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      一種棉纖維特異表達(dá)基因GhRLK1的cDNA序列及用途的制作方法

      文檔序號:420922閱讀:258來源:國知局
      專利名稱:一種棉纖維特異表達(dá)基因GhRLK1的cDNA序列及用途的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體涉及一新發(fā)現(xiàn)的棉纖維特異表達(dá)基因GhRLK1的cDNA序列,該基因在培育優(yōu)質(zhì)棉花纖維品種中有重要的意義。
      背景技術(shù)
      棉花是最重要的天然纖維作物。棉纖維是由胚珠外珠被表皮層分化而來的單細(xì)胞,其形成和發(fā)育可分為四個時期起始期、伸長期(初生壁合成)、次生壁合成期和成熟期,各個時期的發(fā)育分別決定著纖維的不同品質(zhì)性狀,其中在延伸階段的發(fā)育關(guān)系到纖維的長度品質(zhì),在次生壁合成階段的發(fā)育則與纖維的強(qiáng)度品質(zhì)密切相關(guān)。分離鑒定控制纖維細(xì)胞延伸和次生壁合成的基因,是了解棉纖維細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)理及其調(diào)控的關(guān)鍵,也是通過基因工程方法定向改良纖維度和強(qiáng)度品質(zhì)的核心技術(shù)環(huán)節(jié)。
      迄今為止,已經(jīng)報道了30多個在纖維細(xì)胞中特異或優(yōu)先表達(dá)的棉花基因。為了了解這些基因與纖維發(fā)育和品質(zhì)形成的關(guān)系,美國Monsanto公司對其中的多個基因,分別用antisense方法進(jìn)行了功能鑒定,但發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平的改變與纖維發(fā)育和品質(zhì)性狀沒有明顯的相關(guān)性。因此,他們認(rèn)為纖維發(fā)育和品質(zhì)形成可能受到另外一些尚未分離鑒定的基因的控制,而只有繼續(xù)尋找并獲得這些基因,特別是那些參與基因表達(dá)調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要功能基因,才有可能在闡明棉纖維發(fā)育和品質(zhì)形成的分子調(diào)控機(jī)理方面取得突破,從而為棉纖維品質(zhì)改良基因工程提供有用目標(biāo)基因和表達(dá)調(diào)控元件。
      纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分,細(xì)胞壁的生物合成是保證植物細(xì)胞生長的前提。然而,植物在其生長發(fā)育過程中如何感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外信號,從而控制細(xì)胞壁纖維素的生物合成,有關(guān)這方面的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子調(diào)控機(jī)理目前還知之甚少。棉纖維是單細(xì)胞,成熟棉纖維含90%以上的纖維素,在纖維發(fā)育中期和后期,其細(xì)胞內(nèi)的生化過程幾乎純是纖維素的合成。因此,棉纖維細(xì)胞被認(rèn)為是研究纖維素的生物合成及其調(diào)控機(jī)理的良好實驗體系。
      受體蛋白激酶(receptor protein kinase)在動植物細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有極其重要的作用。在植物細(xì)胞中,已發(fā)現(xiàn)類受體蛋白激酶(receptor-like kinasesRLKs)能感應(yīng)細(xì)胞外環(huán)境,進(jìn)而激活多種與植物生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答(如細(xì)胞伸長、細(xì)胞分化、花器官的發(fā)育、自花授粉的控制和抗病反應(yīng)等)密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。雖然,已從擬南芥、玉米、大豆等植物中克隆了多個RLKs基因,并發(fā)現(xiàn)了它們在植物發(fā)育過程中的重要功能,但對RLKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與棉纖維發(fā)育還一無所知。因此,研究與棉纖維發(fā)育相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,特別是控制纖維素生物合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及分子調(diào)控機(jī)理,具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明利用熒光差異顯示(FDD)方法,從陸地棉(Gossypium hirsutum)中克隆了一個新的類受體蛋白激酶(receptor-like protein kinase)基因的cDNA,它具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列,命名為GhRLK1。利用基因特異性探針進(jìn)行Northern分析,發(fā)現(xiàn)GhRLK1基因在纖維細(xì)胞中特異表達(dá),其表達(dá)在初生壁向次生壁合成轉(zhuǎn)化階段開始,至次生壁纖維素合成速度最快時達(dá)到高峰。GhRLK1基因的這一表達(dá)特征表明該基因在控制纖維細(xì)胞次生壁纖維素合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要作用。
      本發(fā)明發(fā)現(xiàn)GhRLK1的表達(dá)與纖維次生壁纖維素的合成呈正相關(guān),這方面的研究結(jié)果還未見報道。因此,本發(fā)明不僅為研究GhRLK1在棉花纖維發(fā)育進(jìn)程中次生壁纖維素合成中的功能奠定了基礎(chǔ),重要的是能為控制植物細(xì)胞壁纖維素生物合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供一個具有如圖1和SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的新基因GhRLK1。應(yīng)當(dāng)指出的是,對本發(fā)明提供的GhRLK1克隆的核苷酸序列進(jìn)行修飾,一個或多個核苷酸的替換、插入和/或缺失,所得到的功能類似物也能達(dá)到本發(fā)明的目的。因此,本發(fā)明也包括該類衍生體。
      本發(fā)明還提供了含有GhRLK1及其衍生體的植物表達(dá)載體、原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體,以及一種含有所述GhRLK1及其衍生體的轉(zhuǎn)化子,所述的轉(zhuǎn)化子,是如圖3所示的將GhRLK1的正義和反義cDNA序列分別構(gòu)建到pPZP111(Peter H,1994)植物表達(dá)載體中,將構(gòu)建好的載體電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株AGL-1中;或如圖4所示的的將GhRLK1基因的激酶結(jié)構(gòu)域cDNA構(gòu)建到原核表達(dá)載體pQE30(QIAGEN)中;或如圖6所示的將GhRLK1 cDNA構(gòu)建到真核生物酵母表達(dá)載體pESP-2(Stratagene)中的一種轉(zhuǎn)化子。
      本發(fā)明的另外一個目的是將上述提供的基因、衍生體、表達(dá)載體轉(zhuǎn)化子應(yīng)用于植物基因工程, 為控制纖維生長發(fā)育和改良纖維品質(zhì)提供一種新途徑。


      圖1.GhRLK1 cDNA的核苷酸序列、推導(dǎo)蛋白的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)域分析(“—”示信號肽;“黑體”示富含亮氨酸區(qū);“斜體”示富含脯氨酸區(qū);“=”示疏水區(qū);“——”示激酶區(qū)。)圖2.GhRLK1在棉花纖維發(fā)育不同時期及不同器官中表達(dá)水平的Northern分析(f9、f12、fl8、f24分別代表開花后9、12、18和24天的纖維;R,根;H,下胚軸;L,葉;F,花;18S rRNA為上樣量對照。)圖3.pPZP111-GhRLK1植物表達(dá)載體的構(gòu)建圖4.pQE30-GhRLK1原核表達(dá)載體的構(gòu)建圖5.GhRLK1激酶區(qū)cDNA在原核生物中的表達(dá)通過電擊法將pQE30-GhRLK1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株M15中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),獲得一個約32KD的蛋白條帶(A),并通過Ni親和層析柱獲得純化蛋白(B)。
      圖6.pESP2-GhRLK1酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
      具體實施例方式實施例1.GhRLK1基因cDNA的克隆選取開花后9天、21天、27天的棉纖維,提取總RNA,利用FDD(熒光差異顯示)技術(shù)進(jìn)行分析,從中選出109個表達(dá)有差異的cDNA片段,通過兩輪反Northern淘汰了假陽性和差異不明顯的片段,最后選取8個片段進(jìn)行了棉花各器官及棉纖維各發(fā)育階段的Northern分析,其中11號cDNA片段在次生壁合成期特異表達(dá),進(jìn)而通過cDNA文庫篩選和5’RACE技術(shù)獲得含有完整編碼區(qū)的長度為2539bp的cDNA序列。如圖1所示,該cDNA編碼688個氨基酸,含有典型的植物類受體激酶的保守結(jié)構(gòu)域,在蛋白的近N端和中部各有一段疏水序列,它們分別是信號肽和跨膜區(qū)的候選結(jié)構(gòu)域,位于跨膜區(qū)的外側(cè)有富含亮氨酸和脯氨酸的序列,它們是許多RLKs參與感應(yīng)外界環(huán)境因子的典型結(jié)構(gòu)。由于該蛋白與富含亮氨酸的受體類蛋白激酶有很高的同源性和結(jié)構(gòu)相似性,因此將其基因命名為GhRLK1。
      實施例2.GhRLK1基因的表達(dá)特征分析以GhRLK1 cDNA的3’非翻譯區(qū)為基因特異性探針,利用Northern雜交方法,對GhRLK1基因在棉花纖維及不同器官中的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。如圖2所示,GhRLK1基因在棉纖維細(xì)胞次生壁合成期特異表達(dá),在根、下胚軸和花以及早期的纖維中未見雜交信號。在次生壁合成的初始階段(18DPA),GhRLK1 mRNA開始積累,到次生壁合成高峰期(24DPA)達(dá)到高峰。該實驗結(jié)果表明GhRLK1的表達(dá)與棉纖維細(xì)胞的纖維素合成密切相關(guān),這在培育優(yōu)質(zhì)棉花新品種中有著重要的應(yīng)用意義。
      實施例3.GhRLK1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化為了了解GhRLK1基因在植物細(xì)胞內(nèi)的功能,將GhRLK1的正義和反義cDNA序列分別構(gòu)建到pPZP111(Peter H,1994)植物表達(dá)載體中(見圖3),將構(gòu)建好的載體電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株AGL-1中。然后,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和真空轉(zhuǎn)化法,分別轉(zhuǎn)化了棉花和擬南芥,現(xiàn)已獲得轉(zhuǎn)基因植物的T1代種子。
      實施例4.GhRLK1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)為了進(jìn)一步分析GhRLK1基因在棉花各器官和纖維不同發(fā)育時期的蛋白水平,將GhRLK1基因的激酶結(jié)構(gòu)域的cDNA構(gòu)建到原核表達(dá)載體pQE30(QIAGEN)中(見圖4),通過電擊法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株M15中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),獲得一個約32KD的蛋白條帶(見圖5A),通過Ni親和層析柱純化,獲得了該蛋白純品(圖5B),并制備了抗體,將用于免疫印跡分析。與此同時,通過變性—復(fù)性及Ni親和層析柱純化,獲得了活性蛋白,將用其進(jìn)行激酶活性鑒定。
      實施例5.GhRLK1基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建為了避免實施例4中表達(dá)的GhRLK1蛋白可能出現(xiàn)的糖基化問題,將GhRLK1 cDNA構(gòu)建到真核生物酵母表達(dá)載體pESP-2(Stratagene)中(見圖6),利用電擊法轉(zhuǎn)化裂殖酵母,獲得了轉(zhuǎn)化子。將通過VB1誘導(dǎo)和GST柱純化獲得在真核生物內(nèi)表達(dá)的GhRLK1蛋白。
      序列表&lt;110&gt;中國科學(xué)院微生物研究所&lt;120&gt;一種棉纖維特異表達(dá)基因GhRLK1的cDNA序列及用途&lt;130&gt;xia&lt;160&gt;2&lt;170&gt;PatentIn version 3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;2539&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Gossypium hirsutum&lt;400&gt;1cacacacaag tcgacaaaat gagacaccag cgacatgatt cggacgaaga agcccaaact60cagtattcag accgaaaccc aatattacat tcttgatttg ctctttctct atttgttaaa120accgttgata gagaaaagct agaaaaaatt cttcttcttt tggacatgta tgggctctgg180ggattcgagc ggttgaagct caggatgatg gtggtcatgc tgttaatgct ggttttatca240ttgtttgagc agaatatgag cttctcctcg cctttgaacc gtgaaggttt ggctttgttg300aggttcaaac agagagtggg gagtgaccct tttggtgctt tatcgaactg gaaggaaatt360gatggagaga ttgatccgtg ttcttggttc ggggtcgaat gctctgatga aaaagttgta420attttaaatt tgaaagatct ttgccttgtt gggaacctgg gacctgaatt tgggaagctg480gagaatttaa aatctattct attgcgcaac aactctttgt ctggaagcat tcctcaagaa540attggggaat tgaaggagct ggaggtgttg gatttaggat tcaataactt tagtggacca600tttccatctg attttggcaa caatctctcc ttgacaacac ttttacttga caacaatgag660tttcttggaa atctagcacc tgaaatatac gaggttaaga tgctttctga atttcaagta720gatgagaatc agctaaccga tgctgctact ataccatctt gtaaaagcag tggtttcccc780tggaatattg cccagccagg agatatagct tatgggaggc ggctgcagca ggtgtttgta840ccctctaaga cagccaatga aagagtttcc caactgtcac catcaccttc gccatcagaa900tcctcatttt caccttcaat gtcaccttca ccttcatcgt tgtctccttc agaatccccc960tccagtatct ttttgactcc tgcaccttca cctttacctt caccttcacc tgaattagca1020ccggctccag ctttacaacc tcctgtagat ccaccagtat ctatctctga accaccccaa1080
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      &lt;213&gt;Gossypium hirsutum&lt;400&gt;2Met Tyr Gly Leu Trp Gly Phe Glu Arg Leu Lys Leu Arg Met Met Val1 5 10 15Val Met Leu Leu Met Leu Val Leu Ser Leu Phe Glu Gln Asn Met Ser20 25 30Phe Ser Ser Pro Leu Asn Arg Glu Gly Leu Ala Leu Leu Arg Phe Lys35 40 45Gln Arg Val Gly Ser Asp Pro Phe Gly Ala Leu Ser Asn Trp Lys Glu50 55 60Ile Asp Gly Glu Ile Asp Pro Cys Ser Trp Phe Gly Val Glu Cys Ser65 70 75 80Asp Glu Lys Val Val Ile Leu Asn Leu Lys Asp Leu Cys Leu Val Gly85 90 95Asn Leu Gly Pro Glu Phe Gly Lys Leu Glu Asn Leu Lys Ser Ile Leu100 105 110Leu Arg Asn Asn Ser Leu Ser Gly Ser Ile Pro Gln Glu Ile Gly Glu115 120 125Leu Lys Glu Leu Glu Val Leu Asp Leu Gly Phe Asn Asn Phe Ser Gly130 135 140Pro Phe Pro Ser Asp Phe Gly Asn Asn Leu Ser Leu Thr Thr Leu Leu145 150 155 160Leu Asp Asn Asn Glu Phe Leu Gly Asn Leu Ala Pro Glu Ile Tyr Glu165 170 175Val Lys Met Leu Ser Glu Phe Gln Val Asp Glu Asn Gln Leu Thr Asp180 185 190Ala Ala Thr Ile Pro Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Pro Trp Asn Ile195 200 205
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      Leu Ser Lys Val Asn His Lys Asn Phe Val Asn Leu Ile Gly Tyr Cys450 455 460Glu Glu Asn Thr Pro Phe Thr Arg Met Met Val Phe Glu Tyr Val Pro465 470 475 480Asn Gly Ser Leu Tyr Glu His Leu His Ile Gln Glu Ala Glu His Leu485 490 495Asp Trp Gly Met Arg Leu Arg Ile Ala Met Gly Ile Thr Tyr Cys Leu500 505 510Glu His Met His Gln Leu Thr Pro Pro Ile Ala His Arg Asn Leu Gln515 520 525Ser Cys Ser Val Tyr Leu Thr Glu Asp Tyr Ala Ala Lys Ile Ser Asp530 535 540Phe Ser Phe Leu Asn Asn Ala Thr Ala Ala Lys Val Gly Ser Ala Thr545 550 555 560Met Glu Leu Leu Glu Ser Pro Ser Ala Asp Ala Glu Ser Asn Val Tyr565 570 575Ser Phe Gly Val Ile Leu Phe Glu Met Ile Thr Gly Arg Ile Pro Tyr580 585 590Ser Ile Asp Asn Ser Ser Leu Ala Asp Trp Ala Ser Asp Tyr Leu Lys595 600 605Arg Asp Gln Pro Leu Lys Glu Met Val Asp Pro Thr Leu Lys Phe Phe610 615 620Gln Gly Asp Asp Leu Glu Lys Leu Phe Glu Val Val Lys Thr Cys Val625 630 635 640Asn Pro Asp Pro Lys Glu Arg Pro Thr Met Arg Glu Val Ala Ala Lys645 650 655Leu Lys Glu Ile Thr Ala Met Gly Pro Asp Gly Ala Thr Pro Lys Leu660 665 670Ser Pro Leu Trp Trp Ala Glu Leu Glu Ile Leu Ser Thr Glu Pro Ser675 680 68權(quán)利要求
      1.一種在棉纖維細(xì)胞中特異表達(dá)基因GhRLK1的cDNA,它具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
      2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述cDNA核苷酸序列產(chǎn)生突變引起核苷酸序列的缺失、增加所形成的具有類似功能的核苷酸序列衍生體。
      3.一種含有權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列的植物表達(dá)載體。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體,是一種如圖3所示的pPZP111-GhRLK1表達(dá)載體。
      5.一種含有權(quán)利要求1或2所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)化子。
      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化子,是如圖3所示的將GhRLK1的正義和反義cDNA序列分別構(gòu)建到pPZP111(Peter H.,1994)植物表達(dá)載體中,將構(gòu)建好的載體電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌株AGL-1中;或如圖4所示的將GhRLK1基因的激酶結(jié)構(gòu)域cDNA構(gòu)建到原核表達(dá)載體pQE30(QIAGEN)中;或如圖6所示的將GhRLK1 cDNA構(gòu)建到真核生物酵母表達(dá)載體pESP-2(Stratagene)中的一種轉(zhuǎn)化子。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
      8.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的植物表達(dá)載體,在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
      9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的轉(zhuǎn)化子,在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一新發(fā)現(xiàn)的cDNA序列,其基因在棉花纖維細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)。本發(fā)明從陸地棉(Gossypium hirsutum)中克隆了一個類受體蛋白激酶(receptor-like protein kinase)基因,命名為GhRLK1。Northern分析表明GhRLK1基因在纖維細(xì)胞中特異表達(dá),其表達(dá)從初生壁向次生壁合成轉(zhuǎn)化階段開始,在次生壁纖維素合成速度最快時達(dá)到高峰。表明GhRLK1基因的表達(dá)與纖維素的生物合成密切相關(guān)。這方面的研究結(jié)果目前尚未見任何報道。GhRLK1的發(fā)現(xiàn)可為利用基因工程方法控制纖維生長發(fā)育和改良纖維品質(zhì)提供一種新的目的基因和表達(dá)調(diào)控元件。
      文檔編號C12N15/82GK1566344SQ0314115
      公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
      發(fā)明者夏桂先, 李園莉, 孫杰 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所
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