專(zhuān)利名稱(chēng)：利用蛋白組芯片全面分析蛋白活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在政府支持下完成的，由國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)給予許可編號(hào)CA77808和GM62480。政府可擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2001年5月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/290,583和2001年7月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/308,149的權(quán)益，上述每一份申請(qǐng)都被以全文形式引入本文作為參考。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及蛋白組芯片(proteome chips)，它包括具有在單一物種中表達(dá)的所有蛋白的大部分的陣列。本發(fā)明還涉及制備蛋白組芯片的方法。本發(fā)明還涉及利用蛋白組芯片以高處理量的方式系統(tǒng)地分析一個(gè)物種中所有蛋白相互作用的方法。
本發(fā)明還涉及以高密度陣列方式制備和純化真核蛋白的方法。本發(fā)明還涉及通過(guò)將雙重標(biāo)記的融合蛋白連接在固體支持物上制備蛋白陣列的方法。本發(fā)明還涉及用于確定信號(hào)是否是陽(yáng)性的方法。
2.背景技術(shù)后基因組測(cè)序時(shí)代的一項(xiàng)繁重的任務(wù)是了解由基因組所編碼的每一種蛋白的功能、修飾和調(diào)控(Fields等，1999，Proc Natl Acad Sci.968825；Goffeau等，1996，Science 274563)。目前，人們致力于通過(guò)分析mRNA表達(dá)特征，基因破壞表型，雙雜交相互作用和蛋白亞細(xì)胞定位研究基因，以及蛋白功能(Ross-Macdonald等，1999，Nature 402413；DeRisi等，1997，Science 278680；Winzeler等，1999，Science285901；Uetz等，2000，Nature 403623；Ito等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.971143)。盡管所述研究是有用的，轉(zhuǎn)錄特征不一定與細(xì)胞蛋白水平有太大的相關(guān)性。因此，生物化學(xué)活性的分析可以提供有關(guān)蛋白功能的信息，它能補(bǔ)充基因組分析，以便提供細(xì)胞工作的更全面的圖象(Zhu等，2001，Curr.Opin.Chem.Biol.540；Martzen，等，1999，Science 2861153；Zhu等，2000，Nat.Genet.26283；MacBeath，2000，Science 2891760；Caveman，2000，J.Cell Sci.1133543)。
若干個(gè)研究小組最近業(yè)已披露了用于篩選蛋白活性的微陣列方案(Zhu等，2000，Nat.Genet.26283；MacBeath等，2000，Science 2891763；Arenkov等，2000，Anal.Biochem 278123)。另外，業(yè)已制備了酵母蛋白的超量表達(dá)克隆的集合體，并且篩選了生物化學(xué)活性(Martzen等，1999，Science 2861153)。不過(guò)，尚未能制備、排列和篩選接近整個(gè)蛋白組的數(shù)千種不同蛋白的多種活性(Caveman，2000，J.Cell Sci.1133543)。
對(duì)整個(gè)蛋白組的篩選可能需要以高處理量的方式檢測(cè)所生產(chǎn)的多種蛋白的生物化學(xué)活性，并且同時(shí)分析數(shù)百或數(shù)千個(gè)蛋白樣品的功能(Zhu等，2000，Nat.Genet.26283；MacBeath等，2000，Science 2891763；Arenkov等，2000，Anal.Biochem 278123)。篩選整個(gè)蛋白組陣列的努力業(yè)已遇到了重大障礙，包括不能制備必要的表達(dá)克隆，以及不能以高處理量的方式表達(dá)和純化表達(dá)的蛋白。以前業(yè)已利用隨機(jī)表達(dá)文庫(kù)或合并物策略進(jìn)行了體外分析，這兩種方法都具有缺陷(Martzen等，1999，Science 2861153；Bussow等，2000，Genomics 651)。具體地講，隨機(jī)表達(dá)文庫(kù)的篩選是煩瑣的，并且包括通常不是完整長(zhǎng)度的克隆。另一個(gè)最近的方法是制備特定的陣列，并且利用合并策略篩選該陣列(Martzen等1999，Science 2861153)。不過(guò)，所述合并方法限制了要篩選的蛋白的實(shí)際數(shù)量，并且當(dāng)被鑒定的陽(yáng)性克隆的數(shù)量龐大時(shí)該方法是繁重的。
可用于檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的另一種方法是雙雜交方法(Uetz等，2000，Nature 403623；Ito等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.971143)。不過(guò)，可以用該方法檢測(cè)的相互作用的類(lèi)型是有限的，因?yàn)樗鱿嗷プ饔猛ǔＪ窃诩?xì)胞核中檢測(cè)的。
因此，本領(lǐng)域仍然需要大規(guī)模分析生物化學(xué)功能，這可能需要以高處理量方式制備并篩選由一個(gè)物種的基因組所編碼的一整套蛋白。
在第二部分或在本申請(qǐng)的任何其他部分所引用的或確定的任何參考文獻(xiàn)都不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是承認(rèn)所述文獻(xiàn)是在本發(fā)明以前可以獲得的。
3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了可用于以高處理量方式對(duì)一個(gè)物種的蛋白相互作用進(jìn)行全面分析的蛋白組芯片。本發(fā)明的方法和組合物是通過(guò)申請(qǐng)人對(duì)一種方法的新的和非顯而易見(jiàn)的發(fā)現(xiàn)而成為可能的，所述方法是制備一整套包括一個(gè)基因組的蛋白編碼序列的表達(dá)構(gòu)建體，以高處理量的方式在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)所述蛋白產(chǎn)物，并且利用微陣列以高處理量的方式分析多種蛋白的功能。
本發(fā)明涉及蛋白組芯片，它是包括多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的一個(gè)不同的位置上，其中，多種蛋白代表在單一物種內(nèi)表達(dá)的所有蛋白的大部分，其中，一種開(kāi)放讀框的翻譯產(chǎn)物被認(rèn)為是一種蛋白。
使用陣列，而不是進(jìn)行一個(gè)接一個(gè)地分析的優(yōu)點(diǎn)是，具有可以同時(shí)鑒定和表征多種蛋白-探針相互作用的能力。另外，探針的復(fù)雜混合物可以與蛋白組芯片接觸，以便例如在一種細(xì)胞的更具有代表性的環(huán)境中檢測(cè)相互作用，并且快速評(píng)估多種潛在的結(jié)合化合物。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包括多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的一個(gè)不同的位置上，其中，所述多種蛋白至少占在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種可定位尋址的包括多種蛋白的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的一個(gè)不同的位置上，其中，所述多種蛋白至少占在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％，其中，蛋白同種型和剪接變體被作為一種蛋白統(tǒng)計(jì)。在一種具體實(shí)施方案中，所述多種蛋白至少占在一個(gè)物種中表達(dá)的蛋白的50％，其中，蛋白同種型和剪接變體被作為一種蛋白統(tǒng)計(jì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種可定位尋址的包括多種蛋白的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的一個(gè)不同的位置上，其中，所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000種蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種可定位尋址的包括多種蛋白的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的不同的位置上，其中，所述多種蛋白總體上包括由同一物種中的至少1000種不同的已知基因編碼的蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白是按照蛋白的分類(lèi)在所述陣列上組構(gòu)的。所述分類(lèi)可以根據(jù)豐度、功能、功能類(lèi)型、酶促活性、同源生、蛋白家族、與特定代謝或信號(hào)傳導(dǎo)途徑的結(jié)合、與相關(guān)的代謝或信號(hào)傳導(dǎo)途徑的結(jié)合或翻譯后修飾進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上文所述的可定位尋址的陣列，其中，所述固體支持物包括玻璃、陶瓷、硝酸纖維素、非晶碳化硅、可澆鑄的氧化物，聚酰亞胺，聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、或硅氧烷彈性體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物包括有助于將多種蛋白結(jié)合在所述固體支持物上的材料。例如，所述固體支持物可以用一種能夠與每一種蛋白上的親和標(biāo)記結(jié)合的材料包被。在一種具體實(shí)施方案中，所述固體支持物包括谷胱甘肽。在另一種具體實(shí)施方案中，所述固體支持物包被劑包括鎳或硝酸纖維素。在另一種具體實(shí)施方案中，所述固體支持物包被劑包括谷胱甘肽和鎳。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物是鎳包被的載玻片。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述固體支持物是硝酸纖維素包被的載玻片。用于制備蛋白(和DNA)微陣列的硝酸纖維素包被的載玻片可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得(例如，從Schleicher& Schuell(Keene，NH)獲得，該公司出售用硝酸纖維素基聚合物包被的載玻片(產(chǎn)品目錄號(hào)10 484 182))。在一種具體實(shí)施方案中，用OMNIGRIDTM(GeneMachines，San Carlos，CA)將每一種蛋白點(diǎn)在硝酸纖維素包被的載玻片上。
蛋白組芯片上的蛋白優(yōu)選是融合蛋白，它包括至少一種用于純化和/或連接所述蛋白到蛋白組芯片上的親和標(biāo)記。
本發(fā)明還提供了用于制備蛋白組芯片的方法。因此，本發(fā)明提供了用于構(gòu)建可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白至少占在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白至少占在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％，其中，蛋白的同種型和剪接變體被作為一種蛋白統(tǒng)計(jì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于構(gòu)建可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白至少包括一個(gè)物種中表達(dá)的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000種蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，多種蛋白總體上包括由一個(gè)物種中的至少一千種不同的已知基因所編碼的蛋白。
本發(fā)明還提供了用于以可標(biāo)度(scalable)的形式制備和分離病毒、原核或真核生物蛋白的方法，可用于高處理量分析。優(yōu)選的方法包括以與自動(dòng)化技術(shù)兼容的陣列方案合成和純化蛋白。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備和分離病毒、原核或真核生物蛋白的方法，包括以下步驟生長(zhǎng)用具有與調(diào)控序列可操作地連接的異源序列的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的真核細(xì)胞，讓所述調(diào)控序列與能增強(qiáng)由所述異源序列編碼的蛋白表這的誘導(dǎo)物接觸，裂解所述細(xì)胞，讓所述蛋白與一種結(jié)合制劑接觸，以便形成所述蛋白和結(jié)合制劑的復(fù)合物，從細(xì)胞碎片中分離所述復(fù)合物，并且從所述復(fù)合物中分離所述蛋白，其中，每一個(gè)步驟都是在96孔平板上進(jìn)行的。
所述蛋白優(yōu)選是融合蛋白，以便所述異源序列包括感興趣的蛋白的編碼區(qū)和編碼一種標(biāo)記的序列，如親和標(biāo)記。所述標(biāo)記可用于監(jiān)測(cè)所述蛋白，從細(xì)胞碎片和污染試劑中分離融合蛋白和/或?qū)⑺龅鞍捉Y(jié)合在本發(fā)明的蛋白組芯片上。
本發(fā)明還提供了用于制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種融合蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，其中每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述蛋白包括由一種生物體的基因組核酸編碼的第一標(biāo)記、第二標(biāo)記和蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白是用一種標(biāo)記對(duì)該蛋白的氨基末端進(jìn)行標(biāo)記，而用另一種不同的標(biāo)記對(duì)它的羧基末端進(jìn)行標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，所述蛋白是用兩種標(biāo)記對(duì)該蛋白的氨基末端進(jìn)行標(biāo)記，或者用兩種標(biāo)記對(duì)它的羧基末端進(jìn)行標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，所述蛋白是用一種或多種標(biāo)記對(duì)所述蛋白的除了氨基或羧基末端以外的部位進(jìn)行標(biāo)記的。使用雙標(biāo)記蛋白的優(yōu)點(diǎn)包括獲得高純度蛋白的能力，以及提供從細(xì)胞碎片中獲得純化蛋白的流水線方式，以及將所述蛋白結(jié)合在固體支持物上。
因此，在一種具體實(shí)施方案中，所述第一標(biāo)記是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(″GST標(biāo)記″)，而第二標(biāo)記是聚組氨酸標(biāo)記(″His標(biāo)記″)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述GST標(biāo)記和His標(biāo)記被連接在所述蛋白的氨基末端。另外，所述GST標(biāo)記和His標(biāo)記被連接在所述蛋白的羧基末端。GST標(biāo)記和His標(biāo)記可以出現(xiàn)在所述蛋白的氨基末端或羧基末端。在某些實(shí)施方案中，GST標(biāo)記被連接在所述蛋白的氨基末端，而His標(biāo)記被連接在所述蛋白的羧基末端。在其他實(shí)施方案中，His標(biāo)記被連接在所述蛋白的氨基末端，而GST標(biāo)記被連接在羧基末端。
改變?nèi)诤系鞍椎挠H和標(biāo)記的位置，可能導(dǎo)致功能性二級(jí)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的正確折疊和蛋白的合適的轉(zhuǎn)運(yùn)、定位、和/或分泌。例如，GST標(biāo)記和His標(biāo)記融合在所述蛋白的羧基末端可能在翻譯起始密碼子的上游區(qū)被封閉時(shí)避免不適當(dāng)?shù)恼郫B或表達(dá)。
本發(fā)明還提供了使用蛋白組陣列篩選脂類(lèi)結(jié)合蛋白的方法。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種使用包括多種蛋白的可定位尋址的陣列的方法，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，該方法包括以下步驟讓一種探針與一種陣列接觸，并且檢測(cè)蛋白-探針相互作用，其中，所述探針包括一種脂類(lèi)。在一種具體實(shí)施方案中，所述脂類(lèi)包括磷脂，例如，但不局限于磷脂酰膽堿和磷脂酰肌醇。在另一種具體實(shí)施方案中，所述探針是包括感興趣的磷脂的脂質(zhì)體形式。
還提供了使用蛋白組芯片的方法。本發(fā)明的蛋白組芯片可用于分析一個(gè)物種或細(xì)胞內(nèi)的幾乎所有的蛋白-蛋白相互作用。所述蛋白組芯片還可用于系統(tǒng)分析一個(gè)物種的與一種測(cè)試化合物相互作用的所有蛋白。因此，使用本發(fā)明的蛋白組芯片，可以分析多種活性，以便得到大量信息，例如，但不局限于一種細(xì)胞或生物體對(duì)一種刺激的“指紋”或“標(biāo)記”，表征一個(gè)物種的與感興趣的探針相互作用的所有蛋白，表征兩種或兩種以上物種的與感興趣的探針相互作用的所有蛋白，表征與一種生物學(xué)途徑(例如，代謝或信號(hào)傳導(dǎo)途徑)或與相關(guān)的生物學(xué)途徑相關(guān)的所有蛋白，表征一個(gè)物種的具有感興趣的酶促活性(例如，激酶活性，蛋白酶活性，磷酸酶活性，糖苷酶活性，乙?；富钚院推渌瘜W(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶促活性)的所有蛋白，表征一個(gè)物種的具有感興趣的翻譯后修飾的所有蛋白，以及鑒定藥物目標(biāo)。在一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白組芯片被用于表征一個(gè)物種的所有蛋白，例如，藥物目標(biāo)，它能與感興趣的藥物或藥物候選物相互作用。
因此，本發(fā)明包括用于檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟讓一種探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白包括由一個(gè)物種內(nèi)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已知基因編碼的至少一種蛋白，并且檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種用于檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟讓一種探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白包括在一個(gè)物種內(nèi)表達(dá)的所有蛋白的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，其中，蛋白同種型和剪接變體被作為同一種蛋白統(tǒng)計(jì)，并且檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種用于檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟讓一種探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000種已知蛋白，并且檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種用于檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟讓一種探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白總體上(the plurality of proteins in aggregate)包括一個(gè)物種中的至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、5000、10000、20000、30000、40000或50000種不同的已知基因，并且檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種用于檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟讓一種探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，多種蛋白總體上包括至少兩個(gè)物種的至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、5000、10000、20000、30000、40000或50000種不同的已知基因，并且檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種用于檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟讓一種探針與包括多種融合蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述融合蛋白包括第一標(biāo)記和第二標(biāo)記和一個(gè)由一種生物體的基因組核酸編碼的蛋白序列，并且檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。如上文所述，在某些實(shí)施方案中，所述兩種標(biāo)記可以是His和GST。
本發(fā)明還提供了一種標(biāo)記用于結(jié)合測(cè)定的蛋白的方法，包括以下步驟在合適條件下讓蛋白的單獨(dú)等份樣品(aliquots)與生物素-轉(zhuǎn)運(yùn)化合物接觸一定時(shí)間，以便在不同的等份樣品中產(chǎn)生生物素化程度不同的蛋白，并且，將不同的等份樣品組合在一起，以便產(chǎn)生被不同地生物素化的蛋白的樣品。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟讓通過(guò)上述方法生產(chǎn)的生物素化蛋白的樣品與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，并且檢測(cè)所述陣列上所有蛋白-探針相互作用的位置，其中，在生物素化的蛋白和所述陣列上的蛋白之間發(fā)生了相互作用。
本發(fā)明包括一種用于檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟讓通過(guò)上述方法生產(chǎn)的生物素化蛋白的樣品與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，讓所述陣列與和熒光劑結(jié)合的鏈親和素接觸，并且檢測(cè)所述陣列上出現(xiàn)熒光的位置，其中，所述熒光表示在生物素化的蛋白和所述陣列上的蛋白之間發(fā)生了相互作用。
本發(fā)明還提供了一種用于確定一種信號(hào)是否是陽(yáng)性的方法。相應(yīng)地，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一種用于確定使用蛋白微陣列在一種測(cè)定中獲得的信號(hào)是否是陽(yáng)性的方法，該信號(hào)能表明一種探針與一種相互作用劑的結(jié)合。
3.1定義在本文中，術(shù)語(yǔ)“蛋白”表示完整長(zhǎng)度蛋白、蛋白的一部分或肽。蛋白可以通過(guò)裂解較大的蛋白產(chǎn)生，或通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生。蛋白優(yōu)選是通過(guò)在與一個(gè)物種(例如，但不局限于細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中重組超量表達(dá)而制備的。放置在本發(fā)明蛋白微陣列上的蛋白優(yōu)選是融合蛋白，更優(yōu)選具有至少一種親和標(biāo)記，以有助于純化和/或固定。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“相互作用劑”表示在蛋白微陣列上的能與一種探針相互作用的蛋白。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“探針”表示任何化學(xué)制劑，例如，但不局限于蛋白，核酸(例如DNA，RNA，寡核苷酸，多核苷酸)，小分子，底物，抑制劑，藥物或藥物候選物，受體，抗原，激素，甾醇，脂類(lèi)，磷脂，脂質(zhì)體，抗體，輔因子，細(xì)胞因子，谷胱甘肽，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，碳水化合物，麥芽糖，鎳，二氫胰蛋白酶，鈣調(diào)蛋白，生物素，凝集素和重金屬，這些化學(xué)試劑可用于本發(fā)明的蛋白微陣列上，用于分析與所述微陣列上的蛋白的相互作用。
4.附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A-1B.使用蛋白芯片技術(shù)分析酵母蛋白組的方法。
A.通過(guò)重組方法將酵母ORFs克隆到雙重標(biāo)記的酵母GAL1表達(dá)載體上，并且通過(guò)測(cè)序，證實(shí)正確的身份。然后將每一種純的質(zhì)粒構(gòu)建體重新導(dǎo)入酵母菌株，以便進(jìn)行大規(guī)模的蛋白純化。讓酵母培養(yǎng)物在96孔平板上生長(zhǎng)，并且通過(guò)添加半乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。在高處理量純化步驟之后，對(duì)純化的蛋白進(jìn)行分裝，并且在-80℃下用甘油緩沖液保存，然后印刷。使用高精度微陣列儀，可以在一次實(shí)驗(yàn)中將6566種蛋白樣品重復(fù)點(diǎn)在80個(gè)載玻片上。
B.從3毫升酵母培養(yǎng)物中純化的蛋白的免疫印跡分析。
圖2A-2C.用抗GST抗體檢測(cè)的蛋白組芯片。
使用抗GST抗體通過(guò)印跡分析檢查了60種樣品；示出了19種代表性樣品。80％以上的制劑能產(chǎn)生高產(chǎn)率的融合蛋白。
A.通過(guò)96孔方案純化GST∷酵母融合蛋白。將代表5800種蛋白的6566個(gè)蛋白樣品重復(fù)點(diǎn)在一個(gè)鎳包被的顯微鏡載玻片上。用抗GST抗體檢測(cè)該載玻片。
B.在該蛋白組芯片的右側(cè)示出了48個(gè)區(qū)之一的放大圖象。字母表示重復(fù)的蛋白樣品，而數(shù)字表示源平板編號(hào)。發(fā)現(xiàn)了良好的分辨率和高的信噪比。
C.每一種ORF產(chǎn)品的重復(fù)斑點(diǎn)之間的誤差分布。ε的單位是通過(guò)Axon掃描儀測(cè)定的信號(hào)強(qiáng)度。通過(guò)GST對(duì)照確定，10個(gè)單位相當(dāng)于大約32fg蛋白。ε分布的中央為1.2個(gè)單位，并且所述樣品的95％位于距離該中心10個(gè)單位以內(nèi)。
圖3A-3B.在蛋白組芯上進(jìn)行不同測(cè)定的例子。
A.重復(fù)點(diǎn)滴包括6566種酵母蛋白的蛋白組芯片，并且與所標(biāo)明的生物素化的探針一起培養(yǎng)。通過(guò)方框表示的陽(yáng)性相互作用劑，是通過(guò)6個(gè)蛋白-脂質(zhì)體相互作用測(cè)定(″PI(3)P″，″PI(4，5)p2.′，″PI(4)P″，″PI(3，4)P2″，″PI(3，4，5)P3″，″PC″)，一個(gè)鈣調(diào)蛋白-結(jié)合測(cè)定(“鈣調(diào)蛋白”)，和一個(gè)DNA-蛋白相互作用測(cè)定(“基因組DNA”)確定的。每一個(gè)區(qū)包括16×18個(gè)蛋白斑點(diǎn)。重復(fù)的陽(yáng)性信號(hào)是水平地成對(duì)出現(xiàn)在底部圖片中的。重復(fù)的點(diǎn)滴起著內(nèi)部對(duì)照的作用，當(dāng)所述信號(hào)相對(duì)背景而言較弱時(shí)，這種做法是重要的。上部圖片表示用抗GST抗體(″α-GST″)檢測(cè)的對(duì)照蛋白組芯片的相同的酵母蛋白制劑。如圖中所表明的，強(qiáng)的信號(hào)通常出現(xiàn)在具有較低含量GST融合蛋白(“探針”)的樣品中，這表明所述結(jié)合是敏感的，并且是專(zhuān)一性的。PI，磷脂酰肌醇。PC，磷脂酰膽堿。
B.通過(guò)尋找不同的鈣調(diào)蛋白目標(biāo)所擁有的氨基酸序列，確定推測(cè)的鈣調(diào)蛋白結(jié)合基序(Zhu等2000，Nat.Genet.26283)。39種陽(yáng)性蛋白中的14種擁有一種基序，該基序的共有序列為I/L-Q-X-K-K/X-G-B(SEQ ID NO1)，其中，X是任何殘基，而B(niǎo)是堿性殘基。在排列上方示出的字母的大小，表示所標(biāo)明的氨基酸的相對(duì)頻率。YFL003C/MSH4(SEQ ID NO2)；YJR073C/OPI3(SEQ ID NO3)；YBR050C/REG2(SEQID NO4)；YNL202W/SPS 19(SEQ ID NO5)；YOL016C/CMK2(SEQ IDNO6)；BRO 11C/IPP1(SEQ ID NO7)；YGR034W/RPL26B(SEQ IDNO8)；YFR004W/RPN 11(SEQ ID NO9)；YIL021W/RPB3(SEQ ID NO10)；YGL063W/PUS2(SEQ ID NO11)；YDR292C/SRP101(SEQ ID NO12)；YFR014C/CMK1(SEQ ID NO13)；YBR213W/MET8(SEQ IDNO14)；YAL029C/MY04(SEQ ID NO15)。
圖4A-4D.磷脂酰肌醇-結(jié)合蛋白的分析。為了確定150種陽(yáng)性蛋白的磷脂酰肌醇(″PI″)-結(jié)合專(zhuān)一性，將它們的結(jié)合信號(hào)相對(duì)磷脂酰膽堿(″PC″)的相應(yīng)結(jié)合信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)一化。根據(jù)其比例(″PI/PC″)，將所述蛋白分成四類(lèi)(A)30種強(qiáng)的和專(zhuān)一性的，(B)43種強(qiáng)的和非專(zhuān)一性的，(C)19種弱的和專(zhuān)一性的，和(D)58種弱的和專(zhuān)一性的磷脂酰肌醇-結(jié)合專(zhuān)一性。強(qiáng)度表示PI/PC信號(hào)比，如在附圖中通過(guò)尺度所表示的。位于PI/PC結(jié)合比例右側(cè)用“10n”標(biāo)明的柱，表示最大結(jié)合信號(hào)強(qiáng)度(空心方框)，以及它的置信間隔(實(shí)心水平線)；數(shù)字表示有關(guān)值的對(duì)數(shù)。位于置信間隔柱右側(cè)的三個(gè)柱上的方框分別表示膜結(jié)合蛋白(“膜”)，激酶(“激酶”)和未表征的ORFs(“未知”)。
圖5A-5C.通過(guò)蛋白組微陣列檢測(cè)證實(shí)蛋白-脂類(lèi)相互作用的常規(guī)方法(Casamayor等，1999，Curr.Biol.9186；Guerra等，2000，Biosci.Rep.2041)。
A.首先將PI(4，5)P2脂質(zhì)體結(jié)合在硝酸纖維素膜上，該纖維素膜是通過(guò)BSA封閉的；利用Rim15p，Eno2p和Hxk1p和GST對(duì)照的稀釋系列檢測(cè)所述膜。用抗GST抗體和強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光(“ECL”)試劑盒檢測(cè)結(jié)合的蛋白。
B.進(jìn)行相反的測(cè)定，以便測(cè)試蛋白-脂類(lèi)相互作用。制備所述蛋白，并且通過(guò)系列稀釋點(diǎn)滴在硝酸纖維素濾膜上，并且用6種不同的脂質(zhì)體檢測(cè)。作為對(duì)照，同樣將6種脂質(zhì)體添加到BSA封閉的膜上。在經(jīng)過(guò)充分洗滌之后，利用HRP-結(jié)合的鏈親和素和ECL試劑盒檢測(cè)結(jié)合的脂質(zhì)體。
C.在膜測(cè)定中，結(jié)合信號(hào)和Rim15p的數(shù)量的線性相關(guān)。當(dāng)來(lái)自所述膜測(cè)定(圖4B)的Rim15p的脂質(zhì)體結(jié)合信號(hào)相對(duì)點(diǎn)滴的Rim15p的濃度梯度作圖時(shí)，PI(4)P，PI(3，4)P2，PI(3)P，和PI(4，5)P2的結(jié)合信號(hào)與Rim15p的量線性相關(guān)。PI(4)P和Rim15p的相互作用表現(xiàn)出最高的親和力，該親和力比對(duì)照PC Rim15p的親和力至少高3倍。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于申請(qǐng)人的酵母蛋白組微陣列的構(gòu)建，其包括在酵母中表達(dá)的所有蛋白的大約80％，代表任何物種的蛋白組陣列的第一說(shuō)明。本發(fā)明的蛋白組芯片可用于對(duì)一個(gè)物種中的蛋白相互作用和活性進(jìn)行全面分析。蛋白組芯片的使用與現(xiàn)有方法相比具有突出優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所提供的蛋白組微陣列技術(shù)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，能夠以高處理量方式，同時(shí)直接篩選大量不同蛋白的數(shù)百種甚至是數(shù)千種生物化學(xué)活性。例如，所述蛋白組芯片方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以在體外直接篩選蛋白的多種活性，包括，但不局限于蛋白-藥物相互作用(例如，藥物目標(biāo)-藥物相互作用)，蛋白-脂類(lèi)相互作用和酶促測(cè)定。另外，可以方便地測(cè)試多種體外條件。另外，一旦制備了所述蛋白，蛋白組篩選明顯更快并且更便宜，并且在多種微陣列方案中的快速數(shù)據(jù)分析與現(xiàn)有的設(shè)備和分析軟件兼容。
5.1蛋白組陣列本發(fā)明包括包括具有多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白包括由一個(gè)物種的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已知基因所編碼的至少一種蛋白，即來(lái)自一種基因的所有蛋白同種型和剪接變體都被視為一種蛋白。
本發(fā)明包括包括具有多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，其中，蛋白同種型和剪接變體都作為一種蛋白統(tǒng)計(jì)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多種蛋白占在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的大約90％、95％或99％。在一種具體實(shí)施方案中，所述多種蛋白占在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的大約93.5％。
本發(fā)明還包括包括具有多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000種蛋白。
本發(fā)明還包括包括具有多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白總體上包括在一個(gè)物種中表達(dá)的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、5000、10000、20000、30000、40000或50000種不同的已知基因。
本發(fā)明還包括結(jié)合在固體支持物的表面上的含有多種融合蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述融合蛋白包括第一標(biāo)記和第二標(biāo)記，和由一種生物體的基因組核酸編碼的蛋白序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白的蛋白序列不一定是由生物體的基因組核酸編碼的，但是，它是鑒定結(jié)合蛋白的功能和/或活性所需要的序列。
可定位尋址的陣列提供了一種結(jié)構(gòu)，以便每一種感興趣的探針或蛋白位于所述位于所述固體支持物的已知位置上，以便能夠根據(jù)它在所述陣列上的位置確定每一種探針或蛋白的身份。因此，陣列上的每一種蛋白優(yōu)選位于固體支持物的已知的、預(yù)定的位置上，以便可以根據(jù)它在所述固體支持物的位置確定每一種蛋白的身份。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物種是病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物種是原核生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物種是真核生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物種是脊椎動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物種是哺乳動(dòng)物。在一種具體實(shí)施方案中，所述物種是動(dòng)物，包括，但不局限于昆蟲(chóng)、靈長(zhǎng)類(lèi)和嚙齒類(lèi)。在一種具體實(shí)施方案中，所述物種是猴子、果蠅、牛、馬、綿羊、豬、雞、火雞、鵪鶉、貓、狗、小鼠、大鼠、兔子、線蟲(chóng)或魚(yú)。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述物種是人類(lèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述物種是酵母。
本發(fā)明的蛋白組芯片的蛋白包括完整長(zhǎng)度蛋白，完整長(zhǎng)度蛋白的部分和肽，所述蛋白可以通過(guò)重組超量表達(dá)、裂解較大的蛋白或化學(xué)合成制備。例如，蛋白可以在來(lái)自酵母、細(xì)菌、昆蟲(chóng)、人類(lèi)、或人哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、貓、狗、豬、牛和馬的細(xì)胞中超量表達(dá)。另外，可以使用包括與天然或合成蛋白結(jié)合的特定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白?？梢栽谂c所述芯片的固體支持物結(jié)合之前，對(duì)蛋白組芯片的蛋白進(jìn)行純化。另外，還可以在與蛋白組芯片結(jié)合期間，對(duì)所述蛋白組芯片的蛋白進(jìn)行純化或再純化。
可以在與所述蛋白芯片結(jié)合之前或在結(jié)合的同時(shí)，將蛋白包埋在人工或天然膜(例如，脂質(zhì)體，膜小泡)中。實(shí)際上，某些蛋白的合成可優(yōu)選在存在人工或天然膜的條件下進(jìn)行，以便，例如，促進(jìn)蛋白折疊，蛋白加工，保留活性，和/或防止蛋白沉淀。
另外，可以將蛋白結(jié)合在蛋白組芯片的固體支持物上。另外，可以將蛋白輸送到蛋白組芯片的孔中，在這里，它們保持不與蛋白組芯片的固體支持物結(jié)合。
本發(fā)明還涉及可用于本發(fā)明蛋白組芯片的固體支持物的化合物。所述固體支持物可以用各種材料制成，例如，但不局限于硅，玻璃，石英，聚酰亞胺，丙烯酸，聚甲基丙烯酸甲酯(LUCITE)，陶瓷，硝酸纖維素，非晶碳化硅，聚苯乙烯，和/或任何其他適合微制造、微蝕刻、或鑄造的材料。例如，所述固體支持物可以是親水性微量滴定板(例如，MILLIPORTM)或硝酸纖維素包被的載玻片。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述固體支持物是硝酸纖維素包被的載玻片。用于制備蛋白(和DNA)微陣列的硝酸纖維素包被的載玻片，可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得(例如，從Schleicher & Schuell(Keene，NH)購(gòu)買(mǎi)，該公司出售用基于硝酸纖維素的聚合物包被的載玻片(產(chǎn)品目錄號(hào)10 484 182))，在一種具體實(shí)施方案中，用OMNIGRIDTM(GeneMachines，San Carlos，CA)將每一種蛋白點(diǎn)滴在硝酸纖維素包被的載玻片上。本發(fā)明涉及可用于制造蛋白芯片的其他固體支持物，其中的某些固體支持物披露于以下文獻(xiàn)中，例如，共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/849,781，2001年5月4日提交，該申請(qǐng)被以全文形式引入本文作為參考。
在一種具體實(shí)施方案中，所述固體支持物包括硅酮彈性材料，例如，但不局限于聚二甲基硅酮(″PDMS″)。硅酮彈性材料的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們的彈性。
在另一種具體實(shí)施方案中，所述固體支持物是硅晶片?？梢詫?duì)硅晶片進(jìn)行成型和蝕刻(例如，參見(jiàn)G.Kovacs，1998，MicromachinedTransducers Sourcebook，Academic Press；M.Madou，1997，F(xiàn)undamentalsof Microfabrication，CRC Press)。可以將蝕刻過(guò)的芯片用于鑄造本發(fā)明的蛋白組芯片。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括固體支持物的蛋白組芯片，該支持物是平面的，例如，但不局限于載玻片。例如，可以在載玻片上生產(chǎn)密集的蛋白陣列，以便能夠以高處理量的方式對(duì)蛋白的存在、數(shù)量和/或功能進(jìn)行分析。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白組芯片包括被涂在固體支持物表面上的多種蛋白，其中，涂敷蛋白的位點(diǎn)的密度為至少100個(gè)位點(diǎn)/平方厘米，1000個(gè)位點(diǎn)/平方厘米，10,000個(gè)位點(diǎn)/平方厘米，100,000個(gè)位點(diǎn)/平方厘米，1,000,000個(gè)位點(diǎn)/平方厘米，10,000,000個(gè)位點(diǎn)/平方厘米，25,000,000個(gè)位點(diǎn)/平方厘米，10,000,000,000個(gè)位點(diǎn)/平方厘米或10,000,000,000,000個(gè)位點(diǎn)/平方厘米。優(yōu)選將每一種蛋白涂在所述芯片的一個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)上。位于所述芯片的每一個(gè)位點(diǎn)上的蛋白的身份是已知的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物具有一系列孔。可以利用微印刷和微機(jī)械加工制造技術(shù)(例如，參見(jiàn)未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/849,781，2001年5月4日提交，該申請(qǐng)被以全文形式引入本文作為參考)產(chǎn)生孔的陣列，這些孔具有從數(shù)百微米至100納米甚至更小的尺寸，孔的深度具有類(lèi)似的尺寸。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)硅晶片進(jìn)行微機(jī)械加工，并且被用作母模，以便澆鑄間隔為200微米的直徑為400微米的孔，孔的密度為每平方厘米大約277個(gè)孔，對(duì)于深度為100微米的孔來(lái)說(shuō)，每一個(gè)孔的體積為大約30nl。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)微印刷、微機(jī)械加工生產(chǎn)間隔1微米的直徑為500納米和275納米的孔，以便分別得到每平方厘米超過(guò)4千4百萬(wàn)和超過(guò)6千1百萬(wàn)個(gè)孔的孔密度。通過(guò)較小的間隔，以及通過(guò)較小的直徑，可以獲得更高的密度。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以利用精密激光微機(jī)械加工技術(shù)直接用丙烯酸樹(shù)脂制造模具結(jié)構(gòu)，其尺寸從高于1.5毫米至低于500微米，孔的間隔大約為500微米。這些孔的體積為50-500nl。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白組芯片包括固體支持物表面上的多個(gè)孔，其中，所述孔的密度至少為100孔/平方厘米，1000孔/平方厘米，10,000孔/平方厘米，100,000孔/平方厘米，1,000,000孔/平方厘米，10,000,000孔/平方厘米，25,000,000孔/平方厘米，10,000,000,000孔/平方厘米或10,000,000,000,000孔/平方厘米。本發(fā)明涉及包括多個(gè)孔的蛋白芯片的變化形式，例如，這種變化形式披露于提交日為2001年5月4日的未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9/849,781中，該專(zhuān)利申請(qǐng)被以全文形式引入本文作為參考。
本發(fā)明還涉及蛋白組芯片上的孔的形狀、寬度與深度的比例和體積的變化，例如，這種變化披露于提交日為2001年5月4日的未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9/849,781中，該專(zhuān)利申請(qǐng)被以全文形式引入本文作為參考。所述形狀包括，但不局限于圓形、橢圓形、矩形、方形等。例如，所述孔還可以具有方形、圓形、V形或U形底部。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物包括金。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述固體支持物包括金包被的載玻片。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物包括鎳。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述固體支持物包括鎳包被的載玻片。包括鎳的固體支持物優(yōu)選用于純化和連接具有多組氨酸標(biāo)記(″His標(biāo)記″)的融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述固體支持物包括硝酸纖維素，在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述固體支持物包括硝酸纖維素包被的載玻片。
本發(fā)明還涉及可用于對(duì)所述蛋白組芯片基質(zhì)進(jìn)行衍生化的化合物。所述蛋白可以直接結(jié)合在固體支持物上，或者可以通過(guò)接頭分子或化合物結(jié)合在固體支持物上。所述接頭可以是能夠?qū)腆w支持物的表面進(jìn)行衍生化，以便有利于蛋白與固體支持物表面結(jié)合的任何分子或化合物。所述接頭可以將蛋白或探針共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合在所述固體支持物上。另外，所述接頭可以是無(wú)機(jī)或有機(jī)分子。在某些實(shí)施方案中，所述接頭可以是硅烷，例如，sianosilane，硫代硅烷，氨基硅烷等。本發(fā)明涉及可用于對(duì)蛋白芯片進(jìn)行衍生化的化合物，例如，某些這樣的化合物披露于提交日為2001年5月4日的未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9/849,781中，該專(zhuān)利申請(qǐng)被以全文形式引入本文作為參考。
相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白組芯片的蛋白非共價(jià)地結(jié)合在固體支持物上(例如，通過(guò)吸附結(jié)合)。與固體支持物非共價(jià)地結(jié)合的蛋白可以通過(guò)多種分子相互作用結(jié)合在固體支持物表面上，例如，氫鍵、范德華鍵、靜電，或金屬螯合物配合鍵。在一種具體實(shí)施方案中，蛋白結(jié)合在聚賴(lài)氨酸包被的固體支持物表面上。另外，如上文所述，在某些實(shí)施方案中，蛋白被結(jié)合在硅烷(例如，sianosilane，硫代硅烷，氨基硅烷等)包被的固體支持物表面上。
另外，可以將本領(lǐng)域公知的交聯(lián)化合物，例如，純合或雜合功能交聯(lián)化合物(例如，二[硫代琥珀酰亞胺基]辛二酸，N-[γ-馬來(lái)酰丁酰羥基]琥珀酰亞胺酯或1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺)通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)相互作用將蛋白結(jié)合在所述固體支持物上。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白組芯片的蛋白是共價(jià)結(jié)合在固體支持物上的。例如，所述蛋白可以通過(guò)受體-配體相互作用結(jié)合在固體支持物上，所述相互作用包括抗體和抗原，DNA結(jié)合蛋白和DNA，酶和底物，親和素(或鏈親和素)和生物素(或生物素化的分子)之間的相互作用，以及脂結(jié)合蛋白和磷脂(或膜，小泡或含有磷脂的脂質(zhì)體)之間的相互作用。
可以利用本領(lǐng)域已知的多種方法將純化的蛋白放置在陣列上。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述蛋白印刷在固體支持物上。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用親和標(biāo)記將所述蛋白固體在固體支持物上。優(yōu)選利用不同于用于純化蛋白的親和力標(biāo)記，因?yàn)樵诮⑺龅鞍钻嚵袝r(shí)實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步的純化。
相應(yīng)地，在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白組芯片的蛋白是作為融合蛋白表達(dá)的，它具有至少一個(gè)異源結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)合在固體支持物表面上的化合物具有親和力。適用于將融合蛋白結(jié)合在固體支持物上的化合物(即起著結(jié)合配偶體的作用)包括，但不局限于胰蛋白酶/無(wú)水胰蛋白酶，谷胱甘肽，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，麥芽糖，鎳或生物素及其衍生物，它們分別結(jié)合在牛胰腺胰蛋白酶抑制劑，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，蛋白A或抗原，麥芽糖結(jié)合蛋白，聚組氨酸(例如，HisX6標(biāo)記)，和親和素/鏈親和素上。例如，蛋白A、蛋白G和蛋白A/G是能夠結(jié)合在哺乳動(dòng)物免疫球蛋白分子，特別是IgG的Fc部分的蛋白。例如，所述蛋白可以共價(jià)結(jié)合在Sepharose支持物上，以便提供純化具有包括Fc結(jié)構(gòu)域的標(biāo)記的融合蛋白的有效方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白直接結(jié)合在固體支持物上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白通過(guò)接頭結(jié)合在固體支持物上。在一種具體實(shí)施方案中，所述蛋白通過(guò)His標(biāo)記結(jié)合在固體支持物上。在另一種具體實(shí)施方案中，所述蛋白通過(guò)3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(″GPTS″)接頭結(jié)合在固體支持物上。在一種具體實(shí)施方案中，所述蛋白通過(guò)His標(biāo)記結(jié)合在固體支持物，其中，所述固體支持物包括一個(gè)平的表面。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白通過(guò)His標(biāo)記結(jié)合在固體支持物上，其中，所述固體支持物包括鎳包被的載玻片。
本發(fā)明的蛋白組芯片的物理尺寸不受限制，并且可以具有任何可以使用的尺寸。所述蛋白組芯片優(yōu)選具有與自動(dòng)化技術(shù)兼容的陣列形式，以便能夠進(jìn)行快速數(shù)據(jù)分析。因此，在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白組微陣列方案是與實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和/或分析軟件兼容的。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白組芯片具有標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片的大小。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，將蛋白芯片設(shè)計(jì)成適合安裝到質(zhì)譜儀的樣品室中。
5.2以高密度陣列形式制備和純化蛋白的方法。
本發(fā)明還涉及以便于標(biāo)度、適合高處理量分析形式制備和分離病毒、原核生物或真核生物蛋白的方法。優(yōu)選的方法包括以與自動(dòng)化技術(shù)兼容的陣列方案合成并純化蛋白。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備和分離真核生物蛋白的方法，包括以下步驟生長(zhǎng)用具有可操作地與調(diào)控序列連接的異源序列的載體轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，讓所述調(diào)控序列與能增強(qiáng)由所述異源序列編碼的蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)物接觸，裂解所述細(xì)胞，讓所述蛋白與一種結(jié)合制劑接觸，以便在所述蛋白和結(jié)合制劑之間形成復(fù)合物，從細(xì)胞碎片中分離所述復(fù)合物，并且從所述復(fù)合物中分離所述蛋白，其中，每一個(gè)步驟都是以96孔方式進(jìn)行的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白包括由一個(gè)物種的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已知基因所編碼的至少一種蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白至少占在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，其中，蛋白同種型和剪接變體是作為一種蛋白統(tǒng)計(jì)的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白至少包括在一個(gè)物種中表達(dá)的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000種蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白總體上包括一個(gè)物種中的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、5000、10000、20000、30000、40000或50000種不同的已知基因。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述蛋白是包括第一標(biāo)記，第二標(biāo)記，和由一種生物體的基因組核酸編碼的蛋白的融合蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，合成和純化方法的每一個(gè)步驟都是以能夠快速自動(dòng)化的陣列形式進(jìn)行的。所述陣列可以包括固體支持物表面上的多個(gè)孔，其中，例如，所述孔的密度至少為10、20、30、40、50、100、1000、10,000、100,000或1,000,000孔/平方厘米，另外，所述陣列包括固體支持物表面上的多個(gè)位點(diǎn)，其中，例如，所述位點(diǎn)的密度至少為10、20、30、40、50、100、1000、10,000、100,000或1,000,000位點(diǎn)/平方厘米。
在一種具體實(shí)施方案中，真核蛋白是以96-陣列形式制備和純化的(即進(jìn)行處理的是所述固體支持物的每一個(gè)位點(diǎn)，在這里是96個(gè)位點(diǎn)中的一個(gè))，例如，96孔微量滴定板。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述固體支持物不與蛋白結(jié)合(例如，非蛋白-結(jié)合微量滴定板)。
在某些實(shí)施方案中，蛋白是按照本領(lǐng)域公知的方法通過(guò)體外翻譯合成的。
任何具有能驅(qū)動(dòng)蛋白合成的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體，都可用于本發(fā)明的方法中。所述表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選是針對(duì)要用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞類(lèi)型而定制的。表達(dá)構(gòu)建體和宿主細(xì)胞之間的兼容性，為本領(lǐng)域所公知，并且，本發(fā)明還包括它的變體的利用。
任何可以在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的宿主細(xì)胞都可用于合成感興趣的蛋白。所使用的宿主細(xì)胞優(yōu)選能超量生產(chǎn)感興趣的蛋白，導(dǎo)致正確的合成、折疊、和蛋白的翻譯后修飾。所述蛋白加工優(yōu)選能形成可用于分析、表征能夠代表體內(nèi)相互作用的體外分子相互作用的表位，活性位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)等。
因此，優(yōu)選使用真核細(xì)胞(例如，酵母、人類(lèi)細(xì)胞)合成真核蛋白。另外，優(yōu)選能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并且具有選擇標(biāo)記以便鑒定和分離含有感興趣的轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞的真核細(xì)胞。另外，具有一種基因產(chǎn)物缺陷的真核宿主細(xì)胞，是用能彌補(bǔ)所述缺陷的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的?？捎糜诒磉_(dá)工程的病毒、原核或真核蛋白的細(xì)胞為本領(lǐng)域所公知，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解所述細(xì)胞的變體。
例如，可以使用購(gòu)自Invitrogen(Carlsbad，CA，產(chǎn)品目錄號(hào)K800-01)的InsectSelect系統(tǒng)，它是一種非裂解的、單一載體昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)，它簡(jiǎn)化了優(yōu)質(zhì)蛋白的表達(dá)，并且，消除了制備和擴(kuò)增病毒原種的必要性。該系統(tǒng)中的優(yōu)選載體是pIB/V5-His TOPO TA載體(產(chǎn)品目錄號(hào)K890-20)?？梢詫⒕酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)(″PCR″)產(chǎn)物直接克隆到該載體上，使用生產(chǎn)商所公開(kāi)的方法，并且可以表達(dá)具有N-末端組氨酸標(biāo)記的蛋白，該標(biāo)記可用于純化所表達(dá)的蛋白。
還可以使用建立在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的另一種真核表達(dá)系統(tǒng)BAC-TO-BACTM系統(tǒng)(LIFETECHTM，Rockville，MD)。與使用同源重組不同，BAC-TO-BACTM系統(tǒng)通過(guò)在大腸桿菌中的位點(diǎn)專(zhuān)一性轉(zhuǎn)座產(chǎn)生了重組桿狀病毒?；虮磉_(dá)是通過(guò)高活性多角蛋白啟動(dòng)子啟動(dòng)的，因此，可以占感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞的細(xì)胞蛋白的25％以上。
在一種具體實(shí)施方案中，將酵母培養(yǎng)物用于合成真核融合蛋白。優(yōu)選將新的培養(yǎng)物用于有效誘導(dǎo)蛋白合成，特別是當(dāng)?shù)鞍缀铣墒窃谛◇w積的培養(yǎng)基中進(jìn)行時(shí)更是如此。另外，優(yōu)選小心操作，以便避免酵母培養(yǎng)物的過(guò)度生長(zhǎng)。另外，優(yōu)選用大約3毫升或更少的酵母培養(yǎng)物產(chǎn)生用于純化的足夠的蛋白。為了改善培養(yǎng)物的通氣性，可以將總體積分成若干個(gè)較小的體積(例如，可以制備4個(gè)0.75毫升的培養(yǎng)物，以便產(chǎn)生3毫升的總體積)。
然后讓細(xì)胞與一種誘導(dǎo)物(例如，半乳糖)接觸，并且收獲。用冷的(即4℃至大約15℃)水洗滌誘導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞，以便終止所述細(xì)胞的進(jìn)一步生長(zhǎng)，然后用冷的(即4℃至大約15℃)裂解緩沖液洗滌，以便除去培養(yǎng)基，并且使誘導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞預(yù)先適應(yīng)蛋白純化。在蛋白純化之前，可以冷凍保藏誘導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞，以便防止所述蛋白降解。在一種具體實(shí)施方案中，以半干燥狀態(tài)將誘導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞保存在-80℃下，以便防止或抑制蛋白降解。
可以使用任何合適的機(jī)械裝置將細(xì)胞從一個(gè)陣列轉(zhuǎn)移到另一個(gè)陣列上。例如，可以用自動(dòng)操作系統(tǒng)(例如，自動(dòng)移液管)將感興趣的細(xì)胞接種到裝有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的陣列上。在一種具體實(shí)施方案中，可以用96-叉子(pronger)將酵母細(xì)胞接種到裝有包括含有瓊脂的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的96孔陣列上。類(lèi)似地，可以使用自動(dòng)化液體操作系統(tǒng)(例如，Q-FILLTM，Genetix，UK)，實(shí)現(xiàn)液體(例如，制劑)從一個(gè)陣列到另一種陣列的轉(zhuǎn)移。
盡管可以在細(xì)胞周期的任何時(shí)間點(diǎn)上從細(xì)胞中收獲蛋白，細(xì)胞優(yōu)選是在對(duì)數(shù)期分離的，此時(shí)蛋白合成得到增強(qiáng)。例如，酵母細(xì)胞可以在OD600＝0.3和OD600＝1.5之間收獲，優(yōu)選在OD600＝0.5和OD600＝1.5之間收獲。在一種具體實(shí)施方案中，蛋白是在對(duì)數(shù)中期之后的時(shí)間點(diǎn)從細(xì)胞中收獲的。收獲的細(xì)胞可以冷凍保存，以便將來(lái)操作。
可以用本領(lǐng)域已知的多種方法裂解收獲的細(xì)胞，包括機(jī)械力，酶促消化，和化學(xué)處理。所述裂解方法應(yīng)當(dāng)適合宿主細(xì)胞的類(lèi)型。例如，將含有新鮮的蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液添加到酵母細(xì)胞中，同時(shí)添加能破壞細(xì)胞壁的制劑(例如，沙子，玻璃珠，鋯珠)，然后，用振蕩器劇烈振蕩所述混合物(例如，渦旋攪拌器，顏料振蕩器(paintshaker))。
在一種特定實(shí)施方案中，讓鋯珠與酵母細(xì)胞接觸，并且通過(guò)渦旋攪拌，通過(guò)機(jī)械破壞裂解細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞在高密度陣列方案中的裂解，是使用顏料振蕩器實(shí)現(xiàn)的。所述顏料振蕩器具有一個(gè)平臺(tái)，它能夠穩(wěn)定地保持分成三層的至少18個(gè)96孔盒子，以便對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行高處理量加工。另外，顏料振蕩器劇烈攪拌所述培養(yǎng)物，即使是在培養(yǎng)物完全解凍之前，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的有效破裂，同時(shí)減少蛋白的降解。實(shí)際上，通過(guò)顯微鏡觀察確定，通過(guò)不到2分鐘的振蕩就可以將超過(guò)90％的酵母細(xì)胞裂解。
可以通過(guò)離心將所得到的細(xì)胞碎片從蛋白和/或其他感興趣的分子中分離。另外，為了以高處理量形式提高蛋白樣品的純度，可以過(guò)濾富含蛋白的上清液，優(yōu)選使用非蛋白結(jié)合固體支持物上的濾膜。為了從可溶性級(jí)份中分離含有感興趣的蛋白的可溶性級(jí)份，優(yōu)選使用過(guò)濾平板，以便減少或避免蛋白降解。另外，優(yōu)選對(duì)含有細(xì)胞碎片的級(jí)份重復(fù)以上步驟，以便提高蛋白的產(chǎn)量。
然后，可以用本領(lǐng)域已知的多種親和純化方法，從富含蛋白的上清液中純化蛋白。用于通過(guò)讓具有結(jié)合配偶體的融合蛋白制劑與親和標(biāo)記接觸，親和純化融合蛋白的親和標(biāo)記包括，但不局限于鈣調(diào)蛋白，胰蛋白酶/無(wú)水胰蛋白酶，谷胱甘肽，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，麥芽糖，鎳或生物素及其衍生物，它們分別結(jié)合在鈣調(diào)蛋白-結(jié)合蛋白，牛胰腺胰蛋白酶抑制劑，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(″GST標(biāo)記″)，抗原或蛋白A，麥芽糖結(jié)合蛋白，聚組氨酸(″His標(biāo)記″)，和親和素/鏈親和素上。例如，其他親和標(biāo)記可以是myc或FLAG。融合蛋白可以使用合適的結(jié)合化合物(即結(jié)合配偶體，如谷胱甘肽珠)進(jìn)行親和純化，并且通過(guò)，例如，將含有結(jié)合蛋白的復(fù)合物固定在非蛋白結(jié)合濾膜上進(jìn)行分離。將一種親和標(biāo)記連接在蛋白的一端(例如羧基末端)，而將另一種親和標(biāo)記連接在蛋白的另一端(例如，氨基末端)，可有助于純化完整長(zhǎng)度的蛋白。
在特別的實(shí)施方案中，所述融合蛋白具有GST標(biāo)記，并且是通過(guò)讓該蛋白與谷胱甘肽珠接觸進(jìn)行親和純化的。在其他實(shí)施方案中，可以在96孔盒子中洗滌結(jié)合有融合蛋白的谷胱甘肽珠，而不使用過(guò)濾平板，以便簡(jiǎn)化樣品操作，并且防止樣品的交叉污染。
另外，可以用洗脫緩沖液從結(jié)合化合物(例如谷胱甘肽珠)中洗脫融合蛋白，以便提供需要的蛋白濃度。在一種具體實(shí)施方案中，融合蛋白是用30微升洗脫緩沖液從谷胱甘肽珠中洗脫的，以便提供需要的蛋白濃度。
為了純化將均勻點(diǎn)滴在顯微鏡載玻片上的蛋白，將谷胱甘肽珠從純化的蛋白中分離。優(yōu)選除去所有谷胱甘肽珠，以避免堵塞用于將純化的蛋白點(diǎn)滴在固體支持物上的微陣列針。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，使用過(guò)濾器平板將谷胱甘肽珠從所述純化蛋白中分離出來(lái)，優(yōu)選包括非蛋白結(jié)合固體支持物。過(guò)濾含有純化蛋白的洗脫液，能夠得到該蛋白的超過(guò)90％的回收率。
所述洗脫緩沖液優(yōu)選包括具有高粘度的液體，例如15％-50％的甘油，優(yōu)選大約40％的甘油。甘油溶液能夠?qū)⑺龅鞍追€(wěn)定在溶液中，并且防止在使用微陣列的印刷步驟期間蛋白溶液發(fā)生降解。
純化的蛋白優(yōu)選保存在一種介質(zhì)中，該介質(zhì)能穩(wěn)定所述蛋白，并且防止樣品的解離。例如，可以將純化的蛋白保存在具有高粘度的液體中，例如，15％-50％的甘油，優(yōu)選大約40％的甘油。優(yōu)選分裝含有純化蛋白的樣品，以便避免由冷凍/解凍循環(huán)所導(dǎo)致的蛋白活性的喪失。
技術(shù)人員可以理解的是，可以調(diào)整純化方案，以便控制需要的蛋白純度水平。在某些場(chǎng)合下，需要分離與感興趣的蛋白結(jié)合的分子。例如，可以用本文所提供的純化方法或它的改進(jìn)方法分離包括感興趣的超量生產(chǎn)的蛋白的雙體、三體、或更高級(jí)別的同型或異型復(fù)合物。另外，可以用本領(lǐng)域已知方法(例如質(zhì)譜法)分別分離并鑒定相關(guān)的分子。
5.3制備蛋白組陣列的方法。
本發(fā)明還涉及制備蛋白組芯片的方法。因此，本發(fā)明提供了用于構(gòu)建可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白包括一個(gè)物種中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已知基因的至少一種代表性蛋白，其中，所述蛋白是源于一個(gè)基因的所有蛋白同種型和剪接變體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于構(gòu)建可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白占在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于構(gòu)建可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000種蛋白。
本發(fā)明還涉及用于制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述固體支持物是用微制造模具鑄造的，并且，其中，所述多種蛋白占在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或包括在一個(gè)物種中表達(dá)的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000種蛋白，或包括一個(gè)物種中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已知基因的至少一種代表性蛋白，其中，所述蛋白是來(lái)自一個(gè)基因的所有蛋白同種型和剪接變體。本發(fā)明涉及用一種微制造模具鑄造的多種固體支持物，例如，某些固體支持物披露于2001年5月4日提交的共同未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/849,781中，該申請(qǐng)被以全文形式引入本文作為參考。
本發(fā)明還涉及用于制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于所述固體支持物的不同位置上，其中，所述蛋白包括第一標(biāo)記和第二標(biāo)記。使用雙重標(biāo)記的蛋白的優(yōu)點(diǎn)包括，可以獲得高度純化的蛋白的能力，以及提供了從細(xì)胞碎片中純化蛋白的有效方式，并且將所述蛋白結(jié)合在固體支持物上。在一種具體實(shí)施方案中，所述第一標(biāo)記是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(″GST標(biāo)記″)，而第二標(biāo)記是聚組氨酸標(biāo)記(″His標(biāo)記″)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GST標(biāo)記和His標(biāo)記連接在所述蛋白的氨基末端。另外，GST標(biāo)記和His標(biāo)記被連接在所述蛋白的羧基末端。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GST標(biāo)記被連接在所述蛋白的氨基末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，His標(biāo)記被連接在所述蛋白的羧基末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，His標(biāo)記被連接在所述蛋白的氨基末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GST標(biāo)記被連接在所述蛋白的羧基末端。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白包括GST標(biāo)記和His標(biāo)記，并且GST標(biāo)記和His標(biāo)記既不位于該蛋白的氨基末端又不位于該蛋白的羧基末端。在一種具體實(shí)施方案中，GST標(biāo)記和His標(biāo)記位于感興趣的蛋白的編碼區(qū)；優(yōu)選位于該蛋白的不會(huì)影響感興趣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的區(qū)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一標(biāo)記被用于純化融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二標(biāo)記被用于將融合蛋白結(jié)合在固體支持物上。在另一種具體實(shí)施方案中，所述第一標(biāo)記是GST標(biāo)記，而第二標(biāo)記是His標(biāo)記。
所述蛋白優(yōu)選是融合蛋白，以便雜合的序列包括感興趣的蛋白的編碼區(qū)，和編碼一種標(biāo)記，如親和標(biāo)記的序列。所述標(biāo)記可用于監(jiān)測(cè)所述蛋白，從細(xì)胞碎片和污染制劑中分離所述融合蛋白，和/或?qū)⑺龅鞍捉Y(jié)合在本發(fā)明的蛋白組芯片上。
誘導(dǎo)物的例子包括，但不局限于半乳糖，增強(qiáng)子結(jié)合蛋白，和其他轉(zhuǎn)錄因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，半乳糖與包括半乳糖誘導(dǎo)型GAL1啟動(dòng)子的調(diào)控序列接觸。
可用于本發(fā)明的結(jié)合制劑包括，但不局限于谷胱甘肽珠，鎳-包被的固體支持物，和抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述復(fù)合物包括結(jié)合在谷胱甘肽珠上的具有GST標(biāo)記的融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述復(fù)合物包括結(jié)合在鎳包被的固體支持物上的具有His標(biāo)記的融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述復(fù)合物包括結(jié)合在抗體，并且選擇性結(jié)合在二級(jí)抗體上的感興趣的蛋白。
5.4使用蛋白組陣列的方法本發(fā)明還涉及使用蛋白組芯片分析存在于至少一種樣品中的蛋白的存在、數(shù)量、和/或功能的方法。將本發(fā)明的蛋白組芯片、化學(xué)反應(yīng)和測(cè)定方法用于大規(guī)模平行分析中，可以表征生物學(xué)狀態(tài)或生物學(xué)反應(yīng)，以及確定蛋白的存在、數(shù)量、和/或生物學(xué)活性。因此，本發(fā)明的蛋白組芯片可用于分析細(xì)胞、組織、器官、系統(tǒng)、或生物體中的幾乎所有的蛋白-蛋白相互作用。
另外，本發(fā)明的蛋白組芯片可用于分析對(duì)宿主細(xì)胞(即用于生產(chǎn)融合蛋白的細(xì)胞)提供的特定刺激的生物學(xué)反應(yīng)。例如，可以對(duì)用編碼融合蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過(guò)的酵母細(xì)胞進(jìn)行刺激，然后純化并且排列所述融合蛋白。然后可以通過(guò)例如，用任何結(jié)合劑檢測(cè)表征所述排列的蛋白。然后將所得到的結(jié)合圖案與用由未進(jìn)行所述處理的酵母細(xì)胞或進(jìn)行了不同刺激的酵母細(xì)胞所產(chǎn)生的相同的陣列進(jìn)行比較。結(jié)合形式的差異，可以作為生物學(xué)反應(yīng)的特征，并且可以鑒定針對(duì)所述生物學(xué)反應(yīng)的感興趣的專(zhuān)一性相互作用劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用標(biāo)記過(guò)的凝集素(例如，伴刀豆蛋白A)篩選用宿主細(xì)胞制備的蛋白組芯片，每一個(gè)芯片表示接受一種不同刺激的宿主細(xì)胞。對(duì)表示糖基化蛋白存在的蛋白-探針相互作用的形式進(jìn)行比較，以便確定每一種刺激對(duì)蛋白組芯片的蛋白的糖基化狀態(tài)的影響。
可以用本發(fā)明的蛋白組芯片確定的生物學(xué)活性包括，但不局限于酶促活性(例如，激酶活性，蛋白酶活性，磷酸酶活性，糖苷酶，乙?；富钚裕推渌瘜W(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶促活性)，核酸結(jié)合，激素結(jié)合等。高密度和小體積的化學(xué)反應(yīng)可能有利于與使用本發(fā)明的蛋白組芯片相關(guān)的方法。
有關(guān)生物學(xué)狀態(tài)或反應(yīng)的其他信息可以用本發(fā)明的蛋白組芯片獲得，其中，所述芯片上的蛋白是按照蛋白的分類(lèi)組構(gòu)的。所述分類(lèi)可以根據(jù)豐度、功能、功能類(lèi)型、酶促活性、同源性、蛋白家族、與特定代謝或信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)系、與相關(guān)代謝或信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)系、或翻譯后修飾進(jìn)行。
在本發(fā)明的蛋白組芯片的蛋白與一種或多種探針接觸時(shí)，可以用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)分析蛋白-探針相互作用。例如，可以用能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光或熒光的標(biāo)準(zhǔn)酶促測(cè)定分析所述蛋白組芯片。例如，可以通過(guò)光致發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、或使用非蛋白底物的熒光、酶促顏色形成、質(zhì)譜特征標(biāo)記、或寡核苷酸標(biāo)記的擴(kuò)增，檢測(cè)各種蛋白修飾。
所述探針是用一種標(biāo)記標(biāo)記過(guò)的，以便可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法直接或間接檢測(cè)它的結(jié)合。本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)記都可以使用，包括，但不局限于諸如表位標(biāo)記、半抗原，和親和標(biāo)記，抗體，標(biāo)記物等，只要該標(biāo)記與用于將該蛋白組芯片的蛋白結(jié)合在該芯片的固體支持物上的親和標(biāo)記或制劑不同就行。例如，如果將生物素用作將蛋白結(jié)合在蛋白組芯片陣列上的接頭的話，就可以將不存在于該蛋白組芯片的蛋白上的另一種標(biāo)記，例如His或GST用于標(biāo)記探針，并且用于檢測(cè)蛋白-探針相互作用。在某些實(shí)施方案中，使用了光致發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、熒光或酶促標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，使用了質(zhì)譜特征標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，使用了可擴(kuò)增的寡核苷酸、肽或分子質(zhì)量標(biāo)記。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)蛋白-探針相互作用的方法，包括以下步驟讓標(biāo)記過(guò)的探針的樣品(例如標(biāo)記過(guò)的蛋白)與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上；并且檢測(cè)所述陣列上的任何位置，其中，在這些位置上發(fā)生了標(biāo)記過(guò)的探針和陣列上的蛋白之間的相互作用。
相應(yīng)地，蛋白-探針相互作用可以通過(guò)例如以下方式檢測(cè)1)使用放射性標(biāo)記過(guò)的配體，通過(guò)放射自顯影和/磷酸成像分析；2)結(jié)合半抗原，然后通過(guò)發(fā)光標(biāo)記的或酶促標(biāo)記的抗體或諸如生物素或鏈親和素的高親和力半抗原配體檢測(cè)；3)質(zhì)譜分析；4)原子力顯微分析；5)熒光偏振方法；6)紅外線標(biāo)記過(guò)的化合物或蛋白；7)可擴(kuò)增的寡核苷酸、肽或分子質(zhì)量標(biāo)記；8)刺激或抑制蛋白的酶促活性；9)滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增-檢測(cè)方法(Hatch等，1999，“固定在固體表面上的DNA的滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增，及其在多突變檢測(cè)中的應(yīng)用”，Genet.Anal.1535-40)；10)競(jìng)爭(zhēng)PCR(Fini等，1999，“使用微型平板發(fā)光劑的用于檢測(cè)和定量小病毒B19DNA的化學(xué)發(fā)光競(jìng)爭(zhēng)PCR的開(kāi)發(fā)”，Clin.Chem.451391-6；Kruse等，1999，“使用半嵌套競(jìng)爭(zhēng)PCR測(cè)定檢測(cè)并且定量測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)基因表達(dá)”，Cytokine 11179-85；Guenthner和Hart，1998，“使用基于顯微平板的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)HIV-1進(jìn)行定量、競(jìng)爭(zhēng)PCR測(cè)定”Biotechniques 24810-6)；11)比色方法；和12)生物學(xué)測(cè)定(例如，測(cè)定病毒效價(jià))。
在特別的實(shí)施方案中，蛋白-探針相互作用是通過(guò)直接質(zhì)譜分析檢測(cè)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白和/或探針的身份是通過(guò)質(zhì)譜分析確定的。例如，可以將與蛋白組芯片的蛋白結(jié)合的一種或多種探針從所述陣列上解離下來(lái)，并且通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行鑒定(例如，參見(jiàn)WO98/59361)。在另一個(gè)例子中，可以檢測(cè)所述蛋白組芯片上的蛋白的酶促裂解，并且可以通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定裂解的蛋白片段或其他釋放的化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，讓所述蛋白組芯片上的每一種蛋白與一種探針結(jié)合，并且檢測(cè)和定量蛋白-探針相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，讓所述蛋白組芯片上的每一種蛋白與多種探針結(jié)合，并且檢測(cè)和定量蛋白-探針相互作用。例如，可以用多種探針同時(shí)篩選所述蛋白組芯片，所述探針包括，但不局限于復(fù)合物(例如，細(xì)胞提取物)，完整的細(xì)胞成分(例如器官)，完整的細(xì)胞，和從若干來(lái)源收集的探針。然后檢測(cè)并且定量蛋白-探針相互作用?？梢酝ㄟ^(guò)使用探針混合物進(jìn)行分析獲得有用的信息，在某種程度上是因?yàn)楸景l(fā)明陣列的可定位尋址的性質(zhì)，即通過(guò)將蛋白放置在蛋白芯片的已知位置上，可以表征與探針結(jié)合(“相互作用劑”)的蛋白。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解的是，通過(guò)使用探針篩選本發(fā)明的蛋白組芯片分析各種細(xì)胞相互作用的各種不同的實(shí)施方案。例如，用各種探針多次順序篩選一個(gè)蛋白組芯片，可以確定與特定信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)或與特定代謝途徑相關(guān)的蛋白。另外，所述分析方法可用于診斷、預(yù)測(cè)和/或治療目的。
根據(jù)本發(fā)明的方法，探針可以是細(xì)胞，細(xì)胞膜，亞細(xì)胞細(xì)胞器，含有蛋白的細(xì)胞材料，蛋白，寡核苷酸，多核苷酸，小分子(即分子量小于500的化合物)，底物，藥物或藥物候選物，受體，抗原，甾醇，磷脂，抗體，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，谷胱甘肽，麥芽糖，鎳，二氫胰蛋白酶，凝集素或生物素。
用于與蛋白陣列接觸的探針可以是生物素化的，以便檢測(cè)蛋白-探針相互作用。弱生物素化的蛋白更可能用于保持感興趣的生物學(xué)活性。因此，輕度的生物素化方法是優(yōu)選的，以便保持該蛋白的結(jié)合活性或其他感興趣的生物學(xué)活性。因此，在一種具體實(shí)施方案中，用生物素轉(zhuǎn)運(yùn)化合物將探針蛋白生物素化到不同的程度(例如，Sulfo-NHS-LC-LC-生物素；PIERCETM產(chǎn)品目錄號(hào)21338，USA)。
另外，所述探針可以是酶底物或抑制劑。例如，所述探針可以是酶的底物或抑制劑，例如，但不局限于激酶，磷酸酶，蛋白酶，糖苷酶，乙?；?，和其他類(lèi)型的轉(zhuǎn)移酶。在將芯片上的蛋白與核酸或蛋白探針的組合物一起培養(yǎng)之后，可以鑒定結(jié)合的核酸或蛋白探針，例如，通過(guò)質(zhì)譜分析(Lakey等，1998，“測(cè)定蛋白-蛋白相互作用”，Curr Opin Struct Biol.8119-23)。
相應(yīng)地，可以通過(guò)用完整細(xì)胞檢測(cè)分析對(duì)與蛋白組芯片上的蛋白的相互作用的各種細(xì)胞反應(yīng)。例如，可以讓蛋白組芯片與淋巴細(xì)胞接觸，并且分析各種方法的淋巴細(xì)胞激活作用，包括，但不局限于檢測(cè)抗體合成，檢測(cè)或測(cè)定3H-胸苷的整合，用抗體標(biāo)記細(xì)胞表面分子，以便鑒定通過(guò)抗原識(shí)別和激活而誘導(dǎo)或抑制的分子(例如，CD23，CD38，IgD，C3b受體，IL-2受體，運(yùn)鐵蛋白受體，膜II型MHC分子，PCA-1分子，HLA-DR)，并且鑒定表達(dá)的和/或分泌的細(xì)胞因子。
在另一個(gè)例子中，可以通過(guò)與蛋白組芯片一起培養(yǎng)細(xì)胞確定一種特定細(xì)胞類(lèi)型的促細(xì)胞分裂劑。例如，可以通過(guò)檢測(cè)或測(cè)定細(xì)胞對(duì)3H-胸苷的整合測(cè)定有絲分裂活性。細(xì)胞可以具有相同的細(xì)胞類(lèi)型(即，一致的群體)或可以具有不同的細(xì)胞類(lèi)型。
在另一個(gè)例子中，可以通過(guò)與蛋白組芯片一起培養(yǎng)細(xì)胞測(cè)定特定細(xì)胞類(lèi)型的分化因子。例如，可以通過(guò)肉眼檢查，使用標(biāo)記專(zhuān)一性抗體檢測(cè)細(xì)胞表面分化標(biāo)記，或鑒定分泌的分化標(biāo)記確定細(xì)胞的分化。
在另一個(gè)例子中，可以通過(guò)與蛋白組芯片一起培養(yǎng)細(xì)胞測(cè)定特定細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞程序死亡因子。例如，可以通過(guò)肉眼檢查，使用標(biāo)記專(zhuān)一性抗體檢測(cè)細(xì)胞表面細(xì)胞程序死亡標(biāo)記，或鑒定分泌的標(biāo)記或釋放到培養(yǎng)基中的其他細(xì)胞成分分析細(xì)胞程序死亡。
在另一個(gè)例子中，可以通過(guò)與本發(fā)明的蛋白組芯片一起培養(yǎng)細(xì)胞分析細(xì)胞對(duì)蛋白組芯片上的蛋白的分泌反應(yīng)。例如，可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基中的釋放化合物分析分泌的蛋白和其他細(xì)胞化合物。
在另一個(gè)例子中，例如，可以通過(guò)與本發(fā)明的蛋白組芯片一起培養(yǎng)一種或多種細(xì)胞并且分析聚集作用，分析蛋白組芯片上的蛋白介導(dǎo)細(xì)胞聚集的能力。另外，舉例來(lái)說(shuō)，還可以通過(guò)與蛋白組芯片一起培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分，并且分析所述細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)成分與芯片上的蛋白的增強(qiáng)了的親和力，分析所述蛋白介導(dǎo)與細(xì)胞外基質(zhì)的親和力的能力。例如，通過(guò)這種分析方法確定的相互作用劑，可能在癌、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、突觸發(fā)生、樹(shù)狀生長(zhǎng)、加工延長(zhǎng)、或軸突延伸中發(fā)揮作用。
在另一個(gè)例子中，可以測(cè)定本發(fā)明蛋白組芯片的蛋白對(duì)離子轉(zhuǎn)運(yùn)，或其他小分子轉(zhuǎn)運(yùn)(例如ATP)的影響。例如，所述探針細(xì)胞可以是用放射性標(biāo)記過(guò)的離子或其他小分子預(yù)先加載的，并且與本發(fā)明的蛋白組芯片一起培養(yǎng)。可以在所述細(xì)胞與所述蛋白組陣列的細(xì)胞接觸的不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定放射性標(biāo)記的保留或釋放。另外，可以用本領(lǐng)域已知的電生理學(xué)技術(shù)檢測(cè)并且表征離子轉(zhuǎn)運(yùn)。
在另一個(gè)例子中，例如，可以通過(guò)與在芯片上具有放射性或熒光標(biāo)記的蛋白的蛋白組芯片一起培養(yǎng)細(xì)胞，并且測(cè)定蛋白組芯片上信號(hào)的增強(qiáng)或減弱，或測(cè)定所述細(xì)胞對(duì)標(biāo)記蛋白的攝取分析細(xì)胞對(duì)蛋白組芯片上的蛋白的攝取和/或加工。
另外，本發(fā)明的蛋白組芯片可以與細(xì)胞和感興趣的標(biāo)記過(guò)的化合物一起培養(yǎng)，以便檢測(cè)和/或測(cè)定所述細(xì)胞對(duì)所述化合物的攝取和/或加工。
還可以通過(guò)用諸如，但不局限于ATP，GTP，cAMP，磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，和磷酸蘇氨酸的小分子檢測(cè)，在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中分析小分子(即MW＜500的化合物＝與蛋白組芯片上的蛋白的相互作用。所述分析可以鑒定一個(gè)物種中能與感興趣的小分子相互作用的所有蛋白。感興趣的小分子可以包括，但不局限于藥物、藥物候選物、殺真菌劑、殺除草劑，殺蟲(chóng)劑，致癌劑和污染劑，被用作本發(fā)明方法的探針的小分子優(yōu)選是非蛋白有機(jī)化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)讓感興趣的受體與本發(fā)明的蛋白組芯片接觸，鑒定一個(gè)物種中特定配體或配體類(lèi)型的所有受體。另外，通過(guò)特定受體或感興趣的受體家族鑒定的一個(gè)物種的所有配體，可以通過(guò)讓感興趣的受體與本發(fā)明的蛋白組芯片接觸鑒定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)物種的能夠抑制或阻止特定受體-配體復(fù)合物形成的所有蛋白可以通過(guò)讓一種受體和它的配體與本發(fā)明的蛋白組芯片接觸，并且確定與在沒(méi)有所述芯片上的蛋白的條件下受體-配體相互作用的程度相比，受體-配體相互作用是否受到了抑制。受體-配體相互作用的檢測(cè)和配體相互作用劑的鑒定，可以用本領(lǐng)域已知方法完成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如，一個(gè)物種的所有激酶目標(biāo)可以用以下方法鑒定在存在標(biāo)記過(guò)的磷酸的條件下，讓激酶與本發(fā)明的蛋白組芯片接觸，用本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)磷酸化的相互作用劑。另外，一個(gè)物種的幾乎所有的激酶可以通過(guò)讓可以被磷酸化的底物與本發(fā)明的蛋白組芯片接觸，并且通過(guò)，例如，使用對(duì)磷酸化氨基酸專(zhuān)一的抗體分析磷酸化底物的存在和/或含量進(jìn)行鑒定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)讓激酶和它的底物與本發(fā)明的蛋白組芯片接觸，并且確定與在沒(méi)有所述芯片的蛋白的情況下的磷酸化水平相比所述底物的磷酸化是否減弱了，鑒定一個(gè)物種的幾乎所有激酶抑制劑。
激酶活性的檢測(cè)方法為本領(lǐng)域所公知，并且包括，但不局限于使用放射性標(biāo)記(例如，33P-ATP和35S-γ-ATP)或與磷酸氨基酸結(jié)合的熒光抗體探針標(biāo)記。
類(lèi)似地，可以進(jìn)行分析，以便鑒定一個(gè)物種的所有磷酸酶，和磷酸酶的抑制劑。例如，盡管整合到蛋白中的放射性標(biāo)記過(guò)的磷在一種測(cè)定中表示激酶活性，可以用另一種測(cè)定方法測(cè)定釋放到培養(yǎng)基中的放射性標(biāo)記過(guò)的磷，由它表示磷酸酶活性。
還可將本發(fā)明的蛋白組芯片用于區(qū)分不同的細(xì)胞類(lèi)型(區(qū)分它的形態(tài)或功能)，例如，通過(guò)讓蛋白組芯片與表示不同細(xì)胞群體的細(xì)胞或細(xì)胞提取物接觸，并且比較在所述蛋白組芯片上的蛋白-探針相互作用的形式。該方法還可用于表征，例如，不同的細(xì)胞周期階段，疾病狀態(tài)，改變了的生理學(xué)狀態(tài)(例如，缺氧)，在治療(例如，藥物治療)之前或之后的生理學(xué)狀態(tài)，代謝狀態(tài)，分化階段，發(fā)育階段，對(duì)環(huán)境刺激(例如，光、熱)的反應(yīng)，對(duì)環(huán)境毒素(例如，殺蟲(chóng)劑，除草劑，污染)的反應(yīng)，細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，細(xì)胞專(zhuān)一性蛋白表達(dá)，和疾病專(zhuān)一性蛋白表達(dá)。
蛋白-蛋白相互作用的發(fā)展特征，可用于表征與各個(gè)發(fā)育階段相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑、代謝途徑等，并且說(shuō)明發(fā)育階段之間的過(guò)渡。通過(guò)該研究獲得的大量信息可用于鑒定每個(gè)階段的藥物目標(biāo)，和/或在發(fā)病過(guò)程中制定治療方案。
本發(fā)明的蛋白組芯片可以與細(xì)胞提取物一起培養(yǎng)，以便表征特定的細(xì)胞類(lèi)型，對(duì)刺激的反應(yīng)，或生理學(xué)狀態(tài)。因此，在一種典型實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的蛋白組芯片與來(lái)自用一種化合物(例如，藥物)處理過(guò)的細(xì)胞，或來(lái)自細(xì)胞分化的特定階段的細(xì)胞(例如，多能細(xì)胞)，或來(lái)自特定代謝狀態(tài)的細(xì)胞(例如有絲分裂)的細(xì)胞提取物接觸，并且分析例如，激酶，蛋白酶，糖苷酶，乙?；福姿崦?，和/或其他轉(zhuǎn)移酶活性。
因此，蛋白組芯片上的蛋白-探針相互作用的形式，可以提供所述生物學(xué)狀態(tài)的“標(biāo)記”或“指紋”特征。例如，來(lái)自上述分析的結(jié)果比較了，例如，在有或沒(méi)有藥物的條件下的細(xì)胞，或在不同發(fā)育階段的細(xì)胞，或處在不同代謝狀態(tài)的細(xì)胞，這樣可以提供每一種狀態(tài)的標(biāo)記，并且可以提供有關(guān)所述細(xì)胞在不同條件下的生理學(xué)變化的信息。
很顯然，通過(guò)用多種探針(例如，已知的探針混合物，細(xì)胞提取物，亞細(xì)胞細(xì)胞器，細(xì)胞膜制劑，完整細(xì)胞等)篩選一個(gè)物種的蛋白組，所得到的蛋白-探針相互作用的分析可以構(gòu)成鑒定一種細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞、組織、器官或系統(tǒng)的生理學(xué)狀態(tài)的“指紋”或“標(biāo)記”的基礎(chǔ)。例如，所述信息可用于診斷、預(yù)測(cè)、藥物測(cè)試、和藥物發(fā)現(xiàn)。
相應(yīng)地，本發(fā)明的蛋白組芯片可用于確定藥物與該芯片上蛋白的相互作用。另外，本發(fā)明的蛋白組芯片可用于表征藥物與復(fù)合蛋白混合物的作用，例如，完整細(xì)胞，細(xì)胞提取物或組織勻漿物。例如，可以讓蛋白組芯片與復(fù)雜的蛋白混合物接觸，并且分析了在有或沒(méi)有藥物的情況下，蛋白混合物與芯片上蛋白的相互作用的改變。
因此，可以通過(guò)用藥物處理過(guò)的細(xì)胞、組織或提取物篩選一個(gè)或多個(gè)蛋白組芯片，分析一種藥物的凈作用(net effect)，然后可以提供所述藥物治療狀態(tài)的“標(biāo)記”，并且在與非治療狀態(tài)的“標(biāo)記”比較時(shí)，可以預(yù)測(cè)有關(guān)例如，效力、毒性和副作用的結(jié)果。另外，例如，通過(guò)將所述藥物添加到所述細(xì)胞、細(xì)胞提取物、組織勻漿物或完整生物體中，并且將在不同的處理時(shí)間點(diǎn)制備的藥物處理過(guò)的細(xì)胞或提取物涂敷到蛋白組芯片上，可以分析一種藥物的時(shí)間決定型作用。所述分析可用于疾病的診斷或預(yù)測(cè)。
具體地講，本發(fā)明的蛋白組芯片可用于表征一種藥物的作用模式，確定藥物專(zhuān)一性，預(yù)測(cè)藥物毒性，并且用于藥物發(fā)現(xiàn)。例如，與一種藥物結(jié)合的蛋白的身份，及其相對(duì)親和力可以通過(guò)以下方法測(cè)定在不同的測(cè)定條件下，讓一種藥物或藥物候選物與蛋白組芯片一起培養(yǎng)，通過(guò)確定藥物是否結(jié)合在所述陣列上確定藥物專(zhuān)一性，并且測(cè)定每一種不同的蛋白結(jié)合的藥物的數(shù)量。
本發(fā)明的蛋白組芯片可用于確定疾病狀態(tài)，例如，包括讓蛋白組芯片與病變細(xì)胞，來(lái)自病變組織的細(xì)胞提取物或組織勻漿物，或來(lái)自患有疾病的患者的體液接觸，并且比較患者和健康對(duì)照的蛋白組芯片上的蛋白-探針相互作用的形式。所述分析可以提供所述病變狀態(tài)的“標(biāo)志”，并且在與健康狀態(tài)的“標(biāo)志”比較時(shí)，可以預(yù)測(cè)相對(duì)所述疾病診斷或預(yù)測(cè)的結(jié)果。另外，例如，可以通過(guò)在所述蛋白組芯片上分析不同發(fā)病階段的生物學(xué)制劑，表征一種疾病的階段。
還可以在相同的蛋白組芯片，或相同的第二個(gè)芯片上進(jìn)行生物學(xué)活性的生物學(xué)測(cè)定，而不是結(jié)合測(cè)定。因此，使用本發(fā)明蛋白組芯片的所述類(lèi)型的測(cè)定方法可用于研究藥物專(zhuān)一性，預(yù)測(cè)藥物的潛在副作用，并且對(duì)藥物進(jìn)行分類(lèi)。
另外，本發(fā)明的蛋白組芯片適用于篩選藥物候選物的復(fù)雜的文庫(kù)。具體地講，所述芯片上的蛋白可以與藥物候選物文庫(kù)一起培養(yǎng)，然后，可以鑒定結(jié)合的成分，例如，通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定，這樣可以同時(shí)鑒定優(yōu)先與特殊的蛋白亞型結(jié)合，或與所述芯片上的若干種蛋白結(jié)合的所有文庫(kù)成分。另外，可以確定所述陣列上不同蛋白的藥物候選物的相對(duì)親和力。
另外，可以在存在潛在的抑制劑、催化劑、調(diào)節(jié)劑、或觀察的相互作用的增強(qiáng)劑、酶促活性、或生物學(xué)反應(yīng)的條件下，檢測(cè)本發(fā)明的蛋白組芯片。使用本發(fā)明的蛋白組芯片，所述策略性篩選可以鑒定在一個(gè)物種中表達(dá)的蛋白，所述蛋白，例如，能抑制藥物的結(jié)合，抑制病毒感染，具有抑菌活性，具有抗真菌活性，緩解寄生蟲(chóng)感染，或特殊類(lèi)型蛋白的生理學(xué)效應(yīng)物。
可以用本發(fā)明的蛋白組芯片進(jìn)行酶促反應(yīng)，并且測(cè)定酶促活性。在一種具體實(shí)施方案中，可以鑒定能調(diào)節(jié)芯片上蛋白的酶促活性的化合物，例如，可以通過(guò)將一種化合物或化合物的混合物與酶促反應(yīng)混合物一起培養(yǎng)，以便產(chǎn)生一種信號(hào)(例如，在酶促活性作用下底物會(huì)發(fā)出熒光)，檢測(cè)并且定量酶促活性水平的改變?？梢员碚髟谟泻蜎](méi)有測(cè)試化合物的條件下的差異。另外，可以通過(guò)比較對(duì)蛋白組芯片內(nèi)的樣品的相對(duì)作用和芯片之間的相對(duì)作用檢測(cè)化合物對(duì)酶促活性影響的差異。
使用本發(fā)明的蛋白組芯片的多種方法可用于確定各種蛋白的物理和功能特征。例如，可以通過(guò)用抗體檢測(cè)將所述蛋白組芯片用于評(píng)估蛋白的存在和存在的數(shù)量。所述蛋白可以用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)分析方法檢測(cè)，如發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、熒光、化學(xué)熒光、或質(zhì)譜分析。例如，針對(duì)感興趣的蛋白的一級(jí)抗體可以由熒光標(biāo)記的二級(jí)抗體識(shí)別，然后用一種儀器(例如，分子動(dòng)態(tài)掃描器(Molecular Dynamics scanner))測(cè)定，該儀器能用一個(gè)光源激發(fā)熒光產(chǎn)物，并且隨后檢測(cè)熒光。為了獲得更高的靈敏度，針對(duì)感興趣的蛋白的一級(jí)抗體是由與諸如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗體識(shí)別的。在存在發(fā)光底物(例如化學(xué)發(fā)光)或產(chǎn)熒光底物(例如化學(xué)熒光)的條件下，酶促裂解產(chǎn)生了強(qiáng)的發(fā)光或熒光產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以通過(guò)使用，例如，分子動(dòng)態(tài)掃描器檢測(cè)和定量。另外，可以用堿性磷酸酶結(jié)合的或辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的三級(jí)抗體放大熒光標(biāo)記的二級(jí)抗體的信號(hào)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白組芯片可以用針對(duì)一個(gè)物種的已知蛋白的抗體檢測(cè)，以便可以鑒定另一個(gè)物種的蛋白組中具有識(shí)別表位的同源蛋白?？梢垣@得相互作用劑的相同物種的同系物，例如，通過(guò)使用所述同源蛋白的DNA序列信號(hào)鑒定其他物種中的同系物。在具體實(shí)施方案中，所述抗體是針對(duì)細(xì)胞周期蛋白，激酶，GST，Clb5，Cla4，Ste20，Cdc42，PI(3，4)P2，PI(4)P，SPA2，CLB1，CLB2或Cdc11的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的含有第一個(gè)物種的本發(fā)明的蛋白組芯片可以用來(lái)自第二個(gè)物種的蛋白檢測(cè)，以便鑒定相互作用劑。然后可以鑒定并且表征來(lái)自第一個(gè)物種的相互作用劑在第二個(gè)物種中的同系物，例如，通過(guò)核苷酸序列分析進(jìn)行。因此，當(dāng)所述蛋白組不能用于特定的物種時(shí)，該方法可用于尋找能與感興趣的蛋白相互作用的相同種類(lèi)的蛋白。
本發(fā)明的蛋白組芯片可用于鑒定存在于一個(gè)物種中的每一種酶的該物種中的幾乎所有的底物。因此，可以在本發(fā)明的蛋白芯片上鑒定蛋白激酶，磷酸酶，蛋白酶，糖苷酶，乙?；富蚱渌鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移酶的底物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法(例如質(zhì)譜分析，針對(duì)肽片段的熒光標(biāo)記的抗體，或來(lái)自熒光標(biāo)記的底物的熒光信號(hào)的消失)通過(guò)鑒定由蛋白酶活性產(chǎn)生的并且釋放到培養(yǎng)基中的肽片段檢測(cè)蛋白酶活性。因此，可以通過(guò)若干種方法，使用任何檢測(cè)方式，方便地分析基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶的活性，這些方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解。
本發(fā)明的蛋白組芯片可用于鑒定任何化合物在一個(gè)物種中幾乎所有的結(jié)合蛋白。因此，可以將蛋白組芯片用于鑒定和表征能結(jié)合，例如，激酶，蛋白酶，激素，DNA，RNA，磷酸酶，蛋白酶，糖苷酶，乙?；?，或其他基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶的幾乎所有蛋白。因此，所述芯片可以用一種探針檢測(cè)，并且分析蛋白-探針相互作用和/或分析需要的活性。例如，如果RNA結(jié)合是感興趣的活性的話，用RNA檢測(cè)所述蛋白組芯片，并且鑒定蛋白-RNA復(fù)合物。
例如，本發(fā)明的蛋白組芯片可用于鑒定一個(gè)物種的能與膜相關(guān)蛋白或其他膜相關(guān)化合物結(jié)合的幾乎所有蛋白，包括讓所述芯片與諸如完整細(xì)胞、質(zhì)膜制劑、膜小泡、或含有感興趣的膜成分的脂質(zhì)體接觸，并且檢測(cè)蛋白-探針相互作用。在一種具體實(shí)施方案中，所述探針是含有一種或多種感興趣的磷脂的脂質(zhì)體形式的。所述蛋白-探針相互作用，可以用本領(lǐng)域已知技術(shù)檢測(cè)。所述相互作用劑和/或探針的身份可以用本領(lǐng)域已知技術(shù)確定。另外，還可以用本領(lǐng)域已知技術(shù)檢測(cè)生物學(xué)活性(例如，酶活性，細(xì)胞活化)。
被用作恢復(fù)或非恢復(fù)患者的免疫反應(yīng)的抗原的來(lái)自病原體的靶蛋白(例如，傳染性致病劑，如病毒、細(xì)菌、真菌、或寄生物)或來(lái)自其他異常細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞，病變細(xì)胞或受損細(xì)胞)的靶蛋白的身份，可以使用本發(fā)明的蛋白組芯片確定。例如，從患者體內(nèi)分離的淋巴細(xì)胞可用于篩選包括所有病原體蛋白的芯片。一般，所述篩選包括讓一個(gè)蛋白組芯片與多種淋巴細(xì)胞接觸，其中，所述蛋白組芯片上的蛋白包括多種潛在的抗原，并且檢測(cè)在所述芯片上出現(xiàn)淋巴細(xì)胞激活作用的位置。在一種具體實(shí)施方案中，讓淋巴細(xì)胞與蛋白組芯片上的病原體蛋白接觸，然后分析抗原或抗原組合物對(duì)B細(xì)胞或T細(xì)胞的激活作用，以便鑒定來(lái)自一種病原體的靶抗原。
另外，本發(fā)明的蛋白組芯片可用于表征免疫反應(yīng)，例如，通過(guò)用患者的淋巴細(xì)胞篩選傳染性生物體的蛋白組，以便鑒定患者B細(xì)胞和/或T細(xì)胞的目標(biāo)。例如，B細(xì)胞可以與本發(fā)明的蛋白組芯片一起培養(yǎng)，以便鑒定體液型免疫的抗原性目標(biāo)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的蛋白組芯片用于檢測(cè)并且表征自身免疫性或?qū)е逻^(guò)敏的蛋白的物質(zhì)。例如，可以用患者的淋巴細(xì)胞或患者的循環(huán)抗體篩選人類(lèi)蛋白的蛋白組，以便鑒定患者B細(xì)胞和/或T細(xì)胞的目標(biāo)。所述篩選可以表征自身免疫性或過(guò)敏反應(yīng)，并且鑒定潛在的目標(biāo)藥物候選物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的蛋白組芯片用于鑒定能夠激活B細(xì)胞和/或T細(xì)胞的物質(zhì)。例如，讓淋巴細(xì)胞與蛋白組芯片接觸，并且分析淋巴細(xì)胞的激活，以便鑒定具有激活B細(xì)胞或T細(xì)胞或淋巴細(xì)胞亞群體(例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞)的一般能力的物質(zhì)。
可以通過(guò)各種方法分析由抗原識(shí)別誘導(dǎo)的B-細(xì)胞激活作用，所述方法包括，但不局限于檢測(cè)或測(cè)定抗體合成，3H-胸苷的整合，標(biāo)記過(guò)的抗體與新表達(dá)的或受到抑制的細(xì)胞表面分子的結(jié)合，以及表示B細(xì)胞激活的因子(例如，細(xì)胞因子)的分泌。類(lèi)似地，使用本發(fā)明的蛋白芯片篩選的T細(xì)胞激活作用，可以通過(guò)各種分析方法確定。例如，鉻(51Cr)釋放分析，可以檢測(cè)抗原的識(shí)別以及隨后的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活(例如，參見(jiàn)Palladino等，1987，Cancer Res.475074-9；Blachere等，1993，J.Immunotherapy 14352-6)。
可以通過(guò)使用本發(fā)明的蛋白組芯片確定抗體制劑的專(zhuān)一性，包括讓所述芯片與一種抗體制劑接觸，并且檢測(cè)在固體支持物上發(fā)生與抗體制劑中的抗體結(jié)合的位置。所述抗體制劑可以是，但不局限于Fab片段，抗血清，和多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體，人源化抗體或合成抗體。在一個(gè)例子中，用單克隆抗體檢測(cè)蛋白組芯片，以便表征它的結(jié)合強(qiáng)度和/或它的專(zhuān)一性。在具體實(shí)施方案中，所述抗體是針對(duì)細(xì)胞周期蛋白，激酶，GST，Clb5，Cla4，Ste20，Cdc42，PI(3，4)P2，PI(4)P，SPA2，CLB1，CLB2或Cdc11的。
本發(fā)明的蛋白組芯片可用于鑒定能結(jié)合感興趣的特定生物學(xué)分子的蛋白，包括，但不局限于潛在配體分子的受體，病毒受體，和孤兒受體的配體。
所述蛋白組芯片還可用于檢測(cè)DNA或RNA與所述芯片上的蛋白的結(jié)合，并且用于評(píng)估結(jié)合專(zhuān)一性和強(qiáng)度。所述DNA可以是單鏈或雙鏈的。所述RNA可以是mRNA，hnRNA，polyA+RNA或總RNA。
本發(fā)明的蛋白組芯片可用于鑒定進(jìn)行過(guò)翻譯后修飾的蛋白?？梢杂帽景l(fā)明的方法檢測(cè)的翻譯后修飾包括，但不局限于甲基化，乙?；?，法尼化，生物素化，硬脂?；?，甲?；?，硫辛酸，肉豆蔻?；?，棕櫚酰化，香葉基香葉酸化，聚乙二醇化，磷酸化，磷酸化，糖基化，糖修飾，脂化，脂修飾，遍在化，sumolation，二硫鍵，半胱氨酸化，氧化，谷胱甘肽化，焦谷氨酸，羧基化和脫氨基化。另外，還可以用戊糖，己胺，N-乙酰己胺，脫氧基己糖，己糖和唾液酸對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸檢測(cè)本發(fā)明的蛋白組芯片，以便鑒定磷酸化相互作用劑。在另一個(gè)例子中，可以用凝集素(例如，小麥胚凝集素)檢測(cè)本發(fā)明的蛋白組芯片，以便鑒定糖基化相互作用劑(例如，N-乙酰葡糖胺)?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知方法檢測(cè)磷酸化或糖基化相互作用劑。
本發(fā)明的蛋白組芯片還可用于鑒定和表征在功能、配體結(jié)合或酶促活性方面表現(xiàn)出差別的蛋白同種型。在一種具體實(shí)施方案中，，本發(fā)明的蛋白組芯片被用于通過(guò)評(píng)估其彼此之間的相對(duì)活性，表征來(lái)自不同等位基因的蛋白同種型的不同的結(jié)合親和力。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用本發(fā)明的蛋白組芯片確定共有序列。例如，在用一種結(jié)合劑(它可以來(lái)自不同于芯片上的蛋白的物種的物種)篩選蛋白組芯片，可以比對(duì)相互作用劑的氨基酸序列，以便構(gòu)建相互作用結(jié)構(gòu)域的共有序列。例如，所述信息可用于設(shè)計(jì)結(jié)合劑-相互作用劑相互作用的抑制劑，或用于設(shè)計(jì)特定相互作用劑或相互作用劑的類(lèi)型的新的和/或改進(jìn)的結(jié)合劑。
在一種具體實(shí)施方案中，鈣調(diào)蛋白-結(jié)合蛋白的共有序列是通過(guò)用鈣調(diào)蛋白篩選蛋白組芯片確定的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鈣調(diào)蛋白-結(jié)合蛋白的共有序列包括以下氨基酸序列I/L-Q-X-K-K/X-G-B(SEQ IDNO1)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鈣調(diào)蛋白-結(jié)合蛋白的共有序列包括以下氨基酸序列I/L-Q-X-K-K/X-G-B(SEQ ID NO1)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鈣調(diào)蛋白-結(jié)合蛋白的共有序列包括以下氨基酸序列I/L-Q-X-K-K/X-G-B(SEQID NO1)，并且其長(zhǎng)度小于10，15，30，50或100個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明的蛋白組芯片還可用于鑒定一類(lèi)潛在的抗細(xì)菌、抗真菌、抗寄生蟲(chóng)或抗病毒化合物。例如，可以讓細(xì)菌、真菌、寄生物或病毒的細(xì)胞裂解物或其他制劑與蛋白組陣列接觸，并且檢測(cè)和鑒定蛋白-探針相互作用。另外，通過(guò)比較從傳染階段和非傳染階段的傳染性生物體中獲得的相互作用形式，可以鑒定與有關(guān)宿主的感染相關(guān)的相互作用。
可以通過(guò)將一個(gè)文庫(kù)與本發(fā)明的蛋白組芯片一起培養(yǎng)，實(shí)施噬菌體展示文庫(kù)的篩選。與所述芯片上的蛋白結(jié)合的克隆的檢測(cè)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)行(例如，質(zhì)譜分析)，以便確定感興趣的克隆。然后，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法確定編碼感興趣的克隆的DNA(例如，參見(jiàn)Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184177-86；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24952-8；Persic等，1997，Gene 1879-18)。這樣，可將所述芯片用于篩選具有能結(jié)合所述芯片上的特殊蛋白的表面成分的細(xì)胞。
5.5試劑盒本發(fā)明還提供了用于實(shí)施本發(fā)明分析方案的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括本發(fā)明的一種或多種蛋白組芯片。所述試劑盒還可以在一個(gè)或多個(gè)容器中包括用于分析蛋白或分子的生物學(xué)活性的試劑，用于分析蛋白-探針相互作用的試劑，和/或一種或多種探針、蛋白或其他分子。所述用于分析蛋白或其他分子的生物學(xué)活性，或分析探針和蛋白或其他分子之間的相互作用的試劑可以添加在所述探針上，結(jié)合在蛋白組芯片上，或者容納在蛋白組芯片的一個(gè)或多個(gè)孔中。所述試劑可以是溶液或固體形式的。所述試劑可以包括進(jìn)行感興趣的分析所需要的蛋白或其他分子和探針。
所述蛋白組芯片的蛋白可以結(jié)合在平的固體支持物的表面上，容納在固體支持物的孔中，或結(jié)合在固體支持物上的孔的表面上。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒中的蛋白組芯片具有業(yè)已結(jié)合在固體支持物上的蛋白和/或探針。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒中的蛋白組芯片具有可用于分析蛋白或其他分子的生物學(xué)活性，或用于分析探針和蛋白或業(yè)已結(jié)合在固體支持物上的孔上的其他分子的相互作用的試劑或反應(yīng)混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑不與固體支持物的孔結(jié)合，而是容納在所述孔中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑不與固體支持物的孔結(jié)合，而是容納在一個(gè)或多個(gè)容器中，并且可以添加到所述固體支持物的孔中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括一個(gè)或多個(gè)裝有用于分析蛋白或分子的生物學(xué)活性的溶液反應(yīng)混合物的容器。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒提供了一種基質(zhì)(例如，珠)，感興趣的蛋白或分子，和/或用于進(jìn)行一種或多種分析的其他試劑，可以與所述基質(zhì)結(jié)合，然后，可以將具有結(jié)合的探針、蛋白、或其他試劑的基質(zhì)放入芯片的孔中。
5.6陽(yáng)性鑒定算法(positive identification algorithm)的設(shè)計(jì)。
本發(fā)明還提供了一種用于鑒定一種信號(hào)是否是陽(yáng)性的方法。信號(hào)可以是任何可檢測(cè)形式的，包括，但不局限于可見(jiàn)光，紫外線輻射，紅外線輻射，X射線，熒光和比色觀察。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，信號(hào)是通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)的。
另外，信號(hào)可以是任何排列的，并且是任何物理形式的，例如，但不局限于陣列，印跡，凝膠和篩網(wǎng)。信號(hào)優(yōu)選是靜態(tài)排列的斑點(diǎn)。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，信號(hào)是通過(guò)熒光產(chǎn)生的，并且在一個(gè)陣列上排列成格柵形式。這樣，就可以給信號(hào)確定一個(gè)相對(duì)行和列的位置坐標(biāo)。所述行和列可以具有任何寬度。
過(guò)濾信號(hào)的第一個(gè)步驟是計(jì)算每一個(gè)斑點(diǎn)的局部主要信號(hào)和背景信號(hào)。所述局部主要信號(hào)是由實(shí)際斑點(diǎn)發(fā)射的，而所述局部背景信號(hào)是由緊靠所述斑點(diǎn)周?chē)倪吔绮课话l(fā)射的。將凈信號(hào)(它是局部主要信號(hào)-局部背景信號(hào))用于所有進(jìn)一步的計(jì)算。所述局部主要信號(hào)和背景信號(hào)可以通過(guò)諸如GENEPIXTM的軟件確定。
不過(guò)，芯片之間的差異——它體現(xiàn)了，例如，不同的脂結(jié)合實(shí)驗(yàn)和芯片上的局部波動(dòng)(例如，由于基質(zhì)的不均等的擴(kuò)散)可能導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度的進(jìn)一步波動(dòng)，導(dǎo)致了不同芯片的不同的凈信號(hào)分布。為了糾正芯片之間的波動(dòng)，來(lái)自不同芯片的凈信號(hào)需要標(biāo)度至一個(gè)共同的范圍。選擇若干個(gè)芯片中的一個(gè)作為參考芯片，并且其目標(biāo)是將每一個(gè)芯片的凈信號(hào)分布標(biāo)度成所述參考芯片的凈信號(hào)分布的范圍和形狀。
例如，可以計(jì)算每一個(gè)芯片的凈信號(hào)分布的下部1/4，中間1/4和上部1/4的值。然后，對(duì)于每一個(gè)芯片來(lái)說(shuō)，從每一個(gè)斑點(diǎn)的凈信號(hào)中扣除所述中間凈信號(hào)。另外，計(jì)算了每一個(gè)芯片的標(biāo)度系數(shù)，它等于特定芯片的上部1/4和下部1/4之間的差和參考芯片的上部1/4和下部1/4之間的差的比例。這表明所述參考芯片的標(biāo)度系數(shù)等于1。然后，用所述芯片專(zhuān)一性標(biāo)度系數(shù)乘以每一個(gè)芯片的凈標(biāo)度信號(hào)，以便計(jì)算標(biāo)度的凈信號(hào)。
為了校正一個(gè)陣列上的局部波動(dòng)，可以對(duì)每一個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行“鄰居扣除(neighborhood subtraction)”。例如，相鄰部位可以被定義為一個(gè)信號(hào)斑點(diǎn)的上下兩行和左右兩列之間的區(qū)域。然后從該斑點(diǎn)信號(hào)中扣除所述中間信號(hào)，以便計(jì)算相對(duì)該斑點(diǎn)的相鄰部位的剩余信號(hào)。在任何相鄰區(qū)的具有高信號(hào)強(qiáng)度的斑點(diǎn)的數(shù)量都足夠少，以便所述中間值不會(huì)顯著影響，并且能很好地體現(xiàn)相鄰區(qū)的背景信號(hào)。
對(duì)標(biāo)度的凈信號(hào)實(shí)施相鄰扣除產(chǎn)生了標(biāo)度的多余信號(hào)(scaledexcess signals)。在隨后的步驟中，比較了平行樣品的標(biāo)度的剩余信號(hào)。如果兩個(gè)平行樣品的標(biāo)度剩余信號(hào)的平均值和平行樣品之一的標(biāo)度剩余信號(hào)的差，大于所述標(biāo)度剩余信號(hào)誤差的標(biāo)準(zhǔn)差3倍以上的話，所述斑點(diǎn)就屬于以上兩個(gè)平行樣品，并且被排除在進(jìn)一步分析之外。然后將其余的斑點(diǎn)和它們的標(biāo)度剩余信號(hào)提供在過(guò)濾信號(hào)組中。
可以按以下方法計(jì)算所述標(biāo)度剩余信號(hào)的誤差及其標(biāo)準(zhǔn)差的分布。對(duì)整套的平行樣品進(jìn)行線性回歸，以便確定平行樣品之間的總體線性關(guān)系。然后可以計(jì)算每一個(gè)平行樣品的誤差值εG＝|G2-Gm|，其中，G1和G2表示兩個(gè)平行樣品的兩個(gè)標(biāo)度的剩余信號(hào)。
Gm＝(G1+G2)/2，而函數(shù)f(G1)＝a*G2+b是兩個(gè)平行樣品G1和G2之間的總體線性關(guān)系，參數(shù)a和b是通過(guò)線性回歸確定的。
整套的誤差值是所有平行樣品的一套誤差值，并且表示標(biāo)度的剩余信號(hào)的誤差值的分布。然后可以計(jì)算該分布的標(biāo)準(zhǔn)差。
最后，如果一對(duì)平行樣品的過(guò)濾信號(hào)的平均值比標(biāo)度的剩余值的誤差的高3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的話，就認(rèn)為這一對(duì)平行樣品是陽(yáng)性的(注意，該閾值獨(dú)立于確定平行樣品是否應(yīng)當(dāng)被排除在過(guò)濾信號(hào)組之外的閾值)。
在所述過(guò)濾過(guò)程之后，用GST信號(hào)(R)將過(guò)濾的信號(hào)(G)統(tǒng)一化(normalized)，得到了比例r＝G/R，該比例可以衡量單位數(shù)量蛋白的結(jié)合，并可以比較不同蛋白的結(jié)合信號(hào)。所述特定的結(jié)合比例r對(duì)于G和R信號(hào)的誤差εG和εR敏感。使用Monte-Carlo方法，可以計(jì)算該比例的90％和95％的置信間隔。R值的誤差eG與εG和εR相關(guān)r+εR＝(G+εG)/(R+εR)其中，εR表示比例r的誤差。
對(duì)于Monte Carlo方法來(lái)說(shuō)，εG和εR的分布必須是已知的。εG的分布可以按上述方法計(jì)算。εR的分布可以按計(jì)算εG的相同方法計(jì)算，使用平行樣品的GST信號(hào)對(duì)作為輸入數(shù)據(jù)。
Monte Carlo方法如下為了確定r+εR的置信度間距，需要計(jì)算r+eR的隨機(jī)樣品群體。所述樣品可能來(lái)自εG和εR的隨機(jī)樣品?？梢园匆韵路椒ㄓ?jì)算εG的隨機(jī)樣品。用標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器計(jì)算在0和1之間均勻分布的隨機(jī)數(shù)字的樣品。通過(guò)εG的分布，用標(biāo)準(zhǔn)方法確定eG的逆累計(jì)分布函數(shù)。用隨機(jī)數(shù)字的樣品作為該函數(shù)的自變量產(chǎn)生了εG的一組隨機(jī)樣品。同樣，可以計(jì)算εG的一組隨機(jī)樣品。這些εG和εR的隨機(jī)樣品可以組合成公式r+εR＝(G+εG)/(R+εR)，以便產(chǎn)生r+εR的一群隨機(jī)樣品的群體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于確定一種信號(hào)是否是陽(yáng)性的方法，包括以下步驟確定每一個(gè)局部斑點(diǎn)的主要信號(hào)和背景信號(hào)，并且確定來(lái)自這兩種信號(hào)的差的凈信號(hào)，確定第一和第二凈信號(hào)分布的下部1/4、中間和上部1/4值，從第一凈信號(hào)分布中扣除第一中間值，并且從第二凈信號(hào)分布中扣除第二中間值，以便分別獲得第一和第二扣除值，用所述第一信號(hào)分布的上部和下部1/4值的差除所述第一扣除值，并且用所述上部和下部1/4值除所述第二標(biāo)度值，以便分別獲得第一和第二標(biāo)度值，計(jì)算相鄰區(qū)的標(biāo)度信號(hào)分布的中間值，其中，所述相鄰區(qū)包括在所述部位的多個(gè)位點(diǎn)；從標(biāo)度信號(hào)中扣除局部中間值，以便獲得標(biāo)度的剩余值；并且如果所述樣品值之一和它的平行值的差，超過(guò)所述標(biāo)度的剩余值誤差的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的話，就將標(biāo)度剩余值的平行樣品排除在外。
可以利用過(guò)濾值確定一種信號(hào)是否是陽(yáng)性的。如果平行樣品的過(guò)濾值的平均值大于標(biāo)度剩余值誤差的標(biāo)準(zhǔn)差3倍的話，該平行樣品就被稱(chēng)為“陽(yáng)性的”?？梢杂靡韵鹿綄⑦^(guò)濾的陽(yáng)性信號(hào)統(tǒng)一化r＝G/R，其中，G是過(guò)濾值，R是GST信號(hào)，而r表示單位數(shù)量蛋白的信號(hào)，可以對(duì)不同斑點(diǎn)的信號(hào)進(jìn)行比較。比例r對(duì)G和R的誤差敏感。該敏感性可以通過(guò)計(jì)算r+εr＝G+εG/R+εR的置信度間隔評(píng)估。
εG是G的誤差，εR是R的誤差，而εr是r的誤差。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，陽(yáng)性信號(hào)表示蛋白-探針相互作用。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，相鄰區(qū)位于有關(guān)信號(hào)上面兩行，下面兩行，左面兩列和右面兩列。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，將兩個(gè)平行樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)排除在進(jìn)一步分析之外，其中，所述樣品的標(biāo)度剩余信號(hào)及其平均值之間的差，超過(guò)標(biāo)度剩余信號(hào)誤差3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。如果數(shù)據(jù)點(diǎn)明顯不真實(shí)的話，就將所述數(shù)據(jù)點(diǎn)排除在外。
6.實(shí)施例用高處理量技術(shù)制備了來(lái)自芽殖酵母的超過(guò)5800種蛋白的特定組合，并且篩選了多種活性，包括蛋白-蛋白，蛋白-DNA，蛋白-RNA和蛋白-脂質(zhì)體相互作用。鑒定了大量的新的活性，提供了有關(guān)已知的和以前未表征過(guò)的基因的新的信息。
為了便于研究酵母蛋白組，克隆并且超量表達(dá)了5800種開(kāi)放讀框，并且純化了相應(yīng)的蛋白。將所述蛋白以高空間密度的方式印刷在載玻片上，以便形成酵母蛋白組芯片微陣列，并且篩選其與蛋白和磷脂相互作用的能力。鑒定了多種新型鈣調(diào)蛋白和磷脂-相互作用蛋白；鑒定了多種鈣調(diào)蛋白-結(jié)合蛋白的共同的潛在結(jié)合基序。所述研究證實(shí)了可以制備整個(gè)真核生物基因組的微陣列，并且篩選大量的生物化學(xué)活性，導(dǎo)致了多種新型蛋白功能/相互作用的鑒定。還可以篩選所述微陣列，以便檢測(cè)蛋白翻譯后修飾。
6.1酵母培養(yǎng)物制備1.用96-叉子將在-80℃下保存96孔平板上的酵母甘油原種接種到URA瓊脂平板上(Omni，USA)。
2.在30℃下讓所述培養(yǎng)物在瓊脂上生長(zhǎng)48小時(shí)，并且可以觀察到可見(jiàn)菌落(直徑2mm)。
3.用96-叉子將來(lái)自瓊脂平板的酵母細(xì)胞接種到96孔2毫升盒子中，其中，每一個(gè)孔容納有300μl URA-/棉子糖液體培養(yǎng)基和一個(gè)直徑2毫升的玻璃球，它有助于均勻生長(zhǎng)。
4.在30℃下劇烈搖晃(300rpm)培養(yǎng)16小時(shí)使O.D.600達(dá)到4.0之后，將15μl相同的菌株接種到在4個(gè)不同盒子中的750μl的URA-/棉子糖液體培養(yǎng)基中，以便獲得3毫升培養(yǎng)物。同樣，每一個(gè)孔裝有相同的玻璃球，以便實(shí)現(xiàn)通氣和均勻生長(zhǎng)。所述細(xì)胞是在30℃下劇烈搖晃生長(zhǎng)的。
5.在生長(zhǎng)12-16小時(shí)之后，所述培養(yǎng)物的O.D.600應(yīng)當(dāng)達(dá)到0.6-0.8。如果OD超過(guò)1.0的話，就將培養(yǎng)物扔掉。使用自動(dòng)液體處理裝置(Q-Fill，Genetix，UK)將40％半乳糖母液添加到每一個(gè)孔中，達(dá)到2％的最終濃度，以便誘導(dǎo)細(xì)胞。在30℃下?lián)u晃誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物4小時(shí)。
6.通過(guò)以3000rpm的速度離心2-10分鐘收獲所述細(xì)胞，并且通過(guò)渦旋攪拌，將細(xì)胞沉淀重新懸浮在100-1000微升的冷水中。然后將來(lái)自4個(gè)孔的相同的菌株合并到一個(gè)孔中。通過(guò)離心收集細(xì)胞，并且重新懸浮在100-1500微升放置在冰上的不含蛋白酶抑制劑的冷的裂解緩沖液中。通過(guò)短時(shí)間的離心收集收獲的細(xì)胞，并且扔掉裂解緩沖液。洗滌過(guò)的半干燥培養(yǎng)物馬上保存在-80℃的冰箱中。該培養(yǎng)物可以保持?jǐn)?shù)周時(shí)間。
6.2以96孔方式純化蛋白1.將96孔盒子中的冰凍培養(yǎng)物從-80℃轉(zhuǎn)移到冰上，并且將10-300μl鋯珠(直徑0.5mm，購(gòu)自BSP，德國(guó))添加到每一個(gè)孔中。當(dāng)所述培養(yǎng)物仍然冰凍時(shí)，添加新鮮蛋白酶抑制劑的100-500μl裂解緩沖液。用蓋墊密封每一個(gè)孔。在冰上解凍所述培養(yǎng)物5-25分鐘之后，在冰上對(duì)96孔盒子中的細(xì)胞進(jìn)行渦旋攪拌3-6次，每次20-60秒，間隔1-5分鐘。為了有效裂解酵母細(xì)胞壁，并且一次處理多個(gè)平板，用顏料振蕩器(HARBILTM5G HD，36kg容量，可調(diào)壓力和振動(dòng)時(shí)間，固體速度為每分鐘200次)劇烈攪拌所述樣品。
2.在以3000rpm的速度離心2-10分鐘之后，用廣口吸頭(Fisher，USA)收集上清液，并且轉(zhuǎn)移到96孔過(guò)濾平板(Whatman，USA；Whatman UNIFILTERTM，產(chǎn)品目錄號(hào)7700-1801，具有800μl孔容量的親水性PVDF濾膜)上，該平板放置在96孔盒子的頂部。
3.為了獲得更多的蛋白，將含有新的蛋白酶抑制劑的100-500μl裂解緩沖液添加細(xì)胞碎片中，并且重復(fù)步驟1和2。
4.合并細(xì)胞裂解液，并且在3000rpm的速度下，用10-30分鐘時(shí)間通過(guò)所述過(guò)濾平板離心進(jìn)入冷的、并且干凈的96孔盒子中。每一個(gè)孔中的過(guò)濾裂解液的體積大致為200-1000μl。
5.同時(shí)，用不含蛋白酶抑制劑的冷的裂解緩沖液洗滌所需數(shù)量的谷胱甘肽珠(大體上為每個(gè)樣品10-50μl的珠)(Amersham，USA)4次，并最終懸浮在5倍于它的原始體積的含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中。
6.將100μl洗滌過(guò)的谷胱甘肽珠添加到每一個(gè)孔中，并且用蓋墊緊密密封。將所述珠與裂解液一起放在轉(zhuǎn)鼓上，在4℃下培養(yǎng)1小時(shí)。為了獲得最佳混合，讓所述盒子在轉(zhuǎn)鼓上旋轉(zhuǎn)360度。
7.通過(guò)以3000rpm的速度離心10-60秒收集所述珠，并且扔掉上清液。用200-800μl的含有蛋白酶抑制劑的緩沖液I洗滌所述珠1次，并且用不含抑制劑的緩沖液洗滌2次。
8.然后用200-800μl洗滌緩沖液II洗滌所述珠3次。在完全除去緩沖液之后，將20-50μl洗脫緩沖液添加到每一個(gè)孔中。用于洗脫步驟的過(guò)濾平板包括具有對(duì)蛋白的低親和力的材料(MILLIPOREMULTISCREENTM，產(chǎn)品目錄號(hào)MADVN6550，它具有容量為200μl孔的親水性PVDF濾膜)。對(duì)所述盒子進(jìn)行短時(shí)間的渦旋攪拌，以便重新懸浮所述珠，并且在4℃下在轉(zhuǎn)鼓上培養(yǎng)1小時(shí)。
9.將洗脫液/珠混合物轉(zhuǎn)移到冷的過(guò)濾平板上(Millipore，USA)上，并且通過(guò)在4℃下以3000rpm的速度通過(guò)所述過(guò)濾平板離心0.5-2分鐘，將洗脫液收集到96孔PCR平板中。
10.將每一種純化的蛋白分裝到3個(gè)96孔PCR平板上，并且馬上放入-80℃的冰箱保存。
裂解緩沖液30-300mM Tris pH 7.550-300mM NaCl0.1-10mM EGTA0.01-1.0％TritonX-1000.01-1％ β-巰基乙醇(″BME″)0.1-3mM 苯甲基黃酰氟(″PMSF″)Roche蛋白酶抑制劑片(含有EDTA)BME，PMSF和抑制劑片是新添加的。
洗滌緩沖液I30-300mM Tris pH 7.5300-600mM NaCl0.1-10mM EGTA0.01-1.0％TritonX-1000.01-1％ β-巰基乙醇(″BME″)0.1-3mM PMSFRoche蛋白酶抑制劑片(含有EDTA)BME，PMSF和抑制劑片是新添加的。
洗滌緩沖液II50-200mM HEPES pH 7.550-300mM NaCl1-15％ 甘油洗脫緩沖液
50-200mM HEPES pH7.550-200mM NaCl20-40％甘油5-40mM 谷胱甘肽(還原形式的)洗脫緩沖液的pH大約為pH7.5。
6.3以高處理量96陣列方式制備蛋白的方法制備含有幾乎所有酵母蛋白的酵母蛋白組微陣列，并且篩選多種生物化學(xué)活性。將5800種酵母ORFs(占總數(shù)量的93.5％)的優(yōu)質(zhì)群體克隆到酵母高拷貝表達(dá)載體上，使用重組克隆技術(shù)(Mitchell等，1993，Yeast 9715)。所述酵母蛋白的氨基末端與GST-HisX6融合，并且在半乳糖誘導(dǎo)型GAL1啟動(dòng)子的控制下，在酵母中表達(dá)(Zhu等，2000，Nat.Genet.26283；Mitchell等，1993 Yeast 9715)。所述酵母表達(dá)菌株含有獨(dú)立的質(zhì)粒，其中，通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)正確的酵母ORFs業(yè)已以框內(nèi)形式正確地與GST融合。簡(jiǎn)單地講，通過(guò)PCR擴(kuò)增酵母ORFs，并且隨同所述載體一起共同轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，以便制備表達(dá)克隆。所述質(zhì)粒是在大腸桿菌中挽救的，并且對(duì)載體-插入片段結(jié)合部分進(jìn)行測(cè)序(圖1A)。如果克隆的ORF不是感興趣的ORF的話，或者檢測(cè)到讀框位移的話，就重復(fù)所述克隆循環(huán)。一旦證實(shí)了一種構(gòu)建體，就將所述質(zhì)粒DNA重新導(dǎo)入酵母和大腸桿菌，以便產(chǎn)生永久性原種用于進(jìn)一步分析(Zhu等，2000，Nat Genet.26283)。通過(guò)重復(fù)所述克隆循環(huán)，成功地克隆了5800種不同的酵母ORFs，它占總ORF的93.5％。
為了制備用于生物化學(xué)分析的純化蛋白，開(kāi)發(fā)并且優(yōu)化了用于以96孔方式制備蛋白的可靠的和高處理量的純化方法。使用谷胱甘肽-瓊脂糖珠，制備了酵母提取物，并且純化了融合蛋白(有關(guān)96孔方式蛋白純化方案，來(lái)自所有實(shí)驗(yàn)的完整的結(jié)果，以及陽(yáng)性鑒定算法的設(shè)計(jì)的細(xì)節(jié)可以訪問(wèn)公共網(wǎng)站spine.mbb.yale.edu/protein～chips/)。所述裂解緩沖液和最初的洗滌液含有0.1％Triton，以便確保純化的蛋白不含脂類(lèi)。使用本發(fā)明的方法，在10小時(shí)以內(nèi)可以從細(xì)胞中制備至少1152個(gè)蛋白樣品。
通過(guò)60個(gè)隨機(jī)樣品的免疫吸印分析，監(jiān)測(cè)純化蛋白的質(zhì)量和數(shù)量(圖1B)。超過(guò)80％的菌株產(chǎn)生了具有預(yù)期分子量的可檢測(cè)數(shù)量的融合蛋白。用手工印刷工具將3nl的1152種純化蛋白重復(fù)點(diǎn)滴到載玻片(19)上，并且用多克隆抗GST抗體檢測(cè)蛋白。超過(guò)85％的樣品表現(xiàn)出超過(guò)背景的可見(jiàn)信號(hào)，與免疫吸印分析的結(jié)果吻合。使用本發(fā)明的方法，可以用在兩周以內(nèi)從6144(64×96孔盒子)個(gè)酵母菌株中純化融合蛋白。
6.4制備蛋白組微陣列的方法為了制備蛋白組芯片，使用市場(chǎng)上銷(xiāo)售的微陣列儀，將表示5800種不同酵母蛋白的6566種蛋白制劑重復(fù)印刷到載玻片上。作為對(duì)照，同樣印刷了已知數(shù)量的GST。采用了兩種類(lèi)型的載玻片。將乙醛處理過(guò)的顯微鏡載玻片用于起始實(shí)驗(yàn)(MacBeath等，2000，Science 2891760)中，在這種情況下，融合蛋白通過(guò)N-末端的伯胺或所述融合蛋白的其他殘基結(jié)合在載玻片表面上，導(dǎo)致了所述蛋白在載玻片表面上的相對(duì)隨機(jī)的取向。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，將蛋白點(diǎn)滴在鎳包被的載玻片上。在這種情況下，融合蛋白是通過(guò)它們的His X6標(biāo)記結(jié)合的，以便所述融合蛋白的克隆的酵母部分基本上均勻地遠(yuǎn)離所述表面取向的。盡管成功地使用了兩種類(lèi)型的載玻片，對(duì)于我們的特定蛋白制劑來(lái)說(shuō)鎳包被的載玻片提供了明顯更好的信號(hào)(圖2A)。
為了確定有多少融合蛋白共價(jià)結(jié)合在不同的玻璃表面上，并且評(píng)估所述蛋白結(jié)合的可再現(xiàn)性，用抗GST抗體檢測(cè)芯片。超過(guò)93.5％的蛋白樣品能產(chǎn)生顯著高于背景的信號(hào)(即超過(guò)蛋白的大約10fg)。在載玻片上同樣印刷了具有已知數(shù)量的GST的對(duì)照，表明大約90％的斑點(diǎn)含有大約10-950fg的蛋白。圖2A表示用熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)蛋白組芯片上的蛋白是極其靈敏的，即，信噪比很高，盡管僅將來(lái)自3毫升培養(yǎng)物的1/10000的純化蛋白點(diǎn)滴在所述載玻片上。以上結(jié)果表明，能夠以很高的分辨率將13000個(gè)蛋白樣品輕易地點(diǎn)滴在標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片的1/2面積上(2.5cm×7.5cm)((圖2A和2B)。為了檢驗(yàn)所述蛋白點(diǎn)滴的可再現(xiàn)性，對(duì)照比較了來(lái)自每一對(duì)重復(fù)斑點(diǎn)的信號(hào)。正如圖2C中的尖峰所表明的，95％的信號(hào)在5％的平均值范圍內(nèi)(10)。
6.5使用蛋白組微陣列的方法通過(guò)檢測(cè)若干種典型類(lèi)型的生物學(xué)活性測(cè)試蛋白組芯片蛋白-蛋白相互作用，蛋白-核酸相互作用和蛋白-脂類(lèi)相互作用。
一般地，按以下方法制備用于分析的蛋白組芯片。通過(guò)將印刷過(guò)的載玻片緩慢浸入BSA(1-3％(w/w)BSA，溶解在PBS緩沖液中；SIGMA，USA)或甘氨酸封閉緩沖液(30-300mM甘氨酸；50-300mMTris，pH 6.5-8.5；50-300mM NaCl；SIGMATM，USA)中，使蛋白一側(cè)向上，封閉所述蛋白組芯片。通過(guò)2微米濾膜裝置過(guò)濾所述緩沖液，以便除去顆粒。在檢測(cè)碳水化合物-結(jié)合蛋白時(shí)優(yōu)選甘氨酸。在4℃下，在封閉緩沖液中培養(yǎng)所述載玻片過(guò)夜，而不進(jìn)行任何搖晃(擾動(dòng)封閉緩沖液有可能導(dǎo)致玻璃表面上的蛋白脫落)。
探針蛋白通常是按以下方法制備的。酵母蛋白是用標(biāo)準(zhǔn)方法使用谷胱甘肽珠從50毫升培養(yǎng)物中通過(guò)親和柱純化的，而不從所述珠上洗脫。用冷的PBS緩沖液(pH8.0)(SIGMATM，USA)洗滌蛋白珠3-5次。將以0.1-50毫克/毫升的濃度溶解在PBS(pH8.0)中的大約1毫升硫代-NHS-LC-LC-生物素(PIERCE，產(chǎn)品目錄號(hào)21338，USA)添加到谷胱甘肽珠中，并且在4℃下培養(yǎng)2小時(shí)。用冷的PBS緩沖液(pH8.0)洗滌所述珠5次，并且用100-500毫升洗脫緩沖液(50-200mM，HEPES pH 7.5；50-200mM NaCl；20-40％甘油；5-40mM谷胱甘肽)洗脫。優(yōu)選能產(chǎn)生更弱的生物素化蛋白的方法。合并被生物素化到不同程度的不同批次的蛋白，以便將來(lái)使用。
6.5.1鈣調(diào)蛋白-相互作用蛋白的鑒定為了測(cè)試蛋白-蛋白相互作用，用鈣調(diào)蛋白檢測(cè)了酵母蛋白組(11)。鈣調(diào)蛋白是高度保守的鈣結(jié)合蛋白，它參與多種鈣調(diào)控的細(xì)胞過(guò)程，并且具有很多已知的物理配偶體(Hook等，2001，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.41471)。鈣調(diào)蛋白是生物素化的，并且用Cy3-標(biāo)記的鏈親和素檢測(cè)結(jié)合探針。作為對(duì)照，單獨(dú)用Cy3-標(biāo)記的鏈親和素檢測(cè)酵母蛋白組。
一般，可以按以下方法分析蛋白-蛋白相互作用。用PBS緩沖液洗滌封閉的蛋白組芯片3-5次，并且通過(guò)將載玻片垂直放在KIMWIPETM上輕輕敲打，除去玻璃表面上多余的液體。將200微升生物素化的蛋白探針添加到蛋白組芯片上，并且馬上用疏水性塑料蓋玻片(GRACEBIO-LABSTM，USA)覆蓋。除去滯留在它們之間的氣泡，并且將所述芯片放置在潮濕的培養(yǎng)箱中，在室溫(RT)下培養(yǎng)1小時(shí)。為了去掉蓋玻片，將所述芯片浸泡在大體積PBS緩沖液(＞50ml)中，并且將蓋玻片漂走。然后將所述芯片轉(zhuǎn)移到第二種PBS溶液(＞50ml)中，并且在室溫下通過(guò)振動(dòng)洗滌3×5分鐘。在除去芯片表面上的多余液體之后，將至少150微升的Cy3-或Cy5-結(jié)合的鏈親和素(PIERCE，USA；1∶2000-1∶4000稀釋液)添加到其表面，并且用疏水性塑料蓋玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆蓋。在室溫遮光培養(yǎng)所述芯片30分鐘以上。然后按上述方法洗滌芯片。為了完全除去芯片上的液體，在室溫下以1500-2000rpm的速度離心5-10分鐘，使其干燥。
如果蛋白組芯片要用抗體篩選的話，可以按以下方法測(cè)試蛋白-抗體相互作用。用PBS洗滌封閉的蛋白組芯片3-5次，并且通過(guò)在KIMWIPETM上垂直地輕輕敲打載玻片，除去玻璃表面上多余的液體。將200微升一級(jí)抗體(用含有1-3％的BSA或0.1％TritonX-100的PBS適當(dāng)稀釋過(guò))添加到蛋白組芯片上，并且馬上用疏水性塑料蓋玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆蓋。在將滯留的氣泡除去之后，將所述芯片放置在潮濕的培養(yǎng)箱中在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。為了去掉蓋玻片，將所述芯片浸泡在大體積的PBS緩沖液(＞50ml)中，并且將蓋玻片漂走。然后將所述芯片轉(zhuǎn)移到第二種PBS溶液(＞50ml)中，并且在室溫下通過(guò)振動(dòng)洗滌3×5分鐘。在除去芯片表面上的多余液體之后，將超過(guò)150微升的Cy3-或Cy5-結(jié)合的二級(jí)抗體(用含有1-3％的BSA和TritonX-100的PBS適當(dāng)稀釋過(guò))添加到它的表面，并且用疏水性塑料蓋玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆蓋。在室溫下遮光培養(yǎng)所述芯片30分鐘以上。然后按上述方法洗滌芯片。為了完全除去芯片上的液體，在室溫下以1500-2000rpm的速度離心5-10分鐘，使其干燥。
當(dāng)在有鈣的條件下用生物素化的鈣調(diào)蛋白檢測(cè)蛋白組芯片時(shí)，鑒定了6種已知的鈣調(diào)蛋白目標(biāo)，即Cmk1p，Cmk2p，Cmp2p，Dst1p，Myo4p和Arc35p(圖3A)。Cmk1p和Cmk2p是I和II型鈣/鈣調(diào)蛋白決定型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它們兩者都參與了配合反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Hook等，2001，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.41)。Cmp2p(Cna2p)是兩種酵母鈣調(diào)硫酸酶之一，并且業(yè)已證實(shí)能在體內(nèi)與鈣調(diào)蛋白相互作用(Cyert等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.887376)，Dstlp在轉(zhuǎn)錄延伸中發(fā)揮作用(Stirling等，1994，EMBO J.134329)，Myo4p是ASH1轉(zhuǎn)錄物正確定位所需要的V型肌球蛋白重鏈(Bohl等，2000，EMBO J.195514；Bertrand等，1998，Mol.Cell 2437)。Arc35p是Arp2/3肌動(dòng)蛋白-組構(gòu)復(fù)合體的一種成分，它參與肌動(dòng)蛋白的組裝和功能，并且參與胞吞作用(Winter等，1999，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.967288)。最近在雙雜交研究中證實(shí)了Arc35p能與鈣調(diào)蛋白相互作用(Schaerer-Brodbeck等，2000，Mol.Biol.Cell 111113)，因此證實(shí)了本發(fā)明的表明Arc35p和鈣調(diào)蛋白在體外相互作用的結(jié)果。在沒(méi)有檢測(cè)的六種已知鈣調(diào)蛋白目標(biāo)中，有兩種在該集合體中是不存在的，而其余四種在GST檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中是檢測(cè)不到的。除了已知相互作用劑之外，鈣調(diào)蛋白探針鑒定了33種其他相互作用劑。這些相互作用劑包括多種不同類(lèi)型的蛋白(參見(jiàn)表1；公共網(wǎng)站bioinfo.mbb.yale.edu/proteinchip)，與鈣調(diào)蛋白在多種不同的細(xì)胞中發(fā)揮作用吻合。
除了鈣調(diào)蛋白結(jié)合目標(biāo)之外，還鑒定了一種結(jié)合Cy3-標(biāo)記的鏈親和素的蛋白Pyc1p。Pyc1p編碼丙酮酸羧化酶1同系物，這種酶包括高度保守的生物素結(jié)合區(qū)(Menendez等，1998，Yeast 14647)。因此，正如通過(guò)其序列預(yù)測(cè)的，Pyc1p是在體內(nèi)生物素化的；并且在使用鏈親和素檢測(cè)方法的所有實(shí)驗(yàn)中都鑒定到了。因此，蛋白組微陣列可用于鑒定蛋白的翻譯后修飾。
6.5.2鈣調(diào)蛋白結(jié)合基序的鑒定為了鑒定推測(cè)的鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，確定了不同的鈣調(diào)蛋白結(jié)合目標(biāo)(即相互作用劑)所共同擁有的氨基酸序列(Zhu等，2000，Nat.Genet 26283)。39種鈣調(diào)蛋白-結(jié)合蛋白中的14種包括一個(gè)基序，它的共有序列為I/L-Q-X-X-K-K/X-G-B(SEQ ID NO1)，其中，X是任何殘基，而B(niǎo)是堿性殘基(圖3B)。以前業(yè)已證實(shí)了肌球蛋白上的相關(guān)序列I-Q-X-X-X-X-K-X-X-X-R(SEQ ID NO16)與鈣調(diào)蛋白結(jié)合(Homma等，2000，J.Biol.Chem 275)。以上結(jié)果表明，基序I-Q-X-X-X-X-K-X-X-X-R(SEQ ID NO16)存在于多種鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白中。缺乏該基序的其他鈣調(diào)蛋白結(jié)合相互作用劑可能具有其他鈣調(diào)蛋白結(jié)合序列。
6.5.3 ATP/GTP-結(jié)合蛋白的鑒定1.用冷的PBS緩沖液洗滌封閉的蛋白組芯片3-5次，并且通過(guò)在KIMWIPETM垂直地輕輕敲打載玻片，除去玻璃表面上多余的液體。
2.將100微升ATP和GTP溶液(0.5-5mM ATP-Cy3，0.5-5mMGTP-Cy5，100-400mM NaCl，1-30mM MgCl2，50-300mM Tris，pH 7-8.5)添加到蛋白組芯片上，并且馬上用疏水性塑料蓋玻片(GRACE BIO-LABSTM，OR，USA)覆蓋。在除去滯留的氣泡之后，將芯片放在潮濕的培養(yǎng)箱中，在4℃下培養(yǎng)1小時(shí)。
3.為了去掉蓋玻片，將芯片浸泡在大體積(＞30ml)冷的緩沖液(100-400mM NaCl，1-30mM MgCl2，50-300mM Tris，pH 7-8.5)中，并且將蓋玻片漂走。然后將芯片轉(zhuǎn)移到第二種冷的洗滌溶液(＞50ml)中，并且在4℃下通過(guò)振動(dòng)洗滌3×5分鐘。
4.在除去芯片表面上的多余液體之后，在4℃下以1500-2500rpm的速度將芯片離心至干燥。
6.5.4DNA-結(jié)合蛋白的鑒定對(duì)于諸如轉(zhuǎn)錄調(diào)控，染色體分離和維持，以及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和加工的多種基本生物學(xué)功能來(lái)說(shuō)，蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用是重要的(Williamson，2000，Nat.Struct.Biol.7(10)834-7)。為了揭示使用蛋白組芯片鑒定與DNA或RNA分子結(jié)合的蛋白的可能性，用Cy3-CTP和Klenow片段標(biāo)記總的酵母基因組DNA，并且用生物素化的補(bǔ)骨脂素衍生物標(biāo)記polyA+(31)。與每一種探針與不同的蛋白組芯片培養(yǎng)(圖3A)。
按以下方法分析蛋白-核酸相互作用。按照Winzeler等(1999，Science 285901)披露的方法標(biāo)記核酸探針。用PBS緩沖液洗滌封閉的蛋白組芯片3-5次，并且通過(guò)在KIMWIPETM上垂直地輕輕敲打，除去玻璃表面上的剝離液體。將200微升標(biāo)記過(guò)的核酸探針(50-200mM poly(dC/dG)；100-300mMNaCl；50-300mM HEPES，pH 7.0-8.5；10mMMgCl2)添加到蛋白組芯片上，并且馬上用疏水性塑料蓋玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆蓋。在將滯留的氣泡除去之后，在室溫下在潮濕的培養(yǎng)箱中，遮光培養(yǎng)所述芯片培養(yǎng)1小時(shí)。為了去掉蓋玻片，將芯片浸泡在大體積的PBS緩沖液(＞50ml)中，以便將蓋玻片漂走。然后將芯片轉(zhuǎn)移到第二種PBS溶液(＞50ml)中，并且在室溫下通過(guò)遮光振動(dòng)，洗滌3×5分鐘。為了完全除去芯片表面上的液體，在室溫下以1500-2000rpm的速度離心5-10分鐘，使芯片干燥。
肉眼檢查發(fā)現(xiàn)，所述基因組DNA探針鑒定了41種DNA-結(jié)合蛋白(參見(jiàn)表1)。其中包括8種以前已知的DNA-相關(guān)蛋白和2種推測(cè)的DNA-結(jié)合蛋白。在已知的DNA-結(jié)合蛋白中，我們發(fā)現(xiàn)了3種DNA-修復(fù)蛋白(即xrs2p，Cdc1p和Rad51p(Costanzo等，2001，Nucleic AcidsRes.2975))，一種SWI-SNF總體轉(zhuǎn)錄激活劑復(fù)合成分(即Snfl 1p(Costanzo等2001，Nucleic Acids Res.2975))，II型轉(zhuǎn)錄Bur6p的NC2(Drl/Drapl)抑制劑的α亞基(Sternberg.等，1987，Cell 48567)，轉(zhuǎn)錄因子Spt2p(HO基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)劑(Sternberg等，1987，Cell 48567))和Met30p，它包括5個(gè)WD-重復(fù)，并且結(jié)合某些啟動(dòng)子區(qū)(Thomas等，1995，Mol.Cell Biol.156526)。我們還鑒定了Trm2p，它能結(jié)合DNA和RNA，并且參與DNA修復(fù)和RNA加工/修飾(Sadekova等，1996，Curr.Genet.30(1)50-5.)。
被確定為核酸結(jié)合蛋白的8種蛋白具有未知功能。其中，根據(jù)它們的氨基酸序列和本分析的結(jié)果，3種有可能具有DNA結(jié)合活性。Ycr087c包括鋅指結(jié)構(gòu)域，它是一種常見(jiàn)的DNA結(jié)合基序。Yhr054c與轉(zhuǎn)錄因子Rsc3p擁有序列同源性(Costanzo等，2001，Nucleic AcidsRes.2975)。Ybr025c被認(rèn)為具有推測(cè)的核苷酸結(jié)合活性(Costanzo等，2001，Nucleic Acids Res.2975)。本分析證實(shí)了這8種蛋白能在體外結(jié)合DNA，并且有可能在體內(nèi)結(jié)合核酸。
表1“-”表示標(biāo)記為壞的斑點(diǎn)，在數(shù)據(jù)表中賦值為-10000。

6.5.5RNA結(jié)合蛋白的鑒定除了Trm2p之外，鑒定了具有RNA結(jié)合活性的其他相互作用劑。例如，業(yè)已證實(shí)異亮氨酰-tRNA合成酶(Ilslp)和核糖體蛋白(Rpl41B)能結(jié)合RNA分子(Lanker等，1992，Cell 70647；Suzuki等，1990，Curr.Genet 17185)。參與翻譯的其他蛋白在篩選諸如Rpl41b，Sqt1p和Gcdl1p的結(jié)合蛋白的測(cè)定中是陽(yáng)性的。Rpl41b是大型核糖體亞基的一種成分。Sqt1p與Rpl10p相互作用，后者是一種RNA結(jié)合蛋白(Costanzo，2001，Nucleic Acids Res.2975)。Gcd11p是翻譯起始因子eIF2的γ亞基，它具有GTP結(jié)合活性，并且與Lsml-7復(fù)合物結(jié)合(U6-專(zhuān)一性snRNP)。正如通過(guò)雙雜交分析所證實(shí)的(Fromont Racine等，2000，Yeast1795)。能結(jié)合DNA探針，還能結(jié)合核苷酸的兩種其他的蛋白目標(biāo)，即Thil3p參與核苷酸代謝，而Ypt31p具有GTP-結(jié)合活性(Costanzo等，2001，Nucleic Acids Res.2975)。用DNA探針鑒定的RNA結(jié)合和核苷酸結(jié)合蛋白可能反應(yīng)了與DNA的低的親和相互作用，或者可能表示對(duì)DNA的以前沒(méi)有認(rèn)識(shí)到的正常的親和力。
用生物素標(biāo)記來(lái)自指數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞的RNA-polyA+，并且用于檢測(cè)蛋白組微陣列。用Cy3-鏈親和素檢測(cè)陽(yáng)性信號(hào)。鑒定了19種目標(biāo)相互作用劑(參見(jiàn)表1)，包括U1 snRNP成分(Smdlp)，已知能結(jié)合mRNA輸入蛋白的蛋白(Sxm8p)，C2-H2鋅指蛋白(Azf1p)和Tos8p，根據(jù)它的序列推測(cè)它參與RNA剪接和加工(Schwikowski等，2000，Nat.Biot.181257)。除了有可能直接或間接與RNA相互作用的蛋白之外，我們發(fā)現(xiàn)了兩種轉(zhuǎn)錄因子(Bur6p和Tos8p)，一種轉(zhuǎn)錄沉默子(Hst3p)，由已知ORFs編碼的六種其他蛋白，以及來(lái)自未表征過(guò)的ORFs的七種蛋白。未知ORFs具有最強(qiáng)的信號(hào)(Yerl52c)。必須指出的是，只有一種相互作用劑Bur6p能同時(shí)結(jié)合DNA和RNA探針。其他相互作用劑只能用雙鏈DNA探針或RNA探針檢測(cè)到，這表明大部分蛋白可能專(zhuān)一性地結(jié)合DNA或RNA。
總之，在41種目標(biāo)相互作用劑中，有18種是核酸相互作用蛋白；有11種是已知的或推測(cè)的DNA結(jié)合蛋白，有3種是RNA結(jié)合蛋白，并且有4種能結(jié)合核苷酸。
6.5.6脂結(jié)合蛋白的鑒定本發(fā)明的蛋白組芯片可用于鑒定可能無(wú)法用其他實(shí)驗(yàn)方法獲得的活性，例如，蛋白-藥物相互作用和蛋白-脂類(lèi)相互作用。實(shí)際上，與磷脂結(jié)合的基因組范圍的蛋白分析，以前尚未應(yīng)用于所有種類(lèi)。將本發(fā)明的蛋白組芯片用于研究與磷脂酰肌醇(″PI″)的相互作用的蛋白。除了它們作為細(xì)胞膜成分的作用之外，磷脂酰肌醇是重要的二級(jí)信使，由它調(diào)控多種細(xì)胞過(guò)程，包括生長(zhǎng)，分化，細(xì)胞骨骼重組，膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并且存在于細(xì)胞核，液泡和質(zhì)膜中(Odorizzi等，2000，TIBS 25229；Fruman等，1998，Annu.Rev.Biochem.67481；Martin，2000，Annu.Rev.Cell Dev.Bio.14231；Wera等，2001，F(xiàn)EMS Yeast Res.140617)。因?yàn)樗鼈兺ǔＶ皇嵌虝r(shí)間存在的，并且在細(xì)胞內(nèi)的含量很少，尚未對(duì)酵母中的磷脂酰肌醇進(jìn)行充分表征，因此，對(duì)有關(guān)與特定磷脂結(jié)合的蛋白的了解很少(Odorizzi等，2000，TIBS 25229；Fruman等，1998，Annu.Rev.Biochem.67229；Martin，2000，Annu.Rev.Cell Dev.Bio.14231；Wera等，2001，F(xiàn)EMS Yeast Res.14061)。
為了鑒定酵母中的PI-結(jié)合蛋白，用脂質(zhì)體作探針，因?yàn)橹|(zhì)體提供了分析所述相互作用劑的最相關(guān)的生理學(xué)條件。使用了6種類(lèi)型的脂質(zhì)體。每一種脂質(zhì)體包括磷脂酰膽堿(″PC″)和1％(w/w)N-(biotinoyl)-1，2-雙十六酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙銨鹽(生物素DHPE)。生物素化的脂類(lèi)起著一種標(biāo)記的作用，這種標(biāo)記可以通過(guò)Cy3-鏈親和素檢測(cè)(21)。除了PC之外，5種其他的脂質(zhì)體含有5％(w/w)PI(3)P，PI(4)P，PI(3，4)P2，PI(4，5)P2或PI(3，4，5)P3(圖3A)。除了PI(3，4，5)P3之外，上述每一種磷脂都已經(jīng)在酵母中發(fā)現(xiàn)(Odorizzi等，2000，TIBS 25229；Fruman等，1998，Annu.Rev.Biochem.67481；Martin，2000，Annu.Rev.Cell Dev.Bio.14231；Wera等，2001，F(xiàn)EMS Yeast Res.14061)。
按以下方法分析蛋白-脂質(zhì)體相互作用。在氯仿中混合合適數(shù)量的每一種脂類(lèi)，并且在氮?dú)庵懈稍铩Ｍㄟ^(guò)渦旋攪拌將脂類(lèi)混合物重新懸浮在PBS緩沖液中。通過(guò)超聲波處理產(chǎn)生脂質(zhì)體。用PBS緩沖液洗滌封閉的蛋白組芯片3-5次，并且通過(guò)在KIMWIPETM上輕輕敲擊所述載玻片，除去玻璃表面上的多余的液體。將200微升脂質(zhì)體溶液添加到蛋白組芯片上，并且馬上用疏水性塑料蓋玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆蓋。在除去滯留的氣泡之后，在室溫下在潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所述芯片1小時(shí)。為了去掉蓋玻片，將所述芯片浸泡在大體積的PBS緩沖液(＞50ml)中，以便將蓋玻片漂走。然后將所述芯片轉(zhuǎn)移到第二種PBS溶液(＞50ml)中，并且在室溫下通過(guò)振動(dòng)洗滌3×5分鐘。在除去芯片表面上的多余液體之后，將大約100微升Cy3或Cy5結(jié)合的鏈親和素(PIERCETM，USA；1∶2000-1∶4000稀釋度)添加到其表面，并且用疏水性塑料蓋玻片(GRACE BIO-LABSTM，USA)覆蓋。在室溫下遮光培養(yǎng)所述芯片30分鐘以上。然后按上述方法洗滌所述芯片。為了完全除去芯片上的液體，在室溫下以1500-2000rpm的速度離心5-10分鐘使所述芯片干燥。
6種脂質(zhì)體一共鑒定了150種不同的相同作用劑，它們所產(chǎn)生的信號(hào)明顯高于背景。設(shè)計(jì)了一種算法，以便幫助鑒定陽(yáng)性信號(hào)(42)。52種(35％)的相互作用劑(即脂結(jié)合蛋白)相當(dāng)于未鑒定的蛋白，因此確定了所述蛋白的第一種生物化學(xué)活性。上述結(jié)果還證實(shí)了以前未表征過(guò)的具有潛在的重要生物化學(xué)活性的蛋白。
在52種未表征過(guò)的蛋白中，推測(cè)13種(25％)與膜相關(guān)(Gerstein，1998，Proteins 33518)。很多其他的蛋白包括堿性片段，它能介導(dǎo)與帶負(fù)電荷的磷酸肌醇的靜電相互作用。
在98種以前披露的相互作用劑中，業(yè)已研究了其中81種的亞細(xì)胞定位(Costanzo等，2001，Nucleic Acids Res.2975)。大部分是膜相關(guān)蛋白或參與脂類(lèi)代謝。更具體地講，45種蛋白是膜相關(guān)的，并且具有已知的或推測(cè)的跨膜區(qū)(Gerstein，1998，Proteins 33518)。鑒定的相互作用劑包括膜內(nèi)在蛋白，具有脂修飾的蛋白(例如，糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白Tos6p和Sps2p(Costanzo等，2001，Nucleic Acids Res.2975)，異戊二烯化蛋白Gpa2p和配合信息素a-因子(Ansari等，1999，J.Bio.Chem.27430052)和外周相關(guān)蛋白(例如，Kcc4p和Myo4p，它們存在于芽頸部和/或細(xì)胞周?chē)?Bohl，2000，EMBO J.195514；Bertrand等，1998，Mol.Cell 2437))。八種其他的蛋白參與脂代謝(例如，Bpl1p)，肌醇環(huán)磷酸化(例如Kcs1p)，或推測(cè)與膜/脂功能相關(guān)(例如，Ylr02Ocp，它與三乙酰甘油脂酶有同源性)。
按若干種方法對(duì)相互作用劑(即磷脂結(jié)合蛋白)進(jìn)行分類(lèi)。首先，根據(jù)相對(duì)GST的磷脂結(jié)合信號(hào)，根據(jù)結(jié)合脂類(lèi)的強(qiáng)弱對(duì)所述相互作用劑進(jìn)行分類(lèi)(圖4)。相對(duì)弱結(jié)合蛋白(54％)(圖4C和4D)表征了更多一些(72％)的強(qiáng)脂結(jié)合蛋白(圖4A和4B)。很多強(qiáng)脂結(jié)合蛋白是膜相關(guān)的，或者推測(cè)與膜相關(guān)，而較少的弱結(jié)合蛋白似乎與膜相關(guān)(圖4，“膜”欄)。令人吃驚的是，19種脂結(jié)合蛋白是激酶，而17種是蛋白激酶。另外，17種蛋白激酶中的13種與磷脂的結(jié)合極強(qiáng)。
還根據(jù)與磷脂酰膽堿相比它們是否能優(yōu)先結(jié)合一種或多種磷脂酰肌醇，對(duì)所述蛋白進(jìn)行分類(lèi)。101種蛋白也能與磷脂酰膽堿結(jié)合，或者幾乎與測(cè)試的磷脂酰肌醇脂類(lèi)的結(jié)合一樣好(PI/PC＜1.3)(圖4B和4D)。不過(guò)，49種蛋白優(yōu)選與一種或多種磷脂酰肌醇結(jié)合(PI/PC＞1.3)(圖4A和4C)。分析強(qiáng)相互作用子(即磷脂酰肌醇結(jié)合蛋白)發(fā)現(xiàn)，有很多種專(zhuān)一性地結(jié)合特定磷脂酰肌醇的脂類(lèi)。例如，Stp22p是溫度敏感型質(zhì)膜蛋白的液泡定向所需要的，如Ste2p和Can1p，能優(yōu)先結(jié)合PI(4)P(Li等，1999，Mol.Cell Biol.193588)。有9種蛋白激酶能專(zhuān)一性地牢固結(jié)合PI(4)P和PI(3，4)P2，并且一種能很弱地結(jié)合上述成分。Atp 1p是線粒體內(nèi)膜的F1-ATP合成酶的α亞基，它也能優(yōu)先結(jié)合PI(3，4)P2(Arnold等，1999，J Biol.Chem)。Sps2p參與中期/晚期小孢子形成，并且定位于孢子前體膜上(Chu等，1998，Science 282699)，它優(yōu)先與PI(3)P相互作用。一種有趣的例子是Myo4p，它能優(yōu)先結(jié)合PI(4，5)P2；也許這種脂類(lèi)的結(jié)合是它在細(xì)胞皮層上的相互作用和/或它的調(diào)控作用的重要部分。盡管某些蛋白能同時(shí)結(jié)合這種脂類(lèi)和其他脂類(lèi)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能專(zhuān)一性結(jié)合PI(3，4，5)P3的強(qiáng)的脂類(lèi)結(jié)合目標(biāo)。以上結(jié)果表明，多種膜相關(guān)蛋白，包括膜內(nèi)在蛋白和外周相關(guān)蛋白能優(yōu)先在體內(nèi)結(jié)合特定的脂類(lèi)。
出人意料的是，很多蛋白參與葡萄糖代謝，包括葡萄糖代謝結(jié)合磷脂的調(diào)節(jié)劑。具體地講，鑒定了參與糖酵解中的連續(xù)步驟的三種葡萄糖代謝酶，即磷酸甘油酸變位酶(Gpm3p)，烯醇化酶(Eno2p)和丙酮酸激酶(Cdc 19p/Pyk1p)。作為脂結(jié)合相互作用劑，還鑒定了能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖-6-磷酸的己糖激酶(Hxk1p)和兩種已知是葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)劑的蛋白激酶(即Snf1p和Rim15p)。最近業(yè)已證實(shí)Hxk1p能結(jié)合兩性離子微團(tuán)，這種結(jié)合能促進(jìn)其活性(30)；業(yè)已證實(shí)Eno2p能夠分泌，這表明它還可能與膜相互作用(31)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用磷脂調(diào)節(jié)與葡萄糖代謝相關(guān)的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)在磷脂支架上進(jìn)行葡萄糖代謝的步驟，增強(qiáng)糖酵解步驟，例如，但不局限于在細(xì)胞膜上進(jìn)行。
令人吃驚的是，包括磷脂的探針能識(shí)別多種預(yù)計(jì)與膜功能或脂信號(hào)傳導(dǎo)不相關(guān)的蛋白。因此，用兩種類(lèi)型的標(biāo)準(zhǔn)分析方法進(jìn)一步測(cè)試了六種蛋白的磷酸肌醇結(jié)合，這六種蛋白是Rim15p，Eno2p，Hxk1p，Sps1p，Ygl05 9wp和Gcn2p(Williamson，2000，Nat.Struct Biol.7(10)834-7)。對(duì)于Rim15p，Eno2p和Hxk1p來(lái)說(shuō)，首先將PI(4，5)P2脂質(zhì)體結(jié)合在硝酸纖維素膜上，然后用BSA進(jìn)行封閉；用不同量的GST融合蛋白和GST對(duì)照檢測(cè)所述膜，并且用抗GST抗體檢測(cè)結(jié)合蛋白。如圖5A所示，每一種酵母融合蛋白緊密結(jié)合PI(4，5)P2，并且表現(xiàn)出劑量效應(yīng)；GST本身則不能。我們還對(duì)四種GST融合蛋白R(shí)im15p，Sps1p，Yg1059wp和Gcn2p進(jìn)行了逆向分析(Guerra等，2000，Biosci.Rep.2041)。將不同數(shù)量的所述純化蛋白點(diǎn)滴在硝酸纖維素濾膜上，并且用六種不同的脂質(zhì)體檢測(cè)(圖5B)。用辣根過(guò)氧化物酶(″HRP″)-結(jié)合的鏈親和素檢測(cè)結(jié)合的脂質(zhì)體。對(duì)于使用蛋白組芯片的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，脂質(zhì)體能與每一種蛋白結(jié)合，而不能與BSA對(duì)照結(jié)合。Sps1p能幾乎等同地結(jié)合五種含有磷酸肌醇的脂質(zhì)體。Rim15p，Gcn2p和Yg1059wp對(duì)不同的脂質(zhì)體具有不同的親和力(對(duì)于Rim15p來(lái)說(shuō)，參見(jiàn)圖5B)。所有三種蛋白與PI(3)P和PI(4)P和PI(3，4)P2的結(jié)合最強(qiáng)。對(duì)于Rim15p來(lái)說(shuō)，發(fā)現(xiàn)了在結(jié)合信號(hào)和Rim15p的含量之間存在線性相關(guān)性(圖5C)。
另外，具有未知功能的若干種蛋白也表現(xiàn)出強(qiáng)的脂結(jié)合活性，表明它們可能結(jié)合細(xì)胞中的磷脂?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知的常規(guī)分析方法，迅速篩選用蛋白組芯片鑒定的脂結(jié)合相互作用劑，以便確定在體內(nèi)的脂結(jié)合活性。另外，根據(jù)本發(fā)明，可以用蛋白組芯片確定所述相互作用劑是否與磷脂代謝途徑或信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)。
總之，以上結(jié)果明確無(wú)誤地證實(shí)，多種脂結(jié)合蛋白，包括以前未知的能結(jié)合脂類(lèi)的蛋白，可以用本發(fā)明的蛋白組芯片檢測(cè)和表征。另外，用本發(fā)明的蛋白組芯片鑒定的磷脂結(jié)合相互作用劑，可以通過(guò)常規(guī)分析方法證實(shí)為真正的脂結(jié)合蛋白。
另外，由于所述相互作用不能用酵母雙雜交系統(tǒng)或DNA/寡聚體微陣列技術(shù)研究，本發(fā)明的蛋白組芯片及其使用方法是研究分子-蛋白相互作用的先進(jìn)方法。
所述研究表明，它可以制備并且篩選真核生物的蛋白組芯片。所述若干種技術(shù)特征的新型和非顯而易見(jiàn)的組合，對(duì)于實(shí)施本發(fā)明來(lái)說(shuō)是必要的。首先，在本研究中分析的蛋白是用酵母表達(dá)克隆制備的，所述克隆是通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證的，并且含有純的質(zhì)粒。其次，它是以高處理量方式生產(chǎn)特定克隆和蛋白所必需的。本文所披露的方法提供了足夠5000個(gè)蛋白芯片使用的蛋白。第三，所述蛋白是在真核宿主中生產(chǎn)的，因此，可以生產(chǎn)大量完整長(zhǎng)度的蛋白，所述蛋白是正確折疊的，翻譯后修飾的和/或與它的天然配偶體復(fù)合的。正如通過(guò)免疫吸印分析所證實(shí)的，至少80％的純化融合蛋白是以完整長(zhǎng)度蛋白形式表達(dá)。
很多相互作用劑可以通過(guò)結(jié)合蛋白與探針結(jié)合，而不直接結(jié)合。在某些場(chǎng)合下，相互作用劑可以是多聚體的一部分。不過(guò)，所述結(jié)合蛋白還可以用本發(fā)明的方法檢測(cè)和鑒定。不過(guò)，通過(guò)本發(fā)明方法檢測(cè)的相互作用劑有可能直接與一種探針相互作用，或者至少與一種能與探針相互作用的蛋白緊密結(jié)合。本發(fā)明的蛋白組芯片的蛋白是用嚴(yán)格條件(例如用0.5M NaCl洗滌)制備的，并且，考馬斯染色僅發(fā)現(xiàn)了可以通過(guò)抗GST抗體檢測(cè)的帶，這表明其他蛋白的污染很少。
各種組裝蛋白的集合體可能不足以代表具有正確折疊的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白。GST標(biāo)記和HisX6標(biāo)記融合在翻譯起始密碼子上游，以便具有信號(hào)肽的膜蛋白不會(huì)輸送到分泌途徑中，并且不能適當(dāng)?shù)卣郫B或修飾。在篩選脂結(jié)合蛋白的過(guò)程中，鑒定了三種具有信號(hào)肽的蛋白，這表明至少產(chǎn)生了某些分泌蛋白，并且含有功能性結(jié)構(gòu)域。
另外，由于并不是所有蛋白都能夠通過(guò)高處理量方法超量生產(chǎn)和純化的，并不是所有相互作用都能夠檢測(cè)。不過(guò)，估計(jì)所使用的蛋白陣列包括處在用于篩選的合理水平上的大約80％的完整長(zhǎng)度的酵母蛋白，因此，預(yù)計(jì)大部分蛋白相互作用都可以檢測(cè)。
以上結(jié)果表明，蛋白組芯片可以篩選生物化學(xué)活性，由此可以進(jìn)行全面蛋白組分析。類(lèi)似方法可用于制備具有10-100,000種蛋白的蛋白陣列，用于在人類(lèi)和其他真核生物中進(jìn)行全面的高處理量蛋白組分析。
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10.有關(guān)96孔方式蛋白純化方案、來(lái)自所有實(shí)驗(yàn)的完整的結(jié)果、以及陽(yáng)性鑒定算法的設(shè)計(jì)的詳細(xì)說(shuō)明可以查閱公共網(wǎng)站bioinfo.mbb.yale.edu/proteinchip。
11.將用PBS緩沖液制備的濃度為0.02mg/ml的生物素化的鈣調(diào)蛋白(CalBiochem，USA)與0.1mM的鈣一起添加到蛋白組芯片上，并且在室溫下在潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。在隨后的所有步驟中，緩沖液中都含有0.1mM的鈣。在室溫下用PBS洗滌所述芯片3次。將Cy3-結(jié)合的鏈親和素(Jackson IR，USA)(1∶5000稀釋度)添加到所述芯片上，并且在室溫下培養(yǎng)30分鐘。在充分洗滌之后，通過(guò)離心使所述芯片干燥，并且用微陣列掃描儀掃描；然后用GENEPIXTM陣列密度測(cè)定軟件(Axon，USA)獲得數(shù)據(jù)。
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21.用標(biāo)準(zhǔn)方法制備脂質(zhì)體(52)。簡(jiǎn)單地講，將溶解在氯仿中的合適數(shù)量的每一種脂混合并且在氮?dú)庀赂稍?。通過(guò)渦旋攪拌將所述液體混合物重新懸浮在TBS緩沖液中，通過(guò)超聲波處理產(chǎn)生脂質(zhì)體。為了檢測(cè)所述蛋白組芯片，將60毫升不同的脂質(zhì)體添加到不同的芯片上。在室溫下在潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所述芯片1小時(shí)。在用TBS緩沖液洗滌3次之后，將Cy3-結(jié)合的鏈親和素(1∶5000稀釋度)添加到所述芯片上，并且在室溫下培養(yǎng)30分鐘。
22.通過(guò)計(jì)算每一個(gè)斑點(diǎn)的局部強(qiáng)度背景的GenePix軟件和我們所開(kāi)發(fā)的一系列算法的組合鑒定陽(yáng)性克隆。有關(guān)細(xì)節(jié)可以查閱公共網(wǎng)站bioinfo.mbb.yale.edu/proteinchip。
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7.所引用的參考文獻(xiàn)本文所引用的所有文獻(xiàn)都以全文形式引入本文作為參考，并且是以相同的程度引用的，就如同每一份文獻(xiàn)或?qū)＠驅(qū)＠暾?qǐng)被專(zhuān)門(mén)和分別指明以全文形式引入本文作為參考一樣。
8.等同方案在不超出本發(fā)明構(gòu)思和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改進(jìn)和改變。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，或能夠通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定對(duì)本文所披露的本發(fā)明具體實(shí)施方案的各種改變、調(diào)整和改進(jìn)，所有這樣的改變都屬于本發(fā)明的范圍。相應(yīng)地，要求保護(hù)的發(fā)明意在包括所有這樣的等同方案。因此，本文所披露的具體實(shí)施方案僅僅是以舉例形式提供的，并且，本發(fā)明不僅僅局限于所附權(quán)利要求書(shū)，同時(shí)也不局限于與所述權(quán)利要求書(shū)等同的全部范圍。
序列表<110>耶魯大學(xué)<120>利用蛋白組芯片全面分析蛋白活性<130>6523-035-228<140>待轉(zhuǎn)讓<141>同此<150>60/290,583<151>2001-05-11<150>60/308,149<151>2001-07-26<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白的共有序列<221>變體<222>1<223>Xaa＝Ile或Leu<221>變體<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<221>變體<222>5<223>Xaa＝Lys或任何氨基酸<221>變體<222>7<223>Xaa＝堿性氨基酸<400>1Xaa Gln Xaa Lys Xaa Gly Xaa1 5<210>2<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>2Leu Lys Glu Thr Leu Gln Ser Val Lys Ser Leu Lys Asp Ala Leu Asn1 5 10 15Asp
<210>3<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>3His Ser Val Asp Leu Gln Ser Ser Lys Phe Gln Leu Ala Ile Val Cys1 5 10 15Thr<210>4<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>4Asp Glu His Phe Ile Gln Arg Leu Pro Ser Thr Arg Leu Asn Ser Thr1 5 10 15Asp<210>5<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>5Ala Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Gly Ser Thr Arg Asp Ile Ala Glu1 5 10 15Ser<210>6<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>6Asp Asp Leu Arg Leu Gln Ser Gln Lys Lys Gly Gly Glu Leu Thr Glu1 5 10 15Glu<210>7<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>7Leu Asn Pro Ile Ile Gln Asp Thr Lys Lys Gly Lys Leu Arg Phe Val1 5 10 15Arg
<210>8<211>13<212>PRT<213>釀酒酵母<400>8Arg Lys Ala Leu Ile Gln Arg Lys Gly Gly Lys Leu Glu1 5 10<210>9<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>9Val Val Asp Pro Ile Gln Ser Val Lys Gly Lys Val Val Ile Asp Ala1 5 10 15Phe<210>10<211>16<212>PRT<213>釀酒酵母<400>10Gly His Pro Ile Ile Gln Asp Lys Glu Gly Asn Gly Val Leu Ile Cys1 5 10 15<210>11<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>11Arg Val Trp Gly Ile Gln Pro Val Asn Lys Lys Phe Asn Ala Arg Ser1 5 10 15Ala<210>12<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>12Leu Leu Arg Glu Ile Gln Ser Lys Arg Ser Lys Lys Asp Glu Glu Gly1 5 10 15Lys<210>13<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>13
Leu Asn Met Lys Ile Gln Lys Leu Arg Asp Leu Tyr Leu Glu Gln Thr1 5 10 15Glu<210>14<211>16<212>PRT<213>釀酒酵母<400>14Asp Leu Phe Gly Ile Gln His Cys His Asn Ile Asp Val Lys Arg Leu1 5 10 15<210>15<211>17<212>PRT<213>釀酒酵母<400>15Asn Gly Leu Leu Ile Gln Ser Ser Lys Phe Ile Ser Lys Val Leu Leu1 5 10 15Thr<210>16<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>出現(xiàn)在很多鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白中的基序<221>變體<222>3，4，5，6，8，9，10<223>Xaa＝任何氨基酸<400>16Ile Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Arg1 5 10
權(quán)利要求
1.一種包括多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白包括由一個(gè)物種中的至少50％的已知基因編碼的至少一種蛋白。
2.如權(quán)利要求1的陣列，其中所述多種蛋白包括由一個(gè)物種中的至少70％的已知基因編碼的至少一種蛋白。
3.一種包括多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的至少50％，其中蛋白的同種型和剪接變體是作為一種蛋白統(tǒng)計(jì)的。
4.一種包括多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的至少1000種蛋白。
5.一種包括多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白總體上包括由一個(gè)物種中至少1000種不同的已知基因編碼的蛋白。
6.如權(quán)利要求1、3、4或5的陣列，其中所述蛋白是按照蛋白的分類(lèi)組構(gòu)在所述陣列上的。
7.如權(quán)利要求6的陣列，其中所述分類(lèi)是根據(jù)豐度、功能、酶促活性、同源性、蛋白家族、與特定代謝途徑的關(guān)系或翻譯后修飾進(jìn)行的。
8.如權(quán)利要求1、3、4或5的陣列，其中所述蛋白通過(guò)His標(biāo)記結(jié)合在固體支持物上。
9.如權(quán)利要求1、3、4或5的陣列，其中所述固體支持物包括鎳。
10.如權(quán)利要求1、3、4或5的陣列，其中所述固體支持物包括鎳包被的載玻片。
11.一種制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白包括由一個(gè)物種中的至少50％的已知基因編碼的至少一種蛋白。
12.一種制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物的表面上，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的至少50％，其中蛋白的同種型和剪接變體是作為一種蛋白統(tǒng)計(jì)的。
13.一種制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物上，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的至少1000種蛋白。
14.一種制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種蛋白結(jié)合在固體支持物上，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白總體上包括由一個(gè)物種中的至少1000種不同的已知基因編碼的蛋白。
15.一種制備可定位尋址的陣列的方法，包括以下步驟將多種融合蛋白結(jié)合在固體支持物表面上，每一種融合蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述融合蛋白包括第一標(biāo)記、第二標(biāo)記和由一種生物體的基因組核酸編碼的蛋白序列。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中在所述結(jié)合步驟之前，是一個(gè)通過(guò)讓所述蛋白與所述第一標(biāo)記的結(jié)合配偶體接觸而純化所述蛋白的步驟，并且，在所述結(jié)合步驟中用所述第二標(biāo)記將所述蛋白結(jié)合在固體支持物上。
17.如權(quán)利要求16的方法，其中所述第一標(biāo)記是GST標(biāo)記，而第二標(biāo)記是His標(biāo)記。
18.如權(quán)利要求15的方法，其中所述第一標(biāo)記和第二標(biāo)記存在于所述蛋白的氨基末端。
19.如權(quán)利要求15的方法，其中所述第一標(biāo)記和第二標(biāo)記存在于所述蛋白的羧基末端。
20.一種制備和分離多種純化的蛋白樣品的方法，包括以下步驟在多位點(diǎn)陣列的多個(gè)位點(diǎn)的每一個(gè)位點(diǎn)上(a)生長(zhǎng)具有與調(diào)控序列可操作地連接的異源核苷酸序列的真核細(xì)胞；(b)讓所述調(diào)控序列與誘導(dǎo)物接觸，該誘導(dǎo)物能增強(qiáng)由所述異源核苷酸序列編碼的蛋白的表達(dá)；(c)裂解所述細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞裂解物；(d)將所述細(xì)胞裂解物或來(lái)自它的含有蛋白的樣品與一種結(jié)合制劑接觸，形成所述蛋白和結(jié)合制劑的復(fù)合物；和(e)從所述復(fù)合物中分離所述蛋白；其中每一個(gè)步驟是以多陣列方式進(jìn)行的。
21.如權(quán)利要求20的方法，其中每一個(gè)位點(diǎn)是一個(gè)孔。
22.如權(quán)利要求20的方法，其中所述蛋白是包括與所述結(jié)合制劑結(jié)合的親和標(biāo)記的融合蛋白。
23.如權(quán)利要求20的方法，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求20的方法，其中所述裂解步驟是用顏料振蕩器完成的。
25.一種檢測(cè)脂結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟(a)將包括脂類(lèi)的探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上；和(b)檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用，其中在所述固體支持物的一個(gè)位置上檢測(cè)到相互作用，表明了在該位置上存在脂結(jié)合蛋白。
26.如權(quán)利要求25的方法，其中所述脂類(lèi)是磷脂。
27.如權(quán)利要求26的方法，其中所述磷脂是磷脂酰膽堿或磷脂酰肌醇。
28.如權(quán)利要求25的方法，其中所述探針包括脂質(zhì)體。
29.一種檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟(a)將一種探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白包括由一個(gè)物種中的至少50％的已知基因所編碼的至少一種蛋白；和(b)檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。
30.一種檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟(a)將一種探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的至少50％，其中蛋白同種型和剪接變體作為一種蛋白統(tǒng)計(jì)；和(b)檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。
31.一種檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟(a)將一種探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白包括在一個(gè)物種中表達(dá)的至少1000種蛋白；和(b)檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。
32.一種檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟(a)將一種蛋白與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中多種蛋白總體上包括由一個(gè)物種中的至少1000種不同的已知基因編碼的蛋白；和(b)檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。
33.一種檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟(a)將一種探針與包括多種融合蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種融合蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述融合蛋白包括第一標(biāo)記、第二標(biāo)記和由一種生物體的基因組核酸所編碼的蛋白序列；和(b)檢測(cè)所有蛋白-探針相互作用。
34.如權(quán)利要求29、30、31、32或33的方法，其中所述探針包括核酸、蛋白、小分子、藥物候選物或脂類(lèi)。
35.如權(quán)利要求34的方法，其中所述核酸包括RNA或DNA。
36.如權(quán)利要求34的方法，其中所述探針是酵母蛋白。
37.如權(quán)利要求36的方法，其中所述酵母蛋白是Myo2、Rho1、Rho2、Rho3、Rho4、Cdcl1、Cdcl2或Hsl7。
38.如權(quán)利要求34的方法，其中所述探針是抗體。
39.如權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體是針對(duì)細(xì)胞周期蛋白，激酶，GST，Clb5，Cla4，Ste20，Cdc42，PI(3，4)P2，PI(4)P，SPA2，CLB1，CLB2或Cdcl1的。
40.如權(quán)利要求34的方法，其中所述探針是鈣調(diào)蛋白。
41.如權(quán)利要求34的方法，其中所述探針包括選自下列的小分子ATP，GTP，cAMP，磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸。
42.如權(quán)利要求34的方法，其中所述探針包括磷脂酰膽堿或磷脂酰肌醇。
43.如權(quán)利要求34的方法，其中所述探針包括脂質(zhì)體。
44.如權(quán)利要求25、29、30、31、32或33的方法，其中所述探針來(lái)自哺乳動(dòng)物。
45.如權(quán)利要求44的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
46.如權(quán)利要求44的方法，其中所述多種蛋白是非人的。
47.如權(quán)利要求25、29、30、31、32或33的方法，其中所述多種蛋白通過(guò)His標(biāo)記結(jié)合在固體支持物上。
48.如權(quán)利要求25、29、30、31、32或33的方法，其中所述固體支持物包括鎳。
49.如權(quán)利要求25、29、30、31、32或33的方法，其中所述固體支持物包括鎳包被的載玻片。
50.如權(quán)利要求34的方法，還包括確定一種探針的身份的步驟，在所述檢測(cè)步驟中檢測(cè)到了該探針與一種蛋白的相互作用。
51.如權(quán)利要求50的方法，其中所述相互作用表明被鑒定的探針是抗細(xì)菌、抗真菌或抗病毒蛋白。
52.一種標(biāo)記用于結(jié)合實(shí)驗(yàn)中的蛋白的方法，包括以下步驟(a)將所述蛋白的不同的等份樣品與生物素轉(zhuǎn)運(yùn)化合物在一定條件下接觸一定的時(shí)間，產(chǎn)生在不同的等份樣品中被生物素化到不同程度的所述蛋白；和(b)將不同的等份樣品組合在一起，產(chǎn)生生物素化程度不同的蛋白的樣品。
53.一種檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟(a)將通過(guò)權(quán)利要求52的方法生產(chǎn)的生物素化蛋白的樣品與包括多種融合蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上；和(b)檢測(cè)所述陣列上的所有位置，其中在生物素化的蛋白和所述陣列上的蛋白之間發(fā)生了相互作用。
54.一種檢測(cè)結(jié)合蛋白的方法，包括以下步驟(a)將通過(guò)權(quán)利要求52的方法生產(chǎn)的生物素化蛋白的樣品與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上；(b)將所述陣列與和熒光劑結(jié)合的鏈親和素接觸；和(c)檢測(cè)所述陣列上出現(xiàn)熒光的所有位置，其中所述熒光表示在生物素化的蛋白和陣列上的蛋白之間發(fā)生了相互作用。
55.一種確定與磷脂酰膽堿相比，一種蛋白是否優(yōu)先結(jié)合磷脂酰肌醇的方法，包括以下步驟(a)將包括磷脂酰肌醇的探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上；(b)檢測(cè)蛋白-探針相互作用，其中在所述固體支持物的一個(gè)位置上的相互作用表示存在磷脂酰肌醇結(jié)合蛋白；(c)將包括磷脂酰膽堿的探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，所述蛋白包括步驟(a)中的相同蛋白的至少一些，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上；(d)檢測(cè)蛋白-探針相互作用，其中在所述固體支持物的一個(gè)位置上的相互作用表示存在磷脂酰膽堿結(jié)合蛋白；和(e)對(duì)于多種蛋白的每一種來(lái)說(shuō)，比較步驟(b)和(d)的結(jié)果。
56.一種確定磷脂是否調(diào)節(jié)細(xì)胞中的代謝途徑或信號(hào)傳導(dǎo)途徑，或所述代謝或信號(hào)傳導(dǎo)途徑是否出現(xiàn)在膜表面上的方法，包括以下步驟(a)將包括磷脂的探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述多種蛋白包括構(gòu)成所述途徑的至少一部分的一種或多種蛋白；和(b)檢測(cè)所述探針與所述途徑中的一種蛋白的相互作用；其中所述相互作用表示所述探針調(diào)節(jié)所述代謝途徑或信號(hào)傳導(dǎo)途徑，或所述途徑出現(xiàn)在膜表面上。
57.一種制備結(jié)合鈣調(diào)蛋白的非天然存在的蛋白的方法，包括制備包括以下序列的非天然存在的蛋白I/L-Q-X-X-K-K/X-G-B(SEQ ID NO1)，其中X是任何氨基酸，而B(niǎo)是堿性氨基酸。
58.一種確定翻譯后修飾在蛋白中的存在或缺乏的方法，包括以下步驟(a)將與所述翻譯后修飾結(jié)合的探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上；和(b)檢測(cè)所述探針與蛋白的所有相互作用；其中在所述固體支持物的一個(gè)位置上的所述相互作用表明在所述位置上的蛋白具有翻譯后修飾。
59.如權(quán)利要求58的方法，其中所述翻譯后修飾是甲基化、磷酸化、生物素化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、脂化、遍在化和sumolation。
60.一種制備酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，包括以下步驟(a)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中將多個(gè)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)到OD600為0.3-1.0，其中所述多個(gè)酵母細(xì)胞包括可操作地與調(diào)控序列連接的異源核苷酸序列；(b)將所述細(xì)胞與一種誘導(dǎo)物接觸，該誘導(dǎo)物能增強(qiáng)由所述異源核苷酸序列編碼的蛋白的表達(dá)；(c)從所述培養(yǎng)基中分離所述細(xì)胞；(d)將所述細(xì)胞與冷水接觸；(e)從所述冷水中分離所述細(xì)胞；(f)將所述細(xì)胞與冷的裂解緩沖液接觸；(g)從所述裂解緩沖液中分離所述細(xì)胞；和(h)冷凍所述細(xì)胞至半干以便保存。
61.一種從細(xì)胞中純化蛋白的方法，包括以下步驟(a)對(duì)于多個(gè)細(xì)胞樣品的每一種來(lái)說(shuō)，裂解每一個(gè)樣品中的細(xì)胞，以便產(chǎn)生細(xì)胞裂解物，其中所述細(xì)胞包括具有親和標(biāo)記的融合蛋白，并且，其中所述裂解步驟是用顏料震動(dòng)器完成的；(b)將每一種裂解液分離成可溶性級(jí)份和不可溶性級(jí)份；(c)將每一種可溶性級(jí)份轉(zhuǎn)移到多位點(diǎn)陣列的不同位點(diǎn)上，其中所述轉(zhuǎn)移步驟是用廣口吸頭完成的；(d)將每一種可溶性級(jí)份與一種結(jié)合制劑接觸，以便形成所述融合蛋白和結(jié)合制劑的復(fù)合物；(e)從所述復(fù)合物中分離每一種融合蛋白；和(f)將每一種融合蛋白保存在高粘度的緩沖液中。
62.鑒定一種信號(hào)是否是陽(yáng)性的方法，包括以下步驟(a)確定每一個(gè)斑點(diǎn)的局部主要信號(hào)和背景信號(hào)，并且根據(jù)所述主要信號(hào)和背景信號(hào)之間的差確定凈信號(hào)；(b)確定第一和第二凈信號(hào)分布的下部1/4、中間、和上部1/4值；(c)從所述第一凈信號(hào)分布中扣除第一中間值，并且從所述第二凈信號(hào)分布中扣除第二中間值，以分別獲得第一和第二扣除值；(d)用所述第一信號(hào)分布的上部和下部1/4值的差來(lái)除所述第一扣除值，并且用上部和下部1/4值的差來(lái)除所述第二標(biāo)度值，以分別獲得第一和第二標(biāo)度值；(e)確定相鄰區(qū)的標(biāo)度信號(hào)分布的局部中間值，其中所述相鄰區(qū)包括在所述部位上的多個(gè)位點(diǎn)；和(f)從標(biāo)度信號(hào)中扣除局部中間值，以獲得標(biāo)度的剩余值。
63.如權(quán)利要求62的方法，其中陽(yáng)性信號(hào)表示蛋白-探針相互作用。
64.如權(quán)利要求62的方法，其中相鄰區(qū)是所述信號(hào)上面兩行，下面兩行，左邊兩列，右邊兩列。
65.如權(quán)利要求62的方法，還包括當(dāng)一個(gè)樣品值和樣品值的平均值之間的差大于標(biāo)度剩余值的誤差的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的話，將標(biāo)度剩余值的平行樣品排除在外的步驟。
66.一種確定用多個(gè)不同的陣列測(cè)定的信號(hào)中的陽(yáng)性信號(hào)的方法，包括以下步驟(a)轉(zhuǎn)化用不同陣列測(cè)定的信號(hào)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化信號(hào)；(b)通過(guò)一種方法校正每一個(gè)轉(zhuǎn)化信號(hào)，所述方法包括從所述轉(zhuǎn)化信號(hào)中扣除一個(gè)局部中間信號(hào)，得到校正過(guò)的轉(zhuǎn)化信號(hào)，其中所述局部中間信號(hào)是相鄰區(qū)上的中間信號(hào)，所述相鄰區(qū)包括所述轉(zhuǎn)化信號(hào)位點(diǎn)周?chē)囊粋€(gè)或多個(gè)位點(diǎn)；和(c)將每一個(gè)校正過(guò)的轉(zhuǎn)化信號(hào)與一個(gè)閾值比較，當(dāng)所述校正過(guò)的轉(zhuǎn)化信號(hào)大于所述閾值時(shí)，將所述校正過(guò)的轉(zhuǎn)化信號(hào)確定為陽(yáng)性的；其中所述陣列包括含有多種蛋白的可定位尋址的陣列，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上。
67.如權(quán)利要求66的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟包括以下步驟(a)確定用每一種不同陣列測(cè)定的信號(hào)的信號(hào)分布的下部1/4值、中間值、和上部1/4值；(b)從用所述每一種不同陣列測(cè)定的信號(hào)中扣除所述中間值，獲得所述陣列的翻譯信號(hào)；和(c)用所述陣列的上部和下部1/4值的差來(lái)除所述翻譯信號(hào)，產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)化信號(hào)。
68.如權(quán)利要求66的方法，其中所述相鄰區(qū)由在所述轉(zhuǎn)化信號(hào)上面兩行，下面兩行，左側(cè)兩列和右側(cè)兩列的部位內(nèi)的位點(diǎn)組成。
69.如權(quán)利要求66、67或68的方法，其中所述陽(yáng)性信號(hào)表示蛋白-探針相互作用。
70.如權(quán)利要求66、67或68的方法，還包括去掉數(shù)據(jù)點(diǎn)的步驟，其中所述數(shù)據(jù)點(diǎn)在陣列的重復(fù)位點(diǎn)上測(cè)定；其中重復(fù)位點(diǎn)之間的偏差大于三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。
71.如權(quán)利要求66、67或68的方法，還包括用以下公式對(duì)所述校正的轉(zhuǎn)化信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)一化的步驟r+εr＝G+εG/R+εR其中G是校正過(guò)的轉(zhuǎn)化信號(hào)，R是GST信號(hào)，εG是G的誤差，εR是R的誤差，而εr是r的誤差。
72.如權(quán)利要求20的方法，其中所述多位點(diǎn)陣列是96-位點(diǎn)陣列。
73.一種制備可定位尋址的陣列的方法，包括將多種融合蛋白結(jié)合在固體支持物表面上的步驟，每一種融合蛋白位于固體支持物的不同位置上，其中所述融合蛋白包括第一標(biāo)記、第二標(biāo)記和由一種生物體的基因組核酸編碼的蛋白序列。
74.如權(quán)利要求62或65的方法，還包括以下步驟(a)對(duì)兩個(gè)重復(fù)位點(diǎn)的信號(hào)的值加以平均，以便獲得平均值；和(b)確定所述平均值是否大于所述標(biāo)度的剩余值的誤差三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，其中如果所述平均值大于所述標(biāo)度的剩余值的誤差三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，則所述斑點(diǎn)的信號(hào)是陽(yáng)性的。
75.一種確定蛋白的酶促活性的存在或缺乏的方法，包括以下步驟(a)將一種作為所述酶促活性的底物的探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上；和(b)檢測(cè)所述固體支持物的一個(gè)位置上的所述底物的任何催化作用；其中所述固體支持物的一個(gè)位置上的所述催化作用表示位于所述位置上的蛋白具有所述酶促活性。
76.確定一種酶底物在蛋白中的存在或缺乏的方法，包括以下步驟(a)將作為所述酶底物的酶的探針與包括多種蛋白的可定位尋址的陣列接觸，每一種蛋白位于固體支持物的不同位置上；和(b)檢測(cè)所述固體支持物的一個(gè)位置上的所述底物的任何催化作用；其中所述固體支持物的一個(gè)位置上的所述催化作用表示所述蛋白包括所述酶底物。
77.如權(quán)利要求1、3、4或5的陣列，其中所述蛋白通過(guò)生物素標(biāo)記結(jié)合在固體支持物上。
78.如權(quán)利要求15的方法，其中第一標(biāo)記存在于所述蛋白的羧基末端，而第二標(biāo)記存在于所述蛋白的氨基末端。
79.如權(quán)利要求22的方法，其中親和標(biāo)記是生物素。
80.如權(quán)利要求1、3、4或5的陣列，其中所述固體支持物包括硝酸纖維素包被的載玻片。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白組芯片，它具有在一個(gè)物種中表達(dá)的所有蛋白的大部分的陣列。本發(fā)明還涉及制備蛋白組芯片的方法。本發(fā)明還涉及利用蛋白組芯片以高處理量的方式系統(tǒng)地分析一個(gè)物種中所有蛋白的相互作用的方法。本發(fā)明還涉及以高密度陣列方式制備和純化嵌合蛋白的方法。本發(fā)明還涉及通過(guò)將雙重標(biāo)記的融合蛋白連接在固體支持物上制備蛋白陣列的方法。本發(fā)明還涉及用于確定一種信號(hào)是否是陽(yáng)性的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1527720SQ02814010
公開(kāi)日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2002年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月11日
發(fā)明者M·斯奈德, H·朱, P·博通, S·M·比德林邁爾, M·比爾金, A·J·卡薩馬約爾, M·格爾斯泰因, R·揚(yáng)森, N·藍(lán), M 斯奈德, 卡薩馬約爾, 固┮, 比德林邁爾 申請(qǐng)人:耶魯大學(xué)