專利名稱：用于制備普伐他汀的微生物方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備普伐他汀的方法，具體地說，涉及以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)普伐他汀的微生物方法。
背景技術(shù)：
動脈粥樣硬化、尤其是冠狀血管閉塞最危險的因素是血漿的高膽固醇水平。最近二十年，對作為膽固醇生物合成限速關(guān)鍵酶的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(EC.1.1.1.34)進(jìn)行了深入地研究。普伐他汀，一種式I的化合物， 以及其它相關(guān)化合物(密實菌素、美維諾林(mevinolin)、辛伐他汀)是HMG-CoA還原酶的競爭性抑制劑[A.Endo等，J.Antibiot.29，1346-1348(1976)；A.Endo等，F(xiàn)EBS Lett.72，323-326(1976)；C.H.Kuo等，J.Org.Chem.48，1991(1983)]。
普伐他汀最先由M.Tanaka等(未公開的結(jié)果)在研究密實菌素代謝期間從狗尿中分離出來(Arai，M.等，Sankyo Kenkyusyo Nenpo，40，1-38，1988)。目前，普伐他汀是一種降膽固醇藥，其在治療中具有最有利的作用機制。它最重要的特征是組織選擇性，即在膽固醇生成(cholesterogenesis)的兩個主要部位例如在肝臟和在小腸中它抑制膽固醇的合成，而在其它器官很難檢測到限制作用的胞內(nèi)酶。然而，美維諾林和辛伐他汀的膽固醇生物合成限制作用在大多數(shù)器官中卻是顯著的(T.Koga等，Biochim.Biophys.Acta，1045，115-120，1990)。
普伐他汀在化學(xué)結(jié)構(gòu)方面本質(zhì)上不同于更具親脂特征的美維諾林和辛伐他汀。在后二種化合物的情況下，與六氫化萘骨架的C-1碳原子連接的取代基的末端位于六元內(nèi)酯環(huán)中，而在普伐他汀的情況下，不存在所述內(nèi)酯環(huán)，而是存在生物活性的開鏈二羥酸的鈉鹽形式。另一重要的結(jié)構(gòu)差別是美維諾林和辛伐他汀在六氫化萘環(huán)的C-6-位置是甲基，而在普伐他汀中可以見到一個羥基，這導(dǎo)致在其親水特征方面進(jìn)一步增強。
作為上述結(jié)構(gòu)差異的結(jié)果，普伐他汀只能夠極低程度地穿透外周細(xì)胞的親脂膜(A.T.M.，Serajuddin等，J.Pharm.Sci.80，830-834，1991)。
可以通過兩個發(fā)酵過程達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)普伐他汀。在第一個發(fā)酵過程中，制備微生物階段的密實菌素，然后在第二個發(fā)酵過程中，在6β-位置上，通過微生物羥化作用，使作為底物的密實菌素酸的鈉鹽轉(zhuǎn)化為普伐他汀。
按照公開的專利，用屬于不同屬的霉菌菌種、和用屬于諾卡氏菌屬(Nocardia)的絲狀細(xì)菌、用馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)和鏈霉菌屬(Streptomyces)，可以在不同程度上完成密實菌素的微生物羥化作用(比利時專利說明書第895090號、日本專利說明書第5,810,572號、美國專利第4,537,859和4,346,227號和公開的歐洲專利申請?zhí)?605230)。公開了使用絲狀霉菌例如凍土毛霉(Mucor hiemalis)、Syncephalastrum nigricans、刺孢小克銀漢霉(Cunninghamella echinulata)以500μg/ml濃度和用屬于原核生物的諾卡氏菌屬、馬杜拉放線菌屬和鏈霉菌屬的菌株以2000-4000μg/ml進(jìn)行密實菌素底物的生物轉(zhuǎn)化。
在用絲狀霉菌生產(chǎn)普伐他汀的情況下經(jīng)歷的一個常見問題是由于密實菌素的抗真菌作用，引起微生物不能耐受添加到培養(yǎng)物中甚至低濃度的密實菌素底物(Serizawa等，J.Antibiotics，36，887-891，1983)。日本研究人員用Streptomyces carbophilus深入研究羥化作用時，也觀察到該底物的細(xì)胞毒性(M.Hosobuchi等，Biotechnology andBioengineering，42，815-820，1993)。
日本作者已設(shè)法用重組DNA技術(shù)改進(jìn)Streptomyces carbophilus菌株的羥化能力。密實菌素的羥化作用需要細(xì)胞色素P-450單加氧酶系統(tǒng)(Matsuoka等，Eur.J.Biochem.184，707-713，1989)。然而，根據(jù)所述作者的研究，在細(xì)菌的細(xì)胞色素P-450單加氧酶系統(tǒng)中，不是一種而是數(shù)種蛋白在電子傳遞中起作用，這使得所述DNA技術(shù)的應(yīng)用更加困難。開發(fā)出用于生產(chǎn)普伐他汀的成本有效的微生物羥化法是極其艱難而復(fù)雜的工作。
本發(fā)明的目的是詳細(xì)描述一種用于工業(yè)規(guī)模從密實菌素生產(chǎn)普伐他汀的新的微生物方法，所述方法會比先前已知的那些方法在更為有利的條件下生產(chǎn)普伐他汀。在我們的研究工作期間，我們嘗試了以上所有研究，以發(fā)現(xiàn)含有可能適合于使密實菌素微生物轉(zhuǎn)化為高濃度的普伐他汀的羥化酶的微生物菌株。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種用于從式(II)的底物化合物 其中R代表一種堿金屬或銨離子， 制備式(I)化合物的微生物方法，所述方法包括以下步驟(a)在含有可同化的碳源和氮源和無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)能夠?qū)⑹?II)化合物6β-羥化的Mortierella maculata絲狀霉菌菌種的菌株；(b)將待轉(zhuǎn)化的底物添加到所形成的Mortierellamaculata培養(yǎng)物中；(c)讓所述底物發(fā)酵直至生物轉(zhuǎn)化結(jié)束為止；(d)從所述培養(yǎng)物肉湯中分離式(I)的化合物；和(e)分離純化所述式(I)的化合物。
本發(fā)明還涉及保藏于匈牙利布達(dá)佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心、保藏號為NCAIM(P)F 001266的Mortierella maculata n.sp.E-97菌株的生物學(xué)上純的培養(yǎng)物；以及所述菌株的突變株Mortierellamaculata n.sp.E-97/15/13菌株的生物學(xué)上純的培養(yǎng)物，該突變株保藏于匈牙利布達(dá)佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心，保藏號為NCAIM(P)F 001267。
附圖簡述

圖1說明Mortierella maculata n.sp.E-97的物理特征。
發(fā)明詳述在我們篩選程序的過程中，覆蓋了大約5500種原核和真核菌株，選定了23種微生物，所述23種微生物反過來能夠羥化密實菌素的。在這些菌株中，一種絲狀霉菌證明是更適合于生產(chǎn)普伐他汀，因為與來自公開專利的已知菌株比較，它對密實菌素的抗性較高。按照分類學(xué)研究，該菌株證明是一種屬于被孢霉屬(Mortierella)的新的代表性菌種(Mortierella maculata n.sp.)。從所選定的霉菌中，一方面，通過應(yīng)用突變-選擇方法，另一方面，通過誘導(dǎo)所述菌株的羥化酶，分離到一種新菌株，所述新菌株能夠比迄今為止公開的菌株以更高濃度使密實菌素底物羥化成普伐他汀。作為誘變劑，可使用物理和化學(xué)誘變劑(UV照射、甲磺酸甲酯、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)。誘變處理之后，為了制備單倍體細(xì)胞，將孢子懸液涂布在含benomyl的瓊脂平板上，然后為了誘導(dǎo)羥化酶，將形成的菌落接種在100μg/ml含8-脫-(2-甲基-丁酰)-密實菌素或含密實菌素的瓊脂平板上。通過這些方法的應(yīng)用，從能夠在顯著高于親代菌株的程度上使密實菌素轉(zhuǎn)化為普伐他汀的新菌株中制備突變菌株。
在優(yōu)化實驗的過程中，我們確定了用于密實菌素羥化作用的最有益的接種物和最有利的生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基以及以高濃度重復(fù)添加密實菌素的最佳方法。
因此，本發(fā)明基于對名為Mortierella maculata的分離的霉菌的命名為E-97和E-97/15/13菌株的鑒別，所述菌株保藏于國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心(Department of Microbiology and Biotechnology.University of Horticulture and the Food Industry Budapest)，其保藏號分別為NCAIM(P)F 001266和NCAIM(P)F 001267，，它們在合適的發(fā)酵條件下，能夠高水平地生產(chǎn)普伐他汀，而在生物轉(zhuǎn)化期間，僅得到少量或微量不需要的相關(guān)化合物，例如酸形式的6α-羥基-密實菌素、2α-羥基-密實菌素、8-脫-(2-甲基-丁酰)-密實菌素、3α，5β-二羥基-5，6-二氫-異密實菌素、8a，β-羥基-密實菌素和位于密實菌素的2-甲基-丁酰側(cè)鏈的位置2和3上的羥基化衍生物。因此，這些菌株特別適合于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)普伐他汀。
考慮到所述有效成分的工業(yè)規(guī)模經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)隨密實菌素底物濃度而變化的，因此重要的是具有能夠耐受高密實菌素和普伐他汀濃度的菌株。因此，本發(fā)明的再一重要部分是認(rèn)識到通過應(yīng)用突變-選擇和酶誘導(dǎo)方法可以改進(jìn)原始霉菌分離物的羥化能力，而且通過開發(fā)合適的底物添加方法，可以在單一步驟中實現(xiàn)將大量密實菌素羥化成普伐他汀?？傊麨镸ortierella maculata n.sp.E-97/15/13的新突變菌株特別適合于生產(chǎn)普伐他汀。
下文概述了所述分離的新霉菌菌種與已知的被孢霉菌種的最重要的鑒別屬性比較的分類學(xué)特征。主模式菌株Mortierella maculata nov.spec.E-97的分類學(xué)描述在淀粉-酪蛋白-麥芽汁-瓊脂培養(yǎng)基上，很好地形成氣生菌絲體(基內(nèi)菌絲體上有超過10μm厚的覆蓋層)。開始時，它表現(xiàn)為菌絲緊密編織的白色網(wǎng)，后來，出現(xiàn)稀疏的具有幾毫米直經(jīng)的淺黃色孢子形成斑點(新名稱“maculatus”是指上述的斑點)。這種淺黃顏色有時可以占據(jù)氣生網(wǎng)的較大連續(xù)表面。在Czapek瓊脂培養(yǎng)基、血-Czapek瓊脂培養(yǎng)基、酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基、淀粉-酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基等上基內(nèi)菌絲體的顏色大多數(shù)是無色或淺黃色。在酵母提取物-葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲網(wǎng)的顏色是淡紅色。實際上在以上所列的培養(yǎng)基上沒有產(chǎn)生可擴(kuò)散和可溶性色素，或者很少在這些培養(yǎng)基上產(chǎn)生很淺的淺黃色。菌株E-97的菌落，由于其產(chǎn)生揮發(fā)油，并且與許多被孢霉屬的其它菌種(深黃被孢霉組(section Isabellina)的菌種除外)相似，可以散發(fā)一種非常特征性的強香氣。
由圖1中的參考編號1-7命名的孢囊柄，通常在氣生菌絲上(而較少在基內(nèi)菌絲上)以大量互相之間非常不同的距離局部形成。它們不分枝，但是多數(shù)是直的或彎曲。它們的長度一般為60-80μm。在絕大多數(shù)情況下的起始點是一個大體上短但強烈膨大的氣生網(wǎng)的菌絲區(qū)域，它們由胞壁分隔。孢囊柄自身也可以膨大(有時是強烈地)，如參考編號6所示，但在孢子囊的方向上，它們由5.0-9.0μm逐漸縮窄到1.0-2.0μm。重要的分類學(xué)特征是在所述孢囊柄之下，它們從不加寬(參見參考編號8)。
孢子囊為球形；在某些情況下為略微變平的球體。它們的直經(jīng)約為6.0-17.0μm，比其它被孢霉菌種的測量值小。孢子囊內(nèi)可以有許多孢子，但僅有一個孢子的孢子囊內(nèi)也存在。孢子9為圓柱形或不太橢圓。它們的大小為3.0-5.0×1.5-2.0μm。在單個孢子中，可以存在1個或2個小的暗色球形油滴10。由于孢子囊的壁非常容易分解，因此在潮濕環(huán)境中，孢子會很快地散布。在孢子囊解體后，有時在孢囊孢子的末端，可以觀察到細(xì)小音叉樣“囊領(lǐng)”和一種非常短的退化的(但不是典型的)囊軸。球形或圓柱形的芽孢15-28可以在大多數(shù)不同的鑒別培養(yǎng)基上形成。通常的大小為10-25μm。在所述培養(yǎng)基中，也可以見到球形芽孢13的鏈、芽生細(xì)胞、間生芽孢15-23、一個菌絲圍繞另一菌絲的特定螺旋生長的菌絲群叢11、菌絲融合樣結(jié)構(gòu)和巨細(xì)胞等。在氣生菌絲體中還可以觀察到大的(直經(jīng)50-250pm)非常致密的菌絲網(wǎng)14，但沒有可檢測的接合子存在。
菌株E-97的培養(yǎng)物能夠使硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，不水解淀粉、七葉苷、精氨酸或明膠，但水解吐溫polysorbates，不分解石蠟烴類。菌株E-97的培養(yǎng)物具有脲酶活性，在pH7.0-9.0之間顯示良好生長，耐受最大2％NaCl。黃嘌呤、次黃嘌呤、卵磷脂、酪氨酸和腺嘌呤的效應(yīng)為負(fù)效應(yīng)。從葡萄糖、果糖、甘油和半乳糖中已檢測到培養(yǎng)物產(chǎn)生的強酸，但從木糖、阿拉伯糖、棉子糖、山梨糖醇、肌醇、菊粉等不產(chǎn)生或產(chǎn)生很少的強酸。在丙酮酸鹽和乙酸鹽上檢測到弱生長，但是發(fā)現(xiàn)含有苯甲酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽和丙二酸鹽時不能生長。觀察到用葡萄糖和果糖作為培養(yǎng)基的唯一碳源時生長良好。木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖、棉子糖、甘露醇和肌醇的利用試驗證明為陰性的。所述培養(yǎng)物不分解纖維素。
系統(tǒng)分類學(xué)位置菌株E-97屬于被孢霉科，而且它是被孢霉屬的一個典型成員孢子囊內(nèi)一般有許多孢子，囊軸極其退化，常常存在芽孢，沒有檢測到接合子的存在，菌落散發(fā)一種非常特征性的強烈香氣。在被孢霉屬內(nèi)，菌株E-97是“高山被孢霉組(Section Alpina)”的典型代表。后者的特征為孢囊柄極短，不分枝(最大長度為200μm)，并且孢子囊微小(Zycha，H.und Siepmann，R，Mucorales.EineBeschreibung aller Gattungen und Arion dieser Pilzgruppe.D-3301 Lehre，Verl.von J.Cramer.1969)。在高山被孢霉組的成員中，菌株E-97與菌種薩克被孢霉(M.thaxteri Bjrling 1936)和腎孢被孢霉(M.renisporaDixon-Stewart 1932)顯示最高的相似性。然而，表I的數(shù)據(jù)清楚地表明菌株E-97與這兩個種的鑒別特性方面的差別。因此，作為一個新種，由此我們將所述菌株命名為Mortierella maculata nov.spec.E-97。
表1根據(jù)關(guān)鍵性鑒別特性，對Mortierella maculata n.sp.的主模式菌株E-97與菌種腎孢被孢霉和薩克被孢霉進(jìn)行比較
在按照本發(fā)明制備普伐他汀的方法中，最好使用命名為Mortierella maculata n.sp.E-97或其命名為E-97/15/13突變株的霉菌菌株培養(yǎng)物。所選定的菌株由于它快速生長所以是高度優(yōu)選的菌株。作為碳源，它容易利用葡萄糖、甘油、果糖或半乳糖。作為氮源，可以利用酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆粉、玉米漿、硝酸鈉或硫酸銨。
在用于生產(chǎn)普伐他汀的培養(yǎng)基中，除以上的碳源和氮源外，還可以含有無機鹽(例如磷酸二氫鉀、氯化鎂、硫酸鎂)、微量元素(亞鐵鹽、鎂鹽)、氨基酸和消泡劑。
按照本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，將已由命名為E-97菌株或其命名為E-97/15/13的突變株[NCAIM(P)F 001267]的Mortierellamaculata n.sp.瓊脂斜面培養(yǎng)物制備的孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中；然后，將在大約25-30℃、優(yōu)選在大約24-28℃、最優(yōu)選在大約28℃下培養(yǎng)3天的10％種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種到生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中。然后將其在大約25-28℃、最好在大約28℃培養(yǎng)4天，然后將葡萄糖和密實菌素酸的鈉鹽添加到所述培養(yǎng)物中。根據(jù)所添加的密實菌素底物的濃度，將培養(yǎng)在需氧條件下繼續(xù)再進(jìn)行2-12天，同時使pH保持在5.5-7.5之間，最好在7.0。在攪拌和通氣條件下，此時空氣流速為0.2vvm，攪拌器的轉(zhuǎn)速為400/分鐘，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
在發(fā)酵過程中，在密實菌素底物的生物轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行高壓液相層析法(HPLC)。按照該方法，用甲醇將所述肉湯樣品稀釋2倍，然后離心，將上清液在以下參數(shù)下用于HPLC分析Waters分析型HPLC儀；柱子Nucleosil C1810μm；檢測波長238nm；注射體積20μl，流速1ml/分鐘；采用梯度洗脫，洗脫液A＝0.05％磷酸水溶液，B＝乙腈。洗脫梯度
近似保留時間普伐他汀8.6-9.0分鐘；密實菌素酸11.6-12.0分鐘；普伐他汀內(nèi)酯15.0-15.5分鐘，密實菌素16.5-17.0分鐘。
為了生產(chǎn)普伐他汀，在培養(yǎng)的第96小時加入密實菌素酸的鈉鹽水溶液。對于該方法，如下以固體形式制備所述底物。于40℃、在0.2M氫氧化鈉溶液中將密實菌素內(nèi)酯水解2小時，然后用鹽酸將反應(yīng)混合物的pH調(diào)至7.5，將所述中和的溶液鋪在Diaion HP-20吸附柱上；通過用水洗滌柱子除去中和反應(yīng)期間生成的氯化鈉，然后用50％丙酮水溶液從柱子中洗脫密實菌素酸的鈉鹽。此后，真空蒸餾洗出物并將含水殘余物凍干。中和反應(yīng)后，也可以將密實菌素的堿性水解產(chǎn)物的水溶液直接用作底物。在這種情況下，通過HPLC測量水解產(chǎn)物中密實菌素酸的鈉鹽含量，并且在使用之前一直將所述溶液保藏于20℃。
到發(fā)酵的第4天肉湯的pH越高，對密實菌素底物的羥化越有利。當(dāng)肉湯的pH超過6.3時，允許開始添加密實菌素底物。在發(fā)酵的第4天，按需加入除菌過濾的密實菌素酸的鈉鹽水溶液至達(dá)到濃度為500μg/ml。如下也將在121℃滅菌25分鐘的50％葡萄糖溶液添加至所述培養(yǎng)物中如果肉湯的pH值高于6.7，則對應(yīng)于所述肉湯體積加入1％葡萄糖，而如果pH在6.3-6.7的范圍內(nèi)，則添加的葡萄糖的量為0.5％。24小時后從肉湯中消耗密實菌素酸的鈉鹽，通過HPLC測定分析其轉(zhuǎn)化。在這種情況下，每毫升肉湯另外加入500μg密實菌素。除密實菌素底物之外，還如上所述添加葡萄糖。120小時培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)特征為小球體(pellet)生長(球體直經(jīng)為0.5-3.0mm)。24小時后，從肉湯中再消耗第二劑量的底物，因此，在全肉湯中加入產(chǎn)生濃度為500μg/ml的另一份密實菌素酸的鈉鹽，并且根據(jù)肉湯的pH值平行添加葡萄糖。從發(fā)酵的第4天開始，如上所述以每日的頻率重復(fù)添加所述底物和葡萄糖，直到發(fā)酵的第17-18天為止。
為了從肉湯中回收所述產(chǎn)物，最好是考慮在生物轉(zhuǎn)化期間以其酸的形式生成普伐他汀的事實，因此通過它在陰離子交換樹脂柱上的吸附，可以將它從肉湯的濾液中分離出來。為了分離所述產(chǎn)物，最好是利用強堿性陰離子交換樹脂，它為帶有季銨活性基的聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。通過將羥基形式的陰離子交換樹脂混合到肉湯的濾液中，可以使所述產(chǎn)物直接從所述濾液中吸附出來。用乙酸或含氯化鈉的丙酮-水混合物，最好是用含1％氯化鈉的丙酮-水(1∶1)混合物，可以從所述柱子中將在陰離子交換樹脂上被吸附的產(chǎn)物洗脫出來。合并含普伐他汀的流分，真空蒸餾出洗出物中的丙酮。用15％硫酸將濃縮物的pH調(diào)至3.5-4.0的范圍，水溶液用乙酸乙酯萃取。用水洗滌乙酸乙酯萃取物，并用無水硫酸鈉干燥。然后用普伐他汀制備內(nèi)酯衍生物。在連續(xù)攪拌下，通過用以催化量存在的三氟乙酸誘導(dǎo)內(nèi)酯生成，于室溫下在干燥的乙酸乙酯溶液中進(jìn)行內(nèi)酯環(huán)的閉合。通過薄層層析分析(TLC)檢查轉(zhuǎn)化過程。完成內(nèi)酯生成后，乙酸乙酯溶液首先用5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用水洗滌，再用無水硫酸鈉干燥，并真空蒸發(fā)。蒸發(fā)后的殘余物在丙酮溶液中用活性炭處理，然后再蒸發(fā)，并且從含1-4個碳原子的脂族醇、最好是從乙醇中再結(jié)晶。用使用乙酸乙酯含量逐漸增加的乙酸乙酯-正己烷混合物作為洗脫液，用硅膠柱層析法，將再結(jié)晶母液的蒸發(fā)殘余物純化。
通過在室溫下丙酮中用等量的氫氧化鈉水解，用再結(jié)晶后和層析純化獲得的普伐他汀內(nèi)酯制備普伐他汀。當(dāng)完成普伐他汀鈉鹽的生成后，反應(yīng)混合物用水稀釋并中和，真空蒸餾丙酮內(nèi)容物。在含DiaionHP-20樹脂的柱上從所得到的含水殘余物中吸附普伐他汀，用去離子水洗滌，再用丙酮-去離子水混合物從所述柱子上洗脫。然后將含普伐他汀的流分合并，蒸餾出丙酮內(nèi)容物，在將含水殘余物凍干后可以得到高純度普伐他汀，可以將其從乙酸乙酯-乙醇混合物中再結(jié)晶。
在所述方法的過程中，可以吸附全部量的普伐他汀。在普伐他汀內(nèi)酯閉合期間，還可能生成3α-羥基-異-密實菌素和其它副產(chǎn)物。雖然這些后面的反應(yīng)減少所述分離的得率，但是那些化合物可以通過上述純化方法分離，因此可以以這種方式生產(chǎn)藥學(xué)上可接受質(zhì)量的普伐他汀。
完成生物轉(zhuǎn)化后，或者從發(fā)酵肉湯中或者從分離絲狀霉菌細(xì)胞后獲得的濾液中可以萃取普伐他汀?；蛘咄ㄟ^過濾或者通過離心可以去除絲狀霉菌細(xì)胞；然而，尤其在工業(yè)規(guī)模中，最好是制備全肉湯萃取物。萃取之前，用無機酸、最好是用稀硫酸，將或者發(fā)酵肉湯或者肉湯的濾液的pH調(diào)至3.5-3.7。用乙酸的酯和含24個碳原子的脂族醇、最好是用乙酸乙酯或乙酸異丁酯，進(jìn)行所述萃取。萃取步驟應(yīng)進(jìn)行得非?？欤员苊庠谒嵝詐H下由普伐他汀生成所述內(nèi)酯衍生物。
可以使普伐他汀的酸形式作為鈉鹽從有機溶劑萃取物轉(zhuǎn)移到水相中。例如，可以用1/10和1/20體積比的5％碳酸氫鈉或弱堿性水(pH7.5-8.0)從乙酸乙酯萃取物中萃取普伐他汀。發(fā)現(xiàn)通過應(yīng)用非離子吸附樹脂的柱層析，從以上得到的堿性含水萃取物中可以回收到純形式的普伐他汀。一種優(yōu)選方法是首先通過真空蒸餾從堿性含水萃取物中去除溶于水相的溶劑，然后將含水萃取物加樣到Diaion HP-20柱。
正在所述柱子上吸附的普伐他汀鈉鹽通過逐漸增加水溶液的丙酮含量進(jìn)行洗脫而被純化，然后將含普伐他汀的主要流分合并并且真空濃縮。含水濃縮物進(jìn)一步通過在另一Diaion HP-20柱上層析而純化，獲得含純的普伐他汀的洗出物，將其用活性碳澄清并凍干后，可以得到藥學(xué)上可接受質(zhì)量的普伐他汀。
該分離方法比先前的方法包括更少的步驟，因為在所述方法中不涉及普伐他汀的內(nèi)酯生成及其水解。在所述分離期間，使普伐他汀在酸性條件下只暴露有限時間，因為在酸性條件下它的穩(wěn)定性比在中性或堿性溶液中的穩(wěn)定性低，因此，在該分離方法中實際上不生成矯作物(artefacts)。
此外，發(fā)現(xiàn)最好是用Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(羥基丙基化衍生物)上的層析法純化普伐他汀。通過應(yīng)用該方法，可以產(chǎn)生純度超過99.5％(通過HPLC測定)的普伐他汀。
在我們的實驗過程中，已經(jīng)認(rèn)識到用所述絲狀霉菌或絲狀細(xì)菌菌株尤其是能夠?qū)⑼ㄊ?II)的化合物6β-羥化的Mortierella maculata n.sp.菌株的肉湯或肉湯硝酸鹽的有機溶劑萃取物、最好是用乙酸乙酯或乙酸異丁酯萃取物，可以用仲胺將普伐他汀作為結(jié)晶鹽沉淀出來。還發(fā)現(xiàn)對于鹽的生成，數(shù)種含有烷基取代基、環(huán)烷基取代基、芳烷基取代基或芳基取代基的仲胺是合適的。在它們中選擇方便無毒的仲胺，例如二辛胺、二環(huán)己胺、二芐胺。通過加入相對于萃取物的普伐他汀含量為1.5相當(dāng)量的二芐胺，進(jìn)行所述有機仲胺鹽中間體例如二芐胺鹽的分離，然后通過真空蒸餾使萃取物濃縮至其原始體積的5％，最后再以0.2相當(dāng)量比率將另一個量的二芐胺加入到所述濃縮物中。晶體二芐胺鹽從所述濃縮物中沉淀出來。過濾晶體粗制產(chǎn)物并真空干燥。然后用活性炭將其澄清并在丙酮中再結(jié)晶。
在其中包括堿性pH下有機溶劑萃取和反萃取的先前的所述方法中，基于仲胺鹽形成的分離方法還可以用來代替柱層析的純化。在這種情況下，最好從在堿性含水萃取物酸化后得到的乙酸異丁酯萃取物中沉淀普伐他汀二芐胺鹽。
用氫氧化鈉或醇鈉、最好是乙醇鈉，可以使普伐他汀有機仲胺鹽轉(zhuǎn)化成普伐他汀。
所述轉(zhuǎn)化在普伐他汀二芐胺鹽的情況下詳細(xì)描述。將再結(jié)晶的二芐胺鹽懸浮于乙酸異丁酯-水混合物中，然后通過在攪拌下保持pH的范圍為8.0-8.5，以水溶液將等量的氫氧化鈉加入至所述懸浮液中。在所述懸浮液溶解后，分離各相，含普伐他汀的水溶液用乙酸異丁酯洗滌兩次。水溶液用活性炭澄清并凍干，得到藥學(xué)上可接受質(zhì)量的普伐他汀。
用于將普伐他汀二芐胺鹽轉(zhuǎn)化為普伐他汀的一種優(yōu)選方法是將再結(jié)晶的二芐胺鹽懸浮于乙醇中，然后在攪拌下將等量或稍稍過量的乙醇鈉加入至該懸浮液中，然后真空濃縮反應(yīng)混合物，并通過加入丙酮，使普伐他汀以結(jié)晶形式從濃縮物中沉淀出來。
用于將普伐他汀二芐胺鹽轉(zhuǎn)化為普伐他汀的另一優(yōu)選方法是將再結(jié)晶的二芐胺鹽溶于乙酸乙酯-乙醇混合物中，然后將等量或稍稍過量的氫氧化鈉的乙醇溶液加入至所述溶液中，使普伐他汀沉淀。
通過仲胺鹽中間體分離普伐他汀，比任何先前已知的分離方法都簡單。在該分離方法中不生成后生物(artifacts)，并且不需要用任何層析方法，就可以解決從生物轉(zhuǎn)化副產(chǎn)物和從由羥化微生物生物合成的各種代謝產(chǎn)物中分離普伐他汀。
普伐他汀、普伐他汀內(nèi)酯和普伐他汀的分離的仲胺鹽的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過UV、IR、1H-NMR、13C-NMR和質(zhì)譜法證實。
實施例將參照以下實施例更全面地描述和理解本發(fā)明，所述實施例作為說明提供而不是用來以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例1用5ml 0.9％氯化鈉溶液制備孢子懸液，該溶液得自能夠?qū)⒚軐嵕?β-羥化的Mortierella maculata nov.spec.E-97[NCAIM(P)F 001266]菌株的7-10日齡麥芽汁-酵母提取物瓊脂斜面培養(yǎng)物，用所述懸液接種500ml錐形瓶中滅菌的100ml種子培養(yǎng)基PI。培養(yǎng)基PI的組成葡萄糖50g大豆粉20g溶于1000ml自來水中。
滅菌之前將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.0，然后121℃滅菌25分鐘。于28℃將培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(250rpm，2.5cm振幅)上振搖3天，然后將10ml所獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種到在500ml錐形瓶中121℃滅菌25分鐘的100-100ml生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基MU/4中。培養(yǎng)基MU/4的組成葡萄糖 40g大豆粉 20g酪蛋白-蛋白胨1g天冬酰胺 2g磷酸二氫鉀 0.5g溶于1000ml自來水中。
滅菌之前將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.0，然后121℃滅菌25分鐘。
于25℃將錐形瓶在旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(250rpm，2.5cm振幅)上振搖4天，然后以除菌過濾的水溶液形式將50-50mg密實菌素底物(密實菌素酸的鈉鹽)加入至培養(yǎng)物中，然后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。同樣，在第5天，將另外50-50mg密實菌素酸的鈉鹽加入至該霉菌培養(yǎng)物中，并且使發(fā)酵再繼續(xù)進(jìn)行24小時。通過HPLC測定肉湯中普伐他汀含量。發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行168小時。在生物轉(zhuǎn)化結(jié)束時，發(fā)酵肉湯中普伐他汀平均濃度為620μg/ml。
實施例2在實驗室規(guī)模5升工作體積的發(fā)酵罐中，制備MU/S生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，加入對應(yīng)于5升體積的培養(yǎng)基組分，但僅僅至多加樣4.5升，然后121℃滅菌45分鐘，用按照實施例1制備的500ml種子培養(yǎng)物接種。培養(yǎng)基MU/8的組成葡萄糖 20g甘油 20g大豆粉 20g蛋白胨 5g磷酸二氫鉀 0.5g聚丙二醇2000 1g溶于1000ml自來水中。滅菌之前將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.0值。
于28℃、攪拌速率為400rpm并且從底部方向的通氣速率為60升/小時下，將所述發(fā)酵進(jìn)行4天。轉(zhuǎn)種后的第2天，培養(yǎng)物開始嚴(yán)重起泡，該泡沫可以通過再加入聚丙二醇2000而減少。在發(fā)酵的初期(16-20小時)，pH從6.5的初始值減少至5.0-5.5，然后從第3天開始增加并且在第4天達(dá)到6.3-7.5。如果肉湯的pH大于6.3，則允許開始添加密實菌素底物。在發(fā)酵的第4天，以除菌過濾水溶液加入2.5g密實菌素底物。計算肉湯的體積，平行于所添加的底物，根據(jù)pH，以121℃滅菌25分鐘的50％溶液形式，將0.5-1.0％葡萄糖加入到培養(yǎng)物中。24小時后，從培養(yǎng)物中消耗密實菌素底物，這可從取自發(fā)酵罐中的樣品通過HPLC檢測到。在這種情況下，如上所述加入2.5g密實菌素底物和葡萄糖，并且當(dāng)所述底物被轉(zhuǎn)化為普伐他汀時，使該生物轉(zhuǎn)化再進(jìn)行24小時。
完成所述發(fā)酵后，含630μg/ml普伐他汀的5.1升肉湯用過濾布過濾。將2升水加入到分離的菌絲體中，然后將菌絲體懸液攪拌1小時，然后過濾。將這兩種濾液混合，并且以流速500ml/小時在含138g(250ml)Dowex A1 400(OH)樹脂的柱子(柱子直經(jīng)3.4cm，樹脂床高度28cm)上通過，然后樹脂床用300ml去離子水洗滌。隨后，用1升含10g氯化鈉的丙酮-水(1∶1)混合物對樹脂進(jìn)行洗脫。流分的體積為每個流分100ml。通過以下薄層層析(TLC)方法分析洗出物吸附劑Kieselgel 60F254DC(Merck)鋁箔；展開劑丙酮-苯-乙酸(50∶50∶3)混合物；檢出用磷鉬酸試劑。普伐他汀的Rf值為0.5。合并含所述產(chǎn)物的流分，真空蒸餾出丙酮。用15％硫酸將400ml濃縮物的pH調(diào)至3.5-4.0，然后用150ml乙酸乙酯萃取3次。將乙酸乙酯萃取物合并，用無水硫酸鈉干燥。隨后，于室溫、連續(xù)攪拌下，通過以催化量加入三氟乙酸從普伐他汀酸制備普伐他汀內(nèi)酯。普伐他汀內(nèi)酯的生成由TLC控制(上述TLC系統(tǒng)中的普伐他汀內(nèi)酯的Rf值為0.7)。內(nèi)酯生成完成后，所述乙酸乙酯用2×50ml 5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用50ml水洗滌，用無水硫酸鈉干燥并且真空蒸發(fā)。將得到的3g量的蒸發(fā)殘余物溶于100ml丙酮中并且用0.3g活性炭澄清。然后過濾去除活性炭，真空蒸發(fā)丙酮。得到的粗制產(chǎn)物從20ml乙醇中結(jié)晶。將沉淀的晶體普伐他汀內(nèi)酯過濾出來，用30ml正己烷在過濾器上洗滌，于室溫下真空干燥。這樣得到1.5g層析純的普伐他汀內(nèi)酯。熔點140-142℃，[α]D＝+194°(c＝0.5，甲醇)。真空蒸發(fā)結(jié)晶母液，得到1.2g蒸發(fā)殘余物，該殘余物在含24g Kieselgel 60吸附劑的柱子(柱子直經(jīng)1.6cm，床的高度20cm)上層析。將溶于5ml苯的粗制產(chǎn)物鋪在該柱子上。使用乙酸乙酯-正己烷混合物進(jìn)行洗脫，其中逐漸增加乙酸乙酯的含量。用60％乙酸乙酯-40％正己烷混合物可以將普伐他汀內(nèi)酯從該柱子上洗脫出來。采用乙酸乙酯-正己烷(9∶1)的混合物作為展開劑，通過TLC控制流分。合并含普伐他汀內(nèi)酯的流分，真空蒸發(fā)。按照該方法，得到0.3g純的產(chǎn)物，其質(zhì)量與通過結(jié)晶得到的普伐他汀內(nèi)酯的質(zhì)量相同。
將兩批普伐他汀內(nèi)酯混合，然后按照以下方法制備鈉鹽將1.8g普伐他汀內(nèi)酯溶于20ml丙酮中，攪拌下加入4.5ml 1M氫氧化鈉水溶液，然在室溫下將該溶液攪拌0.5小時。當(dāng)完成鹽的生成后，將20ml水加入到混合物中，使溶液中和，然后真空蒸發(fā)丙酮。將含水濃縮物在用150ml Diaion HP20樹脂填充的柱子(柱子直經(jīng)2.6cm，床的高度30cm)上層析。作為洗脫劑，使用丙酮-去離子水的混合物，其中丙酮的濃度以5％分步增加。用含15％丙酮的丙酮-去離子水混合物，可以使普伐他汀從柱子上洗出。通過TLC分析流分。合并含所述產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)丙酮。通過凍干含水殘余物，得到1.3g普伐他汀。從乙醇和乙酸乙酯的混合物中結(jié)晶出層析純的產(chǎn)物。熔點170-173℃(分解)[α]D20＝+156°，(c＝0.5，水中)。紫外吸收光譜(20μg/ml，甲醇中)λmax＝231，237，245nm(logε-4.263；4.311；4.136)紅外吸收光譜(KBr)υO(shè)H 3415，υCH 2965，υC＝O 1730，υCOO-1575cm-1。1H-NMR波譜(D2O，δ，ppm)0.86，d，3H(2-CH3)；5.92，dd，J＝10.0和5.4Hz，1H(3-H)；5.99，d，J＝10.0Hz，1H(4-H)；5.52，br 1H(5-H)；4.24，m 1H(6-H)；5.34，br，1H(8-H)；4.06，m，1H(β-H)，3.65，m，1H(δ-H)；1.05，d，3H(2’-CH3)；0.82，t，3H(4’-H3)。13C-NMR波譜(D2O，δ，ppm)15.3，q(2-CH3)；139.5，d(C-3)；129.5，d，(C-4)；138.1，s(C-4a)，127.7，d(C-5)；66.6，d(C-6)；70.1，d(C-8)；182.6s(COO-)；72.6.d(C-β)；73.0，d(C-δ)；182.0，s(C-1’)18.8；q(2’-CH3)；13.7，q(C-4’)。正離子FAB質(zhì)譜(特征離子)[M+Na]-469；[M+H]+447負(fù)離子FAB質(zhì)譜(特征離子)[M-H]-445，[M-Na]-423，m/z 101[2-甲基-丁酸-H]-。
實施例3在實驗室規(guī)模5升工作體積發(fā)酵罐中，如實施例1中所述制備生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基MU/4，雖然它至多加樣4.5升，但是培養(yǎng)基的組合物計按5升計算。121℃滅菌45分鐘后，用按照實施例1制備的500ml種子培養(yǎng)物接種。通過使用攪拌速率為300 rpm，通氣速率為50升/小時，使發(fā)酵于25℃進(jìn)行4天。將5g密實菌素底物添加至培養(yǎng)物中后，按照實施例2進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
完成該生成轉(zhuǎn)化后，將4.9升含有660μg/ml普伐他汀的肉湯過濾，通過在2×1升去離子水中懸浮，洗滌分離的菌絲體。用20％硫酸將混合的5.6升肉湯濾液的pH調(diào)至3.5-3.7，然后該酸性濾液和2750ml乙酸乙酯攪拌30分鐘。隨后，分離各相。水相再用2×1375ml乙酸乙酯萃取。將470ml去離子水加入到混合的4740ml乙酸乙酯萃取物中，然后用1M氫氧化鈉將乙酸乙酯混合物水溶液的pH調(diào)至7.5-8.0。攪拌20分鐘后，分離各相，然后如上所述用2×235ml去離子水萃取乙酸乙酯萃取物。然后將混合的弱堿性1080ml體積的水溶液真空濃縮至280ml體積。將該濃縮的水溶液鋪在用280ml Diaion HP-20(Mitsubishi Co.，日本)非離子樹脂填充的層析柱(高度∶直經(jīng)的比率＝6.5)上。用流速250-300ml/小時在該柱子上進(jìn)行吸附，然后用840ml去離子水洗滌柱子。隨后，按以下順序用800ml5％，1000ml 10％，500ml15％和500ml 20％含丙酮的水洗脫柱子。在洗脫的過程中，收集50ml的流分，所述流分根據(jù)實施例2中提供的TLC方法進(jìn)行分析。將含普伐他汀為主要成分的流分合并，所得到的溶液真空濃縮至260ml體積。濃縮的水溶液在含Diaion HP-20樹脂的260ml體積的柱子上層析。吸附普伐他汀后，柱子用790ml去離子水洗滌，然后以260-260ml的部分用如下逐漸增加丙酮含量的丙酮水溶液洗脫2.5％，5.0％，7.5％，10.0％，12.5％，15.0％和20.0％。在柱層析的過程中，收集25ml的流分，如上所述分析流分中的普伐他汀含量。通過TLC鑒定的把含普伐他汀作為單一組分的流分合并，并真空蒸發(fā)。隨后，將0.3g活性炭加入到濃縮的水溶液(約30ml)中，室溫下使普伐他汀澄清30分鐘。然后通過過濾法從溶液中去除活性炭，將濾液凍干。這樣得到1.62g凍干形式的普伐他汀。
實施例4用培養(yǎng)10-12天的Mortierella maculata n.sp.E-97[NCAIM(P)F001266]菌株的斜面培養(yǎng)物，和5ml無菌0.9％氯化鈉溶液制備孢子懸液，用該懸液接種將在3000ml錐形瓶中滅菌的500ml VHIG種子培養(yǎng)基。培養(yǎng)基VHIG的組成葡萄糖 30g肉膏 8g酵母提取物 1g吐溫-80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯) 0.5g溶于1000ml自來水中。
滅菌之前將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.0，121℃滅菌25分鐘。在旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(250rpm，2.5cm振幅)上將培養(yǎng)物培養(yǎng)3天，然后用獲得的種子培養(yǎng)物接種實驗室規(guī)模5升工作體積中含生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基PK的發(fā)酵罐。培養(yǎng)基PK的組成葡萄糖 40g蛋白胨 5g大豆粉 20gK2HPO42gKH2PO41gNaNO32gKCl0.5g溶于1000ml自來水中。
滅菌之前將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.0。按照實施例2進(jìn)行接種、培養(yǎng)、添加底物和生物轉(zhuǎn)化后，再從該肉湯中分離普伐他汀，其中發(fā)酵結(jié)束時普伐他汀的濃度為650μg/ml。
完成發(fā)酵，在連續(xù)攪拌下用2M氫氧化鈉將4.9升含650μg/ml普伐他汀的肉湯的pH調(diào)至9.5-10.0，攪拌1小時后，用20％硫酸將pH調(diào)至3.5-3.7。隨后，用2.45升乙酸乙酯萃取該酸性溶液。分離各相，用離心法從該乳化的有機相制備澄清的萃取物。根據(jù)上述方法，肉湯再用2×1.22升乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯萃取物合并，加入0.4升去離子水，然后用1M氫氧化鈉將混合物的pH調(diào)至8.0-8.5。分離各相，如上所述，用pH 8.0-8.52×0.2升去離子水萃取乙酸乙酯相。攪拌下用20％硫酸將混合的含普伐他汀的弱堿性水溶液的pH調(diào)至3.5-3.7。所獲得的酸性溶液用4×0.2升乙酸乙酯萃取?；旌系囊宜嵋阴ポ腿∥镉?×0.2升去離子水洗滌，然后將150％(摩爾)二芐胺(根據(jù)通過HPLC測量的普伐他汀含量—計算的)加入到乙酸乙酯溶液中。將乙酸乙酯溶液真空濃縮至0.2升體積。再將20％(摩爾)二芐胺加入到獲得的濃縮物中，沉淀的溶液于0-5℃放置過夜。過濾沉淀的普伐他汀二芐胺鹽，然后將沉淀在過濾器上先用冷乙酸乙酯洗滌1次，然后用正己烷洗滌2次，最后于40-50℃真空干燥。室溫下，將得到的粗制產(chǎn)物(3.9g)溶于100ml甲醇，然后用0.45g活性炭使該溶液澄清。此后真空濃縮甲醇濾液。在外部溫度62-66℃時，將蒸發(fā)的殘余物溶于120ml丙酮中，然后將溶液冷卻至室溫。隨后，于0-5℃下繼續(xù)進(jìn)行再結(jié)晶過夜。過濾沉淀的晶體，在過濾器上將晶體先用冷丙酮洗滌2次，然后用正己烷洗滌2次。將再結(jié)晶的普伐他汀二芐胺鹽懸浮于160ml乙酸異丁酯和80ml去離子水的混合物中。隨后，在攪拌下以等量將氫氧化鈉加入到懸浮液中。懸浮液消失后，分離各相，含普伐他汀的水溶液用2×30ml乙酸異丁酯洗滌。獲得的水溶液用活性炭澄清。然后將含水濾液濃縮至約20ml體積。獲得的水溶液加樣到用0.4升SephadexLH-20凝膠(供應(yīng)商Pharmacia，瑞典)填充的層析柱(高度∶直經(jīng)＝22)上。在層析過程中，去離子水用作洗脫液，收集20ml的流分。通過TLC對流分進(jìn)行分析，然后采用上述方法通過HPLC還對含普伐他汀的那些流分進(jìn)行分析。合并含純的普伐他汀的流分并凍干。這樣得到1.75g普伐他汀，通過HPLC測定它的純度高于99.5％。
實施例5用培養(yǎng)10-12天的Mortierella maculata n.sp.E-97[NCAIM(P)F001266]菌株的斜面培養(yǎng)物和5ml無菌0.9％氯化鈉溶液制備孢子懸液，然后如實施例4所述用該懸液接種500ml種子培養(yǎng)基。在實驗室規(guī)模5升工作體積發(fā)酵罐中，將生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基PC/4在121℃滅菌45分鐘，然后用種子培養(yǎng)物接種。培養(yǎng)基PC/4的組成麥芽汁5.0％大豆粉1.0％蛋白胨1.0％玉米漿1.0％
MgSO4×7H2O0.1％溶于1000ml自來水中。
滅菌之前將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.0。按照實施例2進(jìn)行接種、培養(yǎng)和添加底物后，得到5.1升含有濃度為610μg/ml的普伐他汀的肉湯。
根據(jù)實施例4中所提供的方法，從該肉湯中生產(chǎn)3.7g普伐他汀二芐胺鹽粗制產(chǎn)物，將其再結(jié)晶后，從中得到2.9g普伐他汀二芐胺鹽。將該再結(jié)晶的普伐他汀二芐胺鹽懸浮于45ml乙醇中，然后在攪拌下通過添加1M氫氧化鈉的乙醇溶液而加入110％(摩爾)氫氧化鈉。繼續(xù)攪拌溶液0.5小時，然后將0.3g活性炭加入到溶液中并再攪拌0.5小時。過濾溶液，將濾液濃縮至15ml。然后在56-60℃下將60ml丙酮加入到濃縮物中。將所獲得的溶液冷卻至室溫，然后于+5℃放置過夜。隨后，將沉淀過濾，然后用2×20ml丙酮、2×20ml乙酸乙酯和2×20ml正己烷洗滌，最后真空干燥。將得到的1.7g粗制普伐他汀溶于乙醇中，然后用活性炭澄清，從乙醇-乙酸乙酯混合物中結(jié)晶。這樣得到1.54g普伐他汀，它與實施例2的產(chǎn)物相同。
實施例6如實施例4所述，用培養(yǎng)7-10天的Mortierella maculata n.sp.E-97[NCAIM(P)F 001266]菌株的斜面培養(yǎng)物，接種3000ml錐形瓶中滅菌的500ml種子培養(yǎng)基MI，然后于28℃在旋轉(zhuǎn)式搖瓶機上培養(yǎng)3天。培養(yǎng)基MI的組成葡萄糖 40g酪蛋白 5gKCl 0.5gNaNO33gKH2PO42gMgSO4×7H2O 0.5gFeSO4×7H2O 0.01g
溶于1000ml自來水中。
滅菌之前將培養(yǎng)基的pH調(diào)至6.0，121℃滅菌35分鐘。將獲得的種子培養(yǎng)物接種到發(fā)酵罐中滅菌的5升生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基P12中。培養(yǎng)基P12的組成葡萄糖 10g麥芽汁 50g酵母提取物 5g玉米漿 5gMgSO4×7H2O 1g吐溫-80 0.5g溶于1000ml自來水中。
滅菌之前將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.0，然后121℃滅菌45分鐘。按照實施例2進(jìn)行發(fā)酵、添加底物和生物轉(zhuǎn)化。完成生物轉(zhuǎn)化后，如下分離生成的濃度為620μg/ml的普伐他汀用2M氫氧化鈉將5.15升含有620μg/ml普伐他汀的肉湯的pH調(diào)至9.5值，然后室溫下攪拌1小時。過濾肉湯，菌絲體先通過在1×2升水中懸浮，然后在1×0.5水中懸浮進(jìn)行洗滌。合并濾液，用20％硫酸將水溶液的pH值調(diào)至3.7，先用2.5升然后用1.5升乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯萃取物合并，用2×0.5升水洗滌后加入1.95g二環(huán)己胺。在40℃減壓下將乙酸乙酯萃取物濃縮至200ml，再次將0.195g二環(huán)己胺加入到濃縮物中，然后將其于15℃下攪拌6小時。將沉淀的晶體物質(zhì)過濾，先用20ml然后用15ml乙酸乙酯洗滌，在40℃下干燥。這樣得到3.51g粗制產(chǎn)物。該粗制產(chǎn)物在丙酮-乙醇混合物中再結(jié)晶后，得到3.05g普伐他汀二環(huán)己胺鹽(熔點162-168℃)，按照實施例5將其轉(zhuǎn)化為普伐他汀。
實施例7如實施例2所述，用Mortierella maculata n.sp.E-97[NCAIM(P)F001266]菌株進(jìn)行發(fā)酵、添加底物和生物轉(zhuǎn)化。如下從肉湯中分離通過生物轉(zhuǎn)化獲得的普伐他汀。
含有濃度為650μg/ml普伐他汀的5升培養(yǎng)肉湯在過濾布上過濾。在2升0.1M氫氧化鈉溶液中將霉菌菌絲體攪拌1小時，然后過濾?；旌蟽煞N濾液，用15％硫酸將pH調(diào)至3.5-4.0。隨后，該溶液用2×1.8升乙酸乙酯萃取。混合的乙酸乙酯相用800ml水洗滌。然后加入400ml去離子水，用1M氫氧化鈉將混合物的pH值調(diào)至8.0-8.5。將混合物攪拌15分鐘，然后分離各相。將300ml水加入到乙酸乙酯相中，并且將pH調(diào)至8.0-8.5。攪拌15分鐘后，分離各相。再次將300ml水加入到乙酸乙酯相中，并且將pH調(diào)至8.0-9.5。然后將混合物攪拌15分鐘。再次分離兩相。混合所有的水相，并用15％硫酸將pH調(diào)至3.5-4.0，然后用3×300ml乙酸乙酯萃取?；旌系囊宜嵋阴ハ嘤?50ml水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，并且過濾。然后將150％(摩爾)二辛胺(根據(jù)普伐他汀含量—計算的)加入到乙酸乙酯萃取物中。將乙酸乙酯蒸發(fā)至約1/10體積，加入丙酮直到出現(xiàn)沉淀為止。混合物于+5℃放置過夜。在G-4過濾器上過濾沉淀，先用20ml丙酮洗滌，然后用20ml正己烷洗滌，并于室溫下真空干燥。從20ml丙酮中再結(jié)晶所獲得的3.3g粗制普伐他汀二辛胺鹽，得到2.7g純的普伐他汀二辛胺鹽。熔點143-146℃。用實施例5中提供的方法，將普伐他汀二辛胺鹽轉(zhuǎn)化為普伐他汀。
實施例8通過對分離自天然棲息地、能夠?qū)⒚軐嵕?β-羥化的Mortierellamaculata n.sp.E-97菌株羥化能力的開發(fā)，在下文詳細(xì)討論的突變選擇和酶誘導(dǎo)實驗中，得到Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13[NCAIM(P)F 001267]突變株。
將由我們分離的Mortierella maculata n.sp.E-97[NCAIM(P)F001266]菌株于28℃在MS瓊脂斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天。瓊脂培養(yǎng)基MS的組成葡萄糖4g麥芽汁10g酵母提取物4g瓊脂 20g在1000ml蒸餾水中。
用5ml 0.9％氯化鈉溶液從斜面培養(yǎng)物中把孢子洗出，然后在將孢子懸液轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿后，用紫外燈對其照射1分鐘。隨后，將終濃度為2000μg/ml的N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍加入到孢子懸液中。然后將該懸液轉(zhuǎn)移到100ml錐形瓶中，并于28℃下用150rpm的速率將其振搖20分鐘。隨后，通過以400rpm的速率離心10分鐘，使孢子沉淀，然后懸浮于0.9％氯化鈉無菌溶液中。將該懸液涂布在含10μg/ml benomyl和1％去纖維蛋白血的瓊脂平板MU-VB上。瓊脂培養(yǎng)基MU-VB的組成葡萄糖 40g天冬酰胺 2g蛋白胨 2.5g磷酸二氫鉀 0.5g瓊脂 20g溶于990ml蒸餾水中；滅菌后，為該培養(yǎng)基補充10ml牛血和10mgbenomyl。
瓊脂平板于28℃培養(yǎng)7天后，將生長的菌落通過隨機選擇轉(zhuǎn)種到裝有瓊脂培養(yǎng)基PS的試管中。瓊脂培養(yǎng)基PS的組成葡萄糖 40g真菌蛋白胨 10g瓊脂 15g溶于1000ml蒸餾水中。
滅菌之前將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.6-5.7。121℃滅菌20分鐘。
斜面培養(yǎng)物于28℃培養(yǎng)12天，如實施例1所述，在搖瓶實驗中測試培養(yǎng)物的普伐他汀生產(chǎn)力。通過該方法選擇Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13突變株，該突變株用應(yīng)用的1000μg/ml濃度的密實菌素酸的鈉鹽產(chǎn)生超過60％轉(zhuǎn)化率的普伐他汀。
通過在含100μg/ml 8-脫-(2-甲基-丁酰)密實菌素和/或密實菌素的MU-VB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13菌株的羥化酶。隨機選擇生長的菌落后，將它們轉(zhuǎn)種到含誘導(dǎo)物的MU-VB斜面。根據(jù)實施例1中所述的方法檢測斜面生長培養(yǎng)物的普伐他汀生產(chǎn)力，但有以下不同從發(fā)酵的第4天起以500μg/ml的量添加密實菌素底物，連續(xù)添加11天，逐漸加入密實菌素鈉底物，密實菌素鈉底物在12天內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為普伐他汀。在用30g密實菌素鈉底物在50個搖瓶培養(yǎng)物中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化結(jié)束時，通過HPLC測定生成了18.5g普伐他汀。按照以下方法，從混合的發(fā)酵肉湯中進(jìn)行普伐他汀的回收。
完成發(fā)酵后，用20％硫酸溶液將含有3360μg/ml濃度普伐他汀的5.5升肉湯的pH調(diào)至3.5-3.7。隨后，該酸性溶液用2.75升乙酸乙酯萃取。分離各相，通過離心從乳化的有機相制備澄清萃取物。如先前所描述，用1.37升乙酸乙酯再萃取肉湯2次。混合的乙酸乙酯萃取物用2×1.15升去離子水洗滌，然后將150％(摩爾)二芐胺(根據(jù)通過HPLC測量的普伐他汀含量—計算的)加入到乙酸乙酯溶液中。將乙酸乙酯溶液真空濃縮至約0.23升體積。再次將20％(摩爾)二芐胺加入到濃縮物中，將沉淀溶液于0-5℃放置過夜。過濾沉淀的普伐他汀酸的二芐胺鹽，然后將沉淀物通過將其懸浮在冷卻的乙酸乙酯中而洗滌，然后懸浮在在正己烷中洗滌2次，最后于40-50℃真空干燥。于62-65℃溫度將得到的粗制產(chǎn)物(22.4g)溶于0.67升丙酮中，用2.2g活性炭使溶液澄清。澄清后，將丙酮濾液真空濃縮至0.56升體積。在上述溫度下將從該濃縮物中沉淀的晶體再次溶解，然后將該溶液冷卻至室溫。隨后，在0-5℃繼續(xù)再結(jié)晶過夜。過濾沉淀的晶體，通過在冷卻的丙酮中懸浮2次而洗滌，然后懸浮在正己烷中洗滌2次。在40-50℃真空干燥再結(jié)晶的普伐他汀酸的二芐胺鹽。在40-44℃將得到的普伐他汀酸的二芐胺鹽(14.8g)溶于740ml乙酸乙酯-乙醇(9∶1)混合物中，然后將110％(摩爾)氫氧化鈉加入到1M乙醇溶液形式的該溶液中。室溫下繼續(xù)攪拌獲得的沉淀溶液0.5小時，然后通過應(yīng)用或冰冷卻1-1.5小時達(dá)到完全沉淀。隨后，過濾沉淀，用2×150ml冷卻的乙酸乙酯和2×150ml正己烷洗滌，最后于40-50℃真空干燥。將得到的普伐他汀溶于乙醇中，用1.0g活性炭澄清，然后從乙醇-乙酸乙酯混合物中結(jié)晶出來。這樣得到9.4g普伐他汀，其物理常數(shù)對應(yīng)于實施例2中給出的數(shù)據(jù)。
雖然本文已經(jīng)描述了本發(fā)明的某些目前優(yōu)選的實施方案，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以對本發(fā)明描述的實施方案進(jìn)行多種變化和修改。因此，本發(fā)明僅限于所附權(quán)利要求書和法律可應(yīng)用的規(guī)則所需的程度。
權(quán)利要求
1.一種用于從式(II)的底物化合物 其中R代表一種堿金屬或銨離子，制備式(I)化合物的微生物方法， 所述方法包括以下的步驟a)在含有可同化的碳源和氮源和無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)能夠?qū)⑹?II)化合物6β-羥化的Mortierella maculata絲狀霉菌菌種的菌株，b)將待轉(zhuǎn)化的底物添加到所形成的Mortierella maculata培養(yǎng)物中，c)讓所述底物發(fā)酵直至生物轉(zhuǎn)化結(jié)束，d)從所述培養(yǎng)物肉湯中分離所述式(I)的化合物，和e)分離純化所述式(I)的化合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基為一種營養(yǎng)肉湯。
3.權(quán)利要求2的方法，其中通過在一種陰離子交換樹脂上吸附，進(jìn)行從所述培養(yǎng)物肉湯中分離所述式(I)的化合物的所述步驟。
4.權(quán)利要求2的方法，其中通過用一種水不混溶的有機溶劑萃取，進(jìn)行從所述培養(yǎng)物肉湯中分離所述式(I)的化合物的所述步驟，然后制備它的內(nèi)酯衍生物或它的仲胺鹽作為一種中間體。
5.權(quán)利要求2的方法，其中通過在非離子吸附樹脂上層析而將所述發(fā)酵肉湯的有機溶劑萃取物中獲得的堿性含水萃取物純化，進(jìn)行從所述培養(yǎng)物肉湯中分離所述式(I)的化合物的所述步驟。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述Mortierella maculata菌株是保藏于匈牙利布達(dá)佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心、保藏號為NCAIM(P)F 001266的Mortierella maculata n. sp. E-97菌株。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述Mortierella maculata菌株是保藏于匈牙利布達(dá)佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心、保藏號為NCAIM(P)F 001267的Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13菌株。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述用于轉(zhuǎn)化的菌株的羥化酶被8-脫(2-甲基-丁酰)密實菌素或密實菌素誘導(dǎo)。
9.權(quán)利要求2的方法，其中將作為底物的式(II)的化合物加入到平行于所述添加步驟的培養(yǎng)物中，并且其中所述添加步驟取決于所述培養(yǎng)物的pH，而它的量是相應(yīng)于所述肉湯體積的0.5-1.0％。
10.權(quán)利要求1的方法，其中在含有一種選自葡萄糖、果糖和甘油的碳源的培養(yǎng)基上進(jìn)行所述發(fā)酵步驟。
11.權(quán)利要求1的方法，其中在含有一種選自大豆粉、蛋白胨、酪蛋白、酵母提取物和肉膏的氮源的培養(yǎng)基上進(jìn)行所述發(fā)酵步驟。
12.權(quán)利要求2的方法，其中通過以下步驟從所述培養(yǎng)物肉湯中分離在所述生物轉(zhuǎn)化期間生成的式(I)的化合物在一種陰離子交換樹脂上通過從所述肉湯的濾液和從所述菌絲體的洗滌水中吸附所述式(I)化合物，從所述樹脂中洗脫所述式(I)的化合物，將所述式(I)的化合物完全轉(zhuǎn)化成它的內(nèi)酯形式，分離所述內(nèi)酯衍生物，用氫氧化鈉水解所述內(nèi)酯衍生物，以及在一種非離子吸附樹脂上使所述式(I)的化合物脫鹽。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述陰離子交換樹脂具有季銨活性基并攜有聚苯乙烯-二乙烯基苯骨架，被用來從所述肉湯的濾液中分離所述式(I)的化合物。
14.權(quán)利要求4的方法，其中在所述生物轉(zhuǎn)化期間生成的式(I)化合物用水不混溶的有機溶劑從所述肉湯或從所述肉湯的濾液中以酸的形式萃取，所述肉湯已被酸化為pH3.5-3.7。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述水不混溶的有機溶劑是乙酸乙酯。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述水不混溶的有機溶劑是乙酸異丁酯。
17.權(quán)利要求5的方法，其中所述式(I)的化合物以鈉鹽形式用氫氧化鈉水溶液從所述有機溶劑中萃取，并且在一種非離子吸附樹脂上純化。
18.權(quán)利要求14的方法，其中用一種含有烷基取代基、環(huán)烷基取代基、芳烷基取代基或芳基取代基的仲胺將所述式(I)的化合物以晶體形式從所述萃取物中沉淀出來。
19.權(quán)利要求18的方法，其中將所述晶體仲胺鹽懸浮于乙酸的含有1-4個碳原子的烷基酯和水的混合物中；將等量的氫氧化鈉以水溶液加入到所述懸浮液中，以形成有機相和水相；分離所述有機相和水相；所述水相用乙酸異丁酯洗滌，然后用活性炭澄清；并且將所述水溶液凍干。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述烷基酯是異丁酯。
21.權(quán)利要求18的方法，其中將所述晶體仲胺鹽懸浮于含有1-4個碳原子的醇中；通過加入氫氧化鈉的乙醇溶液，從所述懸浮液制備所述式(I)化合物的溶液；并且用丙酮使所述式(I)的化合物從所述溶液中沉淀出來。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述含有1-4個碳原子的醇是乙醇。
23.權(quán)利要求18的方法，其中將所述晶體仲胺鹽溶于含有1-4個碳原子的鏈烷羧酸的含有1-4個碳原子的烷基酯和含有1-4個碳原子的醇的混合物中；并且通過加入氫氧化鈉，使式(I)的化合物從所述溶液中以晶體形式沉淀出來。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述混合物是乙酸乙酯-乙醇混合物。
25.權(quán)利要求19的方法，其中通過所述式(I)化合物酸形式的二芐胺鹽，從所述發(fā)酵肉湯中分離純化普伐他汀。
26.權(quán)利要求19的方法，其中所述式(I)化合物的酸性衍生物通過其二環(huán)己胺鹽純化。
27.權(quán)利要求19的方法，其中所述式(I)化合物的酸性衍生物通過其二辛胺鹽純化。
28.權(quán)利要求19的方法，其中采用凝膠層析，將所述式(I)的化合物純化至經(jīng)HPLC測定至少為99.5％。
29.權(quán)利要求1的方法，其中在約25℃至約30℃下培養(yǎng)所述Mortierella maculata的菌株。
30.一種保藏于匈牙利布達(dá)佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心、保藏號為NCAIM(P)F 001266的Mortierella maculata n.sp.E-97菌株的生物學(xué)純的培養(yǎng)物。
31.一種保藏于匈牙利布達(dá)佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心、保藏號為NCAIM(P)F 001267的Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13菌株的生物學(xué)純的培養(yǎng)物。
32.一種能夠?qū)⑹?II)化合物6β-羥化的被孢霉屬培養(yǎng)物， 其中R代表一種堿金屬或銨離子，所述培養(yǎng)物主要由一種新菌株Mortierella maculata n.sp.E-97組成，所述菌株保藏于匈牙利布達(dá)佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心，保藏號為NCAIM(P)F 001266。
33.一種能夠?qū)⑹?II)化合物6β-羥化的被孢霉屬培養(yǎng)物， 其中R代表一種堿金屬或銨離子，所述培養(yǎng)物主要由一種新菌株Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13組成，所述菌株保藏于匈牙利布達(dá)佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物保藏中心，保藏號為NCAIM(P)F001267。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的微生物方法,通過在好氣發(fā)酵下通過深層培養(yǎng)一種能夠?qū)⑹?II)化合物6β－羥化的霉菌菌株,并且通過分離和純化在所述生物轉(zhuǎn)化過程中生成的式(I)的所述產(chǎn)物,從通式(II)的化合物(其中R代表一種堿金屬或銨離子)制備化合物式(I)。所述方法包括在含有可同化碳源和氮源和無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)一種能夠?qū)⑼ㄊ?II)的化合物6β－羥化的Mortierella maculata絲狀霉菌菌種的菌株,并且從所述發(fā)酵肉湯中分離生成的所述產(chǎn)物,然后分離并純化式(I)的所述化合物。本發(fā)明還公開了Mortierella maculata的多種新菌株。
文檔編號C07C67/28GK1347400SQ00805879
公開日2002年5月1日 申請日期2000年2月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月3日
發(fā)明者A·杰克, A·康雅, I·巴塔, E·伊爾科伊, G·索莫伊, G·阿姆布魯斯, G·霍爾瓦斯, K·阿爾布雷希特, I·M·沙波, J·莫澤斯尼蘇托, J·薩拉特, A·安多爾, L·比林斯克, S·波羅斯, I·朗, M·比德洛尼伊格洛伊 申請人:藥物研究所有限公司