專利名稱：靶核酸的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測樣品中具有靶序列的靶核酸的方法和試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒使得靶核酸可以實時檢測，并且可用于生物化學等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
已用于檢測樣品中具有靶序列的靶核酸的方法包括其中使用探針的雜交法、其中使用寡核苷酸引物的PCR法和其它方法。此外，PCR法一般用于包括靶核酸檢測和克隆在內(nèi)的各個領(lǐng)域，并且已開發(fā)出各種改進方法。
所謂實時PCR已知是靶序列擴增及其擴增產(chǎn)物分析同時進行的PCR法。擴增產(chǎn)物的分析手段已知包括例如Taq-Man探針法(US5,210,015A、JP 06-500021 A和Holland等，Pro.Natl.Aca.Sci.USA.，88，7276-7280，1991)、分子信標法(molecular beacon method)(JP 05-123195A，Sanjay Tyagi等，Nature Biotechnology，第14卷，1996年3月)、嵌入劑法(interealator method)(Bio/Technology，10，413-417，1992，Bio/Technology，11，1026-1030，1993，和JP 05-237000A)等。
在Taq-Man探針法中，使用熒光物質(zhì)和用猝滅劑標記的探針，猝滅劑猝滅由熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光。當探針與靶核酸雜交時，猝滅劑猝滅熒光，而當探針被PCR擴增反應中所用的5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶切割，結(jié)果是熒光物質(zhì)因與猝滅劑分離而發(fā)射熒光。根據(jù)這種熒光，即可獲知雙鏈DNA分子的含量。
此外，分子信標法是使用探針的方法，該探針包括一段與靶序列互補的序列和所述序列兩端彼此互補的臂、以及與其兩端鍵合的熒光物質(zhì)和猝滅劑。當探針退火至靶核酸時，熒光物質(zhì)發(fā)射熒光，而當探針與靶核酸分離時，探針形成臂，結(jié)果是熒光物質(zhì)和猝滅劑彼此靠得較近，引起猝滅。
另一方面，嵌入劑法是使用諸如溴化乙錠等嵌入劑檢測雙鏈DNA的方法。
如上所述，雖然已經(jīng)知道實時定量檢測PCR擴增產(chǎn)物的方法，但是還存在一些問題Taq-Man探針法不能在使用沒有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶擴增方法的情況下使用；分子信標法在設(shè)計探針上有困難而且因為分子間鍵使檢測效果差；而嵌入劑法沒有序列特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是根據(jù)上述觀點提出來的，本發(fā)明的目的是提供一種用于簡便地實時定量檢測靶核酸的方法和試劑盒，且無需使用具有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)進行了深入的研究，以便達到上述目的，結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)了使用兩種不同長度的探針能簡便地定量檢測靶核酸，因而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明涉及(1)一種用于檢測樣品中具有靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括下述步驟(a)將第一探針、第二探針和樣品在其中第一探針和第二探針退火以及第一探針和靶核酸退火的條件下混合，其中第一探針包括的核酸具有一個其序列與所述靶序列互補的特異性區(qū)和一個其序列與所述靶核酸的靶序列不互補的非特異性區(qū)；而第二探針包括的核酸具有至少與第一探針的非特異性區(qū)部分互補的第一區(qū)、其序列與第一探針不互補的環(huán)狀區(qū)和至少與第一探針的特異性區(qū)部分互補的第二區(qū)，所述環(huán)狀區(qū)當?shù)诙结樑c第一探針退火時能形成一個環(huán)，其中所述核酸用標記物質(zhì)標記，所述標記物質(zhì)產(chǎn)生可以檢測出上述環(huán)形成的信號；和(b)檢測所述標記物質(zhì)的信號。
(2)項(1)的方法，其中第二探針的第二區(qū)要比第一探針的特異性區(qū)短。
(3)項(1)或(2)的方法，其中所述標記物質(zhì)包括熒光物質(zhì)和猝滅劑，所述猝滅劑當靠近熒光物質(zhì)并排列成將所述環(huán)狀區(qū)夾在其中時，能猝滅所述熒光物質(zhì)的熒光，其中當?shù)谝惶结樅偷诙结樛嘶鹦纬伤霏h(huán)時，所述熒光物質(zhì)的熒光被猝滅劑猝滅，而當?shù)谝惶结樅偷诙结槢]有退火時與所述探針退火時相比則所述熒光物質(zhì)的熒光未被猝滅。
(4)項(1)-(3)中任一項的方法，其中對所述信號進行定量檢測，從而定量檢測所述靶核酸。
(5)一種用于檢測樣品中具有靶序列的靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含第一探針和第二探針，其中第一探針包括的核酸具有一個其序列與所述靶序列互補的特異性區(qū)和一個其序列與所述靶核酸的靶序列不互補的非特異性區(qū)；而第二探針包括的核酸具有至少與第一探針的非特異性區(qū)部分互補的第一區(qū)、其序列與第一探針不互補的環(huán)狀區(qū)和至少與第一探針的特異性區(qū)部分互補的第二區(qū)，所述環(huán)狀區(qū)當?shù)诙结樑c第一探針退火時能形成一個環(huán)，其中所述核酸用標記物質(zhì)標記，所述標記物質(zhì)產(chǎn)生可以檢測出上述環(huán)形成的信號。
附圖簡述

圖1是說明本發(fā)明構(gòu)思的示意圖，其中F表示熒光物質(zhì)，而Q表示猝滅劑。
圖2圖示反應混合物(未經(jīng)加熱處理)的熒光強度隨時間的變化，其中實線探針1+探針2+靶寡核苷酸虛線探針1+探針2
長短交替的虛線探針2。
圖3圖示反應混合物(經(jīng)加熱處理)的熒光強度隨時間的變化。
本發(fā)明的方法是用于檢測樣品中具有靶序列的靶核酸的方法。所述靶核酸并無具體限制，只要具有所述靶序列即可；它可以是DNA或RNA，它可以是單鏈或雙鏈。本發(fā)明最好應用于特別是雙鏈DNA的檢測。在本發(fā)明的優(yōu)選模式中，所述靶核酸是定量檢測的。注意到定量檢測包括核酸絕對量的檢測以及核酸相對量的檢測。
所述靶序列通常是特異性針對所述靶核酸的序列，所述靶序列在序列和長度上并無具體限制，只要它可與探針形成特異性雜交即可，所述探針具有與所述靶序列互補的序列。所述靶序列的長度最好是不少于6個堿基，更優(yōu)選不少于15個堿基。
含有所述靶核酸的樣品并無具體限制，它們包含從細胞或組織提取的核酸或核酸混合物，PCR核酸擴增反應混合物采用這樣的核酸或核酸混合物作為模板。
在本發(fā)明中，在檢測所述靶核酸中使用了兩種探針(參見圖1)。第一探針(在下文也稱為“探針1”)包括的核酸具有一個其序列與所述靶序列互補的特異性區(qū)和一個其序列與所述靶核酸的靶序列不互補的非特異性區(qū)(圖1A)。因為具有這樣的結(jié)構(gòu)，當探針1與所述靶核酸雜交時，所述非特異性區(qū)仍然保持為單鏈并形成一個瓣(flap)(圖1B)。所述非特異性區(qū)的長度優(yōu)選不少于10個堿基，更優(yōu)選10-30個堿基。
第二探針(在下文也稱為“探針2”)包含的核酸具有至少與上述探針1的非特異性區(qū)部分互補的第一區(qū)、其序列與探針1不互補的環(huán)狀區(qū)和至少與探針1的特異性區(qū)部分互補的第二區(qū)，所述環(huán)狀區(qū)當?shù)诙结樑c第一探針退火時能形成一個環(huán)，所述核酸用標記物質(zhì)標記，所述標記物質(zhì)產(chǎn)生可以檢測出上述環(huán)形成的信號(圖1A)。
注意到圖1顯示探針1和探針2的實例，所述探針1在其5’端具有特異性區(qū)而在其3’端具有非特異性區(qū)，而探針2自其5’端起依次具有第一區(qū)、環(huán)狀區(qū)和第二區(qū)。在本發(fā)明中，探針1在其3’端可具有特異性區(qū)而在其5’端可具有非特異性區(qū)，而探針2自其3’端起依次可具有第一區(qū)、環(huán)狀區(qū)和第二區(qū)。
第一區(qū)具有至少與探針1的非特異性區(qū)部分互補的序列，優(yōu)選具有與整個非特異性區(qū)互補的序列。另一方面，第二區(qū)具有至少與探針1的特異性區(qū)部分互補的序列，優(yōu)選比所述特異性區(qū)短。通過使第二區(qū)比所述特異性區(qū)更短，探針1與探針2相比可以優(yōu)先與所述靶核酸退火。優(yōu)選第二區(qū)的長度不少于6個堿基，更優(yōu)選6-20個堿基。或者，優(yōu)選第二區(qū)比所述特異性區(qū)短1個或更多堿基，更優(yōu)選短4個或更多堿基。
所述環(huán)狀區(qū)是沒有與探針1互補的序列的區(qū)，優(yōu)選它沒有與所述靶核酸互補的序列。當探針2與探針1鍵合時，所述環(huán)狀區(qū)形成一個環(huán)中的突出部分，但當探針2和探針1彼此分開時，所述環(huán)結(jié)構(gòu)消失(圖1C)。探針2用標記物質(zhì)標記，所述標記物質(zhì)產(chǎn)生可以檢測出環(huán)形成的信號。所述標記物質(zhì)具體包括例如能量供體和能量受體，它們排列成將所述環(huán)狀區(qū)夾在其中。所述能量供體和能量受體包括例如熒光物質(zhì)和猝滅劑，所述猝滅劑能猝滅熒光物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光。當所述猝滅劑靠近熒光物質(zhì)時猝滅熒光，但當熒光物質(zhì)和猝滅劑之間的距離等于或大于某一距離時，它將不再猝滅熒光。有了這樣的熒光物質(zhì)和猝滅劑，當探針1和探針2退火形成環(huán)時，熒光物質(zhì)的熒光被猝滅劑猝滅，而當探針1和探針2沒有退火時，熒光未被猝滅。因此，通過測定熒光物質(zhì)的熒光，則可以測定環(huán)的形成，也就是說，探針1和探針2處于雜交狀態(tài)。熒光物質(zhì)的實例包括熒光素染料，例如熒光素和異硫氰酸熒光素(FITC)，而猝滅劑的實例包括羅丹明染料，例如四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)和磺基羅丹明101單磺酰氯衍生物(商品名Texas Red)。其中，一種優(yōu)選的組合是FITC和Texas Red。這些標記物質(zhì)可以通過采用具有與這些標記物質(zhì)鍵合的寡核苷酸進行探針2的化學合成，以引入到所述序列的任何所需部分。任何所述熒光物質(zhì)和猝滅劑都可以在5’端。
所述環(huán)狀區(qū)的序列和長度并無具體限制，只要當探針1和探針2退火時形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且在所述環(huán)結(jié)構(gòu)形成和消失的情況下有來自標記物質(zhì)的信號不同即可。注意到優(yōu)選的所述環(huán)狀區(qū)是所述環(huán)狀區(qū)既不與探針2的第一區(qū)和第二區(qū)形成部分雙鏈，也不在環(huán)狀區(qū)內(nèi)形成部分雙鏈。所述環(huán)狀區(qū)的長度優(yōu)選大于10個堿基，更優(yōu)選大于20個堿基。所述標記物質(zhì)最好鍵合到所述環(huán)狀區(qū)兩端的3個堿基內(nèi)的部分，更優(yōu)選鍵合到末端堿基上。
將上述探針1、探針2和樣品在探針1和探針2退火以及探針1和靶核酸退火的條件下混合。然而，根據(jù)所述探針的上述結(jié)構(gòu)，探針1比探針2優(yōu)先與靶核酸退火。混合順序不是特別的問題；例如，將探針1和探針2混合，然后加入樣品。此外，可提前制備探針1和探針2的預混合物。此外，優(yōu)選將不含有探針1和/或樣品的反應混合物用作對照。
優(yōu)選將探針1和探針2以摩爾比為1∶1混合。優(yōu)選探針1和探針2各自在反應混合物中的終濃度不小于0.1μM。
當將探針1、探針2和樣品混合后，或者可以將所述混合物本身暴露在其中探針1和探針2退火以及探針1和靶核酸退火的條件下，或者將所述混合物經(jīng)加熱變性處理后暴露在上述條件下。
讓上述反應混合物靜置一定時間，優(yōu)選在達到平衡狀態(tài)后，檢測所述標記物質(zhì)的信號。更優(yōu)選實時檢測所述信號。上述條件包括例如溫度比探針1和探針2的Tm低3-10℃。通過用不同溫度在不同階段進行實時信號檢測，以選擇能達到與對照相比的差異最顯著，可以容易地測定最佳條件。在使用FITC作為熒光物質(zhì)而Texas Red作為猝滅劑的情況下，通過在515nm熒光波長下檢測FITC的熒光強度，進行信號檢測。用市售的儀器進行熒光強度的檢測。檢測結(jié)果示于圖2和圖3。這些結(jié)果將在以下的實施例中詳細說明。
通過定量檢測所述標記物質(zhì)的信號，可以定量檢測靶核酸的含量。
本發(fā)明的試劑盒是用于檢測上述靶核酸的試劑盒，并且包括探針1和探針2。每種探針可以是溶液制劑或凍干制劑。此外，每種探針可裝在單獨容器中，或者混裝于同一容器中。本發(fā)明的試劑盒還包含用于溶解或稀釋各種探針或樣品的緩沖液。
本發(fā)明的方法和試劑盒最好可用于實時定量檢測核酸擴增反應混合物中的擴增產(chǎn)物。本發(fā)明的試劑盒可包含一種用于通過核酸擴增法擴增這樣的靶核酸的寡核苷酸引物。所述引物可以裝在單獨容器中，與裝各種探針的容器分開。
實施例在下文，將通過實施例詳細地描述本發(fā)明。
合成探針1(SEQ ID NO1)、探針2(SEQ ID NO2)和靶寡核苷酸(SEQ ID NO3)。每種寡核苷酸都是請求Japan Bio Service Co.，Ltd.合成的。用FITC標記探針2的堿基21的核苷酸(T)，而用Texas Red標記堿基52的核苷酸(T)。注意到所述靶寡核苷酸是人糊精基因的部分序列。
探針1的堿基1-28與所述靶寡核苷酸的堿基6-33互補。探針1的堿基11-33和堿基35-55分別與探針2的堿基52-74和堿基1-21互補。注意到SEQ ID NO2的堿基57-74與SEQ ID NO3的堿基6-23同源。
將每種寡核苷酸溶于TE緩沖液中至5μM。在一支1.5ml試管中加入2.2μl 10×Ex Taq緩沖液(Takara Shuzo Co.，Ltd.Lot.A6501-1)、19.8μl無菌蒸餾水和1μl探針2溶液(5μM)，將它們混合均勻，將23μl所述混合物分裝到反應器(Cepheid Co.，Smart Cycler)的每個25μl管中。在每管中加入1μl探針1溶液(5M)或TE緩沖液，再加入1μl靶寡核苷酸溶液(5μM)或TE緩沖液，以得到反應混合物。該操作在室溫下進行。
將上述反應混合物或在94℃下加熱處理3分鐘的上述反應混合物放在Smart Cycler中，將溫度調(diào)節(jié)到47℃，在505-537nm的波長下測量熒光。未經(jīng)加熱處理的反應混合物的結(jié)果示于圖1，而經(jīng)加熱處理的反應混合物的結(jié)果示于圖2。
僅用探針2，可觀察到熒光，但是在加入了探針1的情況下熒光被大量猝滅。在除了向探針2中加入探針1以外，還加入所述靶寡核苷酸的情況下，在這兩種情況下觀察到中等強度的熒光。無論是否經(jīng)加熱處理結(jié)果都相同。
如上所述，在所述靶序列存在下，觀察到的熒光強度要比靶序列不存在的情況下高，這證實了探針1比探針2優(yōu)先鍵合所述靶序列，而一部分探針2是游離的。
工業(yè)應用性通過本發(fā)明，可以簡便地實時定量檢測靶核酸。本發(fā)明的方法不需要具有5’→3’外切核酸酶活性的聚合酶，所以可應用于各種反應體系。
序列表<110>Arkray，Inc.
<120>靶核酸的檢測方法<140>PCT/JP03/05773<141>2002-05-08<150>JP 2002-132995<151>2002-05-08<160>3<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述探針1<400>1aaagttgttg ctggaatgaa ctaaaaaatg gcaatattca catgtacagg actcag 56<210>2<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述探針2
<400>2ctgagtccag tacaactgaa taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa attgccattt 60tttagttcat tccag 75<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述靶寡核苷酸<400>3ggcaaatttt ttagttcatt ccagcaacaa ctttggtgcc attctctcat50
權(quán)利要求
1.一種用于檢測樣品中具有靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括下述步驟(a)將第一探針、第二探針和樣品在其中第一探針和第二探針退火以及第一探針和靶核酸退火的條件下混合，其中第一探針包括的核酸具有一個其序列與所述靶序列互補的特異性區(qū)和一個其序列與所述靶核酸的靶序列不互補的非特異性區(qū)；而第二探針包括的核酸具有至少與第一探針的非特異性區(qū)部分互補的第一區(qū)、其序列與第一探針不互補的環(huán)狀區(qū)和至少與第一探針的特異性區(qū)部分互補的第二區(qū)，所述環(huán)狀區(qū)當?shù)诙结樑c第一探針退火時能形成一個環(huán)，其中所述核酸用標記物質(zhì)標記，所述標記物質(zhì)產(chǎn)生可以檢測出上述環(huán)形成的信號；和(b)檢測所述標記物質(zhì)的信號。
2.權(quán)利要求1的方法，其中第二探針的第二區(qū)要比第一探針的特異性區(qū)短。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述標記物質(zhì)包括熒光物質(zhì)和猝滅劑，所述猝滅劑當靠近熒光物質(zhì)并排列成將所述環(huán)狀區(qū)夾在其中時，能猝滅所述熒光物質(zhì)的熒光，其中當?shù)谝惶结樅偷诙结樛嘶鹦纬伤霏h(huán)時，所述熒光物質(zhì)的熒光被猝滅劑猝滅，而當?shù)谝惶结樅偷诙结槢]有退火時與所述探針退火時相比則所述熒光物質(zhì)的熒光未被猝滅。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中對所述信號進行定量檢測，從而定量檢測所述靶核酸。
5.一種用于檢測樣品中具有靶序列的靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含第一探針和第二探針，其中第一探針包括的核酸具有一個其序列與所述靶序列互補的特異性區(qū)和一個其序列與所述靶核酸的靶序列不互補的非特異性區(qū)；而第二探針包括的核酸具有至少與第一探針的非特異性區(qū)部分互補的第一區(qū)、其序列與第一探針不互補的環(huán)狀區(qū)和至少與第一探針的特異性區(qū)部分互補的第二區(qū)，所述環(huán)狀區(qū)當?shù)诙结樑c第一探針退火時能形成一個環(huán)，其中所述核酸用標記物質(zhì)標記，所述標記物質(zhì)產(chǎn)生可以檢測出上述環(huán)形成的信號。
全文摘要
按照下述步驟檢測樣品中具有靶序列的靶核酸(a)將樣品與第一探針和第二探針在允許第一探針與第二探針以及第一探針與靶核酸退火的條件下混合，其中第一探針包括的核酸具有一個其序列與如上所述的靶序列互補的特異性區(qū)和一個其序列與所述靶序列不互補的非特異性區(qū)；而第二探針包括的核酸具有至少與第一探針的非特異性區(qū)部分互補的第一區(qū)、其序列與第一探針不互補的環(huán)狀區(qū)和至少與第一探針的特異性區(qū)部分互補的第二區(qū)，所述環(huán)狀區(qū)當?shù)诙结樑c第一探針退火時能形成一個環(huán)，其中所述核酸用標記物質(zhì)標記，所述標記物質(zhì)使得能夠檢測出以上所形成的環(huán)；和(b)檢測由第一探針和第二探針所形成的所述環(huán)。
文檔編號C12Q1/68GK1653191SQ0381024
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月8日
發(fā)明者豬瀨健 申請人:愛科來株式會社