專利名稱：常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于檢測常染色體顯性遺傳型多囊腎病的試劑盒。
常染色體顯性遺傳型多囊腎病是由于I型致病基因和II型致病基因突變所致，其中85％患者與前者突變有關(guān)，而與后者突變相關(guān)的比例僅占15％。I型致病基因位于人類染色體16p13.1，長53kb，包含46個外顯子，其中1-33外顯子位于重復(fù)序列區(qū)，34-46外顯子位于非重復(fù)序列區(qū)。II型致病基因位于人類染色體4q13，長68kb，包含15個外顯子。I、II型致病基因的核苷酸序列詳見Genbank，登錄號分別為L39891及U50928。由于常染色體顯性遺傳型多囊腎病致病基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其中I型致病基因存在多個同源序列，直接降低了檢測的特異性。受其影響，目前大多數(shù)致病基因突變研究僅限于I型致病基因的部分區(qū)域，即使國外個別研究小組初步進(jìn)行了其全基因突變檢測(Rossetti S.，Strmecki L.，GambleV.，et al.Mutation analysis of the entire PKD1 genegenetic and iagnostic implications.Am J Hum Genet，2001，6846-63)，但采用的分子生物學(xué)技術(shù)種類繁多，缺乏統(tǒng)一性和可重復(fù)性。因而，研制常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，直接檢測出其I型致病基因和II型致病基因全序列突變的具體位置和突變類型，是亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種直接用于檢測常染色體顯性遺傳型多囊腎病I型致病基因和II型致病基因突變位點(diǎn)和突變類型的試劑盒。
根據(jù)常染色體顯性遺傳型多囊腎病基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和針對I型致病基因和II型致病基因全序列順序，本發(fā)明試劑盒中有數(shù)十對引物，其原因在于1.I型致病基因和II型致病基因序列長，至今未發(fā)現(xiàn)致病基因存在突變熱點(diǎn)，為能實(shí)現(xiàn)全基因范圍內(nèi)的突變篩查，設(shè)計(jì)引物數(shù)量相應(yīng)增加。
2.I型致病基因由重復(fù)序列區(qū)與非重復(fù)序列區(qū)組成，重復(fù)序列區(qū)內(nèi)還存在同源序列。為克服同源序列的干擾，對重復(fù)序列區(qū)設(shè)計(jì)了長鏈PCR引物，該引物可以特異性擴(kuò)增出I型致病基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物平均長度為4.2kb(而一般PCR擴(kuò)增片段長度多在1.6kb以下)，因此長鏈PCR引物的引入是數(shù)量增加的另一原因。
3.采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法或采用高壓液相色譜儀分析方法對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行初步篩檢時，兩者對篩檢產(chǎn)物的長度均有限制，前者以160-400bp為最佳范圍，后者則以片段不超過600bp為宜。而I型致病基因采用長鏈PCR特異性擴(kuò)增所得產(chǎn)物不適合上述分析方法的要求，故必須再以長鏈PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，通過巢式PCR進(jìn)行第二次擴(kuò)增，將長鏈PCR擴(kuò)增出的長片段通過巢式PCR擴(kuò)增分割成短片段，以便用于單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法或采用高壓液相色譜儀分析。巢式PCR引物的引入是引物數(shù)量增加的又一重要原因。
4.根據(jù)I、II型致病基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物既可采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法篩檢也可通過高壓液相色譜儀篩檢，本發(fā)明分別設(shè)計(jì)了兩套相應(yīng)PCR引物，其中有相當(dāng)數(shù)量的引物是兩種分析方法可以共用的，但為了使用方便，防止差錯，故在兩種篩檢方法共用的試劑盒內(nèi)同時配置了兩套引物以供選擇，從而使試劑盒引物數(shù)量明顯增加。
本發(fā)明引物的核苷酸序列分別見表1、表2和表3。其中I型致病基因采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法篩檢的PCR擴(kuò)增正、反向引物參見序列表1，通過高壓液相色譜儀分析方法的PCR擴(kuò)增正、反向引物參見序列表2。II型致病基因采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法篩檢的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同樣適用高壓液相色譜儀分析方法，其PCR擴(kuò)增正、反向引物參見序列表3。上述各引物可按常規(guī)引物合成方法制備。
為便于敘述，先介紹試劑盒內(nèi)的引物混合物代號1.用于單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析的I型引物混合物，用I-S-n表示，其中I表示I型致病基因，S表示單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法，n表示I型致病基因的引物編號。
2.用于高壓液相色譜儀分析的I型引物混合物，用I-H-n表示，其中H表示高壓液相色譜儀分析方法，I與n同上。
3.II型引物混合物，用II-SH-n表示，其中II表示II型致病基因，SH表示本系列引物對單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法及高壓液相色譜儀分析方法均適用，n表示II型致病基因的引物編號。
試劑盒內(nèi)其它試劑的代號是1.專用于單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法的I型陰性對照物，用-I-S表示，正常對照物，用+I-S表示；專用于高壓液相色譜儀分析法的I型陰性對照物，用-I-H表示，正常對照物，用+I-H表示。
2.在單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法以及高壓液相色譜儀分析法中，II型陰性對照物，均用-II-SH表示，正常對照物，均用+II-SH表示。
3.顯色液代號分別用顯色液A、顯色液B、顯色液C、顯色液D、顯色液E、顯色液F表示。
本發(fā)明試劑盒包括如下試劑1.采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法篩檢的I型引物混合物82管，分別以I-S-1、I-S-2、I-S-3、…、I-S-82表示。其中I-S-1至I-S-8為長鏈PCR引物，共8對，I-S-9至I-S-65為巢式PCR引物，共57對，其余為非重復(fù)區(qū)PCR引物，共17對，分別為I-S-66至I-S-82。
2.采用高壓液相色譜儀分析篩檢的I型引物混合物72管，分別以I-H-1、I-H-2、I-H-3、…、I-H-72表示。其中I-H-1至I-H-8為長鏈PCR引物，共8對，I-H-9至I-H-59為巢式PCR引物，共51對。其余為非重復(fù)區(qū)PCR引物，共13對，分別為I-H-60至I-H-72。
3.II型引物混合物17管，分別用II-SH-1、II-SH-2、II-SH-3、…、II-SH-17表示。
4.I型陰性對照物各1管，分別用-I-S和-I-H表示；I型正常對照物各1管，分別用+I-S和+I-H表示；II型陰性對照物1管，用-II-SH表示；II型正常對照物1管，用+II-SH表示。
5.上樣緩沖液1管。
6.顯色液A、B、C、D、E、F各1瓶。
其中I型致病基因的兩套引物中完全相同的有1.長鏈PCR引物I-S-1至I-S-8與I-H-1至I-H-8分別對應(yīng)相同；2.巢式PCR引物相同的有31對，分別為I-S-14同I-H-13，I-S-15同I-H-14，I-S-16同I-H-15，I-S-17同I-H-16，I-S-18同I-H-17，I-S-19同I-H-18，I-S-20同I-H-19，I-S-22至I-S-28分別同I-H-22至I-H-28，I-S-47同I-H-42，I-S-48同I-H-43，I-S-49同I-H-44，I-S-50同I-H-45，I-S-51同I-H-46，I-S-52同I-H-47，I-S-53同I-H-48，I-S-54同I-H-49，I-S-55同I-H-50，I-S-56同I-H-51，I-S-57同I-H-52，I-S-58同I-H-53，I-S-59同I-H-54，I-S-60同I-H-55，I-S-61同I-H-56，I-S-64同I-H-58，I-S-65同I-H-59。
3.非重復(fù)序列區(qū)引物相同的有2對，即I-S-66同I-H-60，I-S-67同I-H-61。
上述各試劑分別為1.引物混合物各引物混合物均為200μl/管。
I型引物混合物含三羥甲基氨基甲烷80mmol/L，乙酸鉀0-170mmol/L，二甲亞砜0-10％，辛基苯氧基聚乙氧乙醇0.2％，脫氧核苷三磷酸500-1200μmol/L，乙酸鎂0-2.5mmol/L或氯化鎂0-2mmol/L，熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶16-80U，正、反向引物各2-6μmol/L。
II型引物混合物其三羥甲基氨基甲烷、二甲亞砜、辛基苯氧基聚乙氧乙醇濃度與I型引物混合物相同，脫氧核苷三磷酸1200μmol/L，氯化鎂2mmol/L，熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶20U，正、反向引物各2μmol/L。
2.對照物(1)I型和II型陰性對照物滅菌去離子超純水，各0.4ml/管。
(2)I型和II型正常對照物含正常基因100ng/μl，各0.4ml/管。
3.上樣緩沖液10ml/管其中含蔗糖10％，溴酚蘭0.01％，二甲苯青0.01％。
4.顯色液(1)顯色液A無水乙醇，60ml/瓶。
(2)顯色液B濃硝酸，10ml/瓶。
(3)顯色液C30％硝酸銀溶液，10ml/瓶。
(4)顯色液D25％碳酸鈉溶液，60ml/瓶。
(5)顯色液E乙酸，60ml/瓶。
(6)顯色液F37％甲醛溶液，6ml/瓶。


圖1為本發(fā)明試劑盒的引物于常染色體顯性遺傳型多囊腎病I型致病基因結(jié)構(gòu)的相對位置示意圖；圖2為本發(fā)明試劑盒引物于常染色體顯性遺傳型多囊腎病II型致病基因結(jié)構(gòu)的相對位置示意圖；圖3為實(shí)施例5電泳圖譜示意圖；圖4為實(shí)施例6電泳圖譜示意圖；圖5為實(shí)施例7高壓液相色譜儀分析峰圖。
具體實(shí)施例方式
上述各試劑具體制備方法如下1.引物混合物各溶液的制備(1)0.8mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液在800ml去離子超純水中加入96.9克三羥甲基氨基甲烷，用濃鹽酸調(diào)pH值為8.9，用去離子超純水定容至1L。
(2)1.7mol/L乙酸鉀溶液在800ml去離子超純水中加入166.8克乙酸鉀，充分溶解后，用去離子超純水定容至1L。
(3)二甲亞砜溶液將濃度大于99％的二甲亞砜溶液按10ml/瓶分裝備用。
(4)20％辛基苯氧基聚乙氧乙醇取濃度為106.5％(w/v)的商品化辛基苯氧基聚乙氧乙醇(上海華美生物工程技術(shù)有限公司)1.88ml，用去離子超純水定容至10ml。
(5)脫氧核苷三磷酸溶液將濃度為10mmol/L的商品化脫氧核苷三磷酸溶液(日本TaKaRa公司)按1.5ml/管分裝備用。
(6)250mmol/L乙酸鎂溶液在800ml去離子超純水中加入35.61克乙酸鉀，充分溶解后，用去離子超純水定容至1L。
(7)200mmol/L氯化鎂溶液在800ml去離子超純水中加入19.06克乙酸鉀，充分溶解后，用去離子超純水定容至1L。
(8)熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶溶液將酶活性為4U/μl的商品化熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶(美國Applied Biosystems公司)按1.5ml/管分裝備用。
(9)各引物溶液，濃度均為50μmol/L。
將合成所得的各引物粉末，分別用滅菌去離子超純水稀釋至濃度為50μmol/L，按0.5ml/管分裝備用。
2.各引物混合物的制備(按8人份使用量，200ul/管)實(shí)施例1制備引物混合物I-S-1取濃度為0.8mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液20μl，1.7mol/L乙酸鉀溶液20μl，二甲亞砜溶液20μl，20％辛基苯氧基聚乙氧乙醇2μl，10mmol/L脫氧核苷三磷酸溶液24μl，250mmol/L乙酸鎂溶液2μl，酶活性為4U/μl熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶20μl，50μmol/LI-S-1正、反向引物各8μl，充分混勻后，用滅菌去離子超純水定容至200μl，置0.5ml薄壁管中于-20℃?zhèn)溆?。此時終濃度分別為三羥甲基氨基甲烷80mmol/L，乙酸鉀170mmol/L，二甲亞砜10％，辛基苯氧基聚乙氧乙醇0.2％，脫氧核苷三磷酸1200μmol/L，乙酸鎂2.5mmol/L，熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶80U，正、反向引物各2μmol/L。
引物混合物I-H-1制備方法同實(shí)施例1。
實(shí)施例2制備引物混合物I-S-2取10mmol/L脫氧核苷三磷酸溶液10μl，酶活性為4U/μl熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶4μl，其它各成分所取的量同實(shí)施例1。充分混勻后，用滅菌去離子超純水定容至200μl，置0.5ml薄壁管中于-20℃?zhèn)溆谩?br> 引物混合物I-S-3至I-S-8及I-H-2及I-H-8制備方法同實(shí)施例2。
實(shí)施例3制備I-S-9引物混合物取濃度為0.8mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液20μl，20％辛基苯氧基聚乙氧乙醇2μl，10mmol/L脫氧核苷三磷酸溶液24μl，200mmol/L氯化鎂溶液2μl，酶活性為4U/μl熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶5μl，50μmol/L I-S-9正、反向引物各8μl，充分混勻后，用滅菌去離子超純水定容至200μl，置0.5ml薄壁管中于-20℃?zhèn)溆?。此時終濃度分別為三羥甲基氨基甲烷80mmol/L，辛基苯氧基聚乙氧乙醇0.2％，脫氧核苷三磷酸1200μmol/L，氯化鎂2.5mmol/L，熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶20U，正、反向引物各2μmol/L。
引物混合物I-S-10至I-S-65、I-S-67至I-S-73、I-S-78至I-S-80以及I-H-9至I-H-59、I-H-61至I-H-65和I-H-70制備方法同實(shí)施例3。
實(shí)施例4制備引物混合物I-S-66取二甲亞砜溶液20μl，其它各成分所取量同實(shí)施例3。此時終濃度分別為三羥甲基氨基甲烷80mmol/L，辛基苯氧基聚乙氧乙醇0.2％，二甲亞砜10％，脫氧核苷三磷酸1200μmol/L，氯化鎂2.5mmol/L，熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶20U，正、反向引物各2μmol/L。
引物混合物I-S-74至I-S-77、I-S-81、I-S-82及I-H-60、I-H-66至I-H-69、I-H-71、I-H-72制備方法同實(shí)施例4。
3.I、II型陰性及正常對照物的制備(1)陰性對照物-I-S、-I-H與-II-SH的制備用滅菌去離子超純水按0.4ml/管分裝于0.5ml薄壁管中，置-20℃?zhèn)溆谩?br> (2)正常對照物+I-S、+I-H與+II-SH的制備將正常人外周血10毫升，按常規(guī)酚氯仿方法(《分子克隆》實(shí)驗(yàn)指南，金冬雁編譯，第465-467頁)分別抽提其基因組，用滅菌去離子超純水稀釋成濃度為100ng/μl，以此作為正常I、II型致病基因模板溶液，按0.4ml/管分裝于0.5ml薄壁管中，置4℃冰箱備用。使用時，用滅菌去離子超純水稀釋為50ng/μl的工作濃度。
4.上樣緩沖液的制備在80ml去離子超純水中，分別加入10克蔗糖、0.01克溴酚蘭和0.01克二甲苯青，充分混勻溶解后，用去離子超純水定容至100ml，按10ml/管分裝，室溫備用。其終濃度分別為蔗糖10％，溴酚蘭0.01％，二甲苯青0.01％。
5.顯色液的制備(1)顯色液A將無水乙醇按60ml/瓶分裝備用。
(2)顯色液B將濃硝酸按10ml/瓶分裝備用。
(3)顯色液C在80ml去離子超純水中，加入30克硝酸銀，充分混勻溶解后，用去離子超純水定容至100ml，10ml/瓶分裝，置4℃冰箱避光保存。其為30％硝酸銀溶液。
(4)顯色液D在80ml去離子超純水中，加入25克無水碳酸鈉，充分混勻溶解后，用去離子超純水定容至100ml，按60ml/瓶分裝備用。其為25％碳酸鈉溶液。
(5)顯色液E將乙酸按60ml/瓶分裝備用。
(6)顯色液F將37％甲醛溶液按6ml/瓶分裝備用。
6.組裝試劑盒(1)組裝單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法檢測試劑盒分別取上述制備的引物混合物I-S-1至I-S-82，II-SH-1至II-SH-17，對照物-I-S、+I-S、-II-SH和+II-SH各1管，上樣緩沖液1管及顯色液A、B、C、D、E和F各1瓶置于試劑盒內(nèi)，即為本發(fā)明專用于通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析途徑來檢測突變的試劑盒。
(2)組裝高壓液相色譜儀分析法檢測試劑盒分別取上述制備的引物混合物I-H-1至I-H-72及II-SH-1至II-SH-17各1管，對照物-I-H、+I-H、-II-SH和+II-SH各1管置于試劑盒內(nèi)，即為本發(fā)明專用于通過高壓液相色譜儀分析途徑來檢測突變的試劑盒。
(3)組裝兩種分析法兼用的檢測試劑盒分別取上述制備的引物混合物I-S-1至I-S-82、I-H-1至I-H-72及II-SH-1至II-SH-17各1管，對照物-I-S、+I-S、-I-H、+I-H、-II-SH和+II-SH各1管，上樣緩沖液1管及顯色液A、B、C、D、E和F各1瓶置于試劑盒內(nèi)，即為兩種分析法兼用的檢測試劑盒。
當(dāng)然，還可以按需組裝成專測I型或II型致病基因突變等各種試劑盒。試劑盒的使用眾所周知，常染色體顯性遺傳型多囊腎病是由于I、II型致病基因突變所致，究竟是哪一個核苷酸發(fā)生了突變呢？采用本試劑盒檢測時，可按如下程序進(jìn)行根據(jù)I型致病基因突變占該病患者的85％、非重復(fù)序列區(qū)較重復(fù)序列區(qū)容易擴(kuò)增這一特點(diǎn)，可先擴(kuò)增I型致病基因非重復(fù)序列區(qū)，經(jīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法或高壓液相色譜儀分析法篩檢，如果篩檢出異常核苷酸片段，則將該樣品及相應(yīng)的正常對照進(jìn)一步作核苷酸序列分析，通過與正常序列比對，找出突變位點(diǎn)。若此區(qū)域未篩檢出異常核苷酸片段，則不必作核苷酸序列分析，而是進(jìn)一步作II型致病基因序列區(qū)的PCR擴(kuò)增，因?yàn)樵撔蛄袇^(qū)比I型致病基因重復(fù)序列區(qū)較易擴(kuò)增，擴(kuò)增片段按同法篩檢，當(dāng)II型致病基因序列區(qū)也未篩檢到異常核苷酸片段時，再檢測I型致病基因的重復(fù)序列區(qū)。這種檢測程序可減少盲目性，提高檢測效率。
檢測的步驟如下1.制備待測個體基因組溶液；2.以所制備的基因組為模板，用試劑盒中的引物混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3.將PCR擴(kuò)增所得核苷酸片段，用單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法或高壓液相色譜儀進(jìn)行篩檢，通過與正常對照物PCR擴(kuò)增結(jié)果相比對，篩檢出異常核苷酸片段；4.對異常核苷酸片段和相應(yīng)的正常核苷酸片段進(jìn)行核苷酸序列測定，通過與正常序列比對，確定突變位點(diǎn)和突變類型。
上面所說的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法，是檢測DNA突變常用的方法之一。其原理是DNA加熱變性形成兩條單鏈，若其中一條單鏈有核苷酸突變，該單鏈所形成的三維結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的正常單鏈不同，那么在與正常對照物同時進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時導(dǎo)致遷移速度出現(xiàn)差異，電泳帶不在同一位置，從而確定其為異常核苷酸片段。
至于高壓液相色譜儀分析法是一種檢測DNA突變的新方法，其使用離子層析柱，利用突變基因與正?；蜷g細(xì)微堿基差異導(dǎo)致它們在層析柱中滯留時間的不同來進(jìn)行分析。該分析方法實(shí)現(xiàn)了篩檢過程的半自動化，檢測速度大大加快。但所使用的專用儀器價(jià)格昂貴，相應(yīng)增加了檢測費(fèi)用，目前還難以普及。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果使用本發(fā)明試劑盒檢測常染色體顯性遺傳型多囊腎病，操作簡便，重復(fù)性好，檢測區(qū)域涵蓋面廣，可直接檢測出致病基因的突變位點(diǎn)和突變類型。且由于長鏈引物和巢式引物的引入，避免了I型致病基因中同源序列的干擾，提高了檢測的準(zhǔn)確率。使用高壓液相色譜儀篩檢可明顯提高檢測敏感度，并大大縮短檢測周期。本發(fā)明試劑盒可用于常染色體顯性遺傳型多囊腎病家系的基因診斷和產(chǎn)前診斷，為及早防治、擺脫致病基因在受累家系世代間的傳遞提供了有效途徑。
現(xiàn)結(jié)合以下2個實(shí)施例，對本發(fā)明試劑盒用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法進(jìn)行突變檢測作詳細(xì)說明。
實(shí)施例5王某，男性，32歲，體檢B超診斷“雙側(cè)多囊腎伴多囊肝”，其母親和舅舅有多囊腎病史多年，父親身體健康。
1.制備待測人員的基因組溶液收集王某和其母親的外周血2ml，按常規(guī)酚氯仿方法分別制備其基因組，用滅菌去離子超純水將其稀釋為50ng/μl的溶液，置4℃冰箱備用。
2.I型致病基因非重復(fù)序列區(qū)的突變檢測(1)PCR擴(kuò)增取17只PCR擴(kuò)增管，編號為A I-S-66、A I-S-67、…、A I-S-82，分別加入上述王某基因組溶液2μl作為擴(kuò)增模板，再依次加入23μl滅菌去離子超純水，混勻后，95℃5分鐘，立即于冰水中靜置3分鐘，依次加入引物混合物I-S-66、I-S-67、…、I-S-82各25μl，混勻后，95℃1分鐘，然后95℃30秒，退火40秒(推薦退火溫度參見表1，下同)，72℃40秒，循環(huán)35次，最后72℃10分鐘，得17個PCR擴(kuò)增核苷酸片段，置4℃?zhèn)溆谩０赐瑯臃椒?，對王某母親基因組、陰性對照物和正常對照物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中王某母親反應(yīng)管編號分別為B I-S-66、B I-S-67、…、B I-S-82，陰性對照物和正常對照物的反應(yīng)管編號分別為-I-S-66、-I-S-67、…、-I-S-82和+I-S-66、+I-S-67、…、+I-S-82。
(2)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析將上述擴(kuò)增所得核苷酸片段按相應(yīng)編號分組，即樣品A I-S-66、B I-S-66與對照-I-S-66和+I-S-66編為一組，依次共編成17組。以第一組為例按如下步驟操作①將核苷酸片段熱變性取A I-S-66、B I-S-66、+I-S-66和-I-S-66各2μl，分別與10μl上樣緩沖液混勻后置95℃6分鐘，使雙鏈核苷酸片段變性成二個單鏈核苷酸片段，置冰水備用；②電泳按常規(guī)方法制備8％非變性聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為0.5倍稀釋的TBE(0.045mol/L三羥甲基氨基甲烷、0.045mol/L硼酸和0.001mol/L乙二胺四乙酸)，以電壓300V先預(yù)電泳15分鐘，再取上述變性后的樣品各6μl，分別點(diǎn)樣，以溴酚蘭染料剛移出凝膠為止。
③顯色顯色液分別作如下配制a液取顯色液A10ml，用蒸餾水稀釋至100ml，備用。
b液取顯色液B1ml，用蒸餾水稀釋至100ml，備用。
c液取顯色液C0.5ml，用蒸餾水稀釋至100ml，加顯色液F120ul混勻備用。
d液取顯色液D10ml，用蒸餾水稀釋至100ml，備用。
e液取顯色液E10ml，用蒸餾水稀釋至100ml，備用。
將上述電泳后的凝膠在各配制好的顯色液中作如下顯色處理依次將凝膠在a液中浸泡10分鐘；在b液中浸泡5分鐘，用蒸餾水漂洗2次，每次1分鐘；在c液中浸泡60分鐘，用蒸餾水漂洗2次，每次1分鐘；在d液中浸泡5分鐘，待黃褐色條帶顯色清晰；在e液中浸泡5分鐘；最后用蒸餾水浸泡漂洗30分鐘，再照相。各組篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A I-S-77和B I-S-77各有一條電泳帶與正常對照物+I-S-77的遷移位置不同(見圖4)，說明核苷酸片段異常，于是對這兩個樣品及其正常對照物+I-S-77進(jìn)行核苷酸序列測定。
(3)核苷酸序列測定核苷酸序列測定結(jié)果為正常對照物+I-S-77核苷酸序列為-GGGTAGCCTACGCCCAGCTGGCCAT-，而A I-S-77和B I-S-77核苷酸序列為-GGGTAGCCTACGCCCGGCTGGCCAT-，由此可見后兩者均發(fā)生置換突變即I型致病基因組第50906位的腺嘌呤A突變?yōu)轼B嘌呤G，從而確定王某及其母親的常染色體顯性遺傳型多囊腎病是由于I型致病基因突變所造成的，突變位點(diǎn)在其第44外顯子中，突變類型為堿基置換所引起的錯義突變。
實(shí)施例6趙某，女性，28歲，懷孕3個月。體檢B超診斷“雙側(cè)多囊腎伴多囊肝”，其父親和叔叔有多囊腎病史多年，母親身體健康，現(xiàn)利用本發(fā)明試劑盒檢測其常染色體顯性遺傳型多囊腎病致病基因突變位點(diǎn)和突變類型，并對懷孕胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，是否患有遺傳型多囊腎病的可能。
1.待測人員基因組溶液的制備趙某和其父親基因組的制備方法與實(shí)施例5相同。對胎兒的檢測用羊水中的胎兒脫落細(xì)胞制備其基因組。
通過羊水穿刺途徑搜集胎兒羊水至少1.5ml，離心5分鐘后棄上清，沉淀為胎兒的脫落細(xì)胞。用10mmol/L三羥甲基氨基甲烷溶液(含有1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉)洗滌沉淀，加10μl 0.1mol/L氫氧化鈉和2mol/L氯化鈉混合溶液，并搖勻，100℃沸水煮2分鐘，再強(qiáng)烈振蕩后離心10分鐘，取上清液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量并用滅菌去離子超純水將其稀釋成濃度為50ng/μl的基因組溶液，置4℃冰箱中備用。
2.I型致病基因非重復(fù)序列區(qū)的檢測檢測方法同實(shí)施例5，檢測結(jié)果三者均未見異常，故進(jìn)行II型致病基因的檢測。
3.II型致病基因的突變檢測(1)PCR擴(kuò)增取17只PCR擴(kuò)增管，編號為A II-SH-1、A II-SH-2、…、A II-SH-17，分別加入上述趙某基因組溶液2μl作為擴(kuò)增模板，再依次加入23μl滅菌去離子超純水，混勻后，95℃5分鐘，立即于冰水中靜置3分鐘。依次加入引物混合物II-SH-1、II-SH-2、…、II-SH-17各25μl，混勻后，95℃1分鐘，95℃30秒，退火40秒(推薦退火溫度參見表3，下同)，72℃40秒，循環(huán)35次，最后72℃10分鐘，得PCR擴(kuò)增核苷酸片段17管，置4℃?zhèn)溆?。同樣方法，進(jìn)行趙父基因組、趙某的胎兒基因組、陰性對照物和正常對照物的PCR擴(kuò)增，其中趙父PCR產(chǎn)物的編號為B II-SH-1、B II-SH-2、…、B II-SH-17，趙某胎兒PCR產(chǎn)物的編號為C II-SH-1、C II-SH-2、…、C II-SH-17，陰性對照物和正常對照物的編號分別為-II-SH-1、-II-SH-2、…、-II-SH-17和+II-SH-1、+II-SH-2、…、+II-SH-17。
(2)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析分析方法同實(shí)施例5，結(jié)果也未見異常核苷酸片段，故最后對I型致病基因重復(fù)序列區(qū)進(jìn)行檢測。
4.I型致病基因重復(fù)序列區(qū)(包括外顯子1至外顯子33)的突變檢測
(1)長鏈PCR擴(kuò)增①外顯子1的長鏈PCR擴(kuò)增取1只滅菌的PCR擴(kuò)增管，編號為A I-S-1，加入趙某基因組溶液16μl，用滅菌去離子超純水補(bǔ)充體積至25μl，混勻后，98℃5分鐘，立即于冰水中，靜置3分鐘。加引物混合物I-S-125μl，混勻后，95℃1分鐘，95℃30秒，退火40秒，72℃40秒，循環(huán)35次，最后72℃10分鐘，得長鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A I-S-1置4℃?zhèn)溆谩?br> 按同法分別得趙父的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B I-S-1，胎兒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物C I-S-1，陰性對照物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物-I-S-1和正常對照物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物+I-S-1。
②外顯子2至外顯子8的長鏈PCR擴(kuò)增取7只滅菌的PCR擴(kuò)增管，編號分別為AI-S-2至A I-S-8，各加入趙某基因組模板溶液10μl，用滅菌去離子超純水補(bǔ)充體積至40μl，混勻后，98℃5分鐘，立即于冰水中靜置3分鐘。依次向各管分別加入引物混合物I-S-2至I-S-8各50μl，混勻后，95℃1分鐘，95℃30秒，退火40秒，72℃40秒，循環(huán)35次，最后72℃10分鐘，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A I-S-2至A I-S-8，置4℃?zhèn)溆谩?br> 按同法，分別得趙父的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B I-S-2至B I-S-8，胎兒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物C I-S-2至C I-S-8，陰性對照物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物-I-S-2至-I-S-8和正常對照物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物+I-S-2至+I-S-8。
(2)巢式PCR擴(kuò)增①外顯子1的巢式PCR擴(kuò)增取3只滅菌的PCR擴(kuò)增管，編號為A I-S-9、A I-S-10、A I-S-11，分別加入趙某A I-S-1長鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1μl，用滅菌去離子超純水補(bǔ)充體積至25μl，混勻后，95℃5分鐘，立即于冰水中靜置3分鐘。依次加入引物混合物I-S-9、I-S-10、I-S-11各25μl，混勻后，95℃1分鐘，95℃30秒，退火40秒，72℃40秒，循環(huán)30次，最后72℃10分鐘，分別得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A I-S-9、A I-S-10、A I-S-11，置4℃?zhèn)溆谩?br> 按同法，分別得趙父的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B I-S-9、B I-S-10、B I-S-11，胎兒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物C I-S-9、C I-S-10、C I-S-11，陰性對照物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物-I-S-9、-I-S-10、-I-S-11和正常對照物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物+I-S-9、+I-S-10、+I-S-11重復(fù)序列區(qū)其它外顯子的巢式PCR擴(kuò)增的操作步驟同上述外顯子1，只是不同的模板需選用相應(yīng)的PCR引物。其對應(yīng)關(guān)系如下I-S-2擴(kuò)增選用I-S-12至I-S-19，I-S-3擴(kuò)增選用I-S-20至I-S-26，I-S-4擴(kuò)增選用I-S-27至I-S-44，I-S-5擴(kuò)增選用I-S-45至I-S-52，I-S-7擴(kuò)增選用I-S-53至I-S-59，I-S-8擴(kuò)增選用I-S-60至I-S-65。
巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的編號分別為趙某的為A I-S-12、A I-S-13、…、A I-S-65，趙父的為B I-S-12、B I-S-13、…、B I-S-65，趙某胎兒的為C I-S-12、C I-S-13、…、C I-S-65，陰性對照物-I-S-12、-I-S-13、…、-I-S-65，正常對照物+I-S-12、+I-S-13、…、+I-S-65。
如果采用高壓液相色譜儀檢測，則相應(yīng)的巢式PCR擴(kuò)增引物為I-H-1擴(kuò)增選用I-H-9至I-H-11，I-H-2擴(kuò)增選用I-H-12至I-H-18，I-H-3擴(kuò)增選用I-H-19至I-H-26，I-H-4擴(kuò)增選用I-H-27至I-H-39，I-H-5擴(kuò)增選用I-H-40至I-H-47，I-H-7擴(kuò)增選用I-H-48至I-H-54，I-H-8擴(kuò)增選用I-H-55至I-H-59。
由于I-S-6或I-H-6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段較短，僅為300bp，因此不必進(jìn)行下一輪巢式PCR擴(kuò)增，可與上述得到的巢式PCR產(chǎn)物一起進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析或高壓液相色譜儀分析。
(3)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析將上述巢式PCR產(chǎn)物按相應(yīng)編號分組，例如A I-S-9、B I-S-9、C I-S-9、+I-S-9和-I-S-9編為一組，共分成57組，分別進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，操作方法同實(shí)施例5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中趙某的A I-S-30、趙父的B I-S-30存在異常帶型，而趙某的胎兒C I-S-30帶型正常(見圖5)于是對A I-S-30、B I-S-30、C I-S-30及+I-S-30的樣品分別進(jìn)行核苷酸序列測定。
(4)核苷酸序列測定核苷酸序列測定結(jié)果為+I-S-30和C I-S-30的核苷酸序列為-CTACCACGTGCGCCTGGAGGTCAA-，而A I-S-30、B I-S-30為-CTACCACGTGCCTGGAGGTCAA-，比對結(jié)果，在常染色體顯性遺傳型多囊腎病I型致病基因組第27678位開始缺失兩個堿基GC，由此可見后兩者均發(fā)生移碼突變，從而確定趙某及其父親的常染色體顯性遺傳型多囊腎病是由于I型致病基因突變所造成的，突變位點(diǎn)在其第15外顯子，突變類型為堿基缺失所引起的移碼突變。而C I-S-30序列正常，說明胎兒沒有攜帶母親趙某的常染色體顯性遺傳型多囊腎病突變致病基因。
下面通過一個實(shí)施例，對本發(fā)明試劑盒用高壓液相色譜儀進(jìn)行突變檢測作詳細(xì)敘述。
實(shí)施例7李某，男性，62歲，2年前體檢B超診斷“雙側(cè)多囊腎”，有多囊腎病史家族史。
1.基因組溶液的制備、長鏈和巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的制備同實(shí)施例5，只是所選用的引物不同，其擴(kuò)增產(chǎn)物的編號分別為A I-H-60、A I-H-61、…、A I-H-72。正常對照物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的編號分別為+I-H-60、+I-H-61、…、+I-H-72。
2.高壓液相色譜儀分析
①取26只滅菌的PCR擴(kuò)增管，編號分別為A I-H-60至A I-H-72和+I-H-60至+I-H-72，依次加入上述相同編號的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各10μl后，按下列步驟進(jìn)行變性預(yù)處理95℃3分鐘，緩慢冷卻至65℃，溫度下降速度控制在0.1℃/秒；65℃30分鐘；繼續(xù)緩慢降溫至37℃，靜置10分鐘，然后將樣品和對照物按相應(yīng)編號一對一編組，例如A I-H-60和+I-H-60為一組，全部分別上樣到高壓液相色譜儀(美國Transgenomic公司，WAVE核苷酸分析系統(tǒng))。有關(guān)上樣—洗脫—平衡的操作按其提供的操作說明書進(jìn)行。結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)異常峰型，從而可確定李某的常染色體顯性遺傳型多囊腎病不是由于I型致病基因非重復(fù)序列區(qū)突變所造成的。
3.II型致病基因的突變檢測(1)用II-SH-1至II-SH-17引物對II型致病基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其過程同實(shí)施例6，所得李某和正常對照物的擴(kuò)增產(chǎn)物編號分別為A II-SH-1、A II-SH-2、…、A II-SH-17和+II-SH-1、+II-SH-2、…、+II-SH-17。
(2)進(jìn)行高壓液相色譜儀分析則同上。檢測的峰型參見圖6，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A II-SH-8出現(xiàn)異常峰型，則將A II-SH-8和正常對照物+II-SH-8進(jìn)行核苷酸序列測定。
(3)核苷酸序列測定。核苷酸序列測定結(jié)果為正常對照物+II-SH-8的核苷酸序列為-GGAAATTCGCATTCACAAACTA-，而A II-SH-8為-GGAAATTGCATTCACAAACTA-，比對結(jié)果，在常染色體顯性遺傳型多囊腎病II型致病基因組外顯子6中第202位缺失一個堿基C，由此可見后者發(fā)生移碼突變，從而確定李某常染色體顯性遺傳型多囊腎病是由于II型致病基因突變所造成的，突變位點(diǎn)在其第6外顯子，突變類型為堿基缺失所引起的移碼突變。
表1單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測常染色體顯性遺傳型多囊腎病I型致病基因突變引物的核苷酸序列


表2高壓液相色譜儀檢測常染色體顯性遺傳型多囊腎病I型致病基因突變引物的核苷酸序列


表3染色體顯性遺傳型多囊腎病II型致病基因突變檢測引物的核苷酸序列

權(quán)利要求
1.一種常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，包括致病基因引物混合物、陰性對照物、正常對照物，其特征在于致病基因引物混合物的成分為三羥甲基氨基甲烷80mmol/L，乙酸鉀0-170mmol/L，二甲亞砜0-15％，辛基苯氧基聚乙氧乙醇0.2％，脫氧核苷三磷酸500-1200μmol/L，乙酸鎂0-2.5mmol/L或氯化鎂0-2mmol/L，熱穩(wěn)定型脫氧核苷酸聚合酶16-80U以及致病基因正、反向引物各2-6μmol/L。
2.按權(quán)利要求1所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于所說的致病基因引物混合物為I-H-1至I-H-72。
3.按權(quán)利要求1所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于所說的的致病基因引物混合物為II-SH-1至II-SH-17。
4.按權(quán)利要求3所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于所說的致病基因引物混合物還包括I-H-1至I-H-72。
5.按權(quán)利要求1所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，還包括上樣緩沖液和顯色液，其特征在于所說的致病基因引物混合物為I-S-1至I-S-82。
6.按權(quán)利要求1所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，還包括上樣緩沖液和顯色液，其特征在于所說的致病基因引物混合物為II-SH-1至II-SH-17。
7.按權(quán)利要求5所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于所說的致病基因引物混合物還包括II-SH-1至II-SH-17。
8.按權(quán)利要求5、6、7所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于所說的上樣緩沖液成分為蔗糖10％，溴酚蘭0.01％及二甲苯青0.01％。
9.按權(quán)利要求5、6、7所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于所說的顯色液成分分別為顯色液A——無水乙醇；顯色液B——濃硝酸；顯色液C——30％硝酸銀溶液；顯色液D——25％碳酸鈉溶液；顯色液E——乙酸；顯色液F——37％甲醛溶液。
10.按權(quán)利要求8所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于所說的顯色液成分分別為顯色液A——無水乙醇；顯色液B——濃硝酸；顯色液C——30％硝酸銀溶液；顯色液D——25％碳酸鈉溶液；顯色液E——酸；顯色液F——37％甲醛溶液。
11.按權(quán)利要求7所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于所說的致病基因引物混合物還包括I-H-1至I-H-72。
12.按權(quán)利要求8所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于所說的引物混合物還包括I-H-1至I-H-72。
13.按權(quán)利要求9所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于所說的致病基因引物混合物還包括I-H-1至I-H-72。
14.按權(quán)利要求10所述的常染色體顯性遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，其特征在于致病基因引物混合物還包括I-H-1至I-H-72。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于檢測常染色體顯性遺傳型多囊腎病的試劑盒。本發(fā)明根據(jù)該病患者I、II型致病基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，合成相應(yīng)引物，采用分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法或高壓液相色譜儀分析法進(jìn)行檢測，能直接測出常染色體顯性遺傳型多囊腎病致病基因的突變位點(diǎn)和突變類型，為及早防治該病，擺脫致病基因在受累家系世代間的傳遞提供了有效途徑。
文檔編號C12Q1/68GK1434130SQ0311543
公開日2003年8月6日 申請日期2003年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月17日
發(fā)明者梅長林, 張樹忠, 張殿勇 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)