專利名稱：Y染色體復(fù)合擴(kuò)增銀染試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于體外一次性擴(kuò)增Y染色體上的多個DNA目的片段的試劑盒。
背景技術(shù)：
人體的23對染色體中，決定性別的染色體叫做性染色體。性染色體分為X、Y兩種。Y染色體是男性特有的，男性有帶X、Y兩種染色體的精子，女性只有帶X染色體的卵子。當(dāng)帶Y染色體的精子與X染色體的卵子相結(jié)合受孕，產(chǎn)生的個體就是男性；而帶X染色體的精子與帶X染色體的卵子相結(jié)合，產(chǎn)生的個體則是女性。所以Y染色體只能由男性遺傳，Y染色體的遺傳標(biāo)記也就隨父系代代相傳。與常染色體相比，Y染色體上的遺傳標(biāo)記不存在重組與交換。Y染色體遺傳標(biāo)記的特點可以運(yùn)用到刑事案件的偵破上。對于個人識別的優(yōu)點在于1.對陰道分泌物與精液構(gòu)成的混合斑，分析Y染色體遺傳標(biāo)記可以不受女性成份的干擾。陰道分泌物與精液構(gòu)成的混合斑痕(以下簡稱混合斑)是性犯罪案件最常見的法醫(yī)物證檢材。混合斑由兩個人甚至多個人的體液構(gòu)成，混合斑中陰道分泌物的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于精液成份。國內(nèi)外DNA實驗室采用的遺傳標(biāo)記大多定位于常染色體，用常染色體DNA遺傳標(biāo)記分型時，大量陰道分泌物成份常常干擾和掩蓋對精液成份的檢測。因此，混合斑的個人識別是法醫(yī)學(xué)迫切需要解決的難題。相比之下，檢測Y染色體特異遺傳標(biāo)記時，由于陰道脫落上皮細(xì)胞不含這類遺傳標(biāo)記，陰道脫落上皮細(xì)胞含量多少將不會影響檢測結(jié)果。更重要的是，Y染色體特異遺傳標(biāo)記可實現(xiàn)僅對精液成份分型，結(jié)果可與犯罪嫌疑人直接比較，解釋結(jié)果更為簡單。
2.用Y染色體遺傳標(biāo)記檢測輪奸案的混合斑，可推知罪犯的最少人數(shù)，為偵察提供線索。
3.男性嫌疑人在逃的案件，可利用嫌疑人父系親屬的DNA進(jìn)行Y染色體遺傳標(biāo)記分析。
Y染色體遺傳標(biāo)記對于親權(quán)鑒定的優(yōu)點在于1.父親已死亡或失蹤，可通過父系親屬Y染色體遺傳標(biāo)記進(jìn)行父權(quán)鑒定2.可對兄弟、叔侄及爺孫隔代關(guān)系進(jìn)行鑒定。
然而，人類Y染色體非重組區(qū)遺傳標(biāo)記很少，這是Y染色體遺傳標(biāo)記未能廣泛應(yīng)用的主要原因。所幸的是，“人類基因組計劃”研究中發(fā)現(xiàn)了一類具有Y染色體特異性的DNA短串聯(lián)重復(fù)序列(以下簡稱Y染色體特異STR基因座)，為法醫(yī)學(xué)個人識別與親權(quán)鑒定帶來了新的希望，可以提供新的技術(shù)解決方案和新的檢測手段。認(rèn)識到Y(jié)染色體特異STR基因座的重要性，1996年和2000年在德國柏林分別召開了第一屆和第二屆國際法醫(yī)Y染色體特異STR基因座分型協(xié)調(diào)會議。目前，Y染色體特異STR基因座是美國及歐洲國家法醫(yī)學(xué)研究的重點之一。然而，與常染色體相比，極少有Y染色體特異STR基因座分型的商品試劑出現(xiàn)。原因在于Y染色體的結(jié)構(gòu)中，長臂DNA有大量大片段重復(fù)，要求PCR反應(yīng)條件比常染色體高得多；用對常染色體的方法進(jìn)行Y染色體特異STR復(fù)合擴(kuò)增極為困難。另一方面，除擬常染區(qū)外，Y染色體非重組區(qū)中的某些基因座與X染色體仍有部分同源序列，這些基因座在一定的PCR反應(yīng)條件下不具男性特異性，進(jìn)一步增加了設(shè)計Y染色體特異STR復(fù)合擴(kuò)增體系的難度。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)是目前常用體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。
在PCR反應(yīng)時，首先需要一段長約17-20余個堿基的寡核苷酸片段作為引物(primer)，該引物是按照欲檢測的DNA片段的兩個5′端的堿基順序合成的，PCR擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板的特異結(jié)合。整個擴(kuò)增過程分三步(1)變性加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；(2)退火突然變溫后模板DNA與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)簡單等特點，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間；(3)延伸在DNA聚合酶及鎂離子等存在的條件下，從引物的3′端開始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。上述三步為一循環(huán)，從理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過n個循環(huán)后DNA可擴(kuò)增2n-2n倍。
目前國內(nèi)外實驗室對Y染色體STR遺傳標(biāo)記所采用的最主要的方法還是對其單個STR基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增，例如我們實驗室侯一平等人在《ForensicScience Internetional》2001年第118(2-3)期中發(fā)表的《Allele sequencesof six new Y-STR loci and haplotypes in the Chinese Han population》文章中所介紹的方法。單個Y染色體STR基因座擴(kuò)增較多個Y染色體STR基因座同時擴(kuò)增(復(fù)合擴(kuò)增)容易，條件較簡單。但是，復(fù)合擴(kuò)增有著單個基因座擴(kuò)增所不具備的優(yōu)勢，一次能同時能同時擴(kuò)增多個基因座，省時、經(jīng)濟(jì)。所以Y染色體STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增一直是國內(nèi)外相關(guān)實驗室研究的重點。目前，國內(nèi)外對于Y染色體STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增的研究一直處于探索之中，雖然國外已有Y染色體STR基因座的試劑盒出售使用，但它們是基于熒光檢測為基礎(chǔ)的，即采用熒光標(biāo)記引物、通過DNA自動測序儀進(jìn)通過自動測序儀進(jìn)行檢測的方式。例如，Bulter JM等在《Forensic Science Internetional》2002年第129(1)期中發(fā)表的《A novel multiplex for simultaneousamplification of 20 Y chromosome STR markers》文章中所介紹的即是這種方法。而我們的試劑盒的檢測原理與他們不同，我們是以銀染法為基礎(chǔ)設(shè)計的。他們檢測的是DNA的單鏈結(jié)構(gòu)(標(biāo)記熒光的鏈)，而我們檢測的是DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，目前國內(nèi)外尚未報道相關(guān)技術(shù)與產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可同時擴(kuò)增四個基因座、擴(kuò)增效率高、便于實驗室操作和便于檢測擴(kuò)增效果的Y染色體復(fù)合擴(kuò)增銀染試劑盒。
本發(fā)明的Y染色體復(fù)合擴(kuò)增銀染試劑盒由分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2以及人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物構(gòu)成，其中短引物YPA為非人類的基因組序列(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)；短引物YPB為非人類的基因組序列
(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)；A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2為分別在能夠與人類的A基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2為分別在能夠與人類的B基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2為分別在能夠與人類的C基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2為分別在能夠與人類的D基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物共包括了A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物、B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物、C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物和D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為A基因座的長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一。
B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為B基因座的長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一。
C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為C基因座的長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一。
D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為D基因座的長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一。
各組份的用量比為短引物YPA0.25～0.35ml(400nM)、短引物YPB0.25～0.35ml(400nM)、緩沖液(無Mgcl2)3.5～4.0ml、DNA聚合酶3000u(3u/μl)、Mgcl22.5～3.5ml(2.25mM)、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2各0.25～0.35ml(40nM)、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2各0.25～0.35ml(40nM)、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2各0.25～0.35ml(40nM)、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2各0.25～0.35ml(40nM)、人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物4ml(40nM)，在人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物中，A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml(40nM)、B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml(40nM)、C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml(40nM)、D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml(40nM)。
在本發(fā)明的試劑盒中，引物的設(shè)計是極其關(guān)鍵的，其基本思路是選取一對非人類基因組的短DNA片段作為上述短引物YPA和YPB，并在能與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物(P1、P2)之5′端分別加上該對短引物，從而得到長引物YPA-P1和YPB-P2。此處，能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2亦即是可以與待擴(kuò)增基因座的人類基因組結(jié)合的原始引物。由于復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)是同時對四個基因座A、B、C、D進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，相對于不同基因座來說，能夠與該基因座的人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2是不同的，與之相對應(yīng)，四個待擴(kuò)增基因座A、B、C、D的長引物YPA-P1和YPB-P2也因P1、P2的不同而不相同。在進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)時，可以同時在PCR反應(yīng)體系中加入本試劑盒中分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、分型標(biāo)準(zhǔn)物和分別針對四個待擴(kuò)增基因座A、B、C、D的長引物YPA-P1、YPB-P2，并加入常規(guī)PCR反應(yīng)所需的單核苷酸。由于各個待擴(kuò)增基因座A、B、C、D的人類基因組序列中并不含有短引物YPA、YPB所對應(yīng)的序列，所以在該反應(yīng)體系進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)時(經(jīng)歷前述變性、退火、延伸的一次循環(huán)過程)，短引物YPA、YPB并不會與人類基因組序列結(jié)合，所擴(kuò)增的DNA片段還是由長引物YPA-P1、YPB-P2中所含的原來的引物對P1、P2所決定。但是，第一輪反應(yīng)結(jié)束后，在待擴(kuò)增基因座將會產(chǎn)生同時具有目的基因片段和非人類基因組序列YPA、YPB的擴(kuò)增產(chǎn)物。在PCR反應(yīng)體系進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)(即經(jīng)歷變性、退火、延伸的第二次循環(huán)過程)時，上述同時具有目的基因片段和非人類基因組序列YPA、YPB的產(chǎn)物被進(jìn)一步擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物仍然是長引物YPA-P1、YPB-P2，反應(yīng)完成后，所得到的產(chǎn)物同時具有目的基因片段和與短引物對YPA、YPB配對的非人類基因組序列。在本發(fā)明中，我們將上述以長引物作為反應(yīng)引物的第一輪和第二輪PCR反應(yīng)稱之為第一階段的反應(yīng)，即復(fù)合擴(kuò)增過程中第一階段的聚合酶鏈反應(yīng)。換句話說，復(fù)合擴(kuò)增過程中第一階段的聚合酶鏈反應(yīng)包括了上述第一輪和第二輪反應(yīng)。該階段反應(yīng)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物同時具有目的基因片段和與短引物對(YPA、YPB)配對的非人類基因組序列，此處將其稱之為復(fù)合擴(kuò)增第一階段的產(chǎn)物。從第三輪PCR反應(yīng)開始，由于對于各個基因座已經(jīng)具有上述第一階段的產(chǎn)物，這樣，短引物YPA、YPB就可以作為上述各個擴(kuò)增基因座的引物，PCR反應(yīng)就能以上述第一階段的產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。與此相類似，在第三輪之后的各輪PCR反應(yīng)中，均能夠以短引物對(YPA、YPB)充當(dāng)各個擴(kuò)增基因座的引物。在經(jīng)歷多輪(如30輪)PCR循環(huán)反應(yīng)之后，上述第一階段的產(chǎn)物就會被擴(kuò)增至上百萬倍。在本發(fā)明中，我們將上述以短引物作為反應(yīng)引物的PCR反應(yīng)稱之為第二階段的反應(yīng)，即復(fù)合擴(kuò)增過程中第二階段的聚合酶鏈反應(yīng)。需要說明的是，在本發(fā)明的上述設(shè)計思路中，第一階段和第二階段的反應(yīng)是在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行的，而不是截然地分成兩次反應(yīng)。實際上，即使是在第三輪及第三輪之后的PCR反應(yīng)中，仍然存在著上述第一階段的反應(yīng)，只是其所占比例極低而已。另外，在進(jìn)行第一階段的PCR擴(kuò)增反應(yīng)時有多對引物同時參與反應(yīng)，即相對于多個待擴(kuò)增基因座且序列不同的多對長引物同時參與反應(yīng)(如前所述，各個待擴(kuò)增基因座的長引物YPA-P1和YPB-P2并不相同)，引物與引物間的反應(yīng)與競爭在所難免，從而大大降低了PCR擴(kuò)增的效率，這一弊端在前面討論現(xiàn)有技術(shù)時已經(jīng)提及。但是，就本發(fā)明來說，第一階段的PCR擴(kuò)增的目的并不是希望獲得大量的擴(kuò)增片段，而僅僅是使同時帶有目的基因片段和與YPA、YPB配對的非人類基因組序列的產(chǎn)物(第一階段的產(chǎn)物)產(chǎn)生即可，因此上述弊端對整個復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)過程產(chǎn)生的影響是極其微弱的。而在第一階段的PCR擴(kuò)增之后，需要擴(kuò)增的各個目的基因片段的5′端都帶有與YPA、YPB配對的非人類基因組序列，所以加入一對短引物(YPA、YPB)之后，就可以對多個基因座同時進(jìn)行擴(kuò)增。由于在此后進(jìn)行的第二階段擴(kuò)增中，參與反應(yīng)的引物只有一對，即短引物對YPA、YPB，不存在引物間的競爭與反應(yīng)，也無需調(diào)整引物間的濃度，從而大大提高了各基因座的擴(kuò)增效率。因此可以說，第一階段的PCR反應(yīng)是僅需擴(kuò)增出少量模板，而第二階段的擴(kuò)增是高效率擴(kuò)增所有基因座。就其實質(zhì)而言，在第二階段的PCR反應(yīng)中，是把現(xiàn)有復(fù)合擴(kuò)增方法中的多對引物同時擴(kuò)增多個基因座，轉(zhuǎn)變?yōu)橐粚σ?YPA、YPB)同時擴(kuò)增多個基因座；同時，相對于被擴(kuò)增的各個特異性DNA片段來說，YPA、YPB并非是特異引物，因此，上述過程還由現(xiàn)有復(fù)合擴(kuò)增方法中的由多對特異引物同時擴(kuò)增多個特異性基因片段，轉(zhuǎn)變成了由一對非特異引物同時擴(kuò)增多個特異性基因片段。
在本發(fā)明的試劑盒中，上述短引物YPA、YPB的選取考慮了以下幾個方面的要素①、它必須是非人類基因組序列，即它的序列不會與人類基因組序列相同或互補(bǔ)。②、選取適當(dāng)?shù)囊镩L度。大量實驗結(jié)果表明，在設(shè)計引物時，引物長度是一個非常關(guān)鍵的參數(shù)，18～24個堿基構(gòu)成的寡核苷酸鏈?zhǔn)潜容^優(yōu)化的引物長度；引物過短，將會導(dǎo)致特異性的降低；引物過長，擴(kuò)增退火時被引發(fā)的模板太少，在指數(shù)擴(kuò)增期，甚至每一步退火步驟的小失誤都將擴(kuò)大，以致引起擴(kuò)增產(chǎn)物的明顯減少。③、選取引物中堿基GC的含量和引物的退火溫度Tm。PCR反應(yīng)的引物應(yīng)該保持合理的GC含量。兩條引物的GC含量和Tm值應(yīng)該一致，兼容性差的引物對的擴(kuò)增效率和特異性都較差。較低的Tm值會導(dǎo)致特異性的喪失，若采用太高的退火溫度，擴(kuò)增的效率將會非常低；如果退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性退火，從而導(dǎo)致非特異性DNA片段的擴(kuò)增。本發(fā)明在設(shè)計引物的Tm值時選擇的溫度是55℃，因為在該溫度下，復(fù)合擴(kuò)增中絕大多數(shù)的PCR反應(yīng)都能進(jìn)行，同時此溫度將會使首次PCR反應(yīng)后出現(xiàn)大量的非特異的雜帶，我們就必須通過降低長引物的濃度來減少雜帶。降低長引物濃度后，各引物之間的相互作用降低，非特異性的產(chǎn)物減少，與此同時，我們所需的特異性的產(chǎn)物也降低，但是這并不會影響整個擴(kuò)增效率。前已述及，前兩輪PCR反應(yīng)僅僅是上述復(fù)合擴(kuò)增過程的開端，該輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物并不要求有較大的量，只需產(chǎn)生少量同時具有非人類基因組序列和目的基因的DNA片段，即生成少量用于第二階段的PCR反應(yīng)的模板，就能通過其后的PCR反應(yīng)對該模板進(jìn)行放量擴(kuò)增。在第一階段的PCR反應(yīng)之后，參與反應(yīng)的引物就不再是長引物對(YPA-P1、YPB-P2)，而是短引物對(YPA、YPB)。
通過檢索人類基因數(shù)據(jù)庫，在人類基因組中并不存在與上述短引物YPA、YPB相對應(yīng)的序列，從而確保了該短引物不與人類基因組序列發(fā)生結(jié)合。
本發(fā)明的試劑盒是針對四個待擴(kuò)增的Y染色體上的基因座A、B、C、D配制的，因此試劑盒中包含了四對長引物。上述長引物中所含的能夠與人類基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2實際上就是可以與待擴(kuò)增的四個基因座A、B、C、D的人類基因組特異性結(jié)合的原始引物，它們可以通過檢索在互聯(lián)網(wǎng)上公開的人類基因數(shù)據(jù)庫得到。此處，引物P1、P2的序列由待擴(kuò)增基因座A、B、C、D的人類基因組序列所決定，且因待擴(kuò)增基因座的序列的不同而不同。而在具體制作試劑盒產(chǎn)品時，可以根據(jù)該試劑盒所針對的四個待擴(kuò)增的具體基因座A、B、C、D，檢索在互聯(lián)網(wǎng)上公開的人類基因數(shù)據(jù)庫，得到與四個基因座A、B、C、D相對應(yīng)的四個具體的引物序列。亦即是說，當(dāng)產(chǎn)品所針對的四個基因座A、B、C、D是一定的時候，與之對應(yīng)的四個具體引物序列對(P1、P2)就是確定的，而且是公知的。此時，根據(jù)本發(fā)明中給出的上述短引物，就能夠制作出針對四個基因座A、B、C、D的長引物。另外，本發(fā)明試劑盒中所采用的上述緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶和Mgcl2等試劑均可直接采用現(xiàn)有的市售產(chǎn)品，如中國華美公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，相應(yīng)可以實現(xiàn)試劑的國產(chǎn)化。
本發(fā)明試劑盒中所包含的人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物是進(jìn)行結(jié)果檢測時分型的對照物，它是本發(fā)明試劑盒的一個重要組份。
在現(xiàn)有的試劑盒中，通常配備了等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物是指用于STR分型的已知序列的DNA片段群。為了實現(xiàn)實驗室之間的分型標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制，國際法醫(yī)血液遺傳學(xué)會(現(xiàn)名國際法醫(yī)遺傳學(xué)會，International Society of Forensic Genetics，ISFG)于1994年推薦了按核心序列串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)命名常染色體等位基因的原則，1997年再次強(qiáng)調(diào)了該命名原則以序列分析為基礎(chǔ)的意義。在序列分析為基礎(chǔ)構(gòu)建的人類等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物對照下，可以避免按分子量測定值計算DNA片段長短所產(chǎn)生的誤差。更重要的是，引物結(jié)合到基因組DNA上的位置是可以變化的，同一個體同一STR基因座用不同引物擴(kuò)增將產(chǎn)生不同長短的DNA片段，而這些不同長短DNA片段的核心序列串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)是相同的。顯然，核心序列串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)是個體具有的特征，是群體數(shù)據(jù)可比性的基礎(chǔ)，是不同實驗室取得相同分型結(jié)果的關(guān)鍵。這一命名原則早已被商品化常染色體STR基因座采用，也為國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者所熟悉。國內(nèi)外可重復(fù)性分析結(jié)果表明只要將等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物與樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同步電泳，不同的實驗室，不同的設(shè)備，不同的電泳方法，均可得到一致的可重復(fù)性結(jié)果。
本專利中的人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物與等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的區(qū)別在于系列中DNA片段的序列與人類DNA序列只有部分是相同的，而另一部分是不同的(不同之處在于有一段非人類基因組序列在其中)。這種不同是本專利所述復(fù)合擴(kuò)增與分型Y染色體特異STR基因座所必需，因此也是本專利的關(guān)鍵之一。
利用分子克隆技術(shù)可以制備本專利中所涉及的Y染色體特異STR基因座人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物?；静襟E是先用本專利設(shè)計的復(fù)合擴(kuò)增體系擴(kuò)增不同基因型個體，收集Y染色體特異STR基因座的各個等位基因片段，將其插入pUC重組質(zhì)粒中，經(jīng)DNA測序分析，證實插入片段的結(jié)構(gòu)及大小，按國際法醫(yī)遺傳學(xué)會2001年公布的Y染色體特異STR基因座分型標(biāo)準(zhǔn)命名插入的等位基因片段，最后經(jīng)轉(zhuǎn)染、擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)增及再鑒定后制備出人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。
綜上所述，由于本發(fā)明試劑盒中的引物與互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的引物(即P1、P2)不一致，本發(fā)明中的長引物是在互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的引物(P1、P2)的基礎(chǔ)之上加入了短引物，因此不能再采用原基因數(shù)據(jù)庫引物的擴(kuò)增產(chǎn)物作本發(fā)明中的分型標(biāo)準(zhǔn)物。所以，在本發(fā)明的試劑盒中，針對各個待擴(kuò)增基因座分別提供了人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，即由各長引物擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物所對應(yīng)的分型標(biāo)準(zhǔn)物，以供使用本發(fā)明試劑盒的實驗室作對照物。就人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的具體構(gòu)成來說，它實際上是在互聯(lián)網(wǎng)上公布的待擴(kuò)增基因座的引物序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端加上短引物序列而成，它因所選待擴(kuò)增基因座的不同而不同。
與前述現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明對試劑盒內(nèi)的引物進(jìn)行了設(shè)計，從而能夠高效率地同時對Y染色體上的任意四個STR基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增出大量的目的基因片段，實驗結(jié)果的可重現(xiàn)性極高，無需在實驗過程中繁瑣地調(diào)整各對引物的濃度，簡化了整個實驗過程，同時，提供了特有的Y染色體復(fù)合擴(kuò)增的人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，可以方便地檢測擴(kuò)增結(jié)果。另外，采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)之后，可以采用硝酸銀染色方式檢測結(jié)果，對實驗設(shè)備的成本要求不高，而前述現(xiàn)有技術(shù)中僅能采用熒光標(biāo)記引物、通過自動測序儀進(jìn)行檢測的方式，其對實驗設(shè)備的要求高，因此本發(fā)明的產(chǎn)品更符合當(dāng)前中國大多數(shù)分子生物學(xué)實驗室的需要，具有中國特色。
本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實施例作更進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實施例中所涉及的內(nèi)容。
具體實施例方式
實施例1本實施例中的試劑盒所針對的待擴(kuò)增基因座分別為DYS434、DYS438、DYS439和C4，以下分別以A、B、C、D代表上述四個基因座。
在本實施例中，所給出的Y染色體復(fù)合擴(kuò)增銀染試劑盒由分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2以及人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物構(gòu)成，其中短引物YPA為非人類的基因組序列(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)；短引物YPB為非人類的基因組序列(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)。
A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2為分別在能夠與人類的A基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列。在本實施例中，互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的A基因座DYS434的引物P1、P2為P1 5’CACTCCCTGAGTGCTGGATT3’P2 5’GGAGATGAATGAATGGATGGA 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的A基因座長引物為YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CACTCCCTGAGTGCTGGATT 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GGAGATGAATGAATGGATGGA 3’
同樣，B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2為分別在能夠與人類的B基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列。在本實施例中，互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的B基因座DYS4 38的引物P1、P2為P15’TGGGGAATAGTTGAACGGTAA 3’P25’GTGGCAGACGCCTATAATCC 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的B基因座長引物為YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GTGGCAGACGCCTATAATCC 3’C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2為分別在能夠與人類的C基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列。在本實施例中，互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的C基因座DYS439的引物P1、P2為P15’TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT 3’P25’GCCTGGCTTGGAATTCTTTT 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的C基因座長引物為YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT 3’D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2為分別在能夠與人類的D基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列。在本實施例中，互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的D基因座C4的引物P1、P2為P15’GTGGAACCAGCCCAAATATC 3’P25’AATGCTCTCTTGGCTTCTCACT 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的D基因座長引物為YPA-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GTGGAACCAGCCCAAATATC 3’YPB-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-AATGCTCTCTTGGCTTCTCACT 3’人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物共包括了A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物、B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物、C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物和D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物
A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為A基因座的長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一。具體來說，在本實施例中，A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-A-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-A-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS434)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
同理，B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為B基因座的長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一。具體來說，在本實施例中，B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-B-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-B-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS438)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為C基因座的長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一。具體來說，在本實施例中，C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-C-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-C-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS439)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為D基因座的長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一。具體來說，在本實施例中，D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-D-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-D-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(C4)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
在本實施例中，上述各組份的用量比為短引物YPA0.3ml(400nM)、短引物YPB0.3ml(400nM)、緩沖液(無Mgcl2)3.75ml、DNA聚合酶3000u(3u/μl)、Mgcl23ml(2.25mM)、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2各0.3ml(40nM)、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2各0.3ml(40nM)、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2各0.3ml(40nM)、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2各0.3ml(40nM)、人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物4ml，在人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物中，A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml、B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml、C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml、D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml。
在本實施例中，緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2這三種試劑均由中國華美公司生產(chǎn)。其中，緩沖液的組分為500 mM KCl100 mM Tris-HCl1.0％ Triton X-100另外，本實施例中的試劑盒是針對1000個樣本制作的。
實施例2本實施例中的試劑盒所針對的待擴(kuò)增基因座分別為DYS456、DYS443、DYS444和DYS448，以下仍然分別以A、B、C、D代表上述四個基因座。
在本實施例中，除與上述四個基因座相對應(yīng)的長引物和分型標(biāo)準(zhǔn)物的構(gòu)成不同之外，試劑盒的其余成份及各成份的用量比均與實施例1相同。在本例中，互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的A基因座DYS456的引物P1、P2為P15’cccatcaactcagcccaaaac 3’P25’ggaccttgtgataatgtaagata 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的A基因座長引物為YPA-A-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-cccatcaactcagcccaaaac 3’YPB-A-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ggaccttgtgataatgtaagata 3’互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的B基因座DYS44 3的引物P1、P2為P15’tctttagctttttgcagccc 3’P25’tcattggccacctgcatta 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的B基因座長引物為YPA-B-P1 5’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tctttagctttttgcagccc 3’YPB-B-P2 5’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-tcattggccacctgcatta 3’互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的C基因座DYS444的引物P1、P2為P15’tttctctcttcccactttaaccag 3’P25’ctcacgttgttcaagggtca 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的C基因座長引物為YPA-C-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tttctctcttcccactttaaccag 3’YPB-C-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ctcacgttgttcaagggtca 3’互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的D基因座DYS448的引物P1、P2為P15’tcttccttacgtgaatttcctc 3’P25’tgtcaaagagcttcaatggaga 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的D基因座長引物為YPA-D-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tcttccttacgtgaatttcctc 3’
YPB-D-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-tgtcaaagagcttcaatggaga 3’在本實施例中，A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-A-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-A-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS456)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-B-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-B-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS443)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-C-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-C-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS444)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-D-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-D-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS448)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
實施例3本實施例中的試劑盒所針對的待擴(kuò)增基因座分別為DYS458、A10、DYS455和DYS457，以下仍然分別以A、B、C、D代表上述四個基因座。
在本實施例中，除與上述四個基因座相對應(yīng)的長引物和分型標(biāo)準(zhǔn)物的構(gòu)成不同之外，試劑盒的其余成份及各成份的用量比也與實施例1相同。在本例中，互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的A基因座DYS458的引物P1、P2為P15’agcaacaggaatgaaactccaat 3’P25’ccaccacgcccaccctcc 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的A基因座長引物為YPA-A-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-agcaacaggaatgaaactccaat 3’YPB-A-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ccaccacgcccaccctcc 3’互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的B基因座A10的引物P1、P2為P15’ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT 3’P25’CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的B基因座長引物為YPA-B-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT 3’YPB-B-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA 3’互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的C基因座DYS455的引物P1、P2為P15’ggggtggaaacgagtgtt 3’P25’atctgagccgagccgagagaatgata 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的C基因座長引物為YPA-C-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ggggtggaaacgagtgtt 3’YPB-C-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-atctgagccgagccgagagaatgata 3’互聯(lián)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫中公布的D基因座DYS457的引物P1、P2為P15’tgcagcctcaatttcctggt 3’
P25’tatagatagatagataaccacag 3’與之相對應(yīng)，本實施例中的D基因座長引物為YPA-D-P15’ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-tgcagcctcaatttcctggt 3’YPB-D-P25’TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-tatagatagatagataaccacag 3’在本實施例中，A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-A-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-A-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS458)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-B-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-B-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(A10)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-C-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-C-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS455)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物的序列為長引物YPA-D-P1經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-(X)-GTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA長引物YPB-D-P2經(jīng)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物
TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT(X)代表用該基因座(DYS457)原始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的序列，與互聯(lián)網(wǎng)上的人類基因數(shù)據(jù)庫中一致。
權(quán)利要求
1.一種Y染色體復(fù)合擴(kuò)增銀染試劑盒，其特征是由分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2以及人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物構(gòu)成，其中短引物YPA、YPB為非人類的基因組序列YPA5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′；YPB5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′；A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2為分別在能夠與人類的A基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2為分別在能夠與人類的B基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2為分別在能夠與人類的C基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2為分別在能夠與人類的D基因座的基因組序列特異性結(jié)合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上所述短引物YPA、YPB而得到的基因組序列；人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物共包括了A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物、B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物、C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物和D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為A基因座的長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-A-P1、YPB-A-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一；B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為B基因座的長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-B-P1、YPB-B-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一；C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為C基因座的長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-C-P1、YPB-C-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一；D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物為D基因座的長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所得產(chǎn)物，且長引物YPA-D-P1、YPB-D-P2經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物各占其總重量的二分之一；各組份的用量比為短引物YPA0.25～0.35ml(400nM)、短引物YPB0.25～0.35ml(400nM)、緩沖液(無Mgcl2)3.5～4.0ml、DNA聚合酶3000u(3u/μl)、Mgcl22.5～3.5ml(2.25mM)、A基因座長引物YPA-A-P1和A基因座長引物YPB-A-P2各0.25～0.35ml(40nM)、B基因座長引物YPA-B-P1和B基因座長引物YPB-B-P2各0.25～0.35ml(40nM)、C基因座長引物YPA-C-P1和C基因座長引物YPB-C-P2各0.25～0.35ml(40nM)、D基因座長引物YPA-D-P1和D基因座長引物YPB-D-P2各0.25～0.35ml(40nM)、人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物4ml(40nM)，在人工等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物中，A基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml(40nM)、B基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml(40nM)、C基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml(40nM)、D基因座分型標(biāo)準(zhǔn)物1ml(40nM)。
全文摘要
一種Y染色體復(fù)合擴(kuò)增銀染試劑盒，其特征是由分離包裝的短引物YPA、短引物YPB、緩沖液(無Mgcl
文檔編號C12Q1/68GK1438329SQ0311742
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月10日
發(fā)明者侯一平, 李英碧, 應(yīng)斌武, 冀強(qiáng), 董建國, 吳謹(jǐn), 張 申請人:四川大學(xué)