專利名稱：可溶性sars病毒小信封蛋白的表達(dá)和純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子和細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及在宿主細(xì)胞中可溶性SARS病毒小信封蛋白(SARS small envelope E protein)的表達(dá)和純化。
背景技術(shù)：
自2002年底至2003年初，一種被稱為“非典型肺炎(severe acuterespiratory syndrome，SARS)”的病例在我國廣東省被首次發(fā)現(xiàn)，隨后在世界30多個國家和地區(qū)爆發(fā)，SARS在我國內(nèi)地的北京、山西、內(nèi)蒙等25個省市自治區(qū)“肆意橫行”，對我國人民群眾的生命財產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。SARS是一種傳染性強(qiáng)、生存強(qiáng)、致死率高的新型病毒，截止到2003年5月19日，全球累計報告病例已達(dá)7864人，死亡病例643人。SARS已被世界公認(rèn)為人類的共同敵人。SARS爆發(fā)后，引起了各國政府和研究機(jī)構(gòu)的高度重視，世界衛(wèi)生組織(WHO)已派遣技術(shù)人員前往疫區(qū)指導(dǎo)防治工作，各國科研人員緊密合作，共同尋找SARS的病原體和防治方法。經(jīng)過多國科研人員的努力，終于發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒(coronavirus)是SARS感染、病人發(fā)病和致死的元兇。SARS病毒的全基因組已分別被加拿大、美國和中國的科學(xué)家測定，這對于研究SARS病毒的致病機(jī)理以設(shè)計抗SARS藥物具有重要意義。
SARS冠狀病毒(SARS-Cov)屬于巢狀病毒目(OrderNidovirales)，冠狀病毒科(FamilyCoronaviridae)，冠狀病毒屬(GenusCoronavirus)。根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)分類，它屬于單鏈正義病毒[(+)sense，ssRNA virus]，對其它已知冠狀病毒的研究發(fā)現(xiàn)，其病毒包膜(envelop)主要包括三種糖蛋白，分別命名為S蛋白(Spike Protein)、M蛋白(Membrane Protein)、E蛋白(Envelope Protein)。在部分病毒株中還能找到一種HE蛋白(Haemagglutinin-esterase)。其中E蛋白是一種相對較小的蛋白質(zhì)，主要分布于病毒包膜上。SARS病毒的E蛋白是最小的結(jié)構(gòu)蛋白，僅有76個氨基酸。它的氨基酸序列如下MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPTVYVYSRVKNLNSSEGVPDLLV。
和其它冠狀病毒一致，SARS-CoV E蛋白包含一個疏水段(殘基12-37)其側(cè)面是帶電的殘基，而接著是半胱氨酸富集的區(qū)域。應(yīng)用生物信息學(xué)分析工具BLAST和FASTA分析顯示E蛋白與其它冠狀病毒的E(Envelop)蛋白顯著的匹配。PFAM分析揭示SARS的E蛋白較好地表現(xiàn)了NS3_EnvE蛋白家族中一員的特性。InterProScan分析顯示E蛋白是病毒包膜(Envelop)的組成部分，保守的序列在其它病毒中也發(fā)現(xiàn)，如腸胃炎病毒(gastroenteritis)和鼠肝炎病毒(murinehepatitis)。SignalP分析預(yù)計它含有一個跨膜的錨(transmembrane anchor)(可能性達(dá)0.939)。Tmpred分析顯示SARS的E蛋白含有與其它已知病毒包膜上的這種蛋白類似的跨膜段，位于殘基17-34間。TMHMM分析預(yù)計一種由大部分的親水(hydrophilic domain)段(46個殘基)組成的II型的膜蛋白(a type IImembrane protein)和碳末端位于病毒顆粒的表面。
對其它冠狀病毒E蛋白功能研究結(jié)果也許能對SARS病毒E蛋白的功能認(rèn)識有所幫助和指導(dǎo)。一般研究都認(rèn)為冠狀病毒的E蛋白和M蛋白對病毒顆粒的組裝是必需和充分的。為認(rèn)識鼠肝炎病毒(MHV)E蛋白的作用，有人將其中E蛋白的帶電殘基進(jìn)行了丙氨酸突變，突變的病毒顯示出溫度敏感型，即使在適合的溫度下絕大部分突變病毒的形態(tài)也變得緊縮拉長，無法形成正常的野生型(wild-type)，可見E蛋白在冠狀病毒的形態(tài)形成中起了重要的甚至是關(guān)鍵的作用。也有研究顯示一些冠狀病毒如可遺傳的腸胃炎冠狀病毒(TGEV)的E蛋白是病毒復(fù)制所必需的。還有試驗(yàn)顯示，在鼠肝炎病毒(MHV)感染的DBT細(xì)胞中E蛋白的表達(dá)還會導(dǎo)致DBT細(xì)胞的凋亡，而S蛋白、M蛋白和N蛋白的表達(dá)卻不會導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。最近研究表明，雖然去除E基因使鼠肝炎病毒(MHV)的復(fù)制速度降低了一萬倍，但是病毒仍然可以復(fù)制，這提示E蛋白在病毒復(fù)制中起著重要作用，但也許不是病毒復(fù)制的本質(zhì)因素。
因此，在體外大量表達(dá)和純化可溶性SARS病毒E蛋白以進(jìn)一步探索其重要的生物學(xué)功能將具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明者經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)過程中所積累的獨(dú)特相關(guān)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，在大腸桿菌中成功表達(dá)和純化了可溶性SARS病毒E蛋白，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個目的是提供能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)SARS病毒E蛋白的表達(dá)質(zhì)粒；本發(fā)明的另一個目的是提供可溶性SARS病毒E蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)和純化的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面提供可在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒E蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pGEX2T-E，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，分類名稱為大腸桿菌M15/pGEX2T-SARS-E，保藏日2003年5月30日，保藏號CCTCCNo.M203047。
本發(fā)明的另一個方面提供用質(zhì)粒pGEX2T-E轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
本發(fā)明的再一個方面提供在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒E蛋白的方法，包括以下步驟1)采用PCR技術(shù)從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒E蛋白DNA片段(TRO2)；2)用pGEX2T載體構(gòu)建SARS病毒E蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGEX2T-E；3)將pGEX2T-E質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明的還有一個方面提供可溶性SARS病毒E蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化方法，包括細(xì)胞裂解、裂解液透析、Glutathione Sepharose 4B柱層析和分子篩純化。
附圖的簡單說明

圖1所示為可溶性SARS病毒E蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pGEX2T-E)構(gòu)建示意圖。
圖2所示為SARS病毒E蛋白PCR產(chǎn)物DNA瓊脂糖電泳分析圖譜。
圖3所示為pGEX2T-E測序報告。
圖4所示為SARS病毒E蛋白純化產(chǎn)物聚丙烯酰胺電泳分析圖譜。圖中，1.Glutathione Sepharose 4B柱上的GST-E；2.凝血酶酶切后柱上留有的GST；3.凝血酶酶切后洗脫后并FPLC純化后的E蛋白；4.標(biāo)記物(Marker)。
具體實(shí)施例方式
試驗(yàn)材料pQE30載體，大腸桿菌菌株M15由本室保存。各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、高保真DNA聚合酶等工具酶購自TaKaRa公司。DNA標(biāo)記物，蛋白質(zhì)標(biāo)記物購自Invitrogen公司。IPTG，氨芐西林和卡那霉素購自Sigma公司。膠回收試劑盒購自華舜公司。
實(shí)施例1 SARS病毒E蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pGEX2T-E)的構(gòu)建利用PCR技術(shù)從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒E蛋白DNA片段(基因序列依據(jù)TRO2)，按圖1所示，構(gòu)建表達(dá)可溶性的SARS病毒E蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(pGEX2T-E)。
1)設(shè)計引物，擴(kuò)增E蛋白的序列引物序列FW5’ATTAGGATCCATGTACTCATTCGTTTCG3’RV5’TTAAGAATTCTTAGGACCAGAAGATCAGG 3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)(100μl)模板2μl；10×PyrobestTMbuffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；高保真DNA聚合酶(pyrobest DNA polymerase)1μl；水71μl。
反應(yīng)條件95℃ 8分鐘；(95℃ 30秒；60℃ 30秒；72℃ 30秒)30循環(huán)；72℃ 10分鐘。
圖2所示為SARS病毒E蛋白PCR產(chǎn)物DNA瓊脂糖電泳分析圖譜。
2)將E蛋白的PCR產(chǎn)物克隆到pGEX2T載體上E蛋白的PCR產(chǎn)物和pGEX2T分別用BamHI和EcoRI酶切(實(shí)驗(yàn)方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，1999年第二版)；用試劑盒(華舜公司)回收酶切產(chǎn)物(回收E的PCR酶切產(chǎn)物近250bp；pGEX2T酶切產(chǎn)物近4.9kb)；用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)；挑選正確的克隆(酶切鑒定)。
酶切鑒定(實(shí)驗(yàn)方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，1999年第二版)BamHI & EcoRI酶切鑒定，切出228條帶的克隆是正確的。
DNA測序報告pGEX2T-E表達(dá)載體測序報告如圖3所示，pGEX2T-E DNA測序結(jié)果和E蛋白原DNA序列比較，結(jié)果完全一致。
實(shí)施例2 可溶性SARS病毒E蛋白的表達(dá)將pGEX2T-E質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG(濃度0.2mM)誘導(dǎo)，氨芐西林為抗生素，溫度18℃，表達(dá)時間6小時。在上述表達(dá)條件下，6升LB培養(yǎng)基經(jīng)4℃、4000rpm離心30分鐘后，將得到的10克細(xì)菌沉淀物以每份3克分裝，-80℃保存。
實(shí)施例3 表達(dá)產(chǎn)物的純化在4℃下，將3克細(xì)菌沉淀物懸浮于15mL裂解緩沖溶液(50mM Tris-HCl，pH8.0，300mM NaCl，1mM DDT，5mM EDTA，1mM PMSF)中，超聲波破碎(超聲強(qiáng)度200～300W；超聲環(huán)境冰水混合物；總超聲時間15分鐘，每超聲1.5分鐘，間隙1分鐘)。經(jīng)4℃、15,000rpm超速離心1小時后，棄去沉淀物。將得到的14mL上清液在4℃下透析(透析緩沖液PBS，1mM DDT，5mMEDTA，pH7.4)過夜后，用Glutathione Sepharose 4B柱(Pharmacia公司產(chǎn)品)純化蛋白，其中洗滌緩沖液為含1mM DDT、5mM EDTA的PBS(pH7.4)；酶切體系為PBS+80單位凝血酶；E蛋白洗脫緩沖液為含1mM DDT、5mM EDTA的PBS(pH7.4)；GST洗脫緩沖液為含50mM還原性谷胱甘肽的50mM Tris-HCl(pH8.0)。將得到的10mL蛋白粗提物經(jīng)蛋白純化系統(tǒng)FPLC(Pharmacia公司產(chǎn)品)分子篩進(jìn)一步純化得到純SARS病毒E蛋白(如圖4所示)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性利用本發(fā)明可在宿主細(xì)胞中獲得大量的可溶性SARS病毒E蛋白(如，在大腸桿菌中，每升LB培養(yǎng)基可生產(chǎn)10毫克E蛋白)，利用GlutathioneSepharose 4B柱層析和分子篩提純方法即可得到純化的蛋白。本發(fā)明具有操作簡單、蛋白純度高等特點(diǎn)。
利用本發(fā)明得到的SARS病毒E蛋白可用于1)結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的研究A.培養(yǎng)SARS病毒E蛋白晶體，通過X-射線晶體衍射技術(shù)解析SARS病毒E蛋白晶體結(jié)構(gòu)；B.開展NMR研究，以探求SARS病毒E蛋白溶液狀態(tài)下的三維結(jié)構(gòu)。
2)與人體重要蛋白相互作用研究利用本發(fā)明得到的SARS病毒E蛋白以及生物物理技術(shù)可開展與人體重要蛋白(如免疫系統(tǒng))相互作用研究，以探索SARS病毒感染人體正常細(xì)胞的途徑，為抗SARS藥物設(shè)計提供依據(jù)。
3)SARS診斷抗體研究利用本發(fā)明得到的SARS病毒E蛋白與其他生物工程技術(shù)相結(jié)合，可開展SARS診斷抗體研究。
序列表ACGTTATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTATTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTC 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權(quán)利要求
1.可在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒E蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏號M203047。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)質(zhì)粒，含有如下序列ACGTTATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTATTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAAACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTCACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTTTAGTAAAACCAACGGTTTACGTCTACTCGCGTGTTAAAAATCTGAACTCTTCTGAAGGAGTTCCTGATCTTCTGGTCCTAAGAATTCATCGTGACTGACTGACGATCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCGCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACAC CGCATAAATTCCGACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTGGAATT
3.一種用權(quán)利要求1所述表達(dá)質(zhì)粒pGEX2T-E轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
6.在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒E蛋白的方法，包括以下步驟1)用PCR技術(shù)從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒E蛋白DNA片段；2)用pGEX2T載體構(gòu)建SARS病毒E蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGEX2T；3)將pGEX2T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
7.可溶性SARS病毒E蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化方法，包括將細(xì)胞裂解液透析、Glutathione Sepharose 4B柱層析和分子篩純化。
全文摘要
本發(fā)明提供可在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒E蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pGEX2T－E，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏號M203047。還提供在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒E蛋白的方法，包括采用PCR技術(shù)從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒E蛋白DNA片段(TRO2)；用pGEX2T載體構(gòu)建SARS病毒E蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGEX2T－E；和將pGEX2T－E質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)?？扇苄許ARS病毒E蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化方法，包括將細(xì)胞裂解液透析、Glutathione Sepharose 4B柱層析和分子篩純化。本發(fā)明的方法操作簡單、得到的蛋白純度高。
文檔編號C12N15/70GK1468962SQ03129148
公開日2004年1月21日 申請日期2003年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月5日
發(fā)明者沈旭, 蔣華良, 胡庚熙, 陳莉莉, 孫濤, 沈建華, 羅小民, 陳凱先, 莊賢韓, 沈 旭 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所, 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 上海先導(dǎo)藥業(yè)有限公司