專利名稱：酪酸菌活菌制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種酪酸菌活菌制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
酪酸菌即丁酸梭菌(Clostridium butyrium)是歸屬于梭菌屬的革蘭氏陽(yáng)性厭氧芽孢桿菌，存在于土壤、動(dòng)物和人體的腸道中。其主要代謝產(chǎn)物為丁酸、乙酸，其中丁酸為動(dòng)物體腸道上皮組織細(xì)胞新陳代謝不可缺少的能源，對(duì)腸道疾患所致腸上皮組織的修復(fù)具有十分重要的作用；酪酸菌是人和動(dòng)物體內(nèi)正常菌群之一，它能夠促進(jìn)機(jī)體腸道內(nèi)有益菌群(雙歧桿菌、乳酸菌等)的增殖和發(fā)育，抑制腸道內(nèi)腐敗菌和有害菌的生長(zhǎng)繁殖，糾正腸道內(nèi)菌群紊亂，減少和降低腸毒素的產(chǎn)生；與雙歧桿菌、乳酸菌等腸道有益菌不同的是，由于酪酸菌具有芽孢，因而對(duì)外界環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，把它加熱至90℃10分鐘、100℃5分鐘不會(huì)失活，在PH 1.0-5.0的環(huán)境中仍能存活，在PH 4.0-9.8的環(huán)境中能適合其發(fā)育生長(zhǎng)，其固體活菌制劑在室溫、干燥情況下保存具有良好的穩(wěn)定性，保存2年以上，未見(jiàn)活菌顯著減少。
正是由于酪酸菌具有其獨(dú)特的生物特點(diǎn)，早在四十年代，日本就已經(jīng)把它開發(fā)成治療胃腸道疾病的藥品。近半個(gè)世紀(jì)來(lái)，日本產(chǎn)的酪酸菌活菌制劑——米雅系列產(chǎn)品在日本、韓國(guó)、中國(guó)等亞洲國(guó)家和地區(qū)廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)、小兒、外科、腫瘤、婦產(chǎn)科等種種原因引起的腸道菌群失調(diào)、急慢性腹瀉、腸易激綜合征、抗生素相關(guān)性腸炎、便秘或腹瀉便秘交替癥等疾病的治療，療效確切，另外，酪酸菌制劑亦可作為腸炎、各種肝病、化放療造成人體免疫力下降、菌群失調(diào)的良好輔助治療藥物。
在本世紀(jì)以前，我國(guó)沒(méi)有自己生產(chǎn)的酪酸菌活菌制劑產(chǎn)品，中國(guó)各大醫(yī)院臨床上一直是應(yīng)用的日本產(chǎn)品。近兩年來(lái)，國(guó)內(nèi)先后有兩家企業(yè)取得了酪酸菌活菌制劑產(chǎn)品的新藥證書，并實(shí)現(xiàn)了該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化，但還存在著生產(chǎn)規(guī)模偏小，冷凍干燥菌粉活菌含量還不夠高，芽孢形成率偏低，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品存放穩(wěn)定性差等問(wèn)題。但是，目前尚未發(fā)現(xiàn)獸用酪酸菌活菌制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高芽孢形成率、高活菌含量的酪酸菌活菌制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種酪酸菌活菌制劑的制備方法為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案本發(fā)明酪酸菌活菌制劑，由酪酸菌在酪酸菌種子培養(yǎng)基中經(jīng)三級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)和在酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，再經(jīng)菌體收集、干燥制粉、菌粉檢驗(yàn)、配料、成品檢驗(yàn)、包裝工序制得；所說(shuō)酪酸菌種子培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成蛋白胨0.5％～2.0％、酵母膏0.3％～1.8％、磷酸氫二鉀0.02％～0.5％、磷酸二氫鉀0.02％～0.5％、硫酸鎂0.02％～0.2％、葡萄糖0.8％～2.0％、水94.5％～96.8％，培養(yǎng)基的PH 5.0～8.5；
所說(shuō)酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成蛋白胨0.5％～2.0％、酵母膏0.3％～1.8％、磷酸氫二鉀0.02％～0.5％、磷酸二氫鉀0.02％～0.5％、硫酸鎂0.02％～0.2％、淀粉0.2％～2.0％、碳酸鈣0.1％～1.0％、水93.8％～97.0％，培養(yǎng)基的PH 5.0～8.5。
本發(fā)明酪酸菌活菌制劑的制備方法依次由下述工藝步驟組成1、一級(jí)種子培養(yǎng)取酪酸菌生產(chǎn)種子凍干管菌種，接種于酪酸菌種子培養(yǎng)基中，在30～38℃厭氧培養(yǎng)14～18h；2、二級(jí)種子培養(yǎng)一級(jí)種子以5～10％的接種量接種于酪酸菌種子培養(yǎng)基中，在30～38℃厭氧培養(yǎng)14～18h；3、三級(jí)種子培養(yǎng)二級(jí)種子以5～10％的接種量接種于酪酸菌種子培養(yǎng)基，在30～38℃厭氧培養(yǎng)13～18h，各級(jí)種子培養(yǎng)完畢均應(yīng)檢查其生長(zhǎng)狀態(tài)及純度；4、發(fā)酵三級(jí)種子以5～10％的接種量接種于酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基，控制罐壓0.04MPa～0.06MPa，在30～38℃厭氧發(fā)酵培養(yǎng)16～24h，直至芽孢形成率＞80％，發(fā)酵完畢應(yīng)檢查其有無(wú)污染，如有污染應(yīng)予以廢棄；5、菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用高速管式離心機(jī)收集菌體，轉(zhuǎn)速≥16000r/min，獲得濕菌泥；6、干燥制粉濕菌泥稱重，按1∶2～10的重量比，加入重量比為20％的無(wú)菌脫脂奶液，混合均勻，進(jìn)行真空冷凍干燥，先在-40℃預(yù)凍2～3h，然后抽真空，真空度為2～20Pa，干燥過(guò)程中溫度逐漸升至28℃，整個(gè)干燥過(guò)程為20～28h。干燥完畢后粉碎，過(guò)80目篩，制成菌粉；7、菌粉檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1.0×109個(gè)；8、配料將事先在120℃干燥4～6h的玉米淀粉和步驟6制成的菌粉按重量配比9～50∶1的比例進(jìn)行配料混合，即得本發(fā)明酪酸菌活菌制劑的成品；9、成品檢驗(yàn)要求每克成品含酪酸菌活菌數(shù)不少于1.0×108個(gè)；10、包裝出廠包裝后經(jīng)抽樣進(jìn)行全檢，合格后方可出廠。
所述培養(yǎng)基的最適PH值為6.5～7.5，最適發(fā)酵溫度為36～37℃。
本發(fā)明制備的酪酸菌活菌制劑，芽孢率高、活菌含量高、價(jià)格低廉、人獸兩用，可用于各種原因引起的人體腸道菌群失調(diào)、急慢性腹瀉、腸易激綜合癥、與抗生素相關(guān)性腸炎、便秘或腹瀉便秘交替癥等疾病的治療，而且通過(guò)對(duì)豬、雞的毒理、藥理及藥效學(xué)研究和大規(guī)模的臨床試驗(yàn)證明在飼料中添加3.0‰的酪酸菌活菌制劑，對(duì)豬、雞無(wú)不良影響，仔豬腹瀉發(fā)病率降低了36.9％，并有較好的預(yù)防和促生長(zhǎng)作用；用酪酸菌活菌制劑治療仔豬、雛雞白痢病，均有較好的療效，平均治愈率分別為80.64％和95.91％，達(dá)到甚至超過(guò)了抗菌素的平均治愈率；在飼料中添加0.5‰～1.0‰的酪酸菌活菌制劑，可有效預(yù)防雞、豬的腸道疾病，并有效地促進(jìn)它們的生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式
以500升發(fā)酵罐為例實(shí)施例1酪酸菌種子培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成蛋白胨0.5、酵母膏1.8、磷酸氫二鉀0.5、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.2、葡萄糖2.0、水、94.5(水按ml計(jì)，余者按g計(jì))，種子培養(yǎng)的PH5.0～6.0；酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成蛋白胨0.5、酵母膏1.8、磷酸氫二鉀0.5、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.2、淀粉2.0、碳酸鈣1.0、水93.5(水按ml計(jì)，余者按g計(jì))，發(fā)酵培養(yǎng)基的PH5.0～6.0；酪酸菌冷凍管菌種由江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司提供按下述工藝步驟完成1、一級(jí)種子的培養(yǎng)在150ml三角瓶中裝有種子培養(yǎng)基100ml，121℃滅菌30min后，接入酪酸菌冷凍管菌種，于厭氧條件下培養(yǎng)，溫度30～31℃，培養(yǎng)14h。
2、二級(jí)種子培養(yǎng)在2000ml三角瓶中裝有種子培養(yǎng)基1000ml，121℃滅菌30min后接入長(zhǎng)好的一級(jí)種子50ml，于厭氧條件下培養(yǎng)，溫度30～31℃，培養(yǎng)14h。
3、三級(jí)種子培養(yǎng)在50升罐中裝有培養(yǎng)基19升，121℃滅菌30min，接入長(zhǎng)好的二級(jí)種子1升，于厭氧條件下培養(yǎng)，溫度30～31℃，培養(yǎng)13～15h。
4、500升發(fā)酵罐培養(yǎng)將發(fā)酵培養(yǎng)基裝量380升，121℃滅菌30min，接入長(zhǎng)好的三級(jí)種子20升，控制罐壓0.04MPa～0.06MPa，發(fā)酵溫度30～31℃，培養(yǎng)時(shí)間16～24h。
5、菌體收集將培養(yǎng)好的發(fā)酵液用管式離心機(jī)收集菌體，轉(zhuǎn)速≥16000r/min，獲得濕菌泥。
6、干燥制粉將濕菌泥與重量比為20％的無(wú)菌脫脂奶按1∶2的重量比混勻，裝入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，先在-40℃預(yù)凍2～3h，然后抽真空，真空度為2～20Pa，干燥過(guò)程中溫度逐漸升至28℃，整個(gè)干燥過(guò)程為20～28h。干燥完畢，將干菌塊進(jìn)行粉碎、過(guò)80目篩，制成菌粉。采用上述工藝可得冷凍干燥菌粉2.8～3.0Kg，菌粉含酪酸菌活菌數(shù)≥1.0×109個(gè)/克。
7、成品制備根據(jù)菌粉的活菌數(shù)加入適量的輔料混勻制成成品，每克成品含酪酸菌活菌數(shù)不少于1.0×108個(gè)。輔料為事先120℃干燥4～6h的玉米淀粉，將菌粉和輔料充分混合后包裝成不同規(guī)格的產(chǎn)品。
實(shí)施例2 根據(jù)實(shí)施例1，酪酸菌種子培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成蛋白胨1.25、酵母膏1.15、磷酸氫二鉀0.26、磷酸二氫鉀0.26、硫酸鎂0.11、葡萄糖1.4、水95.57(水按ml計(jì)，余者按g計(jì))，種子培養(yǎng)的PH6.5～7.5；酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成蛋白胨1.25、酵母膏1.25、磷酸氫二鉀0.26、磷酸二氫鉀0.26、硫酸鎂0.11、淀粉1.4、碳酸鈣0.55、水93.5(水按ml計(jì)，余者按g計(jì))，發(fā)酵培養(yǎng)基的PH6.5～7.5；1、一級(jí)種子的培養(yǎng)將酪酸菌冷凍管分別接種至2個(gè)裝有110ml種子培養(yǎng)基的150ml三角瓶中，于厭氧條件下培養(yǎng)，溫度34-35℃，培養(yǎng)16h。
2、二級(jí)種子的培養(yǎng)在2個(gè)2000ml三角瓶中裝培養(yǎng)基1390ml，121℃滅菌30min后分別接入長(zhǎng)好的一級(jí)種子110ml，于厭氧條件下培養(yǎng)，溫度34-35℃，培養(yǎng)16h。
3、三級(jí)種子的培養(yǎng)在50升罐中裝培養(yǎng)基27.8升，121℃滅菌30min后接入長(zhǎng)好的二級(jí)種子2.25升，于厭氧條件下培養(yǎng)，溫度34-35℃，培養(yǎng)15～17h。
4、500升發(fā)酵罐培養(yǎng)將上述發(fā)酵培養(yǎng)基裝量370升，121℃滅菌30min，接入長(zhǎng)好的30升三級(jí)種子，控制罐壓0.04MPa～0.06MPa，發(fā)酵溫度36～37℃，培養(yǎng)時(shí)間16～24h。
5、菌體收集方法同實(shí)施例1。
6、干燥制粉將濕菌泥與20％的無(wú)菌脫脂奶按1∶6的比例混勻，裝入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，真空度為2～20Pa，溫度為-40℃～28℃，整個(gè)干燥過(guò)程為20～28h。干燥完畢，將干菌塊進(jìn)行粉碎、過(guò)80目篩，制成菌粉。采用上述工藝可得冷凍干燥菌粉3.0～3.2Kg，菌粉含酪酸菌活菌數(shù)≥1.0×109個(gè)/克。
7、成品制備方法同實(shí)施例1。
實(shí)施例3 根據(jù)實(shí)施例1，酪酸菌種子培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成蛋白胨2.0、酵母膏0.3、磷酸氫二鉀0.02、磷酸二氫鉀0.02、硫酸鎂0.02、葡萄糖0.4、水96.84(水按ml計(jì)，余者按g計(jì))，種子培養(yǎng)基的PH7.5～8.5；酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成蛋白胨、2.0 酵母膏、0.3 磷酸氫二鉀、0.02 磷酸二氫鉀、0.02 硫酸鎂、0.02 淀粉、0.2 碳酸鈣、0.1 水、97.34(水按ml計(jì)，余者按g計(jì))，發(fā)酵培養(yǎng)基的PH7.5～8.5；1、一級(jí)種子的培養(yǎng)將酪酸菌冷凍管分別接種至2個(gè)裝有200ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于厭氧條件下培養(yǎng)，溫度37～38℃，培養(yǎng)16～18h。
2、二級(jí)種子的培養(yǎng)在2個(gè)2000ml三角瓶中分別裝培養(yǎng)基1800ml，121℃滅菌30min后分別接入長(zhǎng)好的一級(jí)種子200ml，于厭氧條件下培養(yǎng)，溫度37-38℃，培養(yǎng)16～18h。
3、三級(jí)種子的培養(yǎng)在50升罐中裝培養(yǎng)基36升，121℃滅菌30min后接入長(zhǎng)好的二級(jí)種子4升，于厭氧條件下培養(yǎng)，溫度37-38℃，培養(yǎng)16～18h。
4、500升發(fā)酵罐培養(yǎng)將上述發(fā)酵培養(yǎng)基裝量360升，121℃滅菌30min，接入長(zhǎng)好的40升三級(jí)種子，控制罐壓0.04MPa～0.06MPa，溫度37～38℃，培養(yǎng)時(shí)間16～24h。
5、菌體收集方法同實(shí)施例1。
6、干燥制粉將濕菌泥與20％的無(wú)菌脫脂奶按1∶10的比例混勻，裝入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，真空度為2～20Pa，溫度為-40℃～28℃，整個(gè)干燥過(guò)程為20～28h。干燥完畢，將干菌塊進(jìn)行粉碎、過(guò)80目篩，制成菌粉。采用上述工藝可得冷凍干燥菌粉3.0～3.2Kg，菌粉含酪酸菌活菌數(shù)≥1.0×109個(gè)/克。
7、成品制備方法同實(shí)施例1。
本發(fā)明與國(guó)內(nèi)同類產(chǎn)品相比較，菌種與生產(chǎn)工藝都不相同。主要具有以下優(yōu)點(diǎn)1、酪酸菌是江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司從土壤中自行分離獲得的，菌種穩(wěn)定性好，產(chǎn)品在室溫保存2年以上，仍能有較高的活菌含量；2、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基成分都比較簡(jiǎn)單，且都是日常易于采購(gòu)、價(jià)格便宜，獲得每千克酪酸菌冷凍干燥粉(含酪酸菌活菌數(shù)≥1.0×109個(gè)/克)原料成本為200元，而一般約需400～500元；3、酪酸菌冷凍干燥粉劑活菌含量高，活菌數(shù)在1.0×109～1.0×1010個(gè)/克，芽孢含量高，芽孢數(shù)≥80％；4、酪酸菌活菌制劑不僅可以用來(lái)治療人體胃腸道疾病，而且對(duì)豬、雞的白痢病有較好的預(yù)防和治療作用，并能有效促進(jìn)它們的生長(zhǎng)。這在國(guó)內(nèi)還是首次。
權(quán)利要求
1.一種酪酸菌活菌制劑，其特征是由酪酸菌在酪酸菌種子培養(yǎng)基中經(jīng)三級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)和在酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，再經(jīng)菌體收集、干燥制粉、菌粉檢驗(yàn)、配料、成品檢驗(yàn)、包裝工序制得；所說(shuō)酪酸菌種子培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成蛋白胨0.5％～2.0％、酵母膏0.3％～1.8％、磷酸氫二鉀0.02％～0.5％、磷酸二氫鉀0.02％～0.5％、硫酸鎂0.02％～0.2％、葡萄糖0.8％～2.0％、水94.5％～96.8％，培養(yǎng)基的PH 5.0～8.5；所說(shuō)酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成蛋白胨0.5％～2.0％、酵母膏0.3％～1.8％、磷酸氫二鉀0.02％～0.5％、磷酸二氫鉀0.02％～0.5％、硫酸鎂0.02％～0.2％、淀粉0.2％～2.0％、碳酸鈣0.1％～1.0％、水93.8％～97.0％，培養(yǎng)基的PH 5.0～8.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪酸菌活菌制劑的制備方法其特征依次由下述工藝步驟組成(1)、一級(jí)種子培養(yǎng)取酪酸菌生產(chǎn)種子凍干管菌種，接種于酪酸菌種子培養(yǎng)基中，在30～38℃厭氧培養(yǎng)14～18h；(2)、二級(jí)種子培養(yǎng)一級(jí)種子以5～10％的接種量接種于酪酸菌種子培養(yǎng)基中，在30～38℃厭氧培養(yǎng)14～18h；(3)、三級(jí)種子培養(yǎng)二級(jí)種子以5～10％的接種量接種于酪酸菌種子培養(yǎng)基，在30～38℃厭氧培養(yǎng)13～18h，各級(jí)種子培養(yǎng)完畢均應(yīng)檢查其生長(zhǎng)狀態(tài)及純度；(4)、發(fā)酵三級(jí)種子以5～10％的接種量接種于酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基，控制罐壓0.04MPa～0.06MPa，在30～38℃厭氧培養(yǎng)16～24h，直至芽孢形成率＞80％，發(fā)酵完畢應(yīng)檢查其有無(wú)污染，如有污染應(yīng)予以廢棄；(5)、菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用高速管式離心機(jī)收集菌體，轉(zhuǎn)速≥16000r/min，獲得濕菌泥；(6)、干燥制粉濕菌泥稱重，按1∶2～10的重量比，加入重量比為20％的無(wú)菌脫脂奶液，混合均勻，進(jìn)行真空冷凍干燥，先在-40℃預(yù)凍2～3h，然后抽真空，真空度為2～20Pa，干燥過(guò)程中溫度逐漸升至28℃，整個(gè)干燥過(guò)程為20～28h。干燥完畢后粉碎，過(guò)80目篩，制成菌粉；(7)、菌粉檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1.0×109個(gè)；(8)、配料將事先在120℃干燥4～6h的玉米淀粉和步驟(6)制成的菌粉按重量配比9～50∶1的比例進(jìn)行配料混合，即得本發(fā)明獸用酪酸菌活菌制劑的成品；(9)、成品檢驗(yàn)要求每克成品含酪酸菌活菌數(shù)不少于1.0×108個(gè)；(10)、包裝出廠包裝后經(jīng)抽樣進(jìn)行金檢，合格后出廠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酪酸菌活菌制劑的制備方法，其特征是所述培養(yǎng)基的最適PH值為6.5～7.5，最適發(fā)酵溫度為36～37℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酪酸菌活菌制劑及其制備方法，由酪酸菌在酪酸菌種子培養(yǎng)基中經(jīng)三級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)和在酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，再經(jīng)菌體收集、干燥制粉、菌粉檢驗(yàn)、配料、成品檢驗(yàn)、包裝工序制得；酪酸菌種子培養(yǎng)基由蛋白胨、酵母膏、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖和水組成；酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基由蛋白胨、酵母膏、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、淀粉、碳酸鈣和水組成。本發(fā)明制備的酪酸菌活菌制劑，芽孢率高、活菌含量高，價(jià)格低廉，人獸兩用。不僅可以用來(lái)治療人體胃腸道疾病，而且對(duì)豬、雞的白痢病有較好的預(yù)防和治療作用，并能有效促進(jìn)它們的生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61P1/00GK101032527SQ20061004443
公開日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者唐寶英, 朱曉慧, 陸茂林, 劉佳, 任穎, 張陽(yáng)軍 申請(qǐng)人:江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司