專利名稱：牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類紅細胞的采集處理和紅細胞外膜蛋白制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牙鲆在我國俗稱牙片、偏口，品種優(yōu)良，生長快速，肉質(zhì)鮮美，是我國優(yōu) 良的海水魚類增養(yǎng)殖品種之一。目前隨著牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模的擴大， 養(yǎng)殖牙鲆各種病害頻繁爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟損失。魚類具備一個相對完善 的免疫系統(tǒng)，可通過特異性和非特異性免疫來防御各種病原的侵襲。外周血細
胞是魚類非特異性免疫防御體系中的重要防線之一"2。但是有關(guān)魚類紅細胞免疫 功能以及紅細胞免疫分子的研究尚未見明確報道，對于牙鲆紅細胞外膜蛋白的 制備技術(shù)仍屬空白。
目前針對魚類紅細胞免疫功能和紅細胞外膜蛋白的研究，存在以下幾個問
題
1. 魚類紅細胞的免疫功能沒有引起研究人員的重視
一般認為，紅細胞的主要功能是攜帶02和0)2，但是1981年Siegel提出了"紅 細胞免疫系統(tǒng)的新概念，促進了紅細胞免疫研究發(fā)展3。這些工作在人類以及其 他哺乳類和鳥類中開展最多，但在魚類中有關(guān)紅細胞免疫的報道很少，認識不 夠。
2. 有關(guān)魚類紅細胞免疫機理的研究基礎(chǔ)薄弱
對于魚類紅細胞免疫功能的作用機理尚不了解，參與免疫反應(yīng)的重要分子 和作用方式也未査明，缺乏對紅細胞免疫分子的深入分析和鑒定，無從下手開 展研究。
3. 有關(guān)魚類紅細胞外膜蛋白的制備未見報道
目前有關(guān)細胞膜蛋白的研究多集中于高等脊椎動物，而有關(guān)低等的魚類細 胞膜的研究還未見報道4。 參考文獻
1.周永燦，邢玉娜，馮全英.魚類血細胞研究進展.海南大學(xué)學(xué)報(自然 科學(xué)版)，2003, 21 (2): 171-176。2. 邢婧，戰(zhàn)文斌，曾曉華等.牙鲆(尸ar^ic力^^s o"race^)紅細胞單克 隆抗體與五種養(yǎng)殖魚類血細胞的交叉反應(yīng).海洋與湖沼，2005 36(2): 123-129。
3. Siegel I， Liu T L， Gleicher N. The red—cell immune system. Lancet. 1981 12; 2 (8246):556-9。
4. 張領(lǐng)兵，倫艷妮，于樂洋等SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分 離和鑒定小鼠巨噬細胞膜蛋白.中國生物工程雜志，2007, 27 (4): 77_82。

發(fā)明內(nèi)容
本方法的主要原理根據(jù)外周血不同類型細胞的密度不同，選用合適比重 的分離液將紅細胞從外周血細胞中分離出來獲得單組分，從而排除其他細胞 的影響。利用添加了蛋白酶抑制劑的低滲溶液溶脹紅細胞獲得細胞膜組分，再 通過溫和的膜蛋白裂解液以及冰浴渦旋攪拌的方式，將膜蛋白成分提取出來。
本發(fā)明是在經(jīng)過實驗摸索優(yōu)化實驗條件和流程，建立了牙鲆紅細胞外膜蛋 白的制備技術(shù)，技術(shù)方案如下
(1) 用5 mL —次性無菌注射器分別從4條體K 20 cm左右的實驗牙鲆的尾 靜脈取血，采用阿氏抗凝劑與牙鲆外周血1:1 1.5混合。收集抗凝血冰盒中暫 存。
(2) 利用比重為1.08 1.09的淋巴細胞分離液分離牙鲆外周血中的紅細胞。 將抗凝血用O. 1 M PBS緩沖液1:1稀釋，與淋巴細胞分離液按l: 2比例混合，于 4"C條件K3000 rpm水平離心15 min。離心后外周血細胞分為4層，小心吸走上 層的分離液、白細胞和血漿，將底層的紅細胞沉淀用O. 1 M PBS緩沖液4'C離心 洗滌3次，去除上清液。
(3) 向紅細胞沉淀中加入20倍體積的低滲緩沖液，置于4。C條件下30 min， 使紅細胞充分溶脹破膜。4。C條件下，12000 rpm離心15 min收集牙鲆紅細胞膜 沉淀。
(4) 向紅細胞膜沉淀中加入10 15 mL低滲緩沖液，用漩渦混合器將紅細胞 膜沉淀打散，4'C條件下12000 rpm， 15 min離心，得到經(jīng)洗滌的紅細胞膜沉淀。 重復(fù)上述洗滌步驟2 4次。
(5) 向牙鲆紅細胞膜沉淀中加入2 3倍體積的膜蛋白裂解液，磁力攪拌過 夜，以充分裂解牙鲆紅細胞膜。裂解過程于冰浴中進行。(6)裂解后所得溶液于4"下，12000 rpm離心30 min，上清液即為牙鲆紅 細胞膜蛋白提取液。分裝后于-8(TC冰箱中保存。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒 檢測牙鲆細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度。
本制備方法相比與現(xiàn)有文獻中描述的方法程序更為簡單，效率更好，既保 證了膜蛋閂制備的高效性，乂保持il莫蛋白的生物活性。


圖1.分離牙鲆紅細胞；利用1. 08-1. 09的淋巴細胞分離液分離外周血細胞 中的紅細胞，從上到下分別為分離液、淋巴細胞層、血漿層、紅細胞層。
圖2.牙鲆紅細胞外膜蛋白電泳；利用SDS-PAGE電泳分析制備的牙鲆紅細 胞外膜蛋白組分。
圖3.根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒操作手冊和實驗中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可 以計算牙鲆紅細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度。
具體實施例方式
具體實施中使用的專用液配方
(1) 低滲緩沖液
5 mM PBS緩沖液(pH 7. 8) ， 0. 5 mM EDTA ， 1 u g/mL抑肽酶(Aprotinin)。
(2) 膜蛋白裂解液
50 mM Tris-HC1 (pH 7.8)， 150 raM NaCl， 1% Triton X-100， 0.1% SDS， 1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)， 1 yg/mL Aprotinin, 1% NP 40， 0. 5%去氧膽酸 鈉，5 mM PBS， 0. 5 mM EDTA， 0.85%生理鹽水。
(3) 阿氏抗凝劑液
葡萄糖 2.05 g 檸檬酸鈉 0.8 g 檸檬酸 0.055 g 氯化鈉 0.42 g加蒸餾水至100 mL，加熱溶解后將pH值調(diào)到6. 1，經(jīng)8磅(115。C)， 15分鐘的高壓滅菌后分裝。 實施例l
具體操作步驟為
(1) 用5 mL —次性無菌注射器分別從4條體長20 cm左右的實驗牙鲆的尾 靜脈取血，采用阿氏抗凝劑與牙軤外周血l:l混合。收集抗凝血冰盒中暫存。
(2) 利用比重為l. 08 1. 09的淋巴細胞分離液分離牙鲆外周血中的紅細胞。 將抗凝血用O. 1 M PBS緩沖液1:1稀釋，與淋巴細胞分離液按l: 2比例混合，于
64。C條件下3000 rpm水平離心15 min。離心后外周血細胞分為4層，小心吸走上 層的分離液、白細胞和血漿，將底層的紅細胞沉淀用O. 1 M PBS緩沖液4。C離心 洗滌3次，去除上清液。
(3) 向紅細胞沉淀中加入20倍體積的低滲緩沖液，置于4"C條件下30 min， 使紅細胞充分溶脹破膜。4'C條件下，12000 rpm離心15 min收集牙鲆紅細胞膜 沉淀。
(4) 向紅細胞膜沉淀中加入IO mL低滲緩沖液，用漩渦混合器將紅細胞膜沉 淀打散，4'C條件下12000 rpm， 15 min離心得到經(jīng)洗滌的紅細胞膜沉淀，重復(fù) 這一洗滌3次。
(5) 向牙鲆紅細胞膜沉淀中加入2倍體積的膜蛋白裂解液，磁力攪拌過夜， 以充分裂解牙鲆紅細胞膜。裂解過程于冰浴中進行。
(6) 裂解后所得溶液于4。C下，12000 rpm離心30 min，上清即為牙鲆紅細 胞膜蛋白提取液。分裝后于-8(TC冰箱中保存。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢 測牙鲆細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度。
樣品(體積吸收值(A62。)吸收值(A艦)
00. 1080. 055
10. 1120. 064
20. 1170. 075
陽性對照樣品40.1280. 105
80. 1470. 123
120. 1670. 154
160. 1890. 187
200. 2160. 228
膜蛋白提取液200.2190. 225
根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒操作手冊和實驗中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算牙 鲆紅細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度50.23 Pg/uL。 實施例2
具體操作步驟為(1) 用5 mL —次性無菌注射器分別從4條體長20 cm左右的實驗牙鲆的尾靜脈取血，采用阿氏抗凝劑與牙鲆外周血l: 1.5混合。收集抗凝血冰盒中暫存。
(2) 利用比重為l. 08 1. 09的淋巴細胞分離液分離牙鲆外周血中的紅細胞。將抗凝血用O. 1 M PBS緩沖液1:1稀釋，與淋巴細胞分離液按l: 2比例混合，于4。C條件下3000 rpm水平離心15 min。離心后外周血細胞分為4層，小心吸走h層的分離液、白細胞和血漿，將底層的紅細胞沉淀用O. 1 M PBS緩沖液4。C離心洗滌3次，去除上清液。
(3) 向紅細胞沉淀中加入20倍休積的低滲緩沖液，置于4。C條件下30 min，使紅細胞充分溶脹破膜。4。C下，12000 rpm離心15 min收集牙鲆紅細胞膜沉淀。
(4) 向紅細胞膜沉淀中加入15 mL低滲緩沖液，用漩渦混合器將紅細胞膜沉淀打散，4。C條件下12000 rpm， 15 min離心得紅細胞膜沉淀，再將紅細胞膜沉淀重復(fù)上述步驟洗滌2次，得到洗凈得紅細胞膜沉淀。
(5) 向牙鲆紅細胞膜沉淀中加入3倍體積的膜蛋白裂解液，磁力攪拌過夜，以充分裂解牙鲆紅細胞膜。裂解過程于冰浴中進行。
(6) 裂解后所得溶液于4'C下，12000 rpm離心30 min，上清即為牙鲆紅細胞膜蛋白提取液。分裝后于-8(TC冰箱中保存。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測牙鲆細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度為50. 23 u g/u L。
8
權(quán)利要求
1. 牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備方法，其特征在于操作步驟為(1)用5mL一次性無菌注射器分別從4條體長20cm左右的實驗牙鲆的尾靜脈取血，采用阿氏抗凝劑與牙鲆外周血1:1～1.5混合，收集抗凝血冰盒中暫存；(2)將抗凝血用0. 1M PBS緩沖液1:1稀釋，與比重為1.08～1.09的淋巴細胞分離液按12比例混合，于4℃條件下3000rpm水平離心15min；離心后外周血細胞分為4層，小心吸走上層的分離液、白細胞和血漿，將底層的紅細胞沉淀用0.1M PBS緩沖液4℃離心洗滌3次，去除上清液；(3)向紅細胞沉淀中加入20倍體積的低滲緩沖液，置于4℃條件下30min，使紅細胞充分溶脹破膜，4℃條件下，12000rpm離心15min收集牙鲆紅細胞膜沉淀；(4)向紅細胞膜沉淀中加入10～15mL低滲緩沖液，用漩渦混合器將紅細胞膜沉淀打散，4℃條件下12000rpm，15min離心，得到經(jīng)洗滌的紅細胞膜沉淀，重復(fù)上述洗滌步驟2～4次；(5)向牙鲆紅細胞膜沉淀中加入2～3倍體積的膜蛋白裂解液，磁力攪拌過夜，以充分裂解牙鲆紅細胞膜，裂解過程于冰浴中進行；(6)裂解后所得溶液于4℃下，12000rpm離心30min，上清即為牙鲆紅細胞膜蛋白提取液，分裝后于-80℃冰箱中保存，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測牙鲆細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備方法，其特征在于使用的專用液配方為(1) 低滲緩沖液5 mM pH 7. 8的PBS緩沖液，0. 5 mM EDTA ， 1 u g/mL抑肽酶；(2) 膜蛋白裂解液50 mM pH 7. 8的Tris-HC1, 150 mM NaCl， 1% Triton X-100， 0.1% SDS，lmM苯甲基磺酰氟，1 ug/mL Aprotinin， 1% NP 40， 0. 5%去氧膽酸鈉，5 mMPBS, 0. 5 mM EDTA， 0. 85%生理鹽水；(3) 阿氏抗凝劑液葡萄糖2.05 g，檸檬酸鈉0.8 g，檸檬酸0.055 g，氯化鈉0.42 g，加蒸餾水至100 mL，加熱溶解后將pH值調(diào)到6. 1，經(jīng)8磅(115。C)， 15分鐘的高壓滅菌后分裝。
3.根據(jù)權(quán)利要求l所述牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備方法，其特征在于操作步驟(4)中用低滲緩沖液重復(fù)洗滌步驟3次。
全文摘要
牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備方法。從牙鲆的尾靜脈取血，采用阿氏抗凝劑與牙鲆外周血混合；將其用PBS緩沖液稀釋并與分離液混合，于4℃條件離心，將底層的紅細胞沉淀用PBS緩沖液4℃離心洗滌以去除上清液。加入低滲緩沖液，置于4℃下使紅細胞充分溶脹破膜。4℃條件下離心收集牙鲆紅細胞膜沉淀。加入低滲緩沖液，用漩渦混合器將紅細胞膜沉淀打散，4℃條件下離心洗滌紅細胞膜沉淀。加入膜蛋白裂解液，攪拌以充分裂解牙鲆紅細胞膜，4℃下離心，上清即為牙鲆紅細胞膜蛋白提取液。分裝后于-80℃冰箱中保存。本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比更為簡單，效率更好，既保證了膜蛋白制備的高效性，又保持了膜蛋白的生物活性。
文檔編號C07K1/00GK101463071SQ20091001009
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者偉 張, 張振冬, 王淑芬, 鄒亞男 申請人:張振冬