專利名稱：Y染色體多色熒光復合擴增試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于體外一次性復合擴增Y染色體上的多個DNA目的片段的試劑盒。
背景技術：
STR是短串聯(lián)重復序列的簡稱，是一類核心序列為2～6個bp長的串聯(lián)重復序列，其片段長度在幾十個bp至幾百個bp之間。由于其片段短，擴增效率高、對PCR的條件要求也相對較低，即使是法醫(yī)學上常見的細胞已經(jīng)被破壞，DNA降解嚴重的腐敗檢材或是放置時間很長的檢材，同樣可以用PCR技術擴增出特異的DNA片段來進行基因分型，達到個人認定的目的。由于STR分型具有上述這些十分突出的優(yōu)越性，因此，幾乎全世界的司法鑒定DNA實驗室都在采用這一技術，并已經(jīng)基本上取代了其他DNA分析方法。
人類Y染色體是小的近端著絲粒染色體.它由長臂(Yq)和微小的短臂(YP)兩部分組成。Y染色體(除擬常染色體區(qū)外)在減數(shù)分裂中不發(fā)生交換重組，呈單倍型獨立向下傳遞，表現(xiàn)出父系遺傳特征；序列的變異完全由累積的突變所致，并非重組引起。由于Y染色體的這些特點，使得對Y染色體上多態(tài)性遺傳標記，如Y染色體特異短串聯(lián)重復序列(Y-STR)的研究不僅在人類學、古生物學等方面意義重大，而且在法醫(yī)學的個人識別及親子鑒定中亦具有重要而獨特的應用價值，可以應用于多種法醫(yī)學領域，如男女混合斑檢驗、不同男性個體成分混合物(斑)分析、父權鑒定等等。
然而，應用于法醫(yī)學實踐的Y染色體遺傳標記位于Y染色體的非重組區(qū)，整個非重組區(qū)相當于一個遺傳標記。因此Y染色體遺傳標記的個人識別能力和親權鑒定能力不能像常染色體那樣使用相乘原則。為了達到足夠的排除概率和個人識別概率，就必須不斷的增加新的Y染色體遺傳標記。另一方面，實際檢案對法醫(yī)DNA分析有明確的時間要求，急需快速高效的檢測方法。因此，亟待開發(fā)高復合程度的Y-STR復合體系，將更多變異度高的基因座復合起來一次擴增以滿足法醫(yī)學個人識別和親權鑒定的需要。
復合擴增(Multiplex PCR)又稱為多重PCR，即在一個反應體系中使用多套引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域進行擴增的過程。它可大幅度地簡化操作程序、節(jié)省時間和試劑。并且滿足同時分析不同DNA序列的需要，特別是在法醫(yī)學鑒定中可以用極微量的檢材同時擴增出多個遺傳標志而更顯其優(yōu)越性。因此，Y染色體STR基因座的復合擴增一直是國內(nèi)外相關實驗室研究的重點。
基于檢測體系的不同，目前世界上將復合擴增主要可以分為兩大類銀染復合擴增和熒光復合擴增。銀染復合擴增是復合擴增后的產(chǎn)物利用普通電泳槽分離，進行硝酸銀染色檢測的方法。方法簡單，成本較低，在普通實驗室可以開展這個項目。但由于所得結果只是單種顏色，故其復合擴增試劑盒的位點數(shù)不能太多，一般1次復合擴增的位點不能超過4個，否則會因為不同位點的擴增產(chǎn)物互相重疊，難以區(qū)分檢材的基因型。再加上所得結果是用肉眼觀察，所以其靈敏度受到一定的限制。
熒光復合擴增是在普通復合擴增PCR的其中一條引物(任何PCR反應都必須有兩條引物)一端加上熒光標記，利用STR分型技術主要檢測平臺——自動激光熒光遺傳檢測儀進行檢測PCR擴增產(chǎn)物。熒光標記STR分型技術所需檢材量少，對陳舊、腐敗檢材適用性強，結果準確、靈敏度高，自動化程度高、可重復性強等。用一種顏色的熒光素標記一組3或4個STR位點(其擴增片段不能相重疊)，另一種顏色的熒光素標記另一組3或4個STR位點，多種熒光素則可以標記多組不同的STR位點。加在一起，就可以達到1次檢測12至16個STR位點，其個人識別力則會大大提高?；谝陨蠋讉€原因，熒光復合擴增已成為目前法醫(yī)學領域用得非常普遍和先進的復合擴增方法。
熒光復合擴增的技術核心主要在于引物結構與熒光標記的位置。近年來，Y染色體STR復合擴增的文獻發(fā)表了許多，大多是將原始的用于單獨擴增的引物直接復合擴增，并用熒光標記。但是，隨著復合擴增體系中引物數(shù)量的增加，引物之間的相互影響越嚴重，反應動力學變得越復雜，成為進一步增加復合擴增位點的瓶頸和難點。由于大都采用熒光標記檢測，多色熒光體系包含至多6-8個基因座，整個體系的效能不高，大大浪費了有限的檢測范圍。Butler等人開發(fā)出的針對Y染色體STR五色熒光復合擴增體系，一次可以檢測20個基因座。他們從整體的觀念出發(fā)將所有基因座引物重新設計，既調整了基因座擴增片斷大小，又使其具有相近的退火溫度，從而得到良好的擴增效率。但是由于重新設計引物，得到的資料與原始引物的兼容性受到了巨大考驗，比如引物結合區(qū)突變問題，必須重新考察。因而探索在不降低靈敏度的情況下復合更多的位點、條件易于優(yōu)化的新方法對于法醫(yī)復合擴增的進一步發(fā)展很有必要。
迄今為止，商品化的Y染色體STR復合擴增試劑盒只有一個Y-plexTM 6(Reliagene Technologies，Inc)雙色熒光標記了六個基因座DYS19、DYS385、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS393。其在法醫(yī)學應用實踐中還存在以下問題(1)這些STR基因座都是基于中國群體以外的群體(主要是白人群體)資料而開發(fā)的，有的基因座在中國群體的基因頻率分布較差，個人識別能力較低。(2)此外，Y-plexTM 6提供的STR基因座還遠遠滿足不了法醫(yī)實際工作的需要。(3)國外商品化試劑盒價格昂貴。
本申請人曾在中國發(fā)明專利申請02133812.4號中公開了一種復合擴增STR的引物設計方法，該方法以兩條非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)，作為一對短引物；同時，在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物對的5′端分別加上該對短引物，得到長引物對。上述方法中短引物的選取是關鍵，在選定短引物之后，一個待擴增的基因座的長引物也就相應被選定。這是因為，長引物中的能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物實際上就是可以與待擴增基因座的人類基因組特異性結合的原始引物，它由待擴增基因座的人類基因組序列所決定，且因待擴增基因座的序列的不同而不同。在上述方法中，所設計的長、短引物能夠用于在同一PCR反應體系中同時對四個基因座的目的基因進行復合擴增。在復合擴增的第一階段，利用長引物擴增出同時帶有目的基因片段和與短引物配對的非人類基因組序列的產(chǎn)物；而在復合擴增第二階段，則利用一對短引物對多個基因座的目的基因片段同時進行擴增。利用上述方法設計的引物能夠大量擴增目的基因片段，且無需在實驗過程中繁瑣地調整各對引物的濃度，簡化了整個實驗過程，從而具有優(yōu)點。
與上述引物設計方法相對應，本申請人又在中國發(fā)明專利03117426.4號中提供了一種Y染色體復合擴增銀染試劑盒，該試劑盒由是由分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座長引物、B基因座長引物、C基因座長引物、D基因座長引物以及人工等位基因分型標準物構成。利用該試劑盒，就能方便地同時對Y染色體上的任意四個STR基因座進行復合擴增，同時，利用該試劑盒提供的等位基因分型標準物，還可以方便地檢測擴增結果。
但是，由于上述試劑盒仍然屬于銀染復合擴增的試劑盒，在對擴增結果進行檢測時，必然存在著前面述及的費時、自動化程度不高，準確性較差等弊病，雖然其對實驗設備的要求不高，符合當前中國大多數(shù)分子生物學實驗室的需要，但卻不能滿足已經(jīng)具有自動激光熒光遺傳檢測儀的實驗室的更高要求。因此，上述現(xiàn)有試劑盒仍然有待改進。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在沿用上述現(xiàn)有引物設計方法和試劑盒的基本思路的基礎上，重新提供一種用于熒光復合擴增的試劑盒。
本發(fā)明的試劑盒是由分離包裝的引物混合物、DNA聚合酶、緩沖液、MgCl2和等位基因分型標準物混合物構成，所述引物混合物由四對熒光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4以及對應于A、B、C、D四組Y染色體特異STR基因座的加尾引物混合而成，其中，四對熒光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4中的熒光公共引物YA和YB1、YB2、YB3、YB4為YA(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)，YB1(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)YB2(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)YB3(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)YB4(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；分別加于熒光公共引物YB1、YB2、YB3、YB4的5′端的F1、F2、F3、F4為熒光標記物；
對應于A組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)為分別在A組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB1YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)而得到的基因組序列；對應于B組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-B(P1)和YPB2-B(P2)為分別在B組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB2YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)而得到的基因組序列；對應于C組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-C(P1)和YPB3-C(P2)為分別在C組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB3YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB 3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)而得到的基因組序列；對應于D組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-D(P1)和YPB4-D(P2)為分別在D組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB4YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)而得到的基因組序列；所述等位基因分型標準物混合物由A、B、C、D四組Y染色體特異STR基因座中的各個基因座的等位基因分型標準物混合而成；在本發(fā)明試劑盒中，各組份的用量比為引物混合物中四對熒光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4各0.25～0.35ml(400nM)，32條對應于16個Y染色體特異STR基因座的加尾引物各0.25～0.35ml(40nM)；DNA聚合酶3000u(3u/μl)；緩沖液3.25～4.25ml；MgCl22.5～3.5ml(2.25mM)；等位基因分型標準物混合物總量16ml(40nM)，等位基因分型標準物混合物中所含各個基因座的等位基因分型標準物等量。
在進一步闡述本發(fā)明的內(nèi)容之前先對以下四個基本術語加以說明原始引物將與人類基因組寡核苷酸序列相對應，單基因座PCR產(chǎn)生Y染色體特異片段的引物稱之為原始引物P1、P2。
公共引物將專用于Y-STR復合擴增，序列不與人類基因組同源的特異序列引物稱之為公共引物YPA、YPB。
加尾引物將專用于Y-STR復合擴增，由公共引物分別加上原始引物構成的引物稱之為加尾引物，其在復合擴增反應中所起的作用相當于前述專利申請中的長引物。
熒光公共引物將專用于Y-STR復合擴增熒光檢測，序列不與人類基因組同源的特異序列引物稱之為熒光公共引物YA、YB，其在復合擴增反應中所起的作用相當于前述專利申請中的短引物。
在上述熒光公共引物中，YA由YPA的5′端加上特異序列GTTCTT構成，YB由YPB的5′端加上熒光標記物(熒光分子)構成。
在本發(fā)明中，上述公共引物YPA、YPB的設計是極為關鍵的，其設計需要考慮以下幾個方面的要素(1)、公共引物與人類基因組序列無同源性；(2)、所有位點同時得到擴增，即所有引物對的退火溫度須相近；(3)、公共引物之間與特異引物之間不能形成引物二聚體；(4)、不形成二級結構。
與本申請人在前述專利申請中給出的擴增方法相類似，本發(fā)明中應用加尾序列引物方法的基本思路是選取一對非人類基因組的短DNA片段，讓其作為針對同一組，如A組中的四個不同基因座的公共引物對YPA和YPB1，并在能夠與人類基因組寡核苷酸序列結合的原始引物P1、P2的5′端分別加上該對公共引物，從而得到加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)。對于同一組中的四個不同基因座來說，四個待擴增基因座的加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)因原始引物P1、P2的不同而不同。
依次類推，也可以選取另外三對非人類基因組的短DNA片段，即YPA和YPB2、YPA和YPB3、YPA和YPB4，并得到分別對應于B、C、D組基因座(每組基因座中均包含四個不同的基因座)的加尾引物YPA-B(P1)和YPB2-B(P2)、YPA-C(P1)和YPB3-C(P2)、YPA-D(P1)和YPB4-D(P2)。
在本發(fā)明中，我們選取了四對結構相似，片段大小一致(每條引物間相差5個堿基)，物理動力學特性相似的公共引物，即YPA和YPB1、YPA和YPB2、YPA和YPB3、YPA和YPB4?？梢钥闯?，在這四對公共引物中，實際上僅包含了五條公共引物，這是本發(fā)明的關鍵所在。因為在PCR反應過程中，引物越多，引物間相互的反應(如形成引物二聚體)的可能性就越大；引物之間的堿基構成相差越大，引物間相互反應的可能性就越大。因此，本發(fā)明盡量減少了公共引物的數(shù)目。
當我們在四條公共引物YPB1、YPB2、YPB3、YPB4的5′端分別標記四種不同顏色的熒光標記物F1、F2、F3、F4，并在公共引物YPA的5′端加上特殊序列GTTCTT時，就由四對公共引物YPA和YPB1、YPA和YPB2、YPA和YPB3、YPA和YPB4重新形成了四對熒光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4。本發(fā)明中所選取的四對公共引物及由其進一步形成的四對熒光公共引物如下YPA 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′YA 5′-GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′YPB1 5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′ YB1 5′-F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′YPA 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′YA 5′-GTTCTT-ATTTAGGTGACTATAGAATAC-3′YPB2 5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′ YB2 5′-F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′YPA 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′YA 5′-GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′YPB3 5′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′ YB3 5′-F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′YPA 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′YA 5′-GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′YPB4 5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′ YB4 5′-F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′此處，在公共引物YPA的5′端加上了特殊序列GTTCTT，其目的是有效地抑制擴增反應過程中的“雙尖峰”。
本發(fā)明的試劑盒中包含了根據(jù)上述四對公共引物制作出的16個基因座的加尾引物，這16對(共32條)加尾引物中所含的原始引物P1、P2可以通過互聯(lián)網(wǎng)上公開的人類基因組數(shù)據(jù)庫檢索獲得。
在進行復合擴增反應時，可在PCR反應體系中同時加入本試劑盒中分離包裝的引物混合物、DNA聚合酶、緩沖液、Mgcl2，并加入常規(guī)反應所需的四種脫氧核苷三鱗酸。該反應體系進行第一輪PCR反應時(經(jīng)歷變性、退火、延伸的一次循環(huán)過程)，公共引物不會與人類基因組序列結合，所擴增的DNA片段由各加尾引物中所含的原始引物P1、P2決定。第一輪反應結束后，在待擴增基因座產(chǎn)生的具有目的基因片段和公共引物的擴增產(chǎn)物將作為第二輪PCR反應的模板繼續(xù)擴增。擴增所用引物仍然是各加尾引物，所得到的產(chǎn)物是同時具有目的基因片段和與公共引物配對的非人類基因組序列。我們將上述以加尾引物作為反應引物的第一輪和第二輪PCR反應稱之為第一階段的反應，其目的在于在加尾的原始引物基礎上，有效的保證整個體系的特異性，以及與原始引物資料的兼容性。
從第三輪PCR反應開始，熒光公共引物將作為上述各個擴增基因座的引物。在經(jīng)歷多輪(如30輪)PCR循環(huán)反應之后，上述第一階段的產(chǎn)物就會被擴增至上百萬倍。在利用自動激光熒光遺傳分析儀檢測PCR產(chǎn)物時，實際檢測的是由熒光標記引物延伸產(chǎn)物的單鏈，5′端標記熒光分子，3′末端延伸的模板是反向引物序列。由于我們在原來公共引物的5′端標記了熒光染料，因此可以通過標記的熒光檢測到復合擴增的各個基因座。在本發(fā)明中，我們將上述以熒光公共引物對作為反應引物的PCR反應稱之為第二階段的反應。
與本申請人的前述專利申請相類似，在本發(fā)明的上述設計思路中，第一階段和第二階段的反應是在同一反應體系中進行的，而不是截然地分成兩次反應。實際上，即使是在第三輪及第三輪之后的PCR反應中，仍然存在著上述第一階段的反應，只是其所占比例極低而已。因為熒光公共引物濃度比加尾引物濃度高幾十倍，競爭抑制了加尾引物擴增目的基因的DNA。另外，在進行第一階段的PCR擴增反應時，相對于多個待擴增基因座且序列不同的多對加尾引物同時參與反應，引物間的反應與競爭在所難免，從而大大降低了PCR擴增的效率。但是，就本發(fā)明來說，第一階段的PCR反應僅僅是上述復合過程的開端，只需產(chǎn)生少量同時具有目的基因的DNA片段和非人類基因組序列的產(chǎn)物，即生成少量用于第二階段的PCR反應的模板。因此上述弊端對整個復合擴增反應過程產(chǎn)生的影響是極其微弱的。由于在此后進行的第二階段擴增中，就每一組基因座來說，參與反應的引物只有一對，即熒光公共引物對，不存在引物間的競爭與抑制，也無需調整引物間的濃度，從而大大提高了各基因座的擴增效率。這樣就完成了由多對特異引物同時擴增多個特異性基因片段，到一對公共引物同時擴增多個特異性基因片段轉換。
在本發(fā)明試劑盒中，等位基因分型標準物是進行結果檢測時分型的對照物，是一個非常重要的組份。等位基因分型標準物是指用于STR分型的已知序列的DNA片段群。為了實現(xiàn)實驗室之間的分型標準化與質量控制，國際法醫(yī)遺傳學會(International Society of Forensic Genetics，ISFG)于1994年推薦了按核心序列串聯(lián)重復拷貝數(shù)命名常染色體等位基因的原則，在序列分析為基礎構建的人類等位基因分型標準物對照下，可以避免按分子量測定值計算DNA片段長短所產(chǎn)生的誤差。國內(nèi)外可重復性分析結果表明只要將等位基因分型標準物與樣本PCR擴增產(chǎn)物同步電泳，不同的實驗室，不同的設備，不同的電泳方法，均可得到一致的可重復性結果。
由于本發(fā)明試劑盒中的加尾引物是在互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的原始引物(P1、P2)的基礎之上加入了一段非人類基因組序列的公共引物，因此不能再采用原基因數(shù)據(jù)庫引物的擴增產(chǎn)物作本發(fā)明的分型標準物。所以，在本發(fā)明試劑盒中，針對各個待擴增基因座分別提供了等位基因分型標準物，即由熒光公共引物分別擴增各基因座的等位基因凝膠浸泡液，各等位基因PCR產(chǎn)物混合起來制成。
采用原始引物直接復合擴增熒光檢測，可以成功的復合6-8個基因座，需要引物濃度在0.1～1μM之間。而我們使用加尾引物復合擴增方法的預實驗已經(jīng)證明該方法大大降低了特異引物的濃度，是用原始引物進行復合擴增引物濃度的5～50分之一，理論上復合的基因座數(shù)量至少應該是它們的5倍。此外，分辨率和準確率高，可以分辨1個bp的長度，采用分子質量內(nèi)標及等位基因分型標準物(ladder)，避免了因電泳引起的誤差，具有很好的重復性?？梢娂游惨飶秃蠑U增方法還有很大的潛力，為大規(guī)模Y-STR復合擴增的研究提供了一個行之有效的方法。
本發(fā)明試劑盒能夠高效率地對Y染色體上四組共16個STR基因座進行復合擴增，通過自動熒光測序儀進行檢測分型，達到高自動化水平，實驗結果準確、可重現(xiàn)性好的目的。另外，本發(fā)明試劑盒中所采用的Buffer緩沖液、DNA聚合酶和Mgcl2等試劑均可直接采用現(xiàn)有的市售產(chǎn)品，如中國華美公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，相應可以實現(xiàn)試劑的國產(chǎn)化。
本發(fā)明的內(nèi)容結合以下實施例作更進一步的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實施例中所涉及的內(nèi)容。
具體實施例方式
本實施例中的試劑盒是針對A、B、C、D四組共16個STR基因座制作的。本實施例中的試劑盒由分離包裝的引物混合物、DNA聚合酶、緩沖液、MgCl2和等位基因分型標準物混合物構成，所述引物混合物由四對熒光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4以及對應于A、B、C、D四組Y染色體特異STR基因座的加尾引物混合而成，其中，四對熒光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4中的熒光公共引物YA和YB1、YB2、YB3、YB4為YA(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)，YB1(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)YB2(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG 3′)YB3(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)YB4(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；分別加于熒光公共引物YB1、YB2、YB3、YB4的5′端的F1、F2、F3、F4為熒光標記物。在本實施例中，上述熒光標記物F1、F2、F3、F4分別為現(xiàn)有的藍、綠、黃、紅色熒光標記物FAM、JOE、NED和ROX。其中，藍色熒光標記物FAM的結構式為 綠色熒光標記物JOE的結構式為
黃色熒光標記物NED的結構式為 紅色熒光標記物ROX的結構式為 在本實施例中，對應于A組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)為分別在A組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB1YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)而得到的基因組序列。
本實施例試劑盒所針對的A組待擴增基因座分別為DYS434、Y-GATA-A10、DYS438和DYS439。
與此相對應，加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)為分別在能夠與A組基因座DYS434、Y-GATA-A10、DYS438和DYS439的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB1而得到的基因組序列。互聯(lián)網(wǎng)上GDB基因數(shù)據(jù)庫中公布的DYS434的原始引物為P15’-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3’P25’-GGAGATGAATGAATGGATGGA-3’；Y-GATA-A10的原始引物為P15’-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA-3’P25’-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT-3’；DYS438的原始引物為P15’-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3’P25’-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3’；DYS439的原始引物為P15’-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT-3’P25’-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT-3’；因此，引物混合物中對應于A組DYS434、Y-GATA-A10、DYS438和DYS439基因座的加尾引物分別為YPA-DYS434(P1) 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3′YPB1-DYS434(P2)5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GGAGATGAATGAATGGATGGA-3′YPA-Y-GATA-A10(P1) 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA-3’YPB1-Y-GATA-A10(P2)5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT-3’YPA-DYS438(P1) 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3’YPB1-DYS438(P2)5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3’YPA-DYS439(P1) 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT-3’YPB1-DYS439(P2)5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT-3’。
在本實施例中，對應于B組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-B(P1)和YPB2-B(P2)為分別在B組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB2YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)而得到的基因組序列。
本實施例試劑盒所針對的B組待擴增基因座分別為DYS453、DYS513、DYS19和DYS463。
與此相對應，加尾引物YPA-B(P1)和YPB1-B(P2)為分別在能夠與B組基因座DYS453、DYS513、DYS19和DYS463的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB2而得到的基因組序列。互聯(lián)網(wǎng)上GDB基因數(shù)據(jù)庫中公布的DYS453的原始引物為P15′-GGGTAACAGAACAAGACAGT-3′P25′-CTAAAAGTATGGATATTCTTCG-3′；DYS513的原始引物為P15′-ATTGATCCATCCGTCTGTCC-3′P25′-GTTGGATGAAGGGAGAGCAG-3′；DYS19的原始引物為P15′-CTACTGAGTTTCTGTTATAGT-3′P25′-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3′；DYS463的原始引物為P15′-AATTCTAGGTTTGAGCAAAGACA-3′P25′-ATGAGGTTGTGTGACTTGACTG-3′；因此，引物混合物中對應于B組DYS453、DYS513、DYS19和DYS463基因座的加尾引物分別為YPA-DYS453(P1) 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGGTAACAGAACAAGACAGT-3′YPB2-DYS453(P2)5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-CTAAAAGTATGGATATTCTTCG-3′YPA-DYS513(P1) 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ATTGATCCATCCGTCTGTCC-3′YPB2-DYS513(P2)5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-GTTGGATGAAGGGAGAGCAG-3′YPA-DYS19(P1) 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CTACTGAGTTTCTGTTATAGT-3′YPB2-DYS19(P2) 5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3′
YPA-DYS463(P1) 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-AATTCTAGGTTTGAGCAAAGACA-3′YPB2-DYS463(P2)5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-ATGAGGTTGTGTGACTTGACTG-3′。
在本實施例中，對應于C組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-C(P1)和YPB3-C(P2)為分別在C組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB3YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB 3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)而得到的基因組序列。
本實施例試劑盒所針對的C組待擴增基因座分別為DYS456、DYS520、DYS447和DYS552。
與此相對應，加尾引物YPA-C(P1)和YPB3-C(P2)為分別在能夠與C組基因座DYS456、DYS520、DYS447和DYS552的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB3而得到的基因組序列?；ヂ?lián)網(wǎng)上GDB基因數(shù)據(jù)庫中公布的DYS456的原始引物為P15’-CCCATCAACTCAGCCCAAAAC-3’P25’-GGACCTTGTGATAATGTAAGATA-3’；DYS520的原始引物為P15’-AACAGCCTGCCCAACATAGT-3’P25’-ACCATCATGCCCTGCAATA-3’；DYS447的原始引物為P15’-GGGCTTGCTTTGCGTTATCT-3’P25’-GGTCACAGCATGGCTTGGTT-3’；DYS552的原始引物為P15’-CCATAGTGCCGAGGTCAAGT-3’P25’-AACACCTGATGCCTGGTTG-3’；因此，引物混合物中對應于C組DYS456、DYS520、DYS447和DYS552基因座的加尾引物分別為YPA-DYS456(P1) 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CCCATCAACTCAGCCCAAAAC-3′YPB3-DYS456(P2)5′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GGACCTTGTGATAATGTAAGATA-3′
YPA-DYS520(P1) 5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-AACAGCCTGCCCAACATAGT-3′YPB3-DYS520(P2)5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-ACCATCATGCCCTGCAATA-3′YPA-DYS447(P1) 5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGGCTTGCTTTGCGTTATCT-3′YPB3-DYS447(P2)5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GGTCACAGCATGGCTTGGTT-3′YPA-DYS552(P1) 5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CCATAGTGCCGAGGTCAAGT-3′YPB3-DYS552(P2)5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-AACACCTGATGCCTGGTTG-3′。
在本實施例中，對應于D組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-D(P1)和YPB4-D(P2)為分別在D組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB4YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)而得到的基因組序列。
本實施例試劑盒所針對的D組待擴增基因座分別為DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510。
與此相對應，加尾引物YPA-D(P1)和YPB4-D(P2)為分別在能夠與D組基因座DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB4而得到的基因組序列?；ヂ?lián)網(wǎng)上GDB基因數(shù)據(jù)庫中公布的DYS523原始引物為P15′-GGTCAGCAGTGAAAGATAGGC-3′P25′-TCCATCCATCCATCTACCTG-3′；DYS443原始引物為P15′-TTTCATTGGCCACCTGACATTAC-3′P25′-CGCTTCCATTTACACTTCCTGTG-3′；YGATA-A8原始引物為P15′-CGGCATCTATCTATGTGTCTGTC-3′P25′-AGTAGATACAAAGAGAGCATAGACAAAT-3′；DYS510原始引物為P15′-TTTTTCCTCCCTTACCACAGA-3′P25′-TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA-3′；
因此，引物混合物中對應于D組DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510基因座的加尾引物分別為YPA-DYS523(P1)5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGTCAGCAGTGAAAGATAGGC-3′YPB4-DYS523(P2) 5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-TCCATCCATCCATCTACCTG-3′YPA-DYS443(P1)5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTTCATTGGCCACCTGACATTAC-3′YPB4-DYS443(P2) 5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-CGCTTCCATTTACACTTCCTGTG-3′YPA-Y-GATA-A8(P1) 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CGGCATCTATCTATGTGTCTGTC-3′YPB4-Y-GATA-A8(P2)5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-AGTAGATACAAAGAGAGCATAGACAAAT-3′YPA-DYS510(P1)5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTTTTCCTCCCTTACCACAGA-3′YPB4-DYS510(P2) 5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA-3′。
本實施例中的等位基因分型標準物混合物由A、B、C、D四組Y染色體特異STR基因座中的各個基因座的等位基因分型標準物混合而成。
本實施例中所采用的等位基因分型標準物按以下方式制得用復合擴增銀染體系分別擴增以上四組Y特異STR基因座各個不同基因型的個體樣本，電泳分離，硝酸銀染色，切下各基因座等位基因目的片段凝膠；用四對熒光公共引物分別擴增對應于A、B、C、D四組各基因座的等位基因凝膠浸泡液，將各等位基因PCR產(chǎn)物混合起來，制成等位基因分型標準物。
具體來說，在本實施例中，A組基因座分型標準物的序列為DYS4345′-5FAM-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS434)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。Y-GATA-A105′-5FAM-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3’(X)代表用該基因座(Y-GATA-A10)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。DYS4385′-5FAM-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3’(X)代表用該基因座(DYS439)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。DYS4395′-5FAM-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3’(X)代表用該基因座(DYS438)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
B組基因座分型標準物的序列為DYS4535′-VIC-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-X-G-TATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS453)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
DYS5135′-VIC-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS434)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
DYS195′-VIC-TAATACGACTCAGTATACGGACAG-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS19)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
DYS4635′-VIC-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS463)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
C組基因座分型標準物的序列為DYS4565′-NED-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS456)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
DYS5205′-NED-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS520)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
DYS4475′-NED-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS447)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
DYS5525′-NED-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS552)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
D組基因座分型標準物的序列為DYS5235′-PET-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS523)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
DYS4435′-PET-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS443)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
Y-GATA-A85′-PET-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(Y-GATA-A8)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
DYS5105′-PET-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用該基因座(DYS510)原始引物進行PCR擴增后構成Ladder的各個等位基因序列。
在本實施例的試劑盒中，各組份的用量比為引物混合物中四對熒光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4各0.3ml(400nM)，32條對應于16個Y染色體特異STR基因座的加尾引物各0.3ml(40nM)；DNA聚合酶3000u(3u/μl)；緩沖液(本實施例中采用10 x Reaction Buffer)3.75ml；MgCl23ml(2.25mM)；等位基因分型標準物混合物總量16ml(40nM)，等位基因分型標準物混合物中所含各個基因座的等位基因分型標準物等量。
需要說明的是，本實施例中所采用的熒光標記物F1、F2、F3、F4的具體構成可以相互更換，從而形成不同的熒光公共引物。
權利要求
1.一種Y染色體多色熒光復合擴增試劑盒，其特征是由分離包裝的引物混合物、DNA聚合酶、緩沖液、MgCl2和等位基因分型標準物混合物構成，所述引物混合物由四對熒光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4以及對應于A、B、C、D四組Y染色體特異STR基因座的加尾引物混合而成，其中，四對熒光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4中的熒光公共引物YA和YB1、YB2、YB3、YB4為YA(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YB1(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)YB2(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)YB3(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)YB4(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；分別加于熒光公共引物YB1、YB2、YB3、YB4的5′端的F1、F2、F3、F4為熒光標記物；對應于A組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)為分別在A組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB1YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)而得到的基因組序列；對應于B組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-B(P1)和YPB2-B(P2)為分別在B組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB2YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)而得到的基因組序列；對應于C組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-C(P1)和YPB3-C(P2)為分別在C組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB3YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)而得到的基因組序列；對應于D組Y染色體特異STR基因座的加尾引物YPA-D(P1)和YPB4-D(P2)為分別在D組基因座中的四個基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB4YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)而得到的基因組序列；所述等位基因分型標準物混合物由A、B、C、D四組Y染色體特異STR基因座中的各個基因座的等位基因分型標準物混合而成；各組份的用量比為引物混合物中四對熒光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4各0.25～0.35ml(400nM)，32條對應于16個Y染色體特異STR基因座的加尾引物各0.25～0.35ml(40nM)；DNA聚合酶3000u(3u/μl)；緩沖液3.25～4.25ml；MgCl22.5～3.5ml(2.25mM)；等位基因分型標準物混合物總量16ml(40nM)，等位基因分型標準物混合物中所含各個基因座的等位基因分型標準物等量。
全文摘要
一種Y染色體多色熒光復合擴增試劑盒，其特征是由分離包裝的引物混合物、DNA聚合酶、緩沖液、MgCl
文檔編號C12Q1/68GK1493701SQ0313575
公開日2004年5月5日 申請日期2003年9月4日 優(yōu)先權日2003年9月4日
發(fā)明者侯一平, 張, 石美森, 李英碧, 應斌武, 吳謹, 顏靜 申請人:四川大學