專利名稱：產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。尤其是，本發(fā)明重點(diǎn)在于表達(dá)載體和這些載體用于動(dòng)物的給藥方法。
政府支持此處敘述的工作至少部分是由國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutesof Health)資助(P01 AI43045，P01 AI49364，和R21 AI44325)支持的。因此，美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明具有特定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
疫苗對(duì)世界健康衛(wèi)生具有深刻而持久的影響。天花已經(jīng)根除，脊髓灰質(zhì)炎接近消除，而諸如白喉，麻疹，腮腺炎，百日咳，和破傷風(fēng)等疾病依然存在。盡管如此，當(dāng)前疫苗解決的只是人和家養(yǎng)動(dòng)物遭受的少數(shù)感染。沒有疫苗的常見感染性疾病每年就要耗費(fèi)美國(guó)約1千2百億美元(Robinson等，美國(guó)微生物學(xué)會(huì)(American Academy ofMicrobiology)，1996年5月31日-6月2日)。在第一世界國(guó)家，諸如免疫缺陷性病毒等正在出現(xiàn)的傳染病，以及例如耐藥性肺結(jié)核等再度出現(xiàn)的疾病對(duì)疫苗開發(fā)造成了新的威脅和挑戰(zhàn)。在經(jīng)常得不到有效疫苗或者受到價(jià)格過高限制的第三世界國(guó)家，對(duì)新和改進(jìn)疫苗的需要更為明顯。
HIV-1感染的傳播使得這一新近出現(xiàn)病原體的疫苗開發(fā)成為世界健康衛(wèi)生的主要優(yōu)先頂目。DNA疫苗的預(yù)臨床試驗(yàn)顯示單獨(dú)DNA在黑猩猩體內(nèi)能夠預(yù)防高度減毒HIV-1的攻擊(Boyer等，NatureMed.3526-532，1997)，然而在獼猴體內(nèi)不抗毒力更強(qiáng)的SIV的攻擊(Lu等，Vaccine 15920-923，1997)。DNA激活和衣殼糖蛋白加強(qiáng)免疫相結(jié)合已經(jīng)提高了抗SIV和HIV非致病嵌合體同源攻擊的中和抗體相關(guān)的防護(hù)(Letvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA949378-9383，1997)。測(cè)試了八個(gè)不同方案對(duì)一系列SHIVs(猿和人類免疫缺陷性病毒嵌合體)攻擊的防護(hù)能力的對(duì)比試驗(yàn)顯示抑制攻擊感染的最好免疫方案包括通過皮內(nèi)接種DNA進(jìn)行激活并使用重組禽痘病毒載體組合物進(jìn)行加強(qiáng)免疫(Robinson等，Nature Med.5526，1999)。攻擊性感染的抑制不依賴于攻擊病毒中和抗體存在。盡管這些和許多其它努力，用于包括HIV感染的疫苗仍然是不能市售獲得。
發(fā)明概述AIDS流行的持續(xù)強(qiáng)度顯示了對(duì)抗人類免疫缺陷性病毒(HIV)有效疫苗的迫切需要，HIV頻繁地突變并以一些不同分化體(或者亞型)和重組體的形式存在?？赡茏匀换蛘咭?yàn)槿藶楦深A(yù)而出現(xiàn)的這些亞型和重組體形式可以通過它們核酸序列的差異而加以區(qū)別。我們已經(jīng)開發(fā)出了DNA載體，病毒載體和重組病毒，例如重組修飾的牛痘Ankara(MVA)病毒(如后所述)，它們能單獨(dú)或者以組合形式用作抗HIV分化體，亞型，或者重組體形式HIV或者抗多重HIV分化體，亞型，或者重組體形式(除非另作說明，術(shù)語“分化體”是指包括亞型或者重組體形式HIV)的疫苗。此外，該載體能夠編碼各種抗原，這些抗原可以是獲自一種分化體或者兩種或多種不同分化體，并且可以通過操縱抗原的選擇和/或載體制備方式(例如混合)來產(chǎn)生抗各種分化體(例如患者很可能接觸的分化體)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
目前還存在對(duì)抗諸如引起天花的天花病毒等痘病毒有效疫苗的需要；當(dāng)前的天花疫苗具有產(chǎn)生大量不良副作用的小危險(xiǎn)。盡管天花已經(jīng)根除，天花作為生物武器仍然威脅著人類。此處敘述的病毒載體可用于產(chǎn)生抗痘病毒的免疫應(yīng)答。因此，施用這些載體的方法(不考慮遵循的確切方案)還可以引發(fā)對(duì)抗諸如天花等病癥賦予保護(hù)性或者治療性效應(yīng)的免疫應(yīng)答(即，可以在受試者已經(jīng)接觸導(dǎo)致諸如天花等病毒性疾病的病原體之前或者之后(例如1-4天或更多天后)施用痘病毒載體)。這些方法是有效的，而不考慮這些載體是否含有疫苗插入片段或者這些插入片段編碼何種蛋白(例如，獲自HIV的蛋白或者引發(fā)抗一種或多種HIV分化體免疫應(yīng)答的蛋白)。
本發(fā)明提供了可用于將核酸遞送到細(xì)胞的質(zhì)粒載體和病毒載體；同時(shí)本發(fā)明包括不含有疫苗“插入片段”的載體，當(dāng)免疫或者治療患者時(shí)，該載體將包括蛋白抗原的編碼核酸，所述蛋白抗原可以誘導(dǎo)或者增強(qiáng)抗病原體(例如一種或多種HIV分化體(或者亞型或者重組體形式))的免疫應(yīng)答。此處敘述的核酸或者多核苷酸具有來源于cDNA(或者mRNA)或者基因組DNA，及其衍生物(能夠與諸如核糖或者脫氧核糖等戊糖連接的嘧啶或者嘌呤環(huán))的線性排列的天然存在和/或合成的核苷酸(或者核苷)。核酸序列可以或者可以不與天然存在的序列相同(例如該序列可以編碼突變體形式的HIV蛋白以使得疫苗更安全)。下面討論可通過本發(fā)明描述載體表達(dá)的具有特定特性和特定序列的蛋白。
質(zhì)?；蛘卟《据d體可以包括代表存在于一種或多種HIV分化體或者其片段及其衍生物中的一種或多種基因的核酸，當(dāng)它表達(dá)時(shí)，引發(fā)抗該核酸所衍生自或者獲自的病毒(或者病毒分化體)的免疫應(yīng)答。該核酸可以純化自HIV，或者它們可以是先前克隆，亞克隆，或者合成的，而它們無論如何可以與天然存在的核酸序列相同或者不同。本發(fā)明的質(zhì)粒載體可以是此處所述的表達(dá)載體，表達(dá)構(gòu)建體，質(zhì)粒載體等或者簡(jiǎn)單地說，質(zhì)粒，而不考慮它們是否包括疫苗插入片段(即，編碼抗原或者免疫原的核酸序列)。也存在類似變化的術(shù)語“病毒載體”(例如，我們所指的“病毒載體”為“痘病毒載體”，“牛痘載體”，“修飾的牛痘Ankara載體”，或者“MVA載體”)。這些病毒載體可以包含或者可以不包含疫苗插入片段。
此處敘述的的DNA分子和病毒載體可用于產(chǎn)生重組病毒，該重組病毒能與質(zhì)粒載體結(jié)合使用預(yù)防性地或者治療性地免疫患者。
因此，在一方面，本發(fā)明的要點(diǎn)在于包括但是不局限于載體的組合物(包含藥學(xué)上或者生理學(xué)容許的組合物)，該載體可以是具有疫苗插入片段的質(zhì)?；蛘卟《据d體。該插入片段可以包含此處敘述序列的一種或多種(該插入片段和代表性序列的特征于后面詳細(xì)地?cái)⑹?；任何這些序列或者其組合能被作為插入片段使用)。當(dāng)該插入片段表達(dá)時(shí)，表達(dá)的蛋白(多種蛋白)可能產(chǎn)生抗一種或多種HIV分化體的免疫應(yīng)答。通過在單一載體(多載體疫苗也是有用的，將在下面作進(jìn)一步敘述)的插入片段中包含一種以上分化體在，可以提高免疫應(yīng)答可有效抗一種以上分化體的可能性。例如，為了提高產(chǎn)生抗分化體B和分化體C免疫應(yīng)答的可能性，可以對(duì)給受試者施用包含編碼分化體B和分化體C蛋白插入片段的載體。受試者可以是生活在HIV分化體B和C流行地區(qū)或者在其間旅行的人。當(dāng)然，單一分化體的一種或多種蛋白的表達(dá)也是有益的，并且這樣的載體也在本發(fā)明范圍內(nèi)(此外，可以使用任何具有此處敘述典型插入片段特征或者序列的插入片段，而該插入片段本身是本發(fā)明的特征)。
在另一方面，本發(fā)明特征在于包括但是不局限于兩種載體的組合物(包括藥學(xué)或者生理學(xué)容許的組合物)第一種載體(即包含疫苗插入片段的載體)編碼引發(fā)(例如誘導(dǎo)或者增強(qiáng))抗HIV第一種分化體免疫應(yīng)答的一種或多種抗原，而第二種載體編碼引發(fā)(例如誘導(dǎo)或者增強(qiáng))抗HIV第二種分化體免疫應(yīng)答的一種或多種抗原。然而，該組合物可以包括多于第一和第二種載體的載體；它們可以包括3，4，5，6或更多種不同載體(“不同載體”所指的載體包括不同調(diào)控元件(例如不同啟動(dòng)子)，或者編碼不同抗原或者抗原組合，或者在其他方面改變的載體(例如“骨架”序列不同的載體)。在一些實(shí)施方案中，該組合物可以包括引發(fā)抗2，3，4種，或者大多數(shù)若非全部HIV分化體的免疫應(yīng)答所要求的那些載體。雖然一種載體可以編碼一種抗原(例如Gag-Pol)，但是一種或多種載體(即，第一種載體，第二種載體，或者二者；第一種，第二種，第三種或者所有3種載體；等等)可以包括編碼至少3種抗原的核酸(例如Gag-Pol和Env)，其中每種抗原可以引發(fā)主要抗相同HIV分化體的免疫應(yīng)答(即第一種載體可以表達(dá)3種抗原，其中每種抗原產(chǎn)生主要抗分化體A的應(yīng)答，并且第二種載體可以表達(dá)3種抗原，其中每種抗原產(chǎn)生主要抗分化體B的應(yīng)答)。在其它實(shí)施方案中，一種或者多種載體可以引發(fā)抗一種以上HIV分化體的免疫應(yīng)答(即，第一種載體可以表達(dá)產(chǎn)生抗分化體A應(yīng)答的第一種抗原(例如Gag-Pol)而第二種載體可以表達(dá)產(chǎn)生抗分化體B應(yīng)答的第二種抗原(例如Env))。因此，一種或多種載體可以引發(fā)抗一種以上HIV分化體的免疫應(yīng)答。此處敘述的任何類型載體，無論它們是質(zhì)?；蛘卟《据d體，或者無論它們是否分別編碼引發(fā)主要抗一種，或多于一種HIV分化體的抗原，根據(jù)希望對(duì)其產(chǎn)生免疫力的特定HIV分化體，可以單獨(dú)或者彼此結(jié)合使用。
疫苗插入片段本身(即，用作抗原或者免疫原的HIV蛋白的編碼序列)也在本發(fā)明范圍內(nèi)。雖然在下面詳細(xì)地?cái)⑹鲞@些插入片段，我們這里應(yīng)注意本發(fā)明特征在于代表修飾的HIV基因組的各種分離的核酸(例如以某些方式重組或者突變的基因組或者一種或多種HIV基因的重組體形式或者片段)。例如，可以從一種或多種基因刪除一種或多種核酸或者用其它核酸替換(即該序列可以是一種或多種基因片段并可以包括點(diǎn)突變)。更具體地說，本發(fā)明特征在于代表具有安全突變的HIV基因組的分離的核酸(例如，LTRs和編碼整合酶(IN)，Vif，Vpr和Nef序列的缺失)。該核酸可以編碼Gag，PR，RT，Env，Tat，Rev，和Vpu蛋白，其中一種或多種可能包含安全突變(在下面詳細(xì)地?cái)⑹鎏囟ǖ耐蛔?。此外，分離的核酸可以是任何HIV分化體并且來自不同分化體的核酸可以組合使用(敘述如下)。在此處敘述的工作中，分化體B插入片段被表示為JS(例如JS2，JS7，和JS7.1)，分化體AG插入片段被表示為IC(例如IC2，IC25，IC48，和IC90)，而分化體C插入片段被表示為IN(例如IN2和IN3)。這些插入片段以及包含它們的載體(無論質(zhì)?；蛘卟《?都在本發(fā)明范圍之內(nèi)(在下面涉及特定的載體/插入片段組合，例如pGAI/JS2，pGA2/JS2等等)。
攜帶DNA的表達(dá)載體必定受限，因?yàn)樗鼈冎荒苡肈NA編碼產(chǎn)物(即蛋白)來免疫患者，并且細(xì)菌和寄生蟲的蛋白也可被真核生物細(xì)胞進(jìn)行非典型加工?，F(xiàn)有DNA疫苗的另一問題是一些疫苗插入片段序列在細(xì)菌中DNA疫苗質(zhì)粒生長(zhǎng)和擴(kuò)增期間是不穩(wěn)定的。不穩(wěn)定性可以出現(xiàn)在質(zhì)粒生長(zhǎng)期間，其中疫苗插入片段或者質(zhì)粒載體的二級(jí)結(jié)構(gòu)(“骨架”)可能被細(xì)菌內(nèi)切酶改變。本發(fā)明的表達(dá)載體可以包含提高穩(wěn)定性的終止序列。該終止序列及其它調(diào)節(jié)組分(例如，啟動(dòng)子和加Poly(A)序列)在下面詳細(xì)敘述。
本發(fā)明的組合物可以施用于人包括兒童。因此，本發(fā)明特征在于通過施用一種或多種載體(例如一種或多種質(zhì)粒，其可以或者可以不必具有相同的序列，組分，或者插入片段(即能夠編碼抗原的序列)和/或一種或多種病毒載體，其可以或者可以不必相同或者表達(dá)相同的抗原)免疫患者(或者引發(fā)患者免疫應(yīng)答，包括多抗原決定簇CD8+T細(xì)胞應(yīng)答)的方法。如上所述，這些載體，無論是質(zhì)?；蛘卟《据d體，可以包含一種或多種獲自或者衍生自(例如，突變序列是衍生序列)一種或多種HIV分化體的核酸。當(dāng)這些序列表達(dá)時(shí)，它們產(chǎn)生引發(fā)對(duì)一種或多種HIV分化體免疫應(yīng)答的一種抗原或者多種抗原。在特定的實(shí)施方案中，患者接受第一種和第二種載體。第一種載體可以編碼第一種HIV分化體的一種或多種抗原(這些抗原可以引發(fā)(例如，誘導(dǎo)或者增強(qiáng))抗這種HIV分化體的免疫應(yīng)答)而第二種載體可以編碼第二種HIV分化體的一種或多種抗原(同樣，這些抗原可以引發(fā)(例如誘導(dǎo)或者增強(qiáng))抗第二種HIV分化體的免疫應(yīng)答)。在另一實(shí)施方案中，受試者可以接受編碼來自第三，第四，第五種等HIV分化體(及其突變型)、編碼一種或多種抗原的第三，第四，第五種等載體。此外，如其它實(shí)施方案所述，該抗原(多種抗原)可以來自任何HIV分化體(例如，分化體A-L的一種或者多種)或者任何HIV分離物。
當(dāng)組合物包含在它們的骨架，調(diào)控元件，或者(多個(gè))插入片段方面有區(qū)別的載體時(shí)，載體在該組合物中的比值和它們的給藥途徑可以不同。一種載體與另一種載體的比值可以相等或者大略相等(例如大略1∶1或者1∶1∶1等)?；蛘?，該比值可以是任何期望比例(例如1∶2，1∶3，1∶4...1∶10；1∶2∶1，1∶3∶1，1∶4∶1...1∶10∶1等)。因此，本發(fā)明特征在于包含各種載體的組合物，表達(dá)抗原載體的相對(duì)含量大略相等或者在期望比例。當(dāng)已制備預(yù)成型混合物時(shí)，當(dāng)然可以通過給予兩種或多種包含載體的組合物實(shí)現(xiàn)相同目的(例如，在相同時(shí)間(例如彼此相差在幾分鐘內(nèi))或者幾乎相同時(shí)間(例如連續(xù)幾天))。
質(zhì)粒載體可以單獨(dú)施用(即質(zhì)?？梢院推渌愋鸵呙缰苿┮黄鸹蛘邌为?dú)一次或者數(shù)次施用(例如施用或者不施用蛋白或者諸如病毒載體等其它類型載體))并且，任選地同佐劑一起或者與可選擇的加強(qiáng)免疫結(jié)合進(jìn)行(例如在此之前)(例如諸如重組修飾的牛痘Ankara(MVA)病毒等活的載體疫苗，該載體疫苗含有編碼抗原的DNA插入片段，所述抗原相同于或者不同于該免疫“激活”部分編碼的抗原)。例如病毒載體或者M(jìn)VA病毒可以包含至少一些所施用質(zhì)粒包含的序列作為接種方案“激活”部分(例如編碼一種或多種以及可能所有同樣的抗原的序列)。佐劑可以是“基因佐劑”(即通過DNA序列遞送的蛋白)。同樣地，如下所述，可以不施用基于質(zhì)粒(或者“DNA”)的疫苗，而通過施用活載體疫苗來免疫患者(或者引發(fā)免疫應(yīng)答，包含多抗原決定簇CD8+T細(xì)胞應(yīng)答在內(nèi))。因此，在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明特征在于只具有重組病毒或者病毒載體的組合物(選擇性地含有一種或多種此處敘述的插入片段，或者具有它們特征的插入片段)以及它們的施用方法?；诓《镜寞煼?例如“只有MVA”或者“MVA-MVA”疫苗方案)與此處敘述的“DNA-MVA”方案相同，并且任何疫苗中的MVAs可以是任一期望的比例。例如，在任何情況下(無論免疫方案只使用基于質(zhì)粒的免疫原，只攜帶病毒的免疫原，或者兩者的結(jié)合)，可以包含佐劑以及通過施用大量載體而施用包含獲自任何HIV分化體的各種抗原。
術(shù)語“免疫”(及其變體)意味著可以將本發(fā)明的組合物施用給還沒有感染病原體的受試者(因此此處應(yīng)用的術(shù)語“受試者”或者“患者”包括顯然健康的或者非HIV感染個(gè)體)，但是本發(fā)明不限于此；還可以施用本發(fā)明描述的組合物來治療已接觸或者已知感染病原體(例如，任何HIV分化體，包含目前已知的A-L分化體及其突變型或者重組體形式)的受試者或者患者。
DNA和rMVA免疫的優(yōu)點(diǎn)是免疫原可以由MHC類別I和類別II分子呈遞。內(nèi)源合成的蛋白立即進(jìn)入加工途徑將肽抗原決定簇負(fù)載到MHC I和MHC II分子上。MHC I呈遞的抗原決定簇引發(fā)CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)應(yīng)答，而MHC II呈遞的抗原決定簇引發(fā)CD4輔助T細(xì)胞(Th)應(yīng)答。相反，并非細(xì)胞合成的免疫原主要局限于MHC II抗原決定簇的負(fù)載，因此引發(fā)CD4 Th而非CD8 Tc應(yīng)答。此外，DNA質(zhì)粒只在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)免疫抗原并可用于使免疫應(yīng)答只集中于期望免疫的抗原。相反，活病毒載體，例如重組MVA病毒能表達(dá)許多抗原(例如載體抗原以及免疫抗原)并且產(chǎn)生抗載體和免疫原的免疫應(yīng)答。因此，我們認(rèn)為這些活病毒載體可以由于其表達(dá)的大量抗原高效地加強(qiáng)DNA引發(fā)的應(yīng)答，優(yōu)選加強(qiáng)高度靶向DNA引發(fā)的免疫應(yīng)答。這些活病毒載體也刺激增加免疫應(yīng)答的促炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，施用此處敘述的一種或多種DNA載體(用作“激活”)和隨后施用一種或多種重組體MVA病毒(用作“加強(qiáng)”)，可以比單獨(dú)的DNA或者單獨(dú)的活病毒載體更有效地引發(fā)細(xì)胞和體液免疫。在通過DNA表達(dá)載體和/或重組病毒施用疫苗的范圍內(nèi)，需要在細(xì)菌宿主中穩(wěn)定并且在動(dòng)物中安全使用的質(zhì)粒。本發(fā)明公開了增加了穩(wěn)定性的基于質(zhì)粒的疫苗，并且公開了將它們施用給動(dòng)物包括人類的方法。
DNA或者rMVA編碼的抗原必定是蛋白的。術(shù)語“蛋白”，“多肽”，和“肽”可廣泛地互換，盡管術(shù)語“肽”通常是用來指氨基酸殘基的短序列或者較大蛋白的片段。無論如何，可以通過使用重組體技術(shù)表達(dá)天然來源純化或者合成的DNA(例如，本發(fā)明描述的疫苗插入片斷和擴(kuò)增)獲得通過肽鍵連接的氨基酸殘基連續(xù)系列。
基于DNA疫苗(和諸如基于痘病毒載體等病毒載體)的其它優(yōu)點(diǎn)敘述如下。在下面的附圖和說明中闡明了本發(fā)明一種或多種實(shí)施方案的詳細(xì)內(nèi)容。根據(jù)說明書和附圖和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征，目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。


附圖1是質(zhì)粒構(gòu)建體pGA1的示意圖。顯示了載體中存在的元件(例如啟動(dòng)子的特性和位置，這里是包含內(nèi)含子A的CMV啟動(dòng)子)，多克隆位點(diǎn)，終止序列(這里是λT0終止子)，和選擇基因(這里是卡那霉素抗性基因)。此外還顯示了用于將疫苗的插入片段克隆到質(zhì)粒的特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
附圖2a和2b涉及pGA1。附圖2a是pGA1(SEQ ID NO1)核苷酸的序列表，而附圖2b是pGA1功能區(qū)域，在SEQ ID NO1內(nèi)的位置，和該序列起點(diǎn)的列表。
附圖3a和3b涉及pGA1.1。附圖3a是pGA1.1(SEQ ID NO2)核苷酸的序列表，而附圖3b是pGA1.1功能區(qū)域，在SEQ ID NO2內(nèi)的位置，和該序列起點(diǎn)的列表。pGA1.1不同于pGA1，因?yàn)樗诙嗫寺∥稽c(diǎn)中含有EcoR I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
附圖4a和4b涉及pGA1.2。附圖4a是pGA1.2(SEQ ID NO3)核苷酸的序列表，而附圖4b是pGA1.2功能區(qū)域，在SEQ ID NO3內(nèi)的位置，和該序列起點(diǎn)的列表。pGA1.2不同于pGA1.1因?yàn)樗诙嗫寺∥稽c(diǎn)中含有BamH I限制性內(nèi)酶切位點(diǎn)。
附圖5是質(zhì)粒構(gòu)建體pGA2的示意圖。顯示了元件存在于載體中的特性和位置(例如啟動(dòng)子(這里CMV啟動(dòng)子不內(nèi)含子A)，多克隆位點(diǎn)，終止序列(這里是λT0終止子)，和選擇基因(這里是卡那霉素抗性基因)。此外還顯示了用于將疫苗的插入片段克隆到質(zhì)粒的特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
附圖6a和6b涉及pGA2。附圖6a是pGA2(SEQ ID NO4)核苷酸的序列表，而附圖6b是pGA2功能區(qū)域，在SEQ ID NO4內(nèi)的位置，和該序列起點(diǎn)的列表。
附圖7a和7b涉及pGA2.1。附圖7a是pGA2.1(SEQ ID NO5)核苷酸的序列表，而附圖7b是pGA2.1功能區(qū)域，在SEQ ID NO5內(nèi)的位置，和該序列起點(diǎn)的列表。pGA2.1不同于pGA2因?yàn)樗诙嗫寺∥稽c(diǎn)中含有EcoR I限制性內(nèi)酶切位點(diǎn)。
附圖8a和8b涉及pGA2.2。附圖8a是pGA2.2(SEQ ID NO6)核苷酸的序列表，而附圖8b是pGA2.2功能區(qū)域，在SEQ ID NO6內(nèi)的位置，和該序列起點(diǎn)的列表。PGA2.2不同于pGA2.1因?yàn)樗诙嗫寺∥稽c(diǎn)中含有BamH I限制性內(nèi)酶切位點(diǎn)。
附圖9是前病毒(整合DNA)形式的HIV基因組(HIV-1wt)和典型疫苗插入片段的示意圖。這些典型的插入片段具有安全性突變，包含LTRs的缺失，整合酶(IN)，Vif，Vpr和Nef編碼序列的缺失。該插入片段編碼Gag，PR，RT，Env，Tat，Rev和Vpu蛋白。分化體B插入片段表示為JS(分化體B)，IC(分化體AG)和IN(分化體C)用阿拉伯?dāng)?shù)字表示特異性疫苗構(gòu)建物(例如特異性分化體B疫苗構(gòu)建物的實(shí)例JS2，JS7和JS7.1；特異性分化體AG疫苗構(gòu)建物的實(shí)例IC2，IC25，IC48和IC90；和特異性分化體C疫苗構(gòu)建物的實(shí)例IN2和IN3)。當(dāng)被插入pGA1載體中時(shí)，帶有插入片段的質(zhì)粒被稱為pGA1/JS2等；當(dāng)被插入pGA2載體中時(shí)，質(zhì)粒被稱為pGA2/JS2等。
附圖10a到10c涉及pGA2/JS2。附圖10a是pGA2/JS2分化體B疫苗載體(SEQ ID NO7)的序列表，而附圖10b是pGA2/JS2質(zhì)粒7個(gè)功能區(qū)域的位置，這些區(qū)域內(nèi)的基因序列(描述存在突變的位點(diǎn))，和它們序列起點(diǎn)的列表。附圖10c是改變的密碼子，產(chǎn)生的氨基酸改變(例如C392S表示在第392位氨基酸殘基絲氨酸取代半胱氨酸)，突變存在的基因組區(qū)域，和突變功能的列表。
附圖11a到11c涉及pGA2/JS7。附圖11a是pGA2/JS7分化體B疫苗載體(SEQ ID NO8)的序列表，而附圖11b是pGA2/JS7質(zhì)粒7個(gè)功能區(qū)域的位置，這些區(qū)域內(nèi)的基因序列(描述存在突變的位點(diǎn))，和它們序列起點(diǎn)的列表。附圖11c是改變的密碼子，產(chǎn)生的氨基酸改變(例如C395S表示在第395位氨基酸殘基絲氨酸取代半胱氨酸)，突變存在的基因組區(qū)域，和突變功能的列表。
附圖12a到12c涉及pGA2/JS7.1。附圖12a是pGA2/JS7.1分化體B疫苗載體(SEQ ID NO9)的序列表，而附圖12b是pGA2/JS7.1功能區(qū)域的位置，這些區(qū)域內(nèi)的基因序列(描述存在突變的位點(diǎn))，和它們序列起點(diǎn)的列表。附圖12c是改變的密碼子，產(chǎn)生的氨基酸改變，突變存在的基因組區(qū)域，和突變功能的列表。
附圖13a到13c涉及pGA1/IC25。附圖13a是pGA1/IC25分化體AG疫苗載體(SEQ ID NO10)的序列表，而附圖13b是pGA1/IC25內(nèi)功能區(qū)域的位置，這些區(qū)域內(nèi)的基因序列(描述存在突變的位點(diǎn))，和它們序列起點(diǎn)的列表。附圖13c是改變的密碼子，產(chǎn)生的氨基酸改變，突變存在的基因組區(qū)域，和突變功能的列表。
附圖14a到14c涉及pGA1/IC2。附圖14a是pGA1/IC2分化體AG疫苗載體(SEQ ID NO11)的序列表，而附圖14b是pGA1/IC2內(nèi)功能區(qū)域的位置，這些區(qū)域內(nèi)的基因序列(描述存在突變的位點(diǎn))，和它們序列起點(diǎn)的列表。附圖14c是改變的密碼子，產(chǎn)生的氨基酸改變，突變存在的基因組區(qū)域，和突變功能的列表。
附圖15a到15c涉及pGA1/IC48。附圖15a是pGA1/IC48分化體AG疫苗載體(SEQ ID NO12)的序列表，而附圖15b是pGA1/IC48內(nèi)功能區(qū)域的位置，這些區(qū)域內(nèi)的基因序列(描述存在突變的位點(diǎn))，和它們序列起點(diǎn)的列表。附圖15c是改變的密碼子，產(chǎn)生的氨基酸改變，突變存在的基因組區(qū)域，和突變功能的列表。
附圖16a到16c涉及pGA1/IC90。附圖16a是pGA1/IC90分化體AG疫苗載體(SEQ ID NO13)的序列表，而附圖16b是pGA1/IC90內(nèi)功能區(qū)域的位置，這些區(qū)域內(nèi)的基因序列(描述存在突變的位點(diǎn))，和它們序列起點(diǎn)的列表。附圖16c是改變的密碼子，產(chǎn)生的氨基酸改變，突變存在的基因組區(qū)域，和突變功能的列表。
附圖17a到17c涉及pGA1/IN3。附圖17a是pGA1/IN3分化體C疫苗載體(SEQ ID NO14)的序列表，而附圖17b是pGA1/IN3內(nèi)功能區(qū)域的位置，這些區(qū)域內(nèi)的基因序列(描述存在突變的位點(diǎn))，和它們序列起點(diǎn)的列表。附圖17c是改變的密碼子，產(chǎn)生的氨基酸改變，突變存在的基因組區(qū)域，和突變功能的列表。
附圖18a到18c涉及pGA1/IN2。附圖18a是pGA1/IN2分化體C疫苗載體(SEQ ID NO15)的序列表，而附圖18b是pGA1/IN2內(nèi)功能區(qū)域的位置，這些區(qū)域內(nèi)的基因序列(描述存在突變的位點(diǎn))，和它們序列起點(diǎn)的列表。附圖18c是改變的密碼子，產(chǎn)生的氨基酸改變，突變存在的基因組區(qū)域，和突變功能的列表。
附圖19是HIV-1 Env糖蛋白的示意圖。箭頭表示gp160裂解成gp120和gp41的位點(diǎn)。在gp120中，斷面線區(qū)域代表可變區(qū)(V1到V2)而明框描繪了保守序列(C1到C5)。在gp41胞外結(jié)構(gòu)域，顯示了幾個(gè)結(jié)構(gòu)域N末端融合肽和2個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域螺旋(N-和C-螺旋)。跨膜結(jié)構(gòu)域用黑色框表示。在gp41細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，顯示了Tyr-X-X-Leu(YXXL)內(nèi)吞作用基元和2個(gè)推測(cè)的螺旋結(jié)構(gòu)域(螺旋-1和螺旋-2)。氨基酸殘基以每間隔100計(jì)數(shù)。
附圖20A和20B涉及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體pLW-48。附圖20A是pLW-48的圖。附圖20B展示了其序列。
附圖21是質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體pLW-48的序列，Psy II啟動(dòng)子(其控制ADA衣殼蛋白表達(dá))，ADA衣殼蛋白(截短的)，PmH5啟動(dòng)子(其控制HXB2 gag和pol的表達(dá))，和HXB2 gag-pol(具安全性突變，在RT中滅活的點(diǎn)突變和整合酶的缺失)的圖示。
附圖22是質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體pLW-48和制備MVA重組病毒(MVA/HIV48)方案的圖示。
附圖23是分化體B gag pol的圖示。
附圖24是Psyn II啟動(dòng)子的圖示。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括多個(gè)種類和類型的載體(例如質(zhì)粒和病毒載體)，其每個(gè)可以但是未必包含一種或多種編碼一種或多種抗原的核酸序列，這些抗原引發(fā)(例如誘導(dǎo)或者增強(qiáng))免疫應(yīng)答以抗抗原獲自或者衍生自的病原體(編碼引發(fā)免疫應(yīng)答蛋白的序列此處被稱為“疫苗插入片段”或者簡(jiǎn)單地被稱為“插入片段”；當(dāng)突變被引入天然存在的序列中時(shí)，產(chǎn)生突變體“衍生自”天然存在的序列)。我們指出所述載體未必編碼抗原以清楚表明不具“插入片段”的載體是在本發(fā)明范圍之內(nèi)，而插入片段本身也是本發(fā)明的組成部分。
因此，本發(fā)明特征在于此處公開的核酸序列及其類似物，和包含那些核酸的組合物(附加插入片段的載體或者單獨(dú)的插入片段；例如可能包含諸如脂質(zhì)體鈣，顆粒(例如金珠)等的載體，或者其它用于將DNA遞送到細(xì)胞的試劑的生理學(xué)溶液)。類似物可以不同于此處公開的序列，而是在該序列(例如此處公開的JS，IC，或者IN序列)內(nèi)類似位置包含相同或者類似的突變?？梢栽诓煌腍IV分化體中鑒定出給定殘基或者結(jié)構(gòu)域，盡管它不會(huì)出現(xiàn)在準(zhǔn)確相同的排列位置。類似物還可以是包含突變的序列，雖然所述序列不同于此處敘述那些的序列，它們同樣地使HIV基因產(chǎn)物失活。例如，比這里敘述的基因截短到更大或者更小程度但是同樣失活(例如，缺失特定的酶活)的基因也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
下文詳細(xì)敘述的病原體和抗原包括人類免疫缺陷性病毒的任何分化體(例如來自任何已知的分化體或者來自任一分離物(例如，分化體A，AG，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J，K或者L))。當(dāng)載體包括來自病原體的序列時(shí)，可以將它們施用給患者以引發(fā)免疫應(yīng)答。因此，此處也敘述了單獨(dú)或者彼此結(jié)合施用編碼抗原載體的方法。可以使用這種方法免疫患者(從而減小患者感染的危險(xiǎn))或者治療已經(jīng)感染的患者；當(dāng)表達(dá)時(shí)，抗原可能引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的和體液的免疫應(yīng)答從而基本上防止感染(例如，免疫可以防止病原體后來的攻擊)或者限制對(duì)患者健康影響的程度。雖然在許多實(shí)例中患者是人類患者，而本發(fā)明不作如此限定。還可以治療包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，家養(yǎng)動(dòng)物和家畜等其它動(dòng)物。
不管它們抗的病原體或者病原的亞型(例如HIV分化體(多種分化體))，此處敘述的組合物可以包括核酸載體(例如質(zhì)粒)。此處提及的命名為pGA1，pGA2的質(zhì)粒(當(dāng)然包括載體本身)一種或多種特征或者特性(尤其是正向終止序列和強(qiáng)啟動(dòng)子)的載體可被用作疫苗或者治療的基礎(chǔ)。可以使用標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)(部分在下面的實(shí)施例中有說明)通過基因工程操作向這些載體引入編碼抗原的序列，當(dāng)將它們施用給患者并隨后表達(dá)時(shí)可以引發(fā)(例如誘導(dǎo)或者增強(qiáng))免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答給患者提供一些形式的對(duì)抗原獲得或者衍生自病原體的保護(hù)(例如防止感染，防止疾病，或者改善疾病的一種或多種病征或者癥狀)。編碼的抗原可以是任何HIV分化體或者亞型及其任何重組體形式。至于來自免疫缺陷病毒的插入片段，不同分離物顯示出分化的多樣性，每一分離物具有分化體共有序列整體類似的多樣性(見例如Subbarao等，AIDS10(Suppl A)S13-23，1996)。因此，任何分離物可以合理代表其它相同分化體分離物序列。因此，可使用基因的天然變異體或者源于重組事件，旁路剪接，或者突變(這些變異體此處簡(jiǎn)單地稱為“重組體形式”的HIV)的核酸分子制造本發(fā)明的組合物和實(shí)施本發(fā)明敘述的方法。
此外，可以將任何構(gòu)建體內(nèi)的一種或多種插入片段突變(這些人造的變異體此處也被稱為“重組形式”的HIV(以及天然存在的重組體形式))以降低它們?cè)谌祟愔械奶烊簧锘钚?并且因此增加它們的安全性)。在JS2，JS7和JS7.1的說明中如上提到的以及如下所述(見例如實(shí)施例7-10)，可以將突變引入?yún)⑴c衣殼形成的序列中。例如可以突變(通過例如全部或者部分缺失)HIV非編碼調(diào)節(jié)序列中順式作用的RNA衣殼形成序列。另外，或者此外可以突變編碼任何抗原性蛋白的序列(例如，任何HIV抗原，包括上列的那些(例如，病毒RT或者蛋白酶))。
例如，本發(fā)明的組合物包括具有2個(gè)載體的那些組合物(a)第一種載體含有編碼一種或多種抗原的疫苗插入片段，這些抗原引發(fā)抗人類免疫缺陷性病毒(HIV)第一種亞型或者重組體形式的免疫應(yīng)答以及(b)第二種載體含有編碼一種或多種抗原的疫苗插入片段，這些抗原引發(fā)抗人類免疫缺陷性病毒(HIV)第二種亞型或者重組體形式的免疫應(yīng)答。該組合物可以是藥學(xué)上容許的并且可以包括載體或者佐劑(后面敘述)。此外，第一種載體的插入片段或者第二種載體的插入片段可以包括下述的兩種或多種序列(a)gag，pol，env，tat，rev，nef，vif，vpr，或者vpu基因或者(b)它們的突變型以及，選擇性地，(c)HIV基因組的非編碼調(diào)節(jié)序列(包括單個(gè)啟動(dòng)子的序列)。至少兩種或多種序列的一種可以是突變型或者突變以限制病毒RNA的衣殼形成(優(yōu)選地，(多個(gè))突變略微限制衣殼形成)。
可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)引入突變并且測(cè)定它們的影響(例如對(duì)表達(dá)或者免疫原性的影響)；那些保持良好表達(dá)(例如表達(dá)大約和野生型對(duì)應(yīng)物一樣或者超過野生型對(duì)應(yīng)物的抗原)，但是比它們野生型對(duì)應(yīng)物的生物學(xué)活性小的抗原，在本發(fā)明范圍內(nèi)。評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答的技術(shù)也是有用的。例如可以檢測(cè)抗病毒抗體或者病毒特異性T細(xì)胞。
突變型構(gòu)建體(例如，疫苗插入片段)可以包括編碼一種或多種此處敘述的取代突變的序列(見例如實(shí)施例)或者另一HIV分化體的類似突變。另外，或者可選擇地，HIV抗原可以通過刪除編碼序列的部分來產(chǎn)生更小的活性。因此，本發(fā)明的組合物可以包括編碼能夠引發(fā)免疫應(yīng)答抗原的構(gòu)建體，這些抗原是突變型(編碼與相應(yīng)野生型序列長(zhǎng)度或者內(nèi)容不同的蛋白)并且因此當(dāng)在患者體內(nèi)表達(dá)時(shí)較少能實(shí)現(xiàn)它們正常的生物學(xué)功能。如上所述，可以使用分子生物學(xué)和免疫學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來評(píng)價(jià)它們的表達(dá)，免疫原性和活性。
已經(jīng)構(gòu)建了一些質(zhì)粒并用于表達(dá)抗原(例如，pGA2/JS2構(gòu)建體已經(jīng)在獼猴中進(jìn)行免疫原性研究)。制備和使用的質(zhì)粒包括pGA1及其衍生物pGA1.1和pGA1.2；以及pGA2，及其衍生物pGA2.1和pGA2.2(見實(shí)施例1-8)。我們構(gòu)造的疫苗構(gòu)建體通常指的是用反斜線符號(hào)分開的“骨架”載體和“插入片段”。這些構(gòu)建體表達(dá)HIV-1抗原，而且這些構(gòu)建體可以如此處所述施用給患者。雖然在下面詳細(xì)討論到抗原(野生型和包含突變使它們可更安全給藥的那些抗原)，我們這里注意，基于我們給出的證據(jù)，包含JS7類插入片段的質(zhì)?？雌饋盹@示出更好的免疫原性并且比包含JS2類插入片段的質(zhì)粒對(duì)激活免疫應(yīng)答更有效(通過抗Env抗體證明)。pGA2/JS7以及pGA2/JS7.1在各個(gè)方面不同于pGA2/JS2，其中之一是它們相應(yīng)抗原的來源。在pGA2/JS7和pGA2/JS7.1中，Gag和Pol基因獲自HIV-1 HXB2，而在pGA2/JS2中那些基因獲自密切相關(guān)的HIV-1，HIV-1 BH10分離物。因此，本發(fā)明特征在于包括獲自HIV-1 HXB2的Gag和Pol基因的插入片段(以及包含它們的載體和組合物)。此外，這些插入片段可以包含抑制Gag-Pol執(zhí)行的一種或多種生物學(xué)活性的突變。命名為JS7和JS2的疫苗插入片段也不同因?yàn)镴S7在蛋白酶基因中具有失活點(diǎn)突變。我們認(rèn)為，這些突變通過阻止pr55 Gag蛋白早熟的細(xì)胞內(nèi)裂解促進(jìn)病毒類粒子(VLPs)的形成，pGA2/JS7和pGA2/JS7.1都包含蛋白酶突變并且兩個(gè)構(gòu)建體都產(chǎn)生大量的VLPs。因此，本發(fā)明特征在于包括突變型gag和/或pol序列的插入片段(例如，抑制蛋白酶基因的突變(例如，一種或多種缺失或者點(diǎn)突變))。pGA2/JS7.1中vpu基因的其它點(diǎn)突變導(dǎo)致Vpu表達(dá)的缺失和Env表達(dá)的增加(在pGA2/JS7.1中，Vpu起始位點(diǎn)和下游的ATG被突變以解除Vpu的翻譯)。Env表達(dá)的增加并不損害Gag表達(dá)。
在包括gag，pol的任何疫苗插入片段中；任何編碼病毒蛋白酶的疫苗插入片段中；或者任何包括vpu基因(不管它獲自的分化體或者分離物)的疫苗插入片段可以產(chǎn)生相同或者類似的改變。此外，可以在置入任何質(zhì)粒或者活載體疫苗(例如MVA)的疫苗插入片段中進(jìn)行這些改變(即任何具有pGA載體一種或多種特征或者特性的質(zhì)粒，pGA載體自身，或者可被單獨(dú)或者結(jié)合用作(例如增強(qiáng))DNA激活患者的疫苗載體)。
本發(fā)明范圍內(nèi)的任何質(zhì)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)染細(xì)胞諸如293T細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞系)來測(cè)試表達(dá)和(通過例如抗原俘獲ELISA或者Western印跡)來評(píng)價(jià)抗原表達(dá)水平。與此處測(cè)試質(zhì)粒相比表達(dá)免疫原的水平接近或者較高的質(zhì)粒是較好的治療候選物并且在本發(fā)明的范圍之內(nèi)(當(dāng)然，任何引發(fā)有效免疫應(yīng)答(例如，任何理想的防護(hù)感染程度或者其它治療的益處)的構(gòu)建體也在本發(fā)明范圍之內(nèi)，不管它產(chǎn)生抗原的表達(dá)水平)?？梢灶愃圃u(píng)價(jià)候選載體產(chǎn)生VLPs的能力；類似VLPs的載體產(chǎn)物越多，它們?cè)接锌赡芤l(fā)強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)(而這是理想的特征，沒能形成VLPs的載體仍然是有用的并且在本發(fā)明范圍之內(nèi))。除了評(píng)價(jià)細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)和VLP形成之外，可以評(píng)價(jià)體內(nèi)候選物載體。例如，可以評(píng)價(jià)動(dòng)物模型中(以及最后人類患者中)的免疫原性。那些具有和此處敘述的pGA載體基本上相同序列的質(zhì)粒和此處敘述的表達(dá)一種或多種抗原的質(zhì)粒在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要它們的免疫原性足以在患者中誘導(dǎo)或者增強(qiáng)治療上有利的應(yīng)答(質(zhì)?？梢跃哂信cpGA載體基本上相同序列，甚至是諸如標(biāo)志基因或者抗生素抗性基因等質(zhì)粒的一種或多種構(gòu)成部分已經(jīng)被刪除)。在免疫原性的動(dòng)物試驗(yàn)中，可以對(duì)響應(yīng)于抗原性肽刺激的IFN-γ產(chǎn)生進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子試驗(yàn)或者ELISPOT試驗(yàn)以評(píng)價(jià)T細(xì)胞應(yīng)答那些肽的頻率。還可以進(jìn)行增殖試驗(yàn)?？梢杂盟矔r(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的抗原進(jìn)行刺激，并且可以用模擬轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物的上清液作為對(duì)照。如果需要，該數(shù)據(jù)可以作為刺激指數(shù)(在病原體(例如病毒)抗原存在情況下培養(yǎng)物的生長(zhǎng)除以在模擬抗原存在情況下培養(yǎng)物的生長(zhǎng))。
本發(fā)明的核酸載體，包括pGA1和pGA2和它們的衍生物可以編碼至少獲自或者來源于任何HIV分化體或者分離物(即任何亞型或者重組體形式的HIV)的一種抗原(也可以稱為免疫原)?？乖?或免疫原)可以是HIV病毒的結(jié)構(gòu)成分；糖基化的，肉豆蔻酰基化的，或者磷酸化的；胞內(nèi)，細(xì)胞表面，或者分泌表達(dá)的(通常分泌的抗原可以是與控制分泌的信號(hào)序列連接)。更具體地說，抗原可以是Gag，gp120，Pol，Env(例如使用CCR5的Env；例見附圖19)，Tat，Rev，Vpu，Nef，Vif，Vpr，或者VLP(例如來源于VLP能夠形成VLP的多肽，包括缺失Env的HIV VLP)的全部或者抗原性部分。
特定的插入片段和帶有插入片段的組合物包括下列那些組合物。其中該組合物包括帶有插入片段的載體或者插入片段自身的載體，而且插入片段編碼單一抗原，該抗原可以是野生型或者突變型gag序列(例如在一種或多種編碼鋅指結(jié)構(gòu)的序列中具有突變的gag序列(例如在SEQ ID NO7或者8的1279-1281，1288-1290，1342-1344，或者1351-1353位置或者在另一分化體HIV gag序列類似位置))。因?yàn)橥蛔兪怯脕砀淖兙幋a的蛋白，它不會(huì)是沉默突變(例如在密碼子第三堿基搖擺位置(包括于本發(fā)明插入片段中的gap或者任一其它HIV序列))。剛剛列舉位置的一種或者更多突變可能將392，395，413，或者416位置的半胱氨酸殘基改變?yōu)榱硪粋€(gè)殘基(例如絲氨酸)。另外地，另外突變可以在SEQ ID NO10-13的1271-1273，1280-1282，1334-1336，或者1343-1345的任何位置或者在另一分化體HIV gag序列的類似位置。這些突變可能將390，393，411，或者414位置的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基改變?yōu)槠渌鼩埢?例如絲氨酸)。另外，突變可以在SEQ ID NOs14或者15的1260-1262，1269-1271，1323-1325，或者1332-1334的任何位置或者在另一分化體HIV gag序列的類似位置。這些突變可能將390，393，411，或者414位置的一個(gè)或者多個(gè)半胱氨酸殘基改變?yōu)槠渌鼩埢?例如絲氨酸)。
當(dāng)組合物包括帶有插入片段的載體或者單獨(dú)的插入片段時(shí)，而且插入片段編碼多種蛋白抗原，一種抗原可以是野生型或者突變型gag序列，包括如上所述的那些。同樣地，當(dāng)一種組合物包括多于一種插入片段或多于一種載體時(shí)，至少一種載體或者插入片段(編碼單一抗原或者多種抗原)可以包括野生型或者突變型gag序列，包括如上所述的那些或者來自其它HIV分化體的類似序列。例如，當(dāng)組合物包括第一種和第二種載體時(shí)，二者之一或者兩個(gè)載體的插入片段(插入片段編碼單個(gè)的或者多種抗原)可以編碼Gag；當(dāng)兩個(gè)載體都編碼Gag時(shí)，第一種載體的Gag序列可以來自一種HIV分化體(例如，分化體B)而第二種載體的Gag序列可以來自另外的HIV分化體(分化體C)。
當(dāng)組合物包括帶有插入片段的載體或者單獨(dú)的插入片段，而插入片段編碼單一的抗原，該抗原可以是野生型或者突變型Pol?？梢酝ㄟ^刪除或者替換一種或多種核酸突變?cè)撔蛄校笔Щ蛘咛鎿Q可以導(dǎo)致Pol基因產(chǎn)物與野生型對(duì)應(yīng)物相比較具有較少酶活性(例如較少整合酶活性，較少逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性，或者較少蛋白酶活性)。例如可以通過向SEQ ID NO7的2454-2456或者2697-2699位置或者其它亞型或者重組體形式序列的類似位置的一個(gè)或者更多位點(diǎn)引入突變從而抑制RT活性。雖然本發(fā)明不局限于對(duì)酶活性具有特定影響的突變，我們認(rèn)為在2454-2456位置的突變通過失活聚合酶活性部位抑制RT和在2697-2699位置的突變通過除去鏈轉(zhuǎn)移活性抑制RT。因此，這些突變以及其它對(duì)基因產(chǎn)物活性具有類似影響的突變?cè)诒景l(fā)明范圍之內(nèi)。更具體地說，所述突變可以將SEQ ID NO7的2454-2456位置的核苷酸編碼的氨基酸(天冬氨酸(D))改變?yōu)槿我饬硗獾陌被?例如天門冬酰胺(N))。另外，或者此外，可以通過例如在SEQ ID NO7的3333-3335位核苷酸引入突變來抑制聚合酶的RNase H活性(例如突變將谷氨酸殘基(E)改變?yōu)樯彼釟埢?W))。或者，可以通過例如在SEQ ID NO8或者9(其它分化體B插入片段)的2418-2420，2661-2663，或者3297-3299位核苷酸引入突變。另外，可以在SEQ ID NOs10-13中任意的2410-2412，2653-2655，或者3289-3291位核苷酸引入突變(例如在這些位置的天冬氨酸(W)，酪氨酸(W)和谷氨酸(W)殘基可以分別被改變?yōu)樘於０?N)，蘇氨酸(T)，和/或谷氨酰氨(Q))。另外，可以在SEQID NOs14或者15中任意的2387-2389，2630-2632，或者3266-3268位核苷酸引入突變。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以辨認(rèn)出其它分化體中編碼類似殘基的核酸，即使那些殘基并不和在這里測(cè)試的分化體中出現(xiàn)在準(zhǔn)確相同的位置。
當(dāng)組合物包括帶有插入片段的載體或者單獨(dú)的插入片段，而且插入片段編碼多種蛋白抗原，其中一種抗原可以是野生型或者突變型pol序列，包括如上所述的那些(這些編碼多種蛋白的插入片段還可以編碼如上所述的野生型或者突變型gag序列)。同樣地，當(dāng)組合物包括多于一種插入片段或多于一種載體時(shí)，至少一種載體或者插入片段(編碼單一抗原或者多種抗原)可以包括野生型或者突變型pol序列，包括如上所述的那些(以及選擇性地，野生型或者突變型gag序列，包括如上所述的那些(即插入片段可以編碼Gag-Pol))。例如，當(dāng)組合物包括第一種和第二種載體時(shí)，二者之一或者兩個(gè)載體的疫苗插入片段(插入片段編碼單個(gè)的或者多種抗原)可以編碼Pol；當(dāng)兩個(gè)載體編碼Pol時(shí)，第一種載體的Pol序列可以來自一種HIV分化體(例如分化體B)而第二種載體的Pol序列可以來自另外的HIV分化體(分化體C)。
當(dāng)插入片段包括一些或者所有pol序列，可以改變的pol序列的另外一部分是編碼蛋白酶活性的序列(無論影響Pol其它酶活性的序列是否被改變)。例如，可以在SEQ ID NO8的1641-1643位置引入突變(例如將正常時(shí)由這個(gè)密碼子編碼的谷氨酸殘基改變?yōu)槠渌被釟埢?，例如丙氨?A)的突變)。如同此處敘述的其它突變體(例如gag突變體)，可以在獲自其它HIV分化體的序列中制造類似的突變。例如，可以在SEQ ID NO10的1633-1635位置引入突變(將精氨酸(R)改變?yōu)榱硪环N的氨基酸，諸如天冬酰氨(N))，在SEQ ID NO12的1703-1705位置引入突變(將甘氨酸(G)改變?yōu)榱硪环N的氨基酸，諸如纈氨酸(V))，或者在SEQ ID NO13的1828-1830位置引入突變(將亮氨酸(L)改變?yōu)榱硪环N殘基，諸如甲硫氨酸(M))(SEQ IDNO10，12和13都代表AG序列)。在來自分化體C的插入片段中，可以在SEQ ID NO14的1610-1612位置引入突變(將天冬氨酸(D)改變?yōu)榱硪环N氨基酸，諸如天冬酰氨(N))。
當(dāng)組合物包括帶有插入片段的載體或者單獨(dú)的插入片段，而該插入片段編碼單一抗原，該抗原可以是野生型或者突變型Env，Tat，Rev，Nef，Vif，Vpr，或者Vpu。當(dāng)組合物包括帶有插入片段的載體或者單獨(dú)的插入片段，而插入片段編碼多種蛋白抗原，該抗原的一種可以是野生型或者突變型Env。例如，多種蛋白插入片段可以編碼野生型或者突變型Gag-Pol和Env；他們還可以編碼野生型或者突變型Gag-Pol和Env和一個(gè)或多個(gè)Tat，Rev，Nef，Vif，Vpr，或者Vpu(每個(gè)可以是野生型或者突變型)。如同其它抗原一樣，Env，Tat，Rev，Nef，Vif，Vpr，或者Vpu可以是由于一個(gè)或者更多氨基酸殘基缺失，添加或者替換(例如任何抗原可以包括點(diǎn)突變)而產(chǎn)生的突變型。至于Env，一個(gè)或多個(gè)突變可以在附圖19的任何結(jié)構(gòu)域中。例如，可以從gp 120表面和/或gp41跨膜裂解產(chǎn)物上刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。至于Gag，可以從基質(zhì)蛋白(pu7)，衣殼蛋白(p24)，核殼蛋白(p7)和C-末端肽(p6)上刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。例如，可以刪除這些區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(特別要求該載體是病毒載體，諸如MVA)。至于Pol，可以從蛋白酶蛋白(p10)，逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白(p66/p51)，或者整合酶蛋白(p32)上刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
更具體地說，本發(fā)明的組合物可以包括載體(例如質(zhì)?；蛘卟《据d體)它們編碼(a)其中一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)已經(jīng)失活以限制病毒RNA包裝的Gag蛋白；(b)Pol蛋白，其中(i)整合酶活性已經(jīng)通過一些或者所有pol序列的缺失而受到抑制以及(ii)聚合酶，鏈轉(zhuǎn)移和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性已經(jīng)通過pol序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變受到抑制；以及(c)具有或者沒有突變的Env，Tat，Rev，和Vpu。在這個(gè)以及其它實(shí)施方案中，編碼的蛋白可以獲自或者衍生自亞型A，B或者C HIV(例如HIV-1)或者它的重組體形式。其中該組合物包括不相同的載體，在各種載體中的序列可以來自不同HIV分化體(或者它的亞型或者重組體形式)。例如，本發(fā)明特征在于包括編碼剛剛敘述抗原(Gag-Pol，Env等等)的質(zhì)粒載體，其中一些質(zhì)粒包括獲自或者衍生自一個(gè)分化體的抗原而其它質(zhì)粒包括獲自(或者衍生自)另外分化體的抗原。具有2種，3種，4種，5種，6種或更多分化體(包括所有分化體)的混合物在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
當(dāng)?shù)谝环N和第二種載體被包含在組合物中時(shí)，載體可以是pGA1/JS2，pGA1/JS7，pGA1/JS7.1，pGA2/JS2，pGA2/JS7，pGA2/JS7.1(pGA1.1或者pGA1.2可被用于替換pGA1而pGA2.1或者pGA2.2可被用于替換pGA2)。同樣地，載體可以是pGA1/IC25，pGA1/IC2，pGA1/IC48，pGA1/IC90，pGA2/IC25，pGA2/IC2，pGA2/IC48，或者pGA2/IC90(同樣，pGA1.1或者pGA1.2可被用于替換pGA1而pGA2.1或者pGA2.2可被用于替換pGA2)。在替代的實(shí)施方案中，編碼的蛋白可以是，或者衍生自C亞型HIV(例如HIV-1)的那些或者它的重組體形式。例如，該載體可以是pGA1/IN2，pGA1.1/IN2，pGA1.2/IN2，pGA1/IN3，pGA1.1/IN3，pGA1.2/IN3，pGA2/IN2，pGA2.1/IN2，pGA2.2/IN2，pGA2/IN3，pGA2.1/IN3，或者pGA2.2/IN3。
編碼的蛋白還可以是或者衍生自HIV分化體(或者亞型)E，F(xiàn)，G，H，I，J，K或者L或者它們的重組體形式。HIV-1分類系統(tǒng)已經(jīng)由LosAlamos國(guó)家實(shí)驗(yàn)室出版(HIV序列概略-2001，kuiken等，理論生物學(xué)和生物物理學(xué)組T-10出版，Los Alamos，NM，(2001)；http//hiv-web.lanl.gov)。
本發(fā)明的組合物還可以包括載體(例如質(zhì)粒載體)，它們編碼(a)其中一個(gè)或者兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)已經(jīng)失活的Gag蛋白；(b)Pol蛋白，其中(i)整合酶活性已經(jīng)通過一些或者pol序列的缺失受到抑制，(ii)聚合酶，鏈轉(zhuǎn)移和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性已經(jīng)通過在pol序列之內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變受到抑制，以及(iii)蛋白酶的蛋白分解活性已經(jīng)通過一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變受到抑制；以及(c)有或者沒有突變的Env，Tat，Rev和Vpu。如上所述，可以通過向SEQ ID NO8的1641-1643位置或者另外的HIV分化體序列的類似位置引入突變以抑制蛋白分解活性。例如，質(zhì)?？梢园颂帞⑹龅牟迦肫蜫S7，IC25，和IN3。編碼其它抗原的質(zhì)粒，編碼剛剛敘述抗原的質(zhì)粒可以與編碼獲自，或者衍生自不同HIV分化體(或者亞型或者它的重組體形式)的其它質(zhì)粒結(jié)合(例如，混合)。(沒有載體)的插入片段本身也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明的其它載體包括的質(zhì)粒編碼Gag蛋白(例如其中一個(gè)或者兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)已經(jīng)失活的Gag蛋白)；Pol蛋白(例如其中整合酶，RT，和/或蛋白酶活性已被抑制的Pol；Vpu蛋白(可以是通過具有突變型起始密碼子的序列編碼)；和Env，Tat，和/或Rev蛋白(野生型或者突變體形式)。同樣編碼其它抗原的質(zhì)粒，編碼剛剛敘述抗原的質(zhì)粒可以與編碼獲自，或者衍生自不同HIV分化體(或者亞型或者它的重組體形式)的其它質(zhì)粒結(jié)合(例如，混合)。(沒有載體)的插入片段本身也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
如上所述的質(zhì)粒，包括表達(dá)JS2或者JS7系列分化體B HIV-1序列的那些，可以施用于任何受試者，但是多數(shù)受益性給予已經(jīng)或者可能接觸HIV分化體B的受試者(除了質(zhì)粒載體的載體同樣如此)。同樣地，表達(dá)IN系列分化體C HIV-1序列的質(zhì)?；蛘咂渌d體可以施用給已經(jīng)或者可能接觸分化體C HIV的受試者。因?yàn)楸磉_(dá)不同分化體抗原的載體可以結(jié)合引發(fā)抗多于一個(gè)分化體的免疫應(yīng)答(無論表達(dá)來自不同分化體多重抗原的一種載體或者表達(dá)來自不同分化體單個(gè)抗原的多重載體)，可以制作疫苗制劑以更好地保護(hù)給定的受試者。例如，如果受試者可能接觸世界上分化體B以外的分化體占優(yōu)勢(shì)的地區(qū)，可以配制和施用表達(dá)抗原(或者多種抗原)的載體或者(多種)載體以使對(duì)主要的分化體或者(多種)分化體的免疫應(yīng)答最佳化。
載體表達(dá)的抗原不是可以變化的質(zhì)粒載體的唯一部分。有用的質(zhì)?？梢曰蛘呖梢圆槐匕旧弦种妻D(zhuǎn)錄的終止子序列(通過加工在DNA模板上通過互補(bǔ)堿基配對(duì)形成RNA分子)。有用的終止子序列包括λT0終止子和它的有功能的片段或者變異體。終止子序列以和原核生物內(nèi)表達(dá)的可讀框C末端相同取向處于載體上(即終止子序列和可讀框連接在同一操縱子上)。當(dāng)質(zhì)粒在原核細(xì)胞中復(fù)制時(shí)通過阻止從選擇性標(biāo)記通讀到疫苗插入片段，終止子可以在細(xì)菌生長(zhǎng)和質(zhì)粒復(fù)制時(shí)穩(wěn)定插入的片段。
本領(lǐng)域已知的選擇性標(biāo)記基因包括例如，編碼賦予標(biāo)記表達(dá)細(xì)胞對(duì)抗生素抗性蛋白的基因(例如對(duì)卡那霉素，氨芐青霉素，或者青霉素抗性)。選擇性標(biāo)記如此稱謂，因?yàn)樗菰S根據(jù)在缺乏標(biāo)記可能殺死它們的條件選擇細(xì)胞。選擇性標(biāo)記，終止子序列，或者兩個(gè)(各自或者二者的一部分)可以是，但是不必是在施用給患者前從質(zhì)粒切除。同樣地，在通過限制性核酸內(nèi)切酶消化而線性化之后，或者在一些載體“骨架”已經(jīng)改變或者刪除之后，可以以環(huán)狀形式施用質(zhì)粒載體。
核酸載體還可以包括復(fù)制起點(diǎn)(例如原核的ori)和轉(zhuǎn)錄盒，轉(zhuǎn)錄盒除包含一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之外，編碼抗原的插入片段可以被克隆插入其中，并選擇性地包括啟動(dòng)子序列和聚腺苷酸化信號(hào)。可以使用并且優(yōu)選已知的強(qiáng)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子之一是細(xì)胞巨化病毒(CMV)中間早期啟動(dòng)子，盡管可以使用其它(包括較弱的)啟動(dòng)子而不背離本發(fā)明的范圍。同樣地，可以挑選強(qiáng)聚腺苷酸化信號(hào)(例如衍生自牛生長(zhǎng)激素(BGH)編碼基因的信號(hào)，或者兔β球蛋白聚腺苷酸化信號(hào)(Bohm等，J.Immunol.Methods 19329-40，1996；Chapman等，Nucl.Acids Res.193979-3986，1991；Hartikka等，Hum.Gene Therapy71205-1217，1996；Manthorpe等，Hum.Gene Therapy 4419-431，1993；Montgomery等，DNA Cell Biol.12777-783，1993))。
載體可以進(jìn)一步包括前導(dǎo)序列(轉(zhuǎn)錄盒任選的前導(dǎo)序列是組織纖溶酶原激活物基因(tPA)前導(dǎo)序列合成的同系物)和/或諸如巨細(xì)胞病毒(CMV)內(nèi)含子A或者SV40內(nèi)含子等內(nèi)含子序列。內(nèi)含子A的存在增加許多來自RNA病毒，細(xì)菌，和寄生蟲抗原的表達(dá)，大概通過提供給表達(dá)的RNA支持加工的序列以及作為真核生物mRNA起作用。本領(lǐng)域中已知的用于增強(qiáng)表達(dá)的其它方法包括但不限于用于真核細(xì)胞的原核生物mRNAs密碼子選擇的優(yōu)化(Andre等，J.Virol.721497-1503，1998；Uchijima等，J.Immunol.1615594-5599，1998)。多順反子載體可被用來表達(dá)多于一種免疫原或者免疫原和刺激免疫蛋白(Iwasaki等，J.Immunol.1584591-4601，1997a；Wild等，Vaccine 16353-360，1998)。因此(以及同樣載體構(gòu)造的其它任選組分)，編碼來自一個(gè)或多個(gè)HIV分化體或者分離物的一種或多種抗原的載體可以，但是未必，包括前導(dǎo)序列和內(nèi)含子(例如CMV內(nèi)含子A)。
本發(fā)明的載體區(qū)別在于能被用于接受編碼抗原序列的位點(diǎn)，和是否轉(zhuǎn)錄盒在CMVIE啟動(dòng)子中包括內(nèi)含子A序列。因此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以修飾質(zhì)粒內(nèi)的(多個(gè))插入位點(diǎn)或者(多個(gè))克隆位點(diǎn)只要不背離本發(fā)明的范圍。內(nèi)含子A和tPA前導(dǎo)序列在特定的實(shí)例中顯示出能夠增強(qiáng)抗原表達(dá)(Chapman等，Nucleic Acids Research 193979-3986，1991)。
如下所述，本發(fā)明的載體可以與佐劑，包括遺傳學(xué)佐劑一起施用。因此，核酸載體，不管它們表達(dá)的抗原，可以選擇性地包括諸如GM-CSF，IL-15，IL-2，干擾素響應(yīng)因子，分泌形式的flt-3，和突變的半胱氨酸蛋白酶基因等遺傳學(xué)佐劑。還可以以融合蛋白的形式供給遺傳學(xué)佐劑，例如通過融合一個(gè)或多個(gè)C3d基因序列(1-3個(gè)(或更多)C3d基因序列)來表達(dá)抗原。
如果施用的載體是pGA載體，它可以包括例如pGA1(SEQ ID NO1)及其衍生物(例如SEQ ID NOs2和3)或者pGA2(SEQ ID NO4)及其衍生物(例如SEQ ID NOs5和6)序列。此處更詳細(xì)地?cái)⑹隽藀GA載體(參見實(shí)施例1-8)。pGA1是3897bp的質(zhì)粒，包括啟動(dòng)子(bp 1-690)，CMV內(nèi)含子A(bp 691-1638)，tPA前導(dǎo)序列合成的模仿物(bp 1659-1721)，牛生長(zhǎng)素加Poly(A)序列(bp 1761-1983)，λT0終止子(bp 1984-2018)，卡那霉素抗性基因(bp 2037-2830)和ColEI復(fù)制子(bp 2831-3890)。pGA1構(gòu)建體(SEQ ID NO1)的DNA序列顯示于附圖2。在附圖1中，顯示的限制酶切位點(diǎn)用于克隆編碼抗原的序列。將疫苗插入片段的5′端克隆在tPA前導(dǎo)序列的上游時(shí)使用Cla I或者BspD I位點(diǎn)。Nhe I位點(diǎn)用于克隆與tPA前導(dǎo)序列相同讀碼框的序列。列舉的在Sma I和Bln I之間的位點(diǎn)被用來克隆抗原編碼序列的3′末端。
pGA2是2947bp的質(zhì)粒，缺乏存在于pGA1中的947bp的內(nèi)含子A序列。除了缺失內(nèi)含子A序列外，pGA2同pGA1一樣。pGA2的價(jià)值在于克隆不需要用于有效表達(dá)的上游內(nèi)含子序列，或者當(dāng)其中上游內(nèi)含子可能干擾良好表達(dá)需要的拼接模式時(shí)用于克隆序列。附圖5顯示了具有用于克隆疫苗插入片段的限制性酶切位點(diǎn)的pGA2的示意圖。附圖6a顯示了pGA2的DNA序列(SEQ ID NO2)。將疫苗克隆入pGA2的限制性酶切位點(diǎn)的用途與用來將片段克隆入pGA1的限制性酶切位點(diǎn)相同。pGA2.1和pGA2.2是pGA2的多克隆位點(diǎn)衍生物。附圖7a和8a分別顯示了pGA2.1(SEQ ID NO5)和pGA2.2(SEQ ID NO6)的DNA序列。
具有不同于此處公開的“骨架”序列的pGA質(zhì)粒也在本發(fā)明范圍內(nèi)，只要質(zhì)?；旧媳３炙杏行е委熕匦璧奶匦?例如可以替換核苷酸，增加核苷酸，或者刪除核苷酸，只要給予患者的質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)或者增強(qiáng)抗給定或者目的病原體的免疫應(yīng)答)。例如可以刪除或者取代1-10，11-20，21-30，31-40，41-50，51-60，61-70，71-80，81-90，91-100或者100以上個(gè)核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法(例如，引發(fā)患者免疫應(yīng)答的方法)可以通過給患者施用治療有效量的生理學(xué)容許的組合物來進(jìn)行，該組合物包括可以包含編碼引發(fā)抗HIV免疫應(yīng)答的一種或多種抗原的疫苗插入片段的載體。載體可以是具有如上所述pGA構(gòu)建物的一個(gè)或多個(gè)特性的質(zhì)粒載體(例如選擇性標(biāo)記基因，原核生物來源的復(fù)制起點(diǎn)，終止序列(例如，λT0終止子)和與選擇性基因標(biāo)記在同一操縱子上的連接，和含有啟動(dòng)子序列的真核生物轉(zhuǎn)錄盒，編碼至少一種衍生自免疫缺陷病毒抗原的核酸插入片段，和聚腺苷酸化信號(hào)序列)。當(dāng)然，本發(fā)明的疫苗插入片段可以通過不具有pGA構(gòu)建物特性的質(zhì)粒載體遞送(例如pGA1或者pGA2外的載體)。另外，該組合物可以包括任何此處敘述的包含插入片段的病毒或者細(xì)菌載體。因此本發(fā)明包括單一類型載體(即包含相同疫苗插入片段的質(zhì)?；蛘卟《据d體(即編碼相同抗原的插入片段))的給藥。如同在別處已經(jīng)說明清楚的，患者可以接受2種載體，載體中的每一個(gè)可以引發(fā)抗不同HIV分化體的免疫應(yīng)答。例如，本發(fā)明特征在于患者接受組合物的方法，其中包括(a)第一種載體，含有編碼一種或多種抗原的疫苗插入片段，可以引發(fā)抗人類免疫缺陷性病毒(HIV)第一種亞型或者重組體形式的免疫應(yīng)答以及(b)第二種載體，含有編碼一種或多種抗原的疫苗插入片段，可以引發(fā)抗HIV第二種亞型或者重組體形式的免疫應(yīng)答。第一種和第二種載體可以是任何此處敘述的那些。同樣地，第一種和第二種載體中的插入片段可以是任何此處敘述的那些。
可以通過肌內(nèi)注射或者皮內(nèi)的途徑施用治療上有效量的載體(可以考慮第一個(gè)，第二個(gè)，第三種載體等等)，連同生理學(xué)容許的載體，稀釋劑，或者賦形劑，以及選擇性地，佐劑?？梢噪S后通過肌內(nèi)注射或者皮內(nèi)的途徑施用治療上有效量的同樣或者不同的載體(可以考慮第一個(gè)，第二個(gè)，第三種載體等等)，連同生理學(xué)容許的填料，稀釋劑，或者賦形劑，以及選擇性地，佐劑來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以很容易地選擇這些組分，而不考慮疫苗引入的抗原或者遞送載體的準(zhǔn)確特征。
引發(fā)免疫應(yīng)答的方法可以通過如下途徑進(jìn)行單獨(dú)施用本發(fā)明質(zhì)粒載體來，通過單獨(dú)施用本發(fā)明病毒載體或者重組病毒，或者通過給予二者(例如可以給予質(zhì)粒載體(或者質(zhì)粒載體的混合物或者組合))來″激活″免疫應(yīng)答并且通過給予病毒載體或者重組病毒(例如可以給予質(zhì)粒載體(或者質(zhì)粒載體的混合物或者組合))來“加強(qiáng)”免疫應(yīng)答。當(dāng)施用質(zhì)粒和病毒載體或者重組病毒時(shí)，它們的插入片段可以是“相匹配”的。為了“相匹配”，質(zhì)粒內(nèi)的一種或者多種序列(例如編碼Gag的序列，或者編碼Env的序列等等)和重組病毒內(nèi)的病毒載體可以是一樣的，但是該名詞不限于此?！跋嗥ヅ洹钡男蛄邢嗷ラg可以不同。例如，當(dāng)DNA載體內(nèi)使用的序列被突變或者進(jìn)一步突變以允許(或者優(yōu)化)病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中編碼這些序列的病毒載體的復(fù)制和編碼抗原(例如Gag，Gag-Pol，或者Env)的表達(dá)，病毒載體表達(dá)的插入片段和DNA載體表達(dá)的那些是“相匹配”的。
至少本發(fā)明的一些免疫缺陷病毒疫苗插入片段被設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生來自單個(gè)DNA的非感染性VLPs(該名詞可以包括真正的VLPs和病毒蛋白的聚集物)。使用正常被免疫缺陷病毒使用的亞基因組剪切元件獲得疫苗插入片段來表達(dá)來自單個(gè)病毒RNA的多重基因產(chǎn)物。亞基因組剪切模式受到(i)全長(zhǎng)病毒RNA中存在的剪切位點(diǎn)和受體，(ii)Rev反應(yīng)元件(RRE)，和(iii)Rev蛋白的影響。反轉(zhuǎn)錄病毒RNA剪切位點(diǎn)使用真核生物RNAs剪切位點(diǎn)的規(guī)范序列。RRE是大約200bp的RNA結(jié)構(gòu)，它與Rev蛋白相互作用以容許病毒RNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)缺乏Rev時(shí)，大約10kb的免疫缺陷病毒RNA大部分剪切為調(diào)節(jié)基因Tat，Rev，和Nef的mRNAs。這些基因由RT和Env之間存在的外顯子編碼并且處在基因組的3’末端。當(dāng)存在Rev時(shí)，除Tat，Rev，和Nef mRNAs外，表達(dá)單獨(dú)剪切的Env mRNA和未剪切的Gag和Pol mRNA。
來自單個(gè)DNA的非感染性VLPs的表達(dá)提供給免疫缺陷病毒疫苗許多好處。來自單個(gè)DNA的大量蛋白的表達(dá)提供給疫苗宿主應(yīng)答存在于這些蛋白中的大量T-和B-細(xì)胞抗原決定簇的機(jī)會(huì)。含有多個(gè)抗原決定簇的蛋白的表達(dá)可以提供具有不同組織相容性類型的抗原決定簇。通過使用全蛋白，可以給具有不同組織相容性類型的宿主提供增強(qiáng)廣幅的T細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)會(huì)。這對(duì)于免疫缺陷病毒感染的有效抑制是必要的，這些病毒的高突變率使它們?nèi)菀滋与x免疫應(yīng)答(Evans等，Nat.Med.51270-1276，1999；Poignard等，Immunity10431-438，1999，Evans et al.，1995)。在本疫苗接種方案的上下文，正如在藥物療法中，需要多重突變用于逃避的多抗原決定簇T細(xì)胞應(yīng)答可以提供比單個(gè)抗原決定簇T細(xì)胞應(yīng)答(需要僅僅單突變用于逃避)更好的保護(hù)。
還可以操作免疫原通過將表達(dá)的抗原靶定到特定的細(xì)胞間隔來使其或多或少有效地形成抗體或者Tc。例如，比起定位到細(xì)胞內(nèi)部的抗原，通過將抗原顯示在細(xì)胞的原生質(zhì)膜上或者從那里分泌，可以更有效地引發(fā)抗體應(yīng)答(Boyle等，Int.Immunol.21897-1906，1997；Inchauspe等，DNA Cell.Biol.16185-195，1997)。N-末端泛素蛋白化信號(hào)通過將DNA編碼的蛋白定位到蛋白體，使細(xì)胞質(zhì)迅速降解并且更有效地將肽負(fù)載到MHC I途徑，可以增強(qiáng)Tc應(yīng)答(Rodriguez等，J.Virol.718497-8503，1997；Tobery等，J.Exp.Med.185909-920，1997；Wu等，J.Immunol.1596037-6043，1997).。對(duì)DNA引發(fā)的免疫應(yīng)答的機(jī)制基礎(chǔ)的綜述，見Robinson和Perter的，病毒研究進(jìn)展(Advances in VirusResearch)，第53卷，Academic Press(2000)。
另外的操作免疫應(yīng)答的方法是將免疫原融合到免疫靶向或者免疫刺激分子。迄今為止，這些融合中最成功的是將分泌的免疫原定向到抗原呈遞細(xì)胞(APCs)或者淋巴結(jié)(Boyle等，Nature392408-411，1998)。因此，本發(fā)明特征在于融合到諸如CTLA-4，L-選擇蛋白，或者細(xì)胞因子(例如諸如IL-1，IL-2，IL-4，IL-7，IL-10，IL-15或者IL-21)等免疫定向或者免疫刺激分子的此處敘述的HIV抗原。編碼這些融合的核酸和包含它們的組合物(例如載體和生理學(xué)容許的制劑)也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
可以以任何可用于遞送本發(fā)明質(zhì)粒到受試者的各種方式遞送DNA。例如，DNA可以以例如鹽水(例如使用皮下注射針)或者以生物學(xué)方法(通過例如給涂敷DNA小珠加速的基因槍)遞送。鹽水注射將DNA遞送到細(xì)胞間隙，而基因槍將轟擊的DNA直接遞送進(jìn)細(xì)胞。鹽水注射需要比基因槍更大量的DNA(一般100-1000倍)(Fynan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011478-11482，1993)。這2種遞送方式不同在于鹽水注射偏嗜應(yīng)答1型T細(xì)胞輔助細(xì)胞，而基因槍遞送偏嗜應(yīng)答2型T細(xì)胞輔助細(xì)胞(Feltquate等J.Immunol.1582278-2284，1997；Pertmer等J.Virol.706119-6125，1996)。在鹽水中DNAs的注射快速地傳遍軀體。通過基因槍遞送更接近定位于目標(biāo)附近。遵循這兩種接種方法之一，胞外的質(zhì)粒DNA具有大約10分鐘的短半衰期(Kawabata等，Pharm.Res.12825-830，1995；Lew等，Hum.Gene Ther.6553，1995)。通過鹽水注射的疫苗接種可以是肌內(nèi)(i.m.)或者皮內(nèi)(i.d.)注射；基因槍遞送可以施用于皮膚或者諸如肌肉等外科接觸的組織。
雖然通常較少關(guān)切其它遞送途徑，然而它們可以用來施用本發(fā)明的組合物。例如，DNA可以被施用于粘膜或者通過腸胃外的途徑接種。鹽水中DNA的鼻內(nèi)給藥具有兩個(gè)好處(Asakura等Scand.J.Immunol.46326-330，1997；Sasaki等，Infect.Immun.66823-826，1998b)并且已經(jīng)有有限的成功(Fynan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011478-82，1993)?；驑屚ㄟ^將DNA遞送到粘液鞘成功地產(chǎn)生IgG(Livingston等，Ann.NewYork Acad.Sci.772265-267，1995)。通過使用脂質(zhì)體(McCluskie等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.8401-414，1998)，微球體(Chen等，J.Virol.725757-5761，1998a；Jones等，Vaccine15814-817，1997)和重組體志賀氏菌載體(Sizemore等，Science270299-302，1995；Sizemore等，Vaccine15804-807，1997)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了遞送DNA到粘膜表面的某些成功。諸如這些試劑(脂質(zhì)體，微球體和重組體志賀氏菌載體)可用于遞送本發(fā)明的核酸。
產(chǎn)生應(yīng)答需要的DNA劑量取決于遞送方法，宿主，載體，和編碼的抗原。遞送方法可能是最有影響的參數(shù)。通常使用從10微克到5毫克DNA進(jìn)行DNA鹽水注射，而更通常使用從0.2微克到20微克DNA進(jìn)行DNA基因槍遞送。通常，較低劑量的DNA被用于小鼠(從10到100微克用于鹽水注射而從0.2到2微克用于基因槍遞送)，而較高劑量用于靈長(zhǎng)類動(dòng)物(從100微克到1毫克用于鹽水注射而從2到20微克用于基因槍遞送)。基因槍遞送需要的低得多量的DNA反映出金顆粒直接遞送DNA進(jìn)入細(xì)胞。
除如上所述DNA載體之外，許多不同痘病毒能被單獨(dú)(即，沒有核酸或者DNA激活劑)或者作為疫苗接種的加強(qiáng)組分使用。MVA在小鼠模型中尤其有效(Schneider等，Nat.Med.4397-402，1998)。MVA是牛痘病毒的高度減毒株，其被開發(fā)用于幫助根除天花，而它已經(jīng)在多于100,000人中進(jìn)行了安全性測(cè)試(Mahnel等，Berl.Munch TierarztlWochenschr107253-256，1994；Mayr等，Zentralbl.Bakteriol.167375-390，1978)。在雞細(xì)胞中在超過500次傳代期間，MVA丟失大約10％其基因組及其在靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞中有效復(fù)制的能力。盡管其有限的復(fù)制，MVA被證明是卓有成效的表達(dá)載體(Sutter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910847-10851，1992)，在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中產(chǎn)生對(duì)副流感病毒(Durbin等，J.Infect.Dis.1791345-1351，1999)，麻疹(Stittelaar等，J.Virol.744236-4243，2000)，和免疫缺陷病毒(Barouch等，J.Virol.755151-5158，2001；Ourmanov等，J.Virol.742740-2751，2000；Amara等，J.Virol.767625-7631，2002)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。MVA比較高的免疫原性部分歸因于一些病毒抗免疫防衛(wèi)基因的損失(Blanchard等，J.Gen.Virol.791159-1167，1998)。
牛痘病毒被用于構(gòu)建用于重組體基因表達(dá)和作為重組體活疫苗的病毒載體(Mackett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA797415-7419；Smith等，Biotech.Genet.Engin.Rev.2383-407，1984)?？赡芫幋a此處敘述的任何HIV抗原的DNA序列，可以被引入牛痘病毒的基因組。如果基因整合在不是病毒生活周期必需的病毒DNA位點(diǎn)，它有可能用于重新產(chǎn)生感染性的(即，能感染其它細(xì)胞)的重組體牛痘病毒并且表達(dá)整合的DNA序列。優(yōu)選地，病毒載體特征在于本發(fā)明的組合物和方法是高度減毒的。開發(fā)了一些減毒的牛痘病毒病毒株以避免天花疫苗接種法不期望的副作用。修飾的牛痘Ankara(MVA)病毒是牛痘病毒Ankara毒株通過在雞胚胎成纖維細(xì)胞上長(zhǎng)期的連續(xù)傳代產(chǎn)生的(CVA；見Mayr等，Infection36-14，1975)。MVA病毒可以從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC；No.VR-1508；Manassas，VA)公開獲得。MVA毒株在臨床試驗(yàn)中顯示出理想的特性(Mayr等，Zentralbl.Bakteriol.167375-390，1978；Stickl等，Dtsch.Med.Wschr.992386-2392，1974；Sutter和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910847-10851，1992)。在對(duì)超過120,000人，包括高危險(xiǎn)患者的研究中，未發(fā)現(xiàn)與使用MVA疫苗有關(guān)的副作用。
MVA載體可以通過如下方法制備。在允許同源重組存在的條件下將DNA構(gòu)建體引入用MVA感染的細(xì)胞，該DNA構(gòu)建體包含例如此處敘述的插入片段序列，編碼外來多肽(例如此處敘述的任何HIV抗原)的DNA序列，其側(cè)翼連接的MVA DNA序列鄰近于MVA基因組天然存在的缺失(例如，缺失III或者其它不需要的(多個(gè))位點(diǎn)；已經(jīng)鑒定出基因組DNA的6個(gè)主要缺失(命名為缺失I，II，III，IV，V，和VI)總共31,000對(duì)堿基對(duì)(Meyer等，J.Gen.Virol.721031-1038，1991))。一旦DNA構(gòu)建體被引入真核細(xì)胞并且外源DNA與病毒DNA重組，可以通過本領(lǐng)域已知的方法分離重組體牛痘病毒(通過利用可檢測(cè)的標(biāo)記分離更為方便)。要插入的構(gòu)建DNA可以是線性的或者環(huán)狀的(例如質(zhì)粒，線性化質(zhì)粒，基因，基因片段，或者修飾的HIV基因組)。外源DNA序列插入在靠近天然存在缺失的序列之間。為了更好的表達(dá)DNA序列，該序列可以包括調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子，諸如牛痘11kDa基因或者7.5kDa基因的啟動(dòng)子)。DNA構(gòu)建體可以通過各種方法引入MVA感染的細(xì)胞，包括磷酸鈣輔助的轉(zhuǎn)染(Graham等，Virol.52456-467，1973和Wigler等，Cell 16777-785，1979)，電穿孔法(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)，顯微注射(Graessmann等，Meth.Enzymol.101482-492，1983)，通過脂質(zhì)體(Straubinger等，Meth.Enzymol.101512-527，1983)，通過原生質(zhì)球(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA772163-2167，1980)，或者通過本領(lǐng)域已知的其它方法。重組體MVA病毒制劑在Moss等，PCT公開WO 02/07275 A2(國(guó)際
發(fā)明者哈里耶特·L·魯賓遜, 詹姆斯·史密斯, 簡(jiǎn)華, 伯納德·莫斯, 拉馬·阿馬拉, 泰德·M·羅斯, 里克·阿瑟·布賴特, 林達(dá)·懷亞特, 帕特里夏·厄爾, 丹尼斯·埃倫伯格, T·?？怂? S·布泰拉 申請(qǐng)人:愛莫里大學(xué), 美國(guó)政府健康及人類服務(wù)部, 美國(guó)政府健康及人類服務(wù)部，疾病控制和預(yù)防中心