專利名稱：沙眼衣原體的一種重組主要外膜蛋白及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及沙眼衣原體的一種重組主要外膜蛋白及其編碼基因與制備方法 和應(yīng)用，特別是涉及沙眼衣原體的一種重組主要外膜蛋白及其編碼基因與制備 方法及在疫苗制備和衣原體檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
沙眼衣原體(CWa歷jY^atrsc/ CT7 stis， Ct)有15個血清型，可引起人類多種 疾病，其中A C型是引起沙眼的主要病原體，D4型引起人的泌尿生殖道感染，在 男性表現(xiàn)為非淋菌性尿道炎、前列腺炎、直腸炎等；在女性表現(xiàn)為子宮頸炎、輸 卵管炎、異位妊娠和不孕等疾病，L1 L3型主要引起性病淋巴肉芽腫。研究表明， Ct感染引起的性傳播疾病(STD)不僅增加HIV感染的幾率(Kilmarx PH， Mock PA, Levine WC. Effect of CW柳j^/i3 z^rsc力湖atis coinfection on HIV shedding in genital tract secretions. Sex Transra Dis, 2001, 28:347-348),而且使宮 頸癌的發(fā)病率增力口(Smith JS, Mu膨N, Herrero R, et al. Evidence for trac力o鵬tisas a human papillomavirus cofactor in the etiology of invasive cervical cancer in Brazil and the Pilippines. J Infect Dis， 2002， 185: 324-3331.)。由于Ct感染病程隱匿，臨床表現(xiàn)輕或無癥狀，以致感染反復(fù)遷延造 成進行性、不可逆性病理變化以及耐藥性菌株的產(chǎn)生等，給衣原體感染的治療帶 來困難。因此，對Ct感染的快速準確診斷，具有十分重要的意義。
衣原體實驗室診斷主要有以下3種方法①衣原體分離與培養(yǎng)；②免疫學檢 測；③聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。在所有方法中，細胞培養(yǎng)是最特異的，但其敏感 性差異大；直接免疫熒光(DFA)和酶免疫測定法(EIA)對臨床標本作抗原檢測 是快速且特異性均較好的方法。DFA法，針對沙眼衣原體主要外膜蛋白或脂多糖 的單克隆抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合,單克隆抗體標有熒光素,在熒光顯微鏡下，陽性 者可見到亮蘋果綠的原體和始體。此法的缺點是在低感染率的人群中敏感性差， 易受實驗人員的主觀影響，優(yōu)點是快速，價廉,操作簡便，標本的貯存和運送方便，
標本中的沙眼衣原體不必是活的或是有感染性的。
預(yù)防Ct感染最有效的方法是疫苗，隨著分子生物學的發(fā)展，人們對Ct抗原的 結(jié)構(gòu)和功能有了深入的了解，Ct主要外膜蛋白(Major outer membrane protein, MOMP)是衣原體外膜復(fù)合物上的主要成分，占外膜蛋白總量的60%以上，為屬特 異性抗原，又是其最主要的保護性抗原。進一步研究發(fā)現(xiàn)Ct的MOMP能夠刺激機體 產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，以阻止或削弱衣原體的感染。用天然結(jié)構(gòu)的外膜復(fù)合 物(富含M0MP)制備疫苗可防止綿羊、豚鼠及小鼠患衣原體的感染。有人用M0MP-霍亂毒素-CpG佐劑聯(lián)合疫苗經(jīng)皮膚接種小鼠，不但能使生殖道粘膜產(chǎn)生特異性 IgG、 IgG抗體，且可生成分泌Y干擾素的Thl細胞，使細胞內(nèi)外的衣原體得到徹 底清除(Berry LJ, Hickey DK, Skelding KA， et al. Transcutaneous immunization with combined cholera toxin and CpG adjuvant protects against CW柳j^/is 孤riokr證genital tract infection. Infect Immun, 2002， 70: 4812-4916.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人對Ct M0MP保護性抗原進行了克隆表達，獲得了較高的產(chǎn)物 表達率。
本發(fā)明的目的是提供Ct的一種重組MOMP及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的Ct重組M0MP，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)， 或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添 加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2的蛋白質(zhì)由394個氨基酸殘基組成，在實際應(yīng)用中，優(yōu)選的是 序列表中序列2的蛋白質(zhì)。
Ct重組M0MP的編碼基因，是下列核苷酸序列之一
1) 序列表中序歹U1的DNA序列；
2) 與序列表中序列l(wèi)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋 白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列l(wèi)編碼Ct重組M0MP的基因由1185個核苷酸組成，其中自5'到 3'端第67位到1185位核苷酸為該基因的讀碼框。
含有序列1DNA序列的表達載體及細胞系均屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的第二個目的是提供Ct重組主要外膜蛋白的制備方法。 制備Ct重組MOMP，包括以下步驟
1) 擴增序列l(wèi)的基因；
2) 將目的片段與表達載體相連轉(zhuǎn)入大腸桿菌；
3) 篩選陽性克?。?br> 4) 誘導表達得到目的蛋白。
利用本發(fā)明提供的基因，可以得到較高的表達產(chǎn)物收獲率，每100ml培養(yǎng)液 可收獲重組蛋白15mg，該重組蛋白具有較好的抗原性和免疫原性。本發(fā)明另外的 目的是提供一種能夠有效預(yù)防衣原體引起STD的疫苗和檢測衣原體感染的試劑。
為實現(xiàn)這個目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案 一種預(yù)防衣原體感染的疫苗， 其活性成分是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的 氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2 的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
在實際應(yīng)用中，優(yōu)選的是以序列表中序列2的蛋白質(zhì)為活性成分的疫苗。為 了使疫苗的效果更好，所述疫苗中還可以加有佐劑。加入的佐劑可以是10號礦物 油佐劑或福氏佐劑。
本發(fā)明疫苗的免疫劑量一般為O. 5-lmg/kg體重。
用本發(fā)明Ct重組MOMP為活性成分的疫苗免疫的大耳白家兔產(chǎn)生了對Ct的特 異性抗體，說明其具有較好的免疫原性，市場應(yīng)用前景非常廣闊，下面結(jié)合具體 實施例對本發(fā)明做進一步說明。


附圖l Ct重組MOMP的誘導與純化
1:誘導前重組菌，2:誘導后重組菌，3:包涵體沉淀，4:超聲上清，5: 純化的包涵體，M:標準分子量蛋白Marker。 附圖2 Ct重組MOMP的抗原性鑒定 M:標準分子量蛋白Marker, 1: 1%BSA， 2:重組MOMP
具體實施例方式
實施例一、Ct M0MP的制備
1、 利用PCR方法對MOMP全DNA進行擴增，其引物是 1: 5， -CATGCCATGGTGCCTGTGGGGAATCCTGCT-3，； 2: 5， -ACGCGTCGACTTAGAAGCGGAATTGTGCAT-3'。
2、 將目的片段從T載體上切下，與經(jīng)相同酶切的pET32a(+)載體相連，轉(zhuǎn)入 表達型菌體BL21(DE3)中。
3、 挑取陽性菌落，菌液和培養(yǎng)液的比例為1:50，同時加入Amp (1:1000)， 37°C、 250rpm搖床培養(yǎng)4小時，至菌液006()()=0. 7 - 0. 9,加入IPTG至終濃度lmM， 繼續(xù)培養(yǎng)5小時，離心集菌。
4、 用含30%蔗糖，50mMTris-HC1， 1 mM EDTA pH8. 0的溶液重懸，冰浴30min， 離心集菌。
5、 用超聲緩沖液(50mM NaH2P04pH7. 8， 300mMNaCl)重懸菌體沉淀至適當 濃度，超聲破碎60分鐘，30秒間歇18秒，超聲次數(shù)40次，功率35%。
6、 10000rpm離心15分鐘，棄上清(需經(jīng)SDS-PAGE證實不含目的蛋白后再棄 掉)，沉淀即為包涵體。
7、 生理鹽水重懸沉淀，10000rpm離心15分鐘，.棄上清(需經(jīng)SDS-PAGE證實 不含目的蛋白后再棄掉)。
8、 生理鹽水重懸沉淀8000rpm離心15分鐘，棄上清(需經(jīng)SDS-PAGE證實不 含目的蛋白后再棄掉)。
9、 生理鹽水重懸沉淀，超聲破碎60分鐘，10000rpm離心15分鐘，棄上清(需 經(jīng)SDS-PAGE證實不含目的蛋白后再棄掉)。
10、 將沉淀用10% Triton x-100重懸，磁力攪拌器攪拌30min， 8000rpm離 心15分鐘，棄上清(需經(jīng)SDS-PAGE證實不含目的蛋白后再棄掉)。
11、 用含8M尿素的緩沖液(NaH2P04 0. 1M， Tris-HCl pH8. 0， 0. 01M) 溶 解沉淀。
12、 12000rprn離心15分鐘，上清即為含重組蛋白的緩沖液，置含6M尿素的 復(fù)性液(lOOmM Tris-HCl， 2 raM EDTA pH8. 0， 0. 2M鹽酸精氨酸，0. 004M氧化型谷 胱甘肽，0.002M還原型谷胱甘肽)中透析4小時以上。
13、 轉(zhuǎn)置含4M尿素的復(fù)性液中透析4小時以上。
14、 轉(zhuǎn)置含2M尿素的復(fù)性液中透析4小時以上。15、 轉(zhuǎn)置含1M尿素的復(fù)性液中透析4小時以上。
16、 轉(zhuǎn)置蒸餾水中中透析4小時以上。
17、 獲得復(fù)性的Ct重組MOMP。
實施例二、以本發(fā)明Ct重組MOMP為活性成分的疫苗對家兔的免疫評價 將實施例1所得的Ct重組MOMP稀釋至0.25mg/ml后用以作雙擴測定血清效 價。取血清檢測為陰性的大耳白家兔6只，隨機分成實驗組和對照組。大耳白家 兔,30日齡，雄性，體重相近約2kg/只，由本院實驗動物中心提供。實驗組用本 發(fā)明Ct重組MOMP免疫，將制備的Ct重組MOMP與福氏佐劑充分攪拌混勻，制成乳 膠溶液，腹部皮下多點注射家兔3只，每只注射2mg,間隔20d同樣劑量和部位 追加1針，30d時再追加l針，共追加2針，對照組大耳白家兔3只，僅注射福氏佐 劑，共免疫3次。比較實驗組及對照組大耳白家兔血清的效價。對照組的動物均 為陰性，實驗組的動物均為陽性，其效價可達1:16。說明本發(fā)明的Ct重組MOMP 可以在家兔體內(nèi)誘導產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。
實施例三、免疫印跡法檢測Ct重組MOMP抗原性
(一) 蛋白質(zhì)樣品經(jīng)純化的Ct重組MOMP。
(二) 電泳制備凝膠，進行SDS-PAGE電泳。
(三) 轉(zhuǎn)移
1、 電泳結(jié)束后將膠條切割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液(39 mM甘氨酸，48mM Tris堿，0.037% SDS， 20%甲醇)平衡，5minX3次。
2、 膜處理預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。
3、 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、4層濾紙、NC膜、凝膠、4層濾 紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步去除氣泡。接通 電源，230mA，轉(zhuǎn)移1.5h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免 疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中染色后，在50%甲醇中多次 脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果 作對比。
(四) 免疫反應(yīng)
1、 用0.01M PBS洗膜，5minX3次。
2、 加入包被液(5%脫脂奶)，平穩(wěn)搖動，室溫2h。
3、 棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5minX3次。
4、 加入一抗(沙眼衣原體免疫兔制備的多抗血清，用0.01M PBS按1:500稀 釋)，4'C放置過夜。陰性對照，以i。/。BSA取代一抗，其余歩驟與實驗組相同。
5、 棄一抗和P/。BSA，用O. 01M PBS分別洗膜，5minX4次。
6、 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(用0.01MPBS按1:5000稀釋)，平穩(wěn)搖 動，室溫2h。
7、 棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5minX4次。
8、 加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。 (五)結(jié)果
見附圖2，在約50KDa處有特異條帶出現(xiàn)，陰性對照沒有條帶出現(xiàn)，說明重組 M(MP具有很好的抗原性。
實施例四、利用本發(fā)明Ct重組MOMP制備的免疫兔血清間接免疫熒光法檢測衣 原體
1、 用提純的沙眼衣原體制備抗原片，甲醛固定15min，用濾紙吸干水分。
2、 用生理鹽水倍比稀釋抗Ct重組MOMP兔多抗血清，滴加抗體覆蓋抗原片。 將玻片置于濕盒內(nèi)，37'C保溫30min。生理鹽水和正常兔血清作陰性對照，用抗 衣原體單抗作陽性對照。
3、 取出玻片，置于玻片架上，用0.01M， pH7.4的PBS沖洗3-4次。
4、 用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴熒光標記的抗兔球蛋 白抗體。
5、 將玻片平放在濕盒內(nèi)，37'C保溫30min。
6、 重復(fù)操作3。
7、 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴伊文思蘭(Evans Blue)襯染。
8、 重復(fù)操作3。
9、 用濾紙吸去多余水分，滴加一滴蒸餾水，置熒光顯微鏡下觀察，判定結(jié)果。
10、 結(jié)果熒光顯微鏡下見發(fā)亮蘋果綠熒光的邊界清晰的亮點為衣原體。
序列表
<160>2
<210〉1
<211>1185
〈212〉畫
〈213〉沙眼衣原體(C/ Ja歷.K力'a trac/ o頂atis， Ct)
<400〉1
tcttgaaatcggtattagtgtttgccgctttgagttctgcttcctccttg60
caagctctgcctgtgggg犯tcctgctgaaccaagccttatgatcgacggaattctatgg120
g犯ggtttcggcgg卿tccttgcgatccttgcaccacttggtgtg3CgCtatC3gC3tg180
cgtatgggttactatggtgactttgttttcgaccgtgttttgc犯acagatgtgaataaa240
gaattccaaatgggtgccaagcctacaactgctacaggcaatgctgc3gctccatccact300
tgtacagc犯gagagaatcctgcttacggccgacatatgcgatgtttaca360
aatgctgcttacatggcattgaatatttgggatcgttttgatgtattctgtacattagga420
gccaccagtgaggaaattcagcatctttcaacttagttggcttattcgga■
accatgctacagtttcagattaccaaatatgagcttagaX540
caatctgttgttgagttgtatacagstactacttttgcttgg兆tgctggagctcgtgca600
gctttgtggg犯tgtggstgcgcgactttaggcgcttctttcc犯tacgctc犯tccaag660
cctaaagtcgcgttctctgtaacgcagctgagtttactatcaataagcct720
tagggca卿attccctcttgatcttaaagcaggaacagatggtgtgaca780
gg咖t卿gatgcctctattgattaccatg組ggcaagcaagtttagctctctcttac840
agactgaatatgttceictccctacattggagttaaatggtctcg3gca^gttttgatgca900
gacacgattcgtattgctcagccgaagtcagctacaactgtctttgatgttaccactctg960
aacccaactaUgctggagctggcgatgtgaaa_gcta_gcgcagagggtcagctcggageit1020
accatgcaaatcgtttccttgc犯ttg犯caagatg'3犯tttgCggt3tt1080
gC8gt3gg犯caactattgtggatgcagacgactcgcttg1140
atcgatgagagagctgctcacgtaaatgcacaattccgcttctaa1185
<210〉2
<211〉394
〈212〉PRT
〈213〉沙眼衣原體(C/^a/nyA'a trac/w/mg"'s，
〈400〉2
Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Val Leu Val Phe
1 5 10
Ser Ala Ser Ser Leu Gin Ala Leu Pro Val Gly
20 25 Pro Ser Leu Met lie Asp Gly lie Leu Trp Glu
35 40 Asp Pro Cys Asp Pro Cys Thr Thr Trp Cys Asp
50 55 Arg Met Gly Tyr Tyr Gly Asp Phe Val Phe Asp
65 70 Thr Asp Val Asn Lys Glu Phe Gin Met Gly Ala
80 85 Ala Thr Gly Asn Ala Ala Ala Pro Ser Thr Cys
95 100 Asn Pro Ala Tyr Gly Arg His Met Gin Asp Ala
110 115 Asn Ala Ala Tyr Met Ala Leu Asn lie Trp Asp
125 130 Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Leu
140 145 Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe Gly Asp
155 160 Ala Thr Val Ser Asp Ser Lys Leu Val Pro Asn
170 175 Gin Ser Val Val Glu I>eu Tyr Thr Asp Thr Thr
185 190 Ala Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Cys Gly
200 205 Gly Ala Ser Phe Gin Tyr Ala Gin Ser Lys Pro
215 220 Leu Asn Val Leu Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr
230 235 Lys Gly Tyr Val Gly Gin Glu Phe Pro Leu Asp 245 250
Ct)
Ala Ala Leu Ser 15
Asn Pro Ala Glu 30
Gly Phe Gly Gly 45
Ala lie Ser Met 60
Arg Val Leu Gin 75
Lys Pro Thr Thr 90
Thr Ala Arg Glu 105
Glu Met Phe Thr 120
Arg Phe Asp Val 135
Lys Gly Asn Ser 150
Asn Glu Asn His 165
Met Ser Leu Asp 180
Phe Ala Trp Ser 195
Cys Ala Thr Leu 210
Lys Val Glu Glu 225
lie Asn Lys Pro 240
Leu Lys Ala Gly 255
Thr Asp Glu Trp Thr Pro Asp Thr Asp Val Lys Ala Ser Leu Ala Val Val Glu Gin Phe
Gly Gin Tyr lie Thr Ser Gin Gly Thr Arg
Val
Ala
lie
Arg
Thr
Ala
Leu
Thr
Arg
Phe 394
Thr Gly 260
Ser Leu 275
Gly Val 2恥
lie Ala 305
Leu Asn 320
Glu Gly 335
Asn Lys 350
Thr lie 365
Leu lie 380
Thr Ala Lys Gin Pro Gin Met Val Asp
Lys Leu Trp Pro Thr Leu Lys Asp Glu
Asp
Ser
Ser
Lys
lie
Gly
Ser
Ala
Arg
Ala Ser 265
Tyr Arg 280
Arg Ala 295
Ser Ala 310
Ala Gly 325
Asp Thr 340
Arg Lys 355
Asp Lys 370
Ala Ala 385
lie Asp Leu Asn Ser Phe Thr Thr Ala Gly Met Gin Ser Cys Tyr Ala His Val
Tyr
Met
Asp
Val
Asp
lie
Gly
Val
Asn
His 270 Phe 285 Ala 300 Phe 315 Val 330 Val 345 lie 360 Thr 375 Ala 390
權(quán)利要求
1、沙眼衣原體的一種重組主要外膜蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的 蛋白質(zhì)。
3、 沙眼衣原體一種重組主要外膜蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1) 序列表中序列1的DNA序列；2) 與序列表中序歹iJl限定的DNA序列具有9(n以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述沙眼衣原體重組主要外膜蛋白的編碼基 因是序列表中序列1的DNA序列。
5、 含有權(quán)利要求3所述基因的表達載體。
6、 含有權(quán)利要求3所述基因的細胞系。
7、 沙眼衣原體一種重組主要外膜蛋白的制備方法，包括以下歩驟1) 擴增序列l(wèi)的基因；2) 將目的片段與表達載體相連轉(zhuǎn)入大腸桿菌；3) 篩選陽性克??；4) 誘導表達得到目的蛋白。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于；擴增序列1基因所用的引物是1:5' -CATGCCATGGTGCCTGTGGGGAATCCTGCT-3' ;2:5' -ACGCGTCGACTTAGAAGCGGAATTGTGCA T-3';誘導表達得到沙眼衣原體重組主要外膜蛋白的具體步驟是將目的片段從T載體 上切下，與經(jīng)相同酶切的pET32a(+)載體相連，轉(zhuǎn)入表達型菌體BL21(DE3)，挑取陽 性培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導表達得到目的蛋白。
9、 一種預(yù)防沙眼衣原體感染的疫苗，其活性成分是權(quán)利要求l所述的重組主要外膜蛋白 保護性抗原。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于其活性成分是權(quán)利要求2所述的重組主要 外膜蛋白保護性抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開了沙眼衣原體的一種重組主要外膜蛋白及其編碼基因與制備方法。本發(fā)明所提供的沙眼衣原體重組主要外膜蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。沙眼衣原體重組主要外膜蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的抗原具有非常好的免疫原性，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。
文檔編號A61K39/118GK101113167SQ20071012979
公開日2008年1月30日 申請日期2007年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日
發(fā)明者君 何, 劉光橋, 宋立華, 左庭婷, 虹 朱, 華 檀, 青 端 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所