專利名稱：生產(chǎn)普伐他汀鈉的微生物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種新的生產(chǎn)普伐他汀鈉的微生物及使用該微生物生產(chǎn)普伐他汀鈉的方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病己是人類死的主要原因，其發(fā)病率與死亡率都高居所有疾病之首。醫(yī)學(xué)研究證實心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化，高血脂癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的首要因素。因此降脂藥在減少心血管疾病發(fā)病率方面的重要性己引起人們的關(guān)注，各國竟相研究開發(fā)降血脂藥物。
在眾多降血脂藥物中，八十年代初發(fā)展起來的一類化合物，它們是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(HMG-CoA reductase inhibitor)，由于它們降低膽固醇的高效性，抑制膽固醇合成的高度選擇性以及低毒性，正成為心血管藥物研究中最活躍，發(fā)展最迅速的領(lǐng)域。
這類藥物又被稱為他汀類藥物，包括洛伐他汀(lovastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，普伐他汀(pravastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，西立伐他汀(cerivastatin)，阿伐他汀(atorvastatin)等。
和同類藥物相比，普伐他汀具有獨特的組織選擇性，它選擇性抑制肝臟及小腸內(nèi)的膽固醇合成，但僅微弱抑制其它器官中的膽固醇合成，此外它還具有低毒性的優(yōu)點。
普伐他汀鈉(Pravastatin Sodium，式I)生產(chǎn)是通過微生物對其前體藥物美伐他汀(Mevastatin，式IIa)或美伐他汀的鹽(Mevastatin salt，式IIb)羥基化而得到。

其中美伐他汀(IIa)的水溶性差，因此通常通過加入堿而將式IIa轉(zhuǎn)變?yōu)槊婪ニ〉柠}(式IIb，式中R＝堿金屬(如Na、K)、堿土金屬、和NH4)。
生產(chǎn)美伐他汀鈉的生物轉(zhuǎn)化可以多種微生物進(jìn)行，主要為以下幾類霉菌的多個屬(Mortierella，WO00/46175)，諾卡氏菌(Norcardia，US5830695)，馬杜拉放線菌(Actinomadura，WO96/40863)，鏈霉菌(Streptomyces CarbopilusEP215665，Streptomyces exfoliatus WO98/45410)，小單孢菌(Micromonospora)。
但上述各菌種在生產(chǎn)過程中都有一個缺點由于普伐他汀的前體美伐他汀對于微生物具有較強(qiáng)的毒性，尤其是霉菌，因而在工業(yè)化生產(chǎn)過程中美伐他汀僅能維持在較低的濃度，且轉(zhuǎn)化速度也較慢，這大大提高了普伐他汀微生物轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)成本。
因此，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)迫切需求開發(fā)高效率生產(chǎn)普伐他汀鈉的微生物和相應(yīng)的生產(chǎn)工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效生產(chǎn)普伐他汀鈉的微生物和方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種粉白小多孢菌(Micropolysporaroseoalba)，其保藏號是CGMCC 0624。
在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明上述粉白小多孢菌的用途，它被用于生產(chǎn)普伐他汀鈉。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種生產(chǎn)普伐他汀或其鹽的方法，包括以下步驟(a)在28-35℃，pH6.8-7.5條件下，培養(yǎng)保藏號CGMCC 0624的粉白小多孢菌(Micropolyspora roseoalba)；(b)加入美伐他汀或其鹽，維持美伐他汀濃度在0.005-0.5wt％，持續(xù)2-6天；(c)停止加入美伐他汀或其鹽；(d)分離出普伐他汀或其鹽。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中維持美伐他汀或其鹽濃度在0.01-0.05wt％。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)的持續(xù)時間為3-5天。
在另一優(yōu)選例中，步驟(d)是當(dāng)美伐他汀或其鹽的濃度低于1mg/l后，才開始分離普伐他汀鈉。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)和(c)中美伐他汀是美伐他汀鈉。
在另一優(yōu)選例中，步驟(d)中分離出的普伐他汀鹽是普伐他汀鈉。


圖1顯示了用本發(fā)明微生物制備的普伐他汀鈉的1H核磁共振波譜。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過傳統(tǒng)的微生物篩選方法獲得了一株新的微生物TW-9918，它能夠耐受高濃度的美伐他汀，并且具有極高的轉(zhuǎn)化效率，這一菌株被命名為粉白小多孢菌(Micropolyspora roseoalba)。在此菌株的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的粉白小多孢菌TW-9918已于2001年8月29日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國，北京)，編號為CGMCC 0624。
如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明菌株”或“本發(fā)明微生物”指編號為CGMCC 0624的粉白小多孢菌，即TW-9918。
本發(fā)明的生產(chǎn)方法，除了生產(chǎn)菌和發(fā)酵條件不同之外，其他條件與現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)普伐他汀鈉的方法基本相同，例如普伐他汀鈉的分離和純化工藝。
本發(fā)明菌株的發(fā)酵條件與一般的小多孢菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培養(yǎng)基中，在pH6.8-7.5(較佳地pH7.0-7.2)和25-38℃(較佳地28-35℃)上發(fā)酵。
一些優(yōu)選的培養(yǎng)基如下斜面培養(yǎng)基采用酵母麥芽瓊脂(ISP2)，其組成為麥芽抽提物1.0％，酵母抽提物0.4％，葡萄糖0.4％，瓊脂2.0％，pH7.0-7.2。
種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.2-5.0％，酵母抽提物0.05-0.5％，蛋白胨0.1-2.0％，磷酸氫二鉀0.02-0.1％，pH7.0-7.2。
發(fā)酵用培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.0-5.0％，酵母抽提物0.1-1.0％，蛋白胨0.5-2.0％，K2HPO40.01-0.5％，MgSO4·7H2O 0.01-0.05％，pH7.0-7.2。
一種優(yōu)選的用TW-9918菌株轉(zhuǎn)化美伐他汀為普伐他汀的生產(chǎn)過程如下TW-9918于28℃在斜面上培養(yǎng)7-10天后即成熟。取成熟斜面上的菌絲接入種子培養(yǎng)基，然后于28℃在搖床上以轉(zhuǎn)速210RPM培養(yǎng)2-3天。
發(fā)酵培養(yǎng)基接入5-15％種子培養(yǎng)液，然后置于搖床或在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28-35℃。菌體生長12-24小時后，每天補(bǔ)入0.2-2.0％的葡萄糖，并同時補(bǔ)入美伐他汀使培養(yǎng)液中美伐他汀濃度維持在0.005-0.5wt％(較佳地0.01-0.05％)。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)一般進(jìn)行2-6天(較佳地3-5天)后即停止補(bǔ)加美伐他汀，待培養(yǎng)液中美伐他汀濃度低于1mg/L即終止。
發(fā)酵液通過離心去除菌體，上清液由疏水樹脂吸附，以水洗滌樹脂，普伐他汀鈉以乙醇/水混合溶液或丙酮/水混合溶液洗脫，收集普伐他汀部分，濃縮。濃縮液經(jīng)乙酸乙酯萃取，乙醇/乙酸乙酯結(jié)晶得普伐他汀鈉純品。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于本發(fā)明菌株對美伐他汀鈉的耐受性強(qiáng)，生產(chǎn)過程中美伐他汀鈉可維持在較高濃度。對美伐他汀鈉的轉(zhuǎn)化速度快，導(dǎo)致生產(chǎn)成本大幅下降。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1普伐他汀鈉生產(chǎn)菌株的獲得和鑒定1.微生物的分離篩選從中國各地采集得到的土壤樣本以10-2-10-6稀釋然后鋪于平板上，平板于28℃恒溫培養(yǎng)7-10天。共約1,500個菌株被分離出來用于搖瓶篩選。其中有3株菌株具有美伐他汀轉(zhuǎn)化能力，其中一株從中國寧波土壤分離所得的TW-9918顯示出對美伐他汀的高耐受性，并能高效轉(zhuǎn)化為普伐他汀。
2.微生物的鑒定形態(tài)特征TW-9918在桑塔斯瓊脂和葡萄糖天冬酰胺瓊脂上生長5-10天后，氣生菌絲上形成3-12個孢子的短鏈，孢子絲直絲；基內(nèi)菌絲有橫隔，斷裂，并產(chǎn)生少量短孢子鏈。孢子橢圓形，0.85×1.5um，表面光滑。
培養(yǎng)特征
TW-9918在七種培養(yǎng)基上28℃生長7-15天的特征如下

化學(xué)分類細(xì)胞壁組分分析菌株TW-9918的細(xì)胞壁中含有mdso-DAP(二氨基庚二酸，Diaminopimelicacid)，甘氨酸(細(xì)胞壁IV型)。
全細(xì)胞糖型分析菌株TW-9918水解液中含有半乳糖和阿拉伯糖(糖型A)。
枝菌酸分析菌株TW-9918不含枝菌酸。
生理生化特征

菌種鑒定結(jié)果
根據(jù)形態(tài)特征與細(xì)胞壁化學(xué)組分定屬的原則，TW-9918基絲有橫隔、斷裂；氣生菌絲和基內(nèi)菌絲都有短的孢子鏈；細(xì)胞壁為IV型，糖型為A，無枝菌酸，屬于小多孢菌屬(Micropolyspora)。又根據(jù)培養(yǎng)特征和生理生化特征定種的原則，菌株TW-9918氣生菌絲灰白、粉白；基內(nèi)菌絲淺黃色調(diào)，無可溶性色素；結(jié)合生理生化特征，菌株TW-9918與粉白小多孢菌相似，故劃歸為粉白小多孢菌(Micropolyspora roseoalba)。
目前尚沒有小多孢菌屬的菌株用于生產(chǎn)普伐他汀鈉的報道。
實施例2在本實施例中，用TW-9918生產(chǎn)普伐他汀鈉。
在一個250ml搖瓶中加入50ml種子液。種子液的配方組成如下葡萄糖2.0％，酵母抽提物1.0％，蛋白胨1.0％，pH7.2。種子液在121℃滅菌20分鐘，冷卻后接入TW-9918菌種，在搖床上28℃培養(yǎng)2天，搖床轉(zhuǎn)速210RPM。
2天后分別取10ml種子培養(yǎng)液接入含有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的2個500ml搖瓶中，于搖床上30℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速290RPM。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.0％，酵母抽提物0.5％，蛋白胨2.0％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH7.2，121℃滅菌20分鐘。培養(yǎng)24小時后開始補(bǔ)糖，葡萄糖每天加量為2.0％。溶液中的美伐他汀含量用HPLC檢測，通過補(bǔ)加美伐他汀鈉鹽水溶液使其濃度維持在0.01％-0.05％。4天后培養(yǎng)結(jié)束，共加入美伐他汀0.6g(3g/L)。
發(fā)酵終止后培養(yǎng)液離心去除菌體，上清液約為180ml，以100ml HP-20樹脂吸附，吸附完后，以500ml蒸餾水洗滌，然后以50％丙酮洗脫，收集含普伐他汀鈉部分，濃縮；濃縮液經(jīng)脫色，乙酸乙酯萃取，乙醇/乙酸乙酯結(jié)晶制得普伐他汀鈉純品0.2g。
實施例3在本實施例中用TW-9918在5L全自動發(fā)酵罐生產(chǎn)普伐他汀鈉。
在一個5L全自動發(fā)酵罐中共裝有3.5升發(fā)酵培養(yǎng)基，于121℃滅菌20分鐘，冷卻后接入300ml種子液，種子液培養(yǎng)方法同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖2.0％，酵母抽提物1.0％，蛋白胨2.0％，K2HPO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％。
發(fā)酵在30℃進(jìn)行，通氣量為3L/分鐘，攪拌轉(zhuǎn)速300-500rpm。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到18小時開始連續(xù)補(bǔ)加美伐他汀鈉鹽水溶液及葡萄糖溶液，并維持美伐他汀濃度為0.03-0.05％，轉(zhuǎn)化持續(xù)到96小時結(jié)束，共加入美伐他汀20g(5.7g/L)。
轉(zhuǎn)化液按實施例2相同方法純化，精制后共得普伐他汀鈉7.6g。制得的普伐他汀鈉的1H核磁共振波譜如圖1所示，與普伐他汀鈉標(biāo)準(zhǔn)品相同。
菌株保藏本發(fā)明的粉白小多孢菌(Micropolyspora roseoalba)TW-9918已于2001年8月29日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國，北京)，編號為CGMCC 0624。
權(quán)利要求
1.一種粉白小多孢菌(Micropolyspora roseoalba)，其特征在于，其保藏號是CGMCC 0624。
2.如權(quán)利要求1所述的粉白小多孢菌的用途，其特征在于，用于生產(chǎn)普伐他汀鈉。
3.一種生產(chǎn)普伐他汀或其鹽的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)在28-35℃，pH6.8-7.5條件下，培養(yǎng)保藏號CGMCC 0624的粉白小多孢菌(Micropolyspora roseoalba)；(b)加入美伐他汀或其鹽，維持美伐他汀濃度在0.005-0.5wt％，持續(xù)2-6天；(c)停止加入美伐他汀或其鹽；(d)分離出普伐他汀或其鹽。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(b)中維持美伐他汀或其鹽濃度在0.01-0.05wt％。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(b)的持續(xù)時間為3-5天。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(d)是當(dāng)美伐他汀或其鹽的濃度低于1mg/l后，才開始分離普伐他汀鈉。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(b)和(c)中美伐他汀或其鹽是美伐他汀鈉。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(d)中分離出的普伐他汀鹽是普伐他汀鈉。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的生產(chǎn)普伐他汀鈉的微生物及使用該微生物生產(chǎn)普伐他汀鈉的方法。本發(fā)明的粉白小多孢菌(Micropolyspora roseoalba)CGMCC0624對美伐他汀鈉的耐受性強(qiáng)，對美伐他汀鈉的轉(zhuǎn)化速度快，從而高效、低成本地生產(chǎn)普伐他汀鈉。
文檔編號C12P7/42GK1566328SQ0314147
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者梅民權(quán), 季曉銘, 高霄梁, 鄭扶桑, 陳懿 申請人:上海天偉生物制藥有限公司