專利名稱：通過(guò)熱硫化氫熱厭氧桿菌dna聚合酶i變體進(jìn)行的核酸標(biāo)記的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域熱硫化氫熱厭氧桿菌(Tts)DNA聚合酶已被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)并被純化。最近一份美國(guó)專利(美國(guó)專利5744312)已經(jīng)授予給Amersham生命科學(xué)公司。這種聚合酶的顯著特點(diǎn)是除了具有DNA依賴型DNA聚合酶催化活性外，還具有RNA依賴型DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶催化活性(美國(guó)專利5744312)。這種聚合酶的最佳溫度范圍是37-65℃，最大活性溫度是60℃。酶的這些活性結(jié)合其熱穩(wěn)定性產(chǎn)生了以下所討論的優(yōu)點(diǎn)。這種酶的幾種不同變體已經(jīng)獲得并應(yīng)用于DNA測(cè)序，第一鏈cDNA合成，RT-PCR和鏈置換擴(kuò)增。
2.相關(guān)技術(shù)描述從細(xì)菌，病毒，古細(xì)菌等不同生物分離出的DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶(RTs)已成功用于各種應(yīng)用的分子生物學(xué)領(lǐng)域。這些生物的生長(zhǎng)溫度范圍可以從極高到極低。從這些生物獲取的酶可以應(yīng)用于克隆，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(美國(guó)專利4683195，Mullis等.)，DNA測(cè)序，誘變，基因組文庫(kù)的構(gòu)建和核酸標(biāo)記，如微型和巨型陣列的cDNA標(biāo)記。
DNA聚合酶在DNA合成過(guò)程中能辨別非天然堿基的摻入。大多天然DNA聚合酶也不使用RNA作為模板分子，然而，反轉(zhuǎn)錄酶的天然模板是RNA和DNA。DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶的天然組成元件是四種脫氧核糖核苷酸(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)。大多天然存在的聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)大多核苷酸類似物表現(xiàn)出很弱的摻入效率。這些類似物可以是天然存在的dNTPs的變體，例如ddNTPs，rNTPs，dNTPs和ddNTPs的結(jié)合物(染料或其他)。在宿主的存活中這樣的選擇是很重要的。非天然堿基的頻繁摻入會(huì)阻礙后續(xù)的復(fù)制循環(huán)，導(dǎo)致生物的最終死亡。在極端條件下，假如聚合酶使非天然堿基摻入宿主，則有可能使生物最終存活下來(lái)。然而這種導(dǎo)致生物體突變的事件僅在極端情況下對(duì)其存活是必要的。因此，直接從宿主分離或通過(guò)重組方法獲得的具有野生型氨基酸序列的天然聚合酶表現(xiàn)出對(duì)非天然堿基的辨別作用是不常見(jiàn)的。然而，在類似物有非常高的濃度下，天然聚合酶在DNA合成中雖然很弱但還是會(huì)摻入這些類似物。這一特點(diǎn)目前被應(yīng)用于使用DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行核酸標(biāo)記的所有應(yīng)用中。用天然聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶制成的探針的比活性通常是比較低的，目前的使用天然酶來(lái)標(biāo)記的方法遇到了許多技術(shù)上的困難。例如，在反應(yīng)中使用過(guò)量的標(biāo)記核苷酸只能使這些天然存在的酶摻入標(biāo)記的熒光核苷酸的能力有輕微的提高。但這產(chǎn)生了另外的問(wèn)題。反應(yīng)后除去未使用的過(guò)量的標(biāo)記核苷酸通常是困難的，考慮到低的信噪比，這就產(chǎn)生了嚴(yán)重的問(wèn)題。另外，使用了大量通常稀有的原料，僅獲得了極少的標(biāo)記。除了這些問(wèn)題，還犧牲了產(chǎn)生的總探針的產(chǎn)量，這是由于野生型聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)一個(gè)已摻入的dNTP類似物，例如染料-dNTP的延伸的辨別性。這也是野生聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶的固有特點(diǎn)。
在不同應(yīng)用中更高專一性的探針是有應(yīng)用價(jià)值的，這需要染料-dNMP能很容易的添加以及隨后的延伸。染料-dNMP的添加及延伸的重復(fù)循環(huán)導(dǎo)致形成更高專一性的探針。由于天然聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)dNTP類似物或染料-dNTP的添加和延伸的辨別性，產(chǎn)生的探針的比活性很低。
如上所述，我們期望獲得一種改變聚合酶的天然特性，以便在DNA合成中使核苷酸類似物更好地?fù)饺搿＠?，摻入?biāo)記的核苷酸的能力的提高在不同核酸應(yīng)用如滾環(huán)擴(kuò)增和單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)中是很有用的。這將在下面更詳細(xì)的予以解釋。
發(fā)明概述相應(yīng)的，本發(fā)明的目的是提供一種具有酶活性的DNA聚合酶，它能夠提高核苷酸類似物和天然堿基在DNA合成中的摻入，還提供一種使用DNA聚合酶或其活性片斷摻入染料標(biāo)記的dNTPs的方法。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種利用DNA聚合酶進(jìn)行直接的RNA測(cè)序的方法和試劑盒，并且提供一種含有DNA聚合酶的試劑盒，用于標(biāo)記采用DNA或RNA引物從DNA或RNA模板獲得的多核苷酸。
本發(fā)明能滿足這些目標(biāo)，在一方面涉及一種DNA聚合酶或其活性片斷。該DNA聚合酶或活性片斷在氨基酸序列上具有同熱硫化氫熱厭氧桿菌DNA聚合酶或其片斷至少80％的同一性，并且在Tts Pol I位點(diǎn)720或ΔTts位點(diǎn)426或針對(duì)Tts DNA聚合酶確定的同源位點(diǎn)上有一個(gè)氨基酸改變，與未改變的酶相比提高了核苷酸類似物和天然堿基在DNA合成中的摻入。在一個(gè)實(shí)施方案中所述核苷酸類似物是dNTP，ddNTP和rNTP類似物。在第二個(gè)實(shí)施方案中，該dNTP，ddNTP和rNTP類似物是染料偶聯(lián)或生物素偶聯(lián)的，在第三個(gè)實(shí)施方案中染料偶聯(lián)核苷酸類似物中的染料是若丹明或花青衍生的染料，在第四個(gè)實(shí)施方案中若丹明染料是R110，R6G，TMR或ROX，在第五個(gè)實(shí)施方案中花青衍生染料是Cy3，Cy3.5，Cy5.0或Cy5.5，在第六個(gè)實(shí)施方案中DNA聚合酶在Tts Pol I位點(diǎn)720或ΔTts Pol I位點(diǎn)426的天冬氨酸被精氨酸取代。
本發(fā)明相關(guān)的一方面涉及使用熱硫化氫熱厭氧桿菌DNA聚合酶或其片斷的方法，該酶在Tts Pol I的位點(diǎn)720或ΔTts位點(diǎn)426或針對(duì)Tts DNA聚合酶確定的同源位點(diǎn)有一個(gè)氨基酸改變，與未改變的酶相比提高了核苷酸類似物和天然堿基在DNA合成中的摻入，用于在37-65℃的反應(yīng)溫度范圍摻入Cy3和Cy5染料偶聯(lián)的dNTPs。
更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及一種利用DNA聚合酶進(jìn)行直接RNA測(cè)序的方法，更進(jìn)一步的方面涉及提供含有DNA聚合酶的試劑盒，用于標(biāo)記采用DNA或RNA引物從DNA或RNA模板獲得的多核苷酸。
下面結(jié)合附圖對(duì)發(fā)明作出具體描述，以使本發(fā)明的上述目標(biāo)和特點(diǎn)顯得更加清楚。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1(SEQ ID NO1)是全長(zhǎng)Tts DNA聚合酶I的氨基酸序列。全長(zhǎng)重組形式的酶，具有天然的5’-3’DNA模板介導(dǎo)的DNA聚合酶功能和5’-3’核酸外切酶功能(在美國(guó)專利5744312中公開(kāi))，作為參考氨基酸序列，另外，這種酶具有反轉(zhuǎn)錄酶的活性。
圖1A(SEQ ID NO2)是全長(zhǎng)Tts DNA聚合酶I的DNA序列(在美國(guó)專利5744312中公開(kāi))。
圖2(SEQ ID NO3)是ΔTts DNA聚合酶I的氨基酸序列，一種氨基端被截短的5’-3’核酸外切酶缺陷(exo-)的酶形式(在美國(guó)專利5744312中公開(kāi))，方框內(nèi)部分代表從酶的全長(zhǎng)形式中缺失的氨基酸。
圖2A.ΔTts DNA聚合酶I的DNA序列(SEQ ID NO4)(在美國(guó)專利5744312中公開(kāi))。
圖3ΔTts DNA聚合酶I的F412Y變體的氨基酸序列(在美國(guó)專利5744312中公開(kāi))。方框內(nèi)部分代表從酶的全長(zhǎng)形式中缺失的氨基酸(ΔTts的位點(diǎn)412對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)酶的706，該位點(diǎn)的苯丙氨酸與辨別ddNTP有關(guān)，F(xiàn)412Y的改變促進(jìn)了ddNTP的摻入(SEQ ID NO5)。
圖3AΔTts DNA聚合酶I的F412Y變體的DNA序列(SEQ ID NO6)(在美國(guó)專利5744312中公開(kāi))。
圖4ΔTts F412YD426R變體聚合酶的氨基酸序列。方框部分是從酶的全長(zhǎng)形式中缺失的氨基酸，ΔTts位點(diǎn)412對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)酶的706，該位點(diǎn)的苯丙氨酸與辨別ddNTP有關(guān)。ΔTts位點(diǎn)426對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)酶的720。對(duì)于染料與dNTP，rNTP，ddNTP偶聯(lián)物的摻入和延伸的辨別作用由該位點(diǎn)天冬氨酸殘基支配。通過(guò)基于寡核苷酸的定點(diǎn)突變技術(shù)產(chǎn)生突變，以在Tts F412Y背景中引入ΔTtsD426R改變(SEQ ID NO7)。
圖5ΔTts D426R聚合酶的氨基酸序列。方框部分是從酶的全長(zhǎng)形式中缺失的氨基酸，ΔTts位點(diǎn)426對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)酶的720。對(duì)于染料與dNTP，rNTP，ddNTP偶聯(lián)物的摻入和延伸的辨別作用由該位點(diǎn)天冬氨酸殘基支配(SEQ ID NO8)圖6不同微生物的野生型Pol I序列的比對(duì)。顯示了Pol1家族的聚合酶“指紋區(qū)”附近的同源位點(diǎn)。Richardson，“DNA polymerase from Escherichia coli”，Procedures in Nucleic Acid Research，Cantoni，Davies editors，Harper，Row，NewYork，pp.263-276(1996).Scopes，Protein Purification，Springerverlag，New York，New York，pp.4648(1994)圖7ΔTtsPol I的D426R形式提高了染料(Cy3.5)-dCTP和dCTP的摻入圖8用AMV RT，ΔTts和ΔTtsF412Y Pol I進(jìn)行的直接RNA測(cè)序圖9ΔTts F412YD426R在使用Cy3和Cy5-dCTP進(jìn)行cDNA標(biāo)記中的性能和在微陣列應(yīng)用中的用途圖10ΔTts F412YD426R在使用Cy3和Cy5-dUTP進(jìn)行cDNA標(biāo)記中的性能和在微陣列應(yīng)用中的用途圖11ΔTts F412Y或ΔTtsF412YD426R Pol I在以RNA作模板的單核苷酸引物延伸(SnuPE)中的作用。顯示了染料標(biāo)記或未標(biāo)記的ddA，ddT，ddG，ddC的摻入。
圖12ΔTts DNA聚合酶在滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)中的應(yīng)用圖13DNA依賴型DNA合成ΔTts，ΔTts F412Y，ΔTtsF412YD426R過(guò)程中對(duì)染料標(biāo)記的核苷酸的摻入。
圖14a和bΔTtsF412YD426R在使用Cy3/Cy5-dCTP進(jìn)行cDNA標(biāo)記中的性能，顯示了在很寬的溫度范圍內(nèi)基因表達(dá)的精確測(cè)定。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開(kāi)了熱硫化氫熱厭氧桿菌的天然DNA聚合酶I和DNA聚合酶I變體形式在用熒光核苷酸類似物進(jìn)行核酸標(biāo)記中的用途。也涵蓋了例如cDNA標(biāo)記，滾環(huán)擴(kuò)增，RNA測(cè)序，和RNA上的單核苷酸引物延伸的領(lǐng)域中的應(yīng)用。
本發(fā)明中我們發(fā)現(xiàn)了改變聚合酶的天然特性以提高核苷酸類似物在DNA合成中的摻入的途徑。這里所描述的是可引入天然聚合酶/反轉(zhuǎn)錄酶以促進(jìn)熒光標(biāo)記核苷酸摻入的修飾。本發(fā)明鑒定了聚合酶中負(fù)責(zé)提高某些核苷酸類似物的摻入的一個(gè)單獨(dú)的氨基酸殘基。在該氨基酸位點(diǎn)殘基的改變導(dǎo)致該酶使染料標(biāo)記的核苷酸的摻入和延伸能力大大提高。這一特性應(yīng)用于通過(guò)DNA聚合酶使核苷酸類似物摻入來(lái)進(jìn)行熒光標(biāo)記的核酸應(yīng)用領(lǐng)域。這些應(yīng)用包括在例如用微陣列分析基因表達(dá)等多種應(yīng)用中，在DNA合成過(guò)程中進(jìn)行標(biāo)記。我們還展示了該酶的不同變體在直接RNA測(cè)序，滾環(huán)擴(kuò)增，使用DNA或RNA為模板通過(guò)單核苷酸引物延伸的單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)中的用途。本發(fā)明涉及酶的野生型和突變形式以及它們的DNA序列，氨基酸序列，以及用于產(chǎn)生它們的載體。
本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及產(chǎn)生和純化熱硫化氫熱厭氧桿菌的天然DNA聚合酶I的變體形式，該變體的聚合酶序列與圖1所示氨基酸序列(美國(guó)專利5744312)至少有80％同一性。
圖1顯示了在專利(美國(guó)專利5744312)(SEQ ID NO1)中披露的Tts基因組DNA位點(diǎn)1056-3674編碼的氨基酸參考序列。先前的公開(kāi)內(nèi)容中已經(jīng)對(duì)該酶進(jìn)行工程化以去除在天然酶中相關(guān)的5’-3’核酸外切酶功能，這里在圖2中作為參考序列示出。
為便于參考，在此列出了圖1，2，3(在美國(guó)專利5744312中公開(kāi))。圖1是酶的全長(zhǎng)重組形式，具有天然的5’-3’DNA模板介導(dǎo)的DNA聚合酶功能和5’-3’核酸外切酶(在美國(guó)專利5744312中公開(kāi))，在圖1中作為一個(gè)參考氨基酸序列。本說(shuō)明書(shū)中的酶的全長(zhǎng)形式將稱作Tts DNA Pol I。
圖2是酶的5’-3’核酸外切酶缺陷(exo-)形式，氨基末端被截短(在美國(guó)專利5744312中公開(kāi))。此處將酶的這種形式稱作ΔTts酶。酶的截短形式的氨基酸編號(hào)從截短形式的第一個(gè)氨基酸開(kāi)始計(jì)算。另外，在本說(shuō)明書(shū)的一些情況下，為了易于比較，氨基酸的編號(hào)也表示于酶的未截短的全長(zhǎng)形式。
圖3是酶的一種核酸外切酶缺陷的截短形式，在O-helix區(qū)位點(diǎn)412具有F(苯丙氨酸)變?yōu)閅(酪氨酸)的改變，在此列出作為參考(在美國(guó)專利5744312中公開(kāi))。
圖4是在酶的ΔTts F412Y形式的位點(diǎn)426中引入將天冬氨酸(D)改變?yōu)榫彼?R)的點(diǎn)突變的酶，酶的這種形式在此稱作ΔTts F412YD420R。
圖5顯示了稱作ΔTtsD426R的酶的另一種形式，將酶ΔTts F412Y形式的位點(diǎn)412從酪氨酸殘基(Y)恢復(fù)為苯丙氨酸(F)。單字母氨基酸是以本領(lǐng)域的傳統(tǒng)代碼表示。
美國(guó)專利5744312顯示了天然的Tts，ΔTts，ΔTts F412Y在cDNA制備，鏈的置換擴(kuò)增(Walker et al.″Isothermal in vitro amplification of DNA by a restrictionenzyme/DNA polymerase system，″Proc.natl.Acad.Sci.USA89392-396(1992))和DNA測(cè)序中的用途。
本發(fā)明顯示了不同形式的Tts酶在非天然堿基類似物在DNA合成中的摻入方面的應(yīng)用。一些例子是dNTPs，rNTPs，和ddNTPs的未標(biāo)記或染料標(biāo)記形式的摻入。DNA合成可以是DNA模板介導(dǎo)(DNA聚合酶活性)或RNA模板介導(dǎo)(反轉(zhuǎn)錄酶活性)。DNA或RNA模板介導(dǎo)的cDNA探針在微陣列領(lǐng)域有越來(lái)越高的需求。本發(fā)明證實(shí)這種酶變體在DNA合成中的核酸標(biāo)記，特別強(qiáng)調(diào)了在用于基因表達(dá)研究的微陣列領(lǐng)域的用途。
ddNTP或ddNTP類似物的摻入在例如DNA或RNA測(cè)序領(lǐng)域是非常有用的。在此證實(shí)了酶的ΔTts F412Y和ΔTts F412YD426R在例如直接RNA測(cè)序的領(lǐng)域和監(jiān)測(cè)單核苷酸引物延伸的情形中有很好的前景。例如ΔTts F412Y變體相對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄酶可以從RNA的短片斷中獲得很好的序列信息。本說(shuō)明書(shū)的試驗(yàn)結(jié)果還表明一些酶變體在用于探測(cè)DNA或RNA主鏈的靶序列的單核苷酸引物延伸(SnuPE)中的用途。
這一發(fā)現(xiàn)還應(yīng)用于涉及DNA或RNA的單多態(tài)性檢測(cè)和突變檢測(cè)的領(lǐng)域。RNA水平的直接突變檢測(cè)在許多方面都是有用的。這樣的領(lǐng)域的一個(gè)例子是從接受藥物治療的病人中檢測(cè)人免疫缺陷病毒(HIV)RNA的藥物抗性突變。HIV反轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶抑制因子的抗性突變直接歸結(jié)于RNA基因組中編碼這些蛋白的基因的突變。另外，在人和高等生物中導(dǎo)致缺陷mRNA的不正確RNA剪接與主要的疾病相關(guān)。依靠ΔTts F412Y或ΔTts F412YD426R變體利用SnuPE直接對(duì)限制片斷RNA測(cè)序或直接對(duì)不正確剪接的RNA進(jìn)行突變檢測(cè)是可行的。這同下述現(xiàn)行方法是不同的?，F(xiàn)行方法中由于逆轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄酶不是很好的測(cè)序酶，因此在測(cè)序之前需要進(jìn)行一個(gè)RT-PCR步驟。
除了突變檢測(cè)，Tts Pol I變體可被用于評(píng)估RNA拷貝數(shù)目。這在HIV研究或基因表達(dá)研究中很有價(jià)值。這種酶在cDNA合成中摻入染料-終止子和摻入染料標(biāo)記的dNTP及ddNTP的潛力可應(yīng)用于評(píng)估HIV-RNA的拷貝數(shù)，進(jìn)而評(píng)估病毒濃度。這種通過(guò)ΔTtsD426R得到染料標(biāo)記核苷酸摻入的特點(diǎn)在微型或巨型陣列的mRNA定量、基因表達(dá)研究中是有用的?？蛇x用目前廣泛應(yīng)用的策略1)用于評(píng)估病毒RNA和mRNA的定量RT-PCR，2)病毒的分支DNA/核酸酶切除和mRNA定量。
本發(fā)明還證實(shí)了Tts酶變體在鏈置換擴(kuò)增如滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)中的用途。
實(shí)施例下述實(shí)施例用以解釋本發(fā)明DNA聚合酶的用途，僅出于解釋目的，不應(yīng)該用于以任何方式用以限制所附權(quán)利要求。
實(shí)施例1ΔTtsF412YD426R變體的產(chǎn)生(圖4)攜帶美國(guó)專利5744312中披露的ΔTts F412Y的表達(dá)載體PLS-3作為本發(fā)明的起始質(zhì)粒。我們?cè)O(shè)計(jì)了引物使ΔTts Pol 1中編碼殘基426的密碼子從編碼天冬氨酸變?yōu)榫幋a精氨酸。我們使用了一個(gè)正向引物序列“gggctttctcgacgccttaaaatatca″(SEQ ID NO9)(編碼位點(diǎn)422到430)和一個(gè)互補(bǔ)序列來(lái)引入目的點(diǎn)突變。用于編碼氨基酸R的新密碼子是“cgc”。引物退火，然后在所有四種dNTPs存在下利用Pfu DNA聚合酶循環(huán)反應(yīng)以產(chǎn)生新鏈。最終產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，然后分別進(jìn)行DNA測(cè)序篩選，以選擇具有所需突變的克隆。
實(shí)施例2ΔTts D426R變體的產(chǎn)生(圖5)一個(gè)包含如實(shí)施例1所示具有ΔTts F412YD426R變體的質(zhì)粒的克隆作為產(chǎn)生ΔTts D426R變體的起始物質(zhì)。使用類似上述的策略。設(shè)計(jì)了兩個(gè)互補(bǔ)引物以在ΔTts F412YD426R位點(diǎn)412引入預(yù)期的最初的苯丙氨酸“F”殘基。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)正向引物GCCGTAAATTTTGGCATAATATATGGC(SEQ ID NO10)(跨ΔTts F412YD426R聚合酶的位點(diǎn)409到417)和一個(gè)互補(bǔ)序列以改變“Y”殘基。使用編碼苯丙氨酸的密碼子“TTT”以實(shí)施改變。
實(shí)施例3來(lái)源于不同微生物的野生型Pol I的比對(duì)圖6這里顯示了Pol I家族的聚合酶的指紋區(qū)的同源位點(diǎn)。注意對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)TtsPol I的位點(diǎn)720(ΔTts的位點(diǎn)426)的氨基酸的比對(duì)。方框區(qū)表明了這些酶之間的同源區(qū)。對(duì)應(yīng)于Tts Pol I 706位點(diǎn)的苯丙氨酸在對(duì)ddNTPs辨別方面的作用在此作為參考并已記錄于文獻(xiàn)。本專利的權(quán)利要求覆蓋全長(zhǎng)Tts DNA聚合酶I的720位點(diǎn)的氨基酸的作用。這一氨基酸的改變促進(jìn)染料標(biāo)記的核苷酸類似物的摻入。這一位點(diǎn)的負(fù)電荷氨基酸對(duì)于染料標(biāo)記核苷酸的摻入更有辨別性。改變?yōu)檎姾砂被崂缇彼幔嚢彼峄蚱渌蟮臍埢鶗?huì)降低對(duì)于dNTP或ddNTP偶聯(lián)物的辨別。天然聚合酶作為染料核酸標(biāo)記的應(yīng)用和天然具有除谷氨酸天冬氨酸外的殘基的聚合酶也包括在本專利中。
實(shí)施例4分析條件圖7中顯示的試驗(yàn)研究了染料-CTP(Cy3.5-dCTP)和dCTP的相對(duì)摻入效率。本試驗(yàn)對(duì)三種酶制劑ΔTts，ΔTtsF412Y，ΔTtsF412YD426R進(jìn)行了分析。
所有Tts Pol I變體的反轉(zhuǎn)錄酶(RNA依賴型DNA聚合酶)和DNA聚合酶(DNA依賴型DNA聚合酶)反應(yīng)的最佳的1x緩沖液組成如下所述。Tris，PH8.0(50mM)，KCL(40mM)，MgCl2(3mM)，DTT(1mM)，DNA或RNA模板(必需時(shí))，引物(5到50 femto mols)，酶0.5到1單位，dNTP或dNTP類似物(濃度根據(jù)需要改變)。在標(biāo)準(zhǔn)合成反應(yīng)中，當(dāng)監(jiān)測(cè)全長(zhǎng)合成時(shí)，還要包括50uM包括所有四種dNTPs。典型反應(yīng)體積是10uL，反應(yīng)溫度根據(jù)試驗(yàn)需要保持在37-60℃。對(duì)于單核苷酸摻入反應(yīng)時(shí)間限制在10分鐘。依試驗(yàn)?zāi)康目梢愿淖儠r(shí)間，如果進(jìn)行更長(zhǎng)的延伸有時(shí)則監(jiān)測(cè)最多至1小時(shí)。
圖7中顯示的試驗(yàn)研究了染料-CTP(Cy3.5-cCTP)和dCTP的相對(duì)摻入效率。本試驗(yàn)對(duì)三種酶制劑ΔTts，ΔTtsF412Y，ΔTtsF412YD426R進(jìn)行了分析。
圖7中，球蛋白mRNA作為模板。一個(gè)5’P-33標(biāo)記的引物(DNA 25聚體)與模板進(jìn)行退火。反應(yīng)中對(duì)單獨(dú)的Cy3.5-dCTP或dCTP控制濃度僅僅包括一種dNTP保證了下一步正確的單獨(dú)的核苷酸摻入。允許檢測(cè)單個(gè)核苷酸“C”摻入的模板-引物的序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’mRNA(SEQ ID NO11)TTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-16 3’-5’(SEQ ID NO12)第1，2，3和4道包含20，2，0.2和0.02uM的dNTP或染料-dNTP。沒(méi)有標(biāo)記的道沒(méi)有酶，顯示起始P-33標(biāo)記的引物的完整性。對(duì)單核苷酸延伸產(chǎn)物進(jìn)行定量是判斷酶中的DR改變是否產(chǎn)生了任何結(jié)果的一種方法?！癙”代表放射標(biāo)記的引物，“P+1”表示單個(gè)核苷酸或核苷酸類似物的延伸產(chǎn)物。P+1隨著染料-dNTP偶聯(lián)物緩慢移動(dòng)。注意含Cy3.5 dCMP的帶與dCTP延伸產(chǎn)物相比在凝膠上移動(dòng)緩慢。比較A，B，C板，1-4道都顯示出將酶的氨基酸主鏈從D改變到R導(dǎo)致天然核苷酸效率的提高。采用進(jìn)行了DR改變的酶，在較低dCTP濃度下獲得了10-100倍的P+1產(chǎn)物。同樣，比較A’，B’，C’可以發(fā)現(xiàn)DR改變導(dǎo)致染料-CTP摻入的提高。重要的是，與野生型聚合酶相比可在更低染料-dNTP濃度(低10倍)的情況下獲得摻入。很明顯，DR酶可在0.2uM(Cy3.5CTP)或甚至更低的濃度下?lián)饺隒y3.5dCTP。將其與D酶相比，在這么低的濃度下D酶表現(xiàn)出相對(duì)差的摻入。這些結(jié)果也表明該突變大大逆轉(zhuǎn)了在B板中所見(jiàn)的TtsF412Y對(duì)染料-CTP摻入的下降。在這一實(shí)驗(yàn)中模板-引物是與放射標(biāo)記的引物退火的mRNA。天然核苷酸的延伸定量監(jiān)測(cè)為P+1，染料標(biāo)記的核苷酸的延伸監(jiān)測(cè)為P+1*。這是第一次觀察到有希望用于cDNA探針標(biāo)記的微陣列應(yīng)用。
實(shí)施例5用AMV RT，ΔTts和ΔTtsF412Y Pol I直接進(jìn)行RNA測(cè)序(圖8)球蛋白mRNA作為模板。50聚體DNA作為引物。Amersham PharmaciaThermo Sequenase試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序成分用來(lái)測(cè)序。P-33標(biāo)記的終止子(ddNTP)是從Amersham Pharmacia Biotech獲得。測(cè)序后反應(yīng)產(chǎn)物是從6％尿素-聚丙烯酰胺凝膠上分離。AMV，禽成髓細(xì)胞瘤病毒RT。
實(shí)施例6ΔTtsF412YD426R在使用Cy3和Cy5-dCTP進(jìn)行cDNA標(biāo)記中的作用和在微陣列領(lǐng)域中的應(yīng)用(圖9)典型的20μl反應(yīng)，Cy3或Cy5反應(yīng)，在1x反應(yīng)緩沖液(50mM Tris，PH8.0，1mMDDT，40mM KC，100uM dA，G和TTP以及取決于反應(yīng)的50um CTP，Cy3-dCTP，或Cy5-dCTP中的每一種)中具有1ug人骨肌mRNA，寡dT(25)和隨機(jī)九聚體引物和TtsFYDR聚合酶。不同濃度的已知序列組成的對(duì)照mRNAs(APBiotech Inc.)作為動(dòng)態(tài)范圍和基因表達(dá)比值的對(duì)照。Tts反應(yīng)在從50℃開(kāi)始的溫度下進(jìn)行。模板RNA通過(guò)堿處理水解并用HEPES中和。
探針用MultiScreen濾器(Millipore)純化，用分光光度法計(jì)量。包含有人cDNA基因目標(biāo)的載玻片與同等量(每個(gè)30pmol)Cy3和Cy5標(biāo)記的cDNA探針雜交。載玻片用GenePix(Axon)掃描儀進(jìn)行掃描，用ImageQuant軟件進(jìn)行定量。此圖顯示了探針的精確特征，Cy3與Cy5的接近平均的摻入，和Cy3與Cy5反應(yīng)中的差示基因表達(dá)。
實(shí)施例7ΔTtsF412YD426R在使用Cy3和Cy5-dUTP進(jìn)行cDNA標(biāo)記中的作用和在微陣列領(lǐng)域中的應(yīng)用(圖10)典型的20μl反應(yīng)，Cy3或Cy5反應(yīng)，在1x反應(yīng)緩沖液(50mM Tris，PH8.0，1mMDDT，40mM KC，100uM dA，G和CTP以及取決于反應(yīng)的50um TTP，Cy3-dUTP，或Cy5-dUTP中的每一種)中具有1ug人骨肌mRNA，寡dT(25)和隨機(jī)九聚體引物和TtsFYDR聚合酶。不同濃度的已知序列組成的對(duì)照mRNAs(APBiotech Inc.)作為動(dòng)態(tài)范圍和基因表達(dá)比值的對(duì)照。Tts反應(yīng)在從50℃開(kāi)始的溫度下進(jìn)行。模板RNA通過(guò)堿處理水解并用HEPES中和。
探針用MultiScreen濾器(Millipore)純化，用分光光度法計(jì)量。包含有人cDNA基因目標(biāo)的載玻片與同等量(每個(gè)30pmol)Cy3和Cy5標(biāo)記的cDNA探針雜交。載玻片用GenePix(Axon)掃描儀進(jìn)行掃描，用ImageQuant軟件進(jìn)行定量。此圖顯示了探針的精確特征，Cy3與Cy5的接近平均的摻入，和Cy3與Cy5反應(yīng)中的差示基因表達(dá)。
實(shí)施例8ΔTtsF412Y或ΔTtsF412YD426R Pol I應(yīng)用于SnuPE，基于RNA的單核苷酸引物延伸以檢測(cè)目標(biāo)堿基(圖11)。第1道是dNTP(A，B，C，D中的板G，A，T或C)。第2道是冷ddNTP。第3道是染料標(biāo)記的ddNTP(連接臂長(zhǎng)度11個(gè)碳原子)。第4道是染料標(biāo)記的ddNTP(連接臂長(zhǎng)度4個(gè)碳原子)。染料選自若丹明家類，包括FAM，R6G，TMR，ROX，用4或11碳鍵偶聯(lián)于ddG，ddA，ddT和ddC。
檢測(cè)單核苷酸“G”摻入的模板-引物序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’mRNA(SEQ ID NO13)TCTTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-18(3’-5’)(SEQ ID NO14)檢測(cè)單核苷酸“A”摻入的模板-引物序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’mRNA(SEQ ID NO15)GTCTTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-19(3’-5’)(SEQ ID NO16)檢測(cè)單核苷酸“T”摻入的模板-引物序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’mRNA(SEQ ID NO17)CTTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-17(3’-5’)(SEQ ID NO18)檢測(cè)單核苷酸“C”摻入的模板-引物序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’mRNA(SEQ ID NO19)
TTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-16(3’-5’)(SEQ ID NO20)用Tts變體檢測(cè)染料-ddNTP或ddNTP的效率的分析如下所述。含有除了ddNTP或染料-ddNTP之外的所有反應(yīng)成分的混合物以如下方法制備。反應(yīng)包含下述成分Tris，PH8.0(50mM)，KCl(40mM)，MgCl2(3mM)DTT(1mM)dNTP或染料dNTP0.2uM(1，2，3，4道)，5’標(biāo)記的p-33引物(0.2皮摩爾)，mRNA球蛋白模板(100ng)，10ul反應(yīng)體積的酶。
各成分在60℃處理10分鐘，然后緩慢冷卻到37℃以允許進(jìn)行正確的退火，從而完成模板-引物退火。反應(yīng)在適當(dāng)溫度進(jìn)行10分鐘。然后加入6ul甲酰胺終止溶液終止反應(yīng)。分離樣品并在16％變性聚丙烯酰胺凝膠上分析。濕的疑膠在Whatmann濾紙上干燥，利用放射自顯影或磷光成像儀成像。
實(shí)施例9應(yīng)用ΔTts于RCA反應(yīng)(圖12)等溫滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)如下進(jìn)行。如下混合模板環(huán)形DNA與引物1(與環(huán)互補(bǔ))和2(與環(huán)的極性相同)，與包括酶的所有成分混合。反應(yīng)在55℃下進(jìn)行1小時(shí)，產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上分離然后分析。20ul的反應(yīng)液包括，Tris pH8.0(50uM)，KCl(40uM)，MgCl2(3uM)，DTT(1uM)，和dNTP(400uM)，引物1和2(各1uM)，模板和酶20單位。Tth Pol I反應(yīng)在70℃進(jìn)行，Bst DNAPol反應(yīng)在55℃進(jìn)行。
實(shí)施例10在DNA依賴型DNA合成中ΔTts，ΔTtsF412Y，ΔTtsF412YD426R對(duì)染料標(biāo)記的核苷酸的摻入作用(圖13)使用一個(gè)確定的模板-DNA引物監(jiān)測(cè)引物延伸在本實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)了染料-CTP(Cy3.5-dCTP)的相對(duì)摻入效率。檢測(cè)了ΔTts，ΔTtsF412Y，ΔTtsF412YD426R三種酶。
如下所示的確定的DNA作為模板。一個(gè)P-33標(biāo)記引物(DNA 25聚體)退火到模板上。反應(yīng)中對(duì)單獨(dú)的Cy3.5-dCTP或dCTP控制濃度。僅僅包括一種dNTP保證了接下來(lái)正確的單獨(dú)的核苷酸摻入。允許檢測(cè)單個(gè)核苷酸“C”的摻入的模板-引物的序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’DNA(SEQ ID NO21)TTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-16 3’-5’(SEQ ID NO22)1，2，3，4，5道包含了20，2，0.2，0.02和0uM染料-dCTP。5道沒(méi)有酶，以顯示起始P-33標(biāo)記的引物的完整性。定量單核苷酸延伸產(chǎn)物是辨別酶的DR改變是否產(chǎn)生了結(jié)果的一種方法。“P”表示放射標(biāo)記的引物，“P+1”表示單核苷酸或核苷酸類似物的延伸產(chǎn)物。P+1同染料-dNTP偶聯(lián)物緩慢移動(dòng)，注意含Cy3.5-dCTP的帶與dCMP延伸產(chǎn)物相比在膠體上移動(dòng)緩慢。比較板A，B，和C，1-4道都顯示出將酶的氨基酸主鏈從D改變到R導(dǎo)致天然核苷酸摻入效率的提高。采用進(jìn)行了DR改變的酶，在較低染料-dCTP濃度下，獲得了10-100倍的P+1產(chǎn)物。重要的是，與野生型聚合酶相比可在更低的染料-dNMP濃度下獲得摻入。很明顯DR酶可在0.2uM或甚至更低的濃度下?lián)饺隒y3.5-dCTP。與此相比，在這么低的濃度下D酶(野生型)表現(xiàn)出相對(duì)低的摻入。這些結(jié)果也表明該突變大大逆轉(zhuǎn)了在圖B板中所見(jiàn)的Tts F412Y對(duì)染料-CTP摻入作用的下降。這些結(jié)果證明了DR變體在DNA模板依賴型合成中的標(biāo)記方面的用途。
實(shí)施例11ΔTtsF412YD426R在使用Cy3/Cy5-dCTP的cDNA標(biāo)記中的性能，表明了在一個(gè)很寬的反應(yīng)溫度范圍內(nèi)的基因表達(dá)的精確測(cè)量(圖14a和b)20μl反應(yīng)，Cy3或Cy5反應(yīng)，在1x反應(yīng)緩沖液(50mM Tris，PH8.0，1mMDDT，40mM KC，100uM dA，G和TTP以及取決于反應(yīng)的50um CTP，Cy3-dCTP，Cy5-dCTP中的每一種)中具有1μg人骨骼肌mRNA，寡dT(25)和隨機(jī)九聚體引物和TtsFYDR聚合酶。不同濃度的已知序列組成的對(duì)照mRNAs(APBiotech Inc.)作為動(dòng)態(tài)范圍和基因表達(dá)比值的對(duì)照。Tts反應(yīng)在從37，42，45，50，55，60，65℃開(kāi)始的溫度下進(jìn)行。用Superscript II(LIFETECHNOLOGIES)，cDNA合成反應(yīng)在42℃下進(jìn)行。模板RNA通過(guò)堿處理水解并用HEPES中和。
探針用MultiScreen濾器(Millipore)純化，用分光光度法計(jì)量。包含人cDNA目標(biāo)基因的載玻片與同等量(各30pmol)的Cy3和Cy5標(biāo)記的cDNA探針雜交。載玻片用GenePix(Axon)掃描儀進(jìn)行掃描，用ImageQuant軟件進(jìn)行定量。將標(biāo)準(zhǔn)化因子2(由于Cy3和Cy5不同的激發(fā)效率)用于觀察到的粗熒光信號(hào)比值的標(biāo)準(zhǔn)化。本圖顯示了Cy3和Cy5反應(yīng)中基因表達(dá)差異的精確的測(cè)量。例如在所有的溫度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)化的觀察到的比值與目標(biāo)比值非常接近，表明使用ΔTtsF412YD426R在一個(gè)很寬的溫度范圍內(nèi)精確測(cè)定基因表達(dá)差異的能力。
實(shí)施例12蛋白純化方案ΔTtsF412YD426R或ΔTtsD426R Pol I純化方案以下是改進(jìn)用于將從1L LB培養(yǎng)基中收獲的細(xì)胞用于起始酶評(píng)價(jià)研究(典型濕細(xì)胞是產(chǎn)量4-6g)的方案。包含表達(dá)載體的大腸桿菌細(xì)胞根據(jù)先前的專利所描述的方法培養(yǎng)，收獲，冰貯直至準(zhǔn)備使用。每克濕細(xì)胞糊加入5ml溶胞緩沖液進(jìn)行溶胞作用(50mM Tris Ph8.0，1mM EDTA，50mM NaCl，10％甘油，并含有1mg/ml溶菌酶)。細(xì)胞在冰上放置40分鐘。重懸浮后細(xì)胞在15000PSI條件下通過(guò)弗氏壓碎機(jī)。溶胞之后，細(xì)胞抽提物在70℃下處理以使宿主酶失活。抽提物然后在12000rpm離心30分鐘。包含酶級(jí)分的上清液然后用做進(jìn)一步純化。
溶胞產(chǎn)物上樣于預(yù)先用緩沖液A(Tris 50Mm(PH7.5)，EDTA 1mM，Nacl150mM，10％甘油)平衡過(guò)的Q-Sepharose HP柱。該柱用緩沖液A沖洗四次，流速是8-10ml/分鐘。這一步驟選擇性地結(jié)合核酸，包含酶的流通液在接下來(lái)的柱中繼續(xù)使用。流通的樣品濃縮成小體積，通過(guò)切向流和透析過(guò)濾裝置去鹽以準(zhǔn)備通過(guò)下一個(gè)柱。樣品上樣于第二個(gè)預(yù)先用緩沖液B(Tris 50mM(PH7.5)，EDTA 1mM，10％甘油)平衡過(guò)的Q-Sepharose HP柱。該柱用三倍額外的柱體積的緩沖液B沖洗以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。ΔTts F412YD426R Pol I制劑物通過(guò)用NaCl建立0-30％梯度鹽而進(jìn)行洗脫。洗脫樣品通過(guò)緩沖液C(30mM磷酸鈉，30mM甲酸鈉，60mM醋酸鈉，1mM EDTA和10％甘油)透析。透析樣品上樣于預(yù)先用緩沖液C平衡過(guò)的Resource S柱。該柱用三倍額外的柱體積的緩沖液C沖洗以除去未結(jié)合的蛋白。ΔTtsF412YD426R Pol I通過(guò)使用NaCl建立0-50％鹽梯度洗脫。這一樣品包含了純化的酶制劑。
ΔTtsD426R Pol I應(yīng)用類似的純化方案。
序列表<110>AMERSHAM BIOSCIENCES CORP.
<120>通過(guò)熱硫化氫熱厭氧桿菌DNA聚合酶I變體進(jìn)行的核酸標(biāo)記<130>PB01107 PCT<140>PCT/US02/40798<141>2002-12-20<150>60/343,023<151>2001-12-20<160>32<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>872<212>PRT<213>熱硫化氫熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)<400>1Met Tyr Lys Phe Leu Ile Ile Asp Gly Ser Ser Leu Met Tyr Arg Ala1 5 10 15Tyr Tyr Ala Leu Pro Met Leu Thr Thr Ser Glu Gly Leu Pro Thr Asn20 25 30Ala Leu Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Ile Lys Leu Ile Glu Glu Glu35 40 45Lys Pro Asp Tyr Ile Ala Ile Ala Phe Asp Lys Lys Ala Pro Thr Phe50 55 60Arg His Lys Glu Tyr Gln Asp Tyr Lys Ala Thr Arg Gln Ala Met Pro65 70 75 80Glu Glu Leu Ala Glu Gln Val Asp Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gly85 90 95Phe Asn Ile Lys Thr Leu Glu Leu Glu Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Ile100 105 110Ile Gly Thr Ile Ser Lys Leu Ala Glu Glu Lys Gly Met Glu Val Leu115 120 125Val Val Thr Gly Asp Arg Asp Ala Leu Gln Leu Val Ser Asp Lys Val130 135 140Lys Ile Lys Ile Ser Lys Lys Gly Ile Thr Gln Met Glu Glu Phe Asp145 150 155 160Glu Lys Ala Ile Leu Glu Arg Tyr Gly Ile Thr Pro Gln Gln Phe Ile165 170 175Asp Leu Lys Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val180 185 190
Pro Asn Ile Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Leu Leu Lys Asp Phe Gly195 200 205Thr Ile Glu Asn Leu Ile Gln Asn Leu Ser Gln Leu Lys Gly Lys Ile210 215 220Lys Glu Asn Ile Glu Asn Asn Lys Glu Leu Ala Ile Met Ser Lys Arg225 230 235 240Leu Ala Thr Ile Lys Arg Asp Ile Pro Ile Glu Ile Asp Phe Glu Glu245 250 255Tyr Lys Val Lys Lys Phe Asn Glu Glu Lys Leu Leu Glu Leu Phe Asn260 265 270Lys Leu Glu Phe Phe Ser Leu Ile Asp Asn Ile Lys Lys Glu Ser Ser275 280 285Ile Glu Ile Val Asp Asn His Lys Val Glu Lys Trp Ser Lys Val Asp290 295 300Ile Lys Glu Leu Val Thr Leu Leu Gln Asp Asn Arg Ash Ile Ala Phe305 310 315 320Tyr Pro Leu Ile Tyr Glu Gly Glu Ile Lys Lys Ile Ala Phe Ser Phe325 330 335Gly Lys Asp Thr Val Tyr Ile Asp Val Phe Gln Thr Glu Asp Leu Lys340 345 350Glu Ile Phe Glu Lys Glu Asp Phe Glu Phe Thr Thr His Glu Ile Lys355 360 365Asp Phe Leu Val Arg Leu Ser Tyr Lys Gly Ile Glu Cys Lys Ser Lys370 375 380Tyr Ile Asp Thr Ala Val Met Ala Tyr Leu Leu Asn Pro Ser Glu Ser385 390 395 400Asn Tyr Asp Leu Asp Arg Val Leu Lys Lys Tyr Leu Lys Val Asp Val405 410 415Pro Ser Tyr Glu Gly Ile Phe Gly Lys Gly Arg Asp Lys Lys Lys Ile420 425 430Glu Glu Ile Asp Glu Asn Ile Leu Ala Asp Tyr Ile Cys Ser Arg Cys435 440 445Val Tyr Leu Phe Asp Leu Lys Glu Lys Leu Met Asn Phe Ile Glu Glu450 455 460Met Asp Met Lys Lys Leu Leu Leu Glu Ile Glu Met Pro Leu Val Glu465 470 475 480Val Leu Lys Ser Met Glu Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Lys Glu Val485 490 495Leu Lys Glu Leu Ser Gln Lys Ile Asp Asp Arg Ile Gly Glu Ile Leu500 505 510
Asp Lys Ile Tyr Lys Glu Ala Gly Tyr Gln Phe Asn Val Asn Ser Pro515 520 525Lys Gln Leu Ser Glu Phe Leu Phe Glu Lys Leu Asn Leu Pro Val Ile530 535 540Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Asp Ser Glu Val Leu Glu Gln545 550 555 560Leu Val Pro Tyr Asn Asp Ile Val Ser Asp Ile Ile Glu Tyr Arg Gln565 570 575Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Gly Phe Leu Pro Leu Met580 585 590Asp Glu Asn Asn Arg Val His Ser Asn Phe Lys Gln Met Val Thr Ala595 600 605Thr Gly Arg Ile Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile610 615 620Arg Glu Glu Phe Gly Arg Gln Ile Arg Arg Ala Phe Ile Pro Arg Ser625 630 635 640Arg Asp Gly Tyr Ile Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg645 650 655Val Leu Ala His Val Ser Gly Asp Glu Lys Leu Ile Glu Ser Phe Met660 665 670Asn Asn Glu Asp Ile His Leu Arg Thr Ala Ser Glu Val Phe Lys Val675 680 685Pro Met Glu Lys Val Thr Pro Glu Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val690 695 700Asn Phe Gly Ile Ile Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Arg Asp705 710 715 720Leu Lys Ile Ser Arg Lys Glu Ala Lys Glu Tyr Ile Asn Asn Tyr Phe725 730 735Glu Arg Tyr Lys Gly Val Lys Asp Tyr Ile Glu Lys Ile Val Arg Phe740 745 750Ala Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Thr Ile Met Asn Arg Arg Arg Tyr755 760 765Ile Pro Glu Ile Asn Ser Arg Asn Phe Thr Gln Arg Ser Gln Ala Glu770 775 780Arg Leu Ala Met Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile785 790 795 800Lys Met Ala Met Val Lys Val Tyr Asn Asp Leu Lys Lys Leu Lys Leu805 810 815Lys Ser Lys Leu Ile Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Val Asp Thr820 825 830
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Gly Lys Asp Thr Val Tyr Ile Asp Val Phe Gln Thr Glu Asp Leu Lys340 345 350Glu Ile Phe Glu Lys Glu Asp Phe Glu Phe Thr Thr His Glu Ile Lys355 360 365Asp Phe Leu Val Arg Leu Ser Tyr Lys Gly Ile Glu Cys Lys Ser Lys370 375 380Tyr Ile Asp Thr Ala Val Met Ala Tyr Leu Leu Asn Pro Ser Glu Ser385 390 395 400Asn Tyr Asp Leu Asp Arg Val Leu Lys Lys Tyr Leu Lys Val Asp Val405 410 415Pro Ser Tyr Glu Gly Ile Phe Gly Lys Gly Arg Asp Lys Lys Lys Ile420 425 430Glu Glu Ile Asp Glu Asn Ile Leu Ala Asp Tyr Ile Cys Ser Arg Cys435 440 445Val Tyr Leu Phe Asp Leu Lys Glu Lys Leu Met Asn Phe Ile Glu Glu450 455 460Met Asp Met Lys Lys Leu Leu Leu Glu Ile Glu Met Pro Leu Val Glu465 470 475 480Val Leu Lys Ser Met Glu Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Lys Glu Val485 490 495Leu Lys Glu Leu Ser Gln Lys Ile Asp Asp Arg Ile Gly Glu Ile Leu500 505 510Asp Lys Ile Tyr Lys Glu Ala Gly Tyr Gln Phe Asn Val Asn Ser Pro515 520 525Lys Gln Leu Ser Glu Phe Leu Phe Glu Lys Leu Asn Leu Pro Val Ile530 535 540Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Asp Ser Glu Val Leu Glu Gln545 550 555 560Leu Val Pro Tyr Asn Asp Ile Val Ser Asp Ile Ile Glu Tyr Arg Gln565 570 575Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Gly Phe Leu Pro Leu Met580 585 590Asp Glu Asn Asn Arg Val His Ser Asn Phe Lys Gln Met Val Thr Ala595 600 605Thr Gly Arg Ile Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile610 615 620Arg Glu Glu Phe Gly Arg Gln Ile Arg Arg Ala Phe Ile Pro Arg Ser625 630 635 640Arg Asp Gly Tyr Ile Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg645 650 655
Val Leu Ala His Val Ser Gly Asp Glu Lys Leu Ile Glu Ser Phe Met660 665 670Asn Asn Glu Asp Ile His Leu Arg Thr Ala Ser Glu Val Phe Lys Val675 680 685Pro Met Glu Lys Val Thr Pro Glu Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val690 695 700Asn Tyr Gly Ile Ile Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Arg Arg705 710 715 720Leu Lys Ile Ser Arg Lys Glu Ala Lys Glu Tyr Ile Asn Asn Tyr Phe725 730 735Glu Arg Tyr Lys Gly Val Lys Asp Tyr Ile Glu Lys Ile Val Arg Phe740 745 750Ala Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Thr Ile Met Asn Arg Arg Arg Tyr755 760 765Ile Pro Glu Ile Asn Ser Arg Asn Phe Thr Gln Arg Ser Gln Ala Glu770 775 780Arg Leu Ala Met Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile785 790 795 800Lys Met Ala Met Val Lys Val Tyr Asn Asp Leu Lys Lys Leu Lys Leu805 810 815Lys Ser Lys Leu Ile Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Val Asp Thr820 825 830Tyr Lys Asp Glu Val Asp Ile Ile Lys Lys Ile Leu Lys Glu Asn Met835 840 845Glu Asn Val Val Gln Leu Lys Val Pro Leu Val Val Glu Ile Gly Val850 855 860Gly Pro Asn Trp Phe Leu Ala Lys865 870<210>8<211>872<212>PRT<213>熱硫化氫熱厭氧桿菌<400>8Met Tyr Lys Phe Leu Ile Ile Asp Gly Ser Ser Leu Met Tyr Arg Ala1 5 10 15Tyr Tyr Ala Leu Pro Met Leu Thr Thr Ser Glu Gly Leu Pro Thr Asn20 25 30Ala Leu Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Ile Lys Leu Ile Glu Glu Glu35 40 45Lys Pro Asp Tyr Ile Ala Ile Ala Phe Asp Lys Lys Ala Pro Thr Phe50 55 60
Arg His Lys Glu Tyr Gln Asp Tyr Lys Ala Thr Arg Gln Ala Met Pro65 70 75 80Glu Glu Leu Ala Glu Gln Val Asp Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gly85 90 95Phe Asn Ile Lys Thr Leu Glu Leu Glu Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Ile100 105 110Ile Gly Thr Ile Ser Lys Leu Ala Glu Glu Lys Gly Met Glu Val Leu115 120 125Val Val Thr Gly Asp Arg Asp Ala Leu Gln Leu Val Ser Asp Lys Val130 135 140Lys Ile Lys Ile Ser Lys Lys Gly Ile Thr Gln Met Glu Glu Phe Asp145 150 155 160Glu Lys Ala Ile Leu Glu Arg Tyr Gly Ile Thr Pro Gln Gln Phe Ile165 170 175Asp Leu Lys Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val180 185 190Pro Asn Ile Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Leu Leu Lys Asp Phe Gly195 200 205Thr Ile Glu Asn Leu Ile Gln Asn Leu Ser Gln Leu Lys Gly Lys Ile210 215 220Lys Glu Asn Ile Glu Asn Asn Lys Glu Leu Ala Ile Met Ser Lys Arg225 230 235 240Leu Ala Thr Ile Lys Arg Asp Ile Pro Ile Glu Ile Asp Phe Glu Glu245 250 255Tyr Lys Val Lys Lys Phe Asn Glu Glu Lys Leu Leu Glu Leu Phe Asn260 265 270Lys Leu Glu Phe Phe Ser Leu Ile Asp Asn Ile Lys Lys Glu Ser Ser275 280 285Ile Glu Ile Val Asp Asn His Lys Val Glu Lys Trp Ser Lys Val Asp290 295 300Ile Lys Glu Leu Val Thr Leu Leu Gln Asp Asn Arg Asn Ile Ala Phe305 310 315 320Tyr Pro Leu Ile Tyr Glu Gly Glu Ile Lys Lys Ile Ala Phe Ser Phe325 330 335Gly Lys Asp Thr Val Tyr Ile Asp Val Phe Gln Thr Glu Asp Leu Lys340 345 350Glu Ile Phe Glu Lys Glu Asp Phe Glu Phe Thr Thr His Glu Ile Lys355 360 365Asp Phe Leu Val Arg Leu Ser Tyr Lys Gly Ile Glu Cys Lys Ser Lys370 375 380
Tyr Ile Asp Thr Ala Val Met Ala Tyr Leu Leu Asn Pro Ser Glu Ser385 390 395 400Asn Tyr Asp Leu Asp Arg Val Leu Lys Lys Tyr Leu Lys Val Asp Val405 410 415Pro Ser Tyr Glu Gly Ile Phe Gly Lys Gly Arg Asp Lys Lys Lys Ile420 425 430Glu Glu Ile Asp Glu Asn Ile Leu Ala Asp Tyr Ile Cys Ser Arg Cys435 440 445Val Tyr Leu Phe Asp Leu Lys Glu Lys Leu Met Asn Phe Ile Glu Glu450 455 460Met Asp Met Lys Lys Leu Leu Leu Glu Ile Glu Met Pro Leu Val Glu465 470 475 480Val Leu Lys Ser Met Glu Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Lys Glu Val485 490 495Leu Lys Glu Leu Ser Gln Lys Ile Asp Asp Arg Ile Gly Glu Ile Leu500 505 510Asp Lys Ile Tyr Lys Glu Ala Gly Tyr Gln Phe Asn Val Asn Ser Pro515 520 525Lys Gln Leu Ser Glu Phe Leu Phe Glu Lys Leu Asn Leu Pro Val Ile530 535 540Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Asp Ser Glu Val Leu Glu Gln545 550 555 560Leu Val Pro Tyr Asn Asp Ile Val Ser Asp Ile Ile Glu Tyr Arg Gln565 570 575Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Gly Phe Leu Pro Leu Met580 585 590Asp Glu Asn Asn Arg Val His Ser Asn Phe Lys Gln Met Val Thr Ala595 600 605Thr Gly Arg Ile Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile610 615 620Arg Glu Glu Phe Gly Arg Gln Ile Arg Arg Ala Phe Ile Pro Arg Ser625 630 635 640Arg Asp Gly Tyr Ile Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg645 650 655Val Leu Ala His Val Ser Gly Asp Glu Lys Leu Ile Glu Ser Phe Met660 665 670Asn Asn Glu Asp Ile His Leu Arg Thr Ala Ser Glu Val Phe Lys Val675 680 685Pro Met Glu Lys Val Thr Pro Glu Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val690 695 700Asn Phe Gly Ile Ile Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Arg Asp
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<223>人工序列的描述引物<400>9gggctttctc gacgccttaa aatatca 27<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10gccgtaaatt ttggcataat atatggc 27<210>11<211>50<212>DNA
<213>熱硫化氫熱厭氧桿菌<400>11caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca50<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>12ggcattggcc acaccagcca ccacctt 27<210>13<211>50<212>DNA<213>熱硫化氫熱厭氧桿菌<400>13caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca50<210>14<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14ggcattggcc acaccagcca ccaccttct 29<210>15<211>50<212>DNA<213>熱硫化氫熱厭氧桿菌<400>15caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca50<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>16ggcattggcc acaccagcca ccaccttctg 30
<210>17<211>50<212>DNA<213>熱硫化氫熱厭氧桿菌<400>17caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca50<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>18ggcattggcc acaccagcca ccaccttc28<210>19<211>50<212>DMA<213>熱硫化氫熱厭氧桿菌<400>19caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca50<210>20<211>27<212>DMA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>20ggcattggcc acaccagcca ccacctt 27<210>21<211>50<212>DNA<213>熱硫化氫熱厭氧桿菌<400>21caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca50<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>22ggcattggcc acaccagcca ccacctt 27<210>23<211>40<212>PRT<213>海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)<400>23Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu Met Arg Arg Ala Gly Lys1 5 10 15Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val Thr Pro Tyr Gly Leu Ser20 25 30Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys35 40<210>24<211>40<212>PRT<213>那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)<400>24Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Asn Glu Glu Met Arg Arg Val Gly Lys1 5 10 15Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val Thr Pro Tyr Gly Leu Ser20 25 30Val Arg Leu Gly Ile Pro Val Lys35 40<210>25<21l>40<212>PRT<213>Thermotoga subterranea<400>25Gly Val Ser Glu Met Phe Val Ser Glu Gln Met Arg Arg Val Gly Lys1 5 10 15Met Val Asn Phe Ala Ile Ile Tyr Gly Val Ser Pro Tyr Gly Leu Ser20 25 30Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser35 40<210>26<211>40<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>26Gly Leu Pro Leu Glu Thr Val Thr Ser Glu Gln Arg Arg Ser Ala Lys1 5 10 15
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Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys1 5 10 15Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser20 25 30Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu35 40<210>31<211>40<212>PRT<213>水生棲熱菌(Thermus aquaticus)<400>31Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys1 5 10 15Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser20 25 30Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu35 40<210>32<211>40<212>PRT<213>熱硫化氫熱厭氧桿菌<400>32Lys Val Pro Met Glu Lys Val Thr Pro Glu Met Arg Arg Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Val Asn Phe Gly Ile Ile Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ser20 25 30Arg Asp Leu Lys Ile Ser Arg Lys35 40
權(quán)利要求
1.一種具有酶活性的DNA聚合酶或其活性片斷，在氨基酸序列上具有同熱硫化氫熱厭氧桿菌DNA聚合酶或其片斷至少80％的同一性，并且在Tts PolI位點(diǎn)720或ΔTts Pol I位點(diǎn)426或針對(duì)Tts DNA聚合酶I確定的同源位點(diǎn)上有一個(gè)氨基酸的改變，與未改變的酶相比提高了核苷酸類似物和天然堿基在DNA合成中的摻入。
2.權(quán)利要求1的聚合酶，其中所述核苷酸類似物是dNTP，ddNTP和rNTP類似物。
3.權(quán)利要求2的聚合酶，其中所述dNTP，ddNTP和rNTP類似物是染料-偶聯(lián)或生物素偶聯(lián)的dNTP，ddNTP和rNTP。
4.權(quán)利要求3的聚合酶，其中所述染料-偶聯(lián)的dNTP，ddNTP和rNTP中的染料是若丹明或花青衍生的染料。
5.權(quán)利要求4的聚合酶，其中所述若丹明染料是R110，R6G，TMR或Rox。
6.權(quán)利要求4的聚合酶，其中所述花青衍生的染料是Cy3，Cy3.5，Cy5.0或Cy5.5。
7.權(quán)利要求1的聚合酶，其中所述聚合酶在Tts Pol I位點(diǎn)720或ΔTtsPolI位點(diǎn)426的天冬氨酸被精氨酸取代。
8.利用權(quán)利要求1的聚合酶進(jìn)行直接RNA測(cè)序的方法。
9.利用權(quán)利要求1的聚合酶在37-65℃的反應(yīng)溫度范圍摻入Cy3和Cy5染料偶聯(lián)的dNTPs的方法。
10.包含權(quán)利要求1的DNA聚合酶的試劑盒，該試劑盒用于標(biāo)記采用DNA或RNA引物從DNA或RNA模板獲得的多核苷酸。
全文摘要
一種具有酶活性的DNA聚合酶或其活性片斷，在氨基酸序列上具有同熱硫化氫熱厭氧桿菌DNA聚合酶或其片斷至少80％的同一性，并且在Tts Pol I位點(diǎn)720或ΔTts Pol I位點(diǎn)426或針對(duì)Tts DNA聚合酶I確定的同源位點(diǎn)上有一個(gè)氨基酸的改變，與未改變的酶相比提高了核苷酸類似物和天然堿基在DNA合成中的摻入。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1604907SQ02825310
公開(kāi)日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月20日
發(fā)明者M·達(dá)維斯, C·帕拉尼亞潘 申請(qǐng)人:阿默森生物科學(xué)有限公司