學(xué)處理可以從收獲的部分或整株植株中提取牛EGF。種子特異性親脂性油體蛋白(oleosin)融合物通過將油體蛋白融合蛋白分配到雙低油菜(canola)種子榨出的油部分而與水溶性蛋白分離，從而便利純化(van Rooijen和Moloney，1994)。
如果需要，可以使用沉淀(如硫酸銨沉淀)、色譜(如凝膠過濾、離子交換、親和液體層析)、超濾、電泳、溶劑-溶劑萃取(如丙酮沉淀)或這些方法的組合從微生物、發(fā)酵和植物提取物中純化所述產(chǎn)物。
III.bEGF蛋白的活性可以使用例如DNA合成/細(xì)胞增殖測(cè)定測(cè)試所獲得的重組bEGF蛋白的活性，因?yàn)镋GF是各種類型細(xì)胞的有絲分裂原(實(shí)施例7)。簡(jiǎn)要地說，在24孔板中培養(yǎng)牛成纖維細(xì)胞到半?yún)R合，然后在各個(gè)孔中加入重組bEGF(各種不同濃度)和人EGF(陽(yáng)性對(duì)照)。加入bEGF后十八小時(shí)，在需要摻入所述新合成DNA的每個(gè)孔內(nèi)加入氚化胸苷。八個(gè)小時(shí)后，收獲細(xì)胞，通過酸沉淀分離未摻入和已經(jīng)摻入的胸苷。通過閃爍計(jì)數(shù)確定每個(gè)部分中放射性的量。與對(duì)照細(xì)胞相比摻入的氚化胸苷增加，說明重組bEGF刺激成纖維細(xì)胞中的DNA合成。使用該測(cè)定，還有可能比較人EGF和bEGF刺激牛細(xì)胞中DNA合成和增殖的效力。在相似測(cè)定中，加入bEGF后十八小時(shí)收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)并確定bEGF對(duì)于細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
IV.bEGF的配制和應(yīng)用可以在需要bEGF活性的應(yīng)用中直接使用bEGF蛋白或其功能等價(jià)片段、所有或部分轉(zhuǎn)化微生物培養(yǎng)物和植物、以及從所述培養(yǎng)物或植物獲得的提取物。所述應(yīng)用包括促進(jìn)生長(zhǎng)、預(yù)防或治療腸感染、增加應(yīng)用吸收、以及加速來成熟腸細(xì)胞的發(fā)育。
大部分家畜與人類不同，不能通過胎盤吸收免疫球蛋白，而是借助“滲漏的”不成熟的腸細(xì)胞結(jié)構(gòu)攝取母體乳汁中的抗體。雖然這種攝取在出生后相當(dāng)快速地獲得，但用成熟腸細(xì)胞取代不成熟腸細(xì)胞的時(shí)間可能很長(zhǎng)；例如，該時(shí)間在小豬中為四周，在小牛中可能長(zhǎng)達(dá)三個(gè)月。這個(gè)階段可能在畜牧業(yè)中產(chǎn)生各種問題，尤其是預(yù)防成熟型膳食的應(yīng)用，使得新生動(dòng)物依賴于哺乳獲得基本營(yíng)養(yǎng)。
歸于Wilson等的國(guó)際公開第WO 88/04180號(hào)提供通過給予家畜EGF來促進(jìn)消化酶早熟成熟和生長(zhǎng)的方法。為增強(qiáng)乳?；蛉馀５纳L(zhǎng)，所給予的EGF理論上可能來自任何哺乳動(dòng)物來源。一般相信EGF活性序列在物種之間非常保守。然而，如本發(fā)明展示的，bEGF活性序列與所有其它已知的哺乳動(dòng)物EGF序列顯著不同。因此，為促進(jìn)乳?；蛉馀５纳L(zhǎng)，假如使用替代來源的EGF，那么優(yōu)選使用可能更有效影響牛消化生理并避免不希望的副效應(yīng)的bEGF。也可以使用牛EGF促進(jìn)其它家畜物種的生長(zhǎng)，所述家畜物種優(yōu)選反芻動(dòng)物例如山羊和綿羊。
EGF可能參與調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)攝入；例如，在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)，EGF增加跨過空腸刷狀緣膜的電解質(zhì)、葡萄糖和脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，本發(fā)明的bEGF也可使用比以前所述改變腸細(xì)胞結(jié)構(gòu)所需時(shí)間更長(zhǎng)的時(shí)期。應(yīng)對(duì)bEGF在營(yíng)養(yǎng)攝入上的潛在增加將會(huì)增加飼料效率并增強(qiáng)生長(zhǎng)。
年幼動(dòng)物的腸細(xì)胞必須保持在未成熟狀態(tài)足夠長(zhǎng)的時(shí)間以允許轉(zhuǎn)移獲得母體免疫。因此，如果所需效應(yīng)是加速所述腸細(xì)胞結(jié)構(gòu)成熟，那么當(dāng)小牛兩日齡、三日齡或四日齡時(shí)可以開始給予bEGF，持續(xù)僅兩到四天；或者如果所需效應(yīng)是利用bEGF介導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)攝取增加，則給予bEGF可以持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間，例如四到六周。可能必須通過實(shí)驗(yàn)確定在小牛體內(nèi)獲得最佳效應(yīng)給予bEGF的最佳時(shí)間?？梢砸詭追N方法給予牛EGF，即通過如歸于Wilson等的國(guó)際
發(fā)明者S·比洛多－格西爾斯, S·J·約翰, L·B·西林格爾, B·F·本克爾, S 比洛多-格西爾斯, 本克爾, 約翰, 西林格爾 申請(qǐng)人:加拿大農(nóng)業(yè)及農(nóng)業(yè)食品部