釀酒酵母內(nèi)乙酰輔酶a綜合利用的雙調(diào)控策略的制作方法
【專利摘要】釀酒酵母內(nèi)乙酰輔酶A綜合利用的雙調(diào)控策略。本發(fā)明提供線粒體內(nèi)乙酰輔酶A代謝調(diào)控方法，并建立了細(xì)胞質(zhì)和線粒體雙調(diào)控的策略。本發(fā)明成功將以上策略用于類異戊二烯中的關(guān)鍵合成單體異戊二烯的生物合成中。
【專利說(shuō)明】
釀酒酵母內(nèi)乙酰輔酶A綜合利用的雙調(diào)控策略
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于代謝工程領(lǐng)域，具體涉及一種釀酒酵母內(nèi)乙酰輔酶A綜合利用的雙調(diào) 控策略。
【背景技術(shù)】
[0002] 釀酒酵母是第一個(gè)進(jìn)行全基因組測(cè)序的真核微生物，由于其遺傳操作簡(jiǎn)便、基因 其遺傳操作簡(jiǎn)便、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理清楚且高密度發(fā)酵技術(shù)成熟，被視為理想的細(xì)胞工廠， 廣泛應(yīng)用于生物基產(chǎn)品生產(chǎn)和技術(shù)研究。
[0003] 乙酰輔酶A的是釀酒酵母中的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，可作為前體物進(jìn)行類異戊二烯、聚酮 化合物、脂類、聚羥基脂肪酸酯、丁醇等重要天然代謝產(chǎn)物的生物合成。在釀酒酵母中，乙酰 輔酶A主要分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。由于MVA和脂肪酸等途徑存在于細(xì)胞質(zhì)中，為方便操 作，目前研究主要集中于細(xì)胞質(zhì)中的調(diào)控。當(dāng)前釀酒酵母中提高類異戊二烯產(chǎn)量的最常用 策略主要集中于MVA途徑的代謝工程調(diào)控：1)提高前體物IPP和DMAPP的供應(yīng)量，如過(guò)表達(dá) MVA途徑中的限速酶tHMGl;2)過(guò)表達(dá)固醇生物合成的全局轉(zhuǎn)錄因子upc2-l;3)抑制競(jìng)爭(zhēng)性 代謝支路，例如，在類胡蘿卜素合成途徑中，通過(guò)添加麥角固醇生物合成抑制劑或?qū)⒔酋徬?合成酶基因的啟動(dòng)子換成甲硫氨酸啟動(dòng)子，對(duì)競(jìng)爭(zhēng)路徑進(jìn)行下調(diào)。
[0004] 由于肉毒堿穿梭系統(tǒng)和合成機(jī)制的缺乏，故很難實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)間的乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化，這就造成了相當(dāng)線粒體內(nèi)乙酰輔酶A的浪費(fèi)。線粒體作為獨(dú)立的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)， 在其中進(jìn)行代謝調(diào)控具有很大的優(yōu)勢(shì)：1)線粒體中有TCA、氨基酸、脂肪酸等中心代謝途徑， 且其環(huán)境中pH較高，氧氣濃度較低，有更多的氧化還原力，其環(huán)境對(duì)輔酶鐵硫簇較為有利； 2)線粒體體積較小，能增加底物濃度，提高反應(yīng)速率和產(chǎn)量;3)可以消除反饋調(diào)節(jié)及代謝流 到競(jìng)爭(zhēng)途徑的轉(zhuǎn)化。因此如何利用線粒體內(nèi)的乙酰輔酶A并對(duì)細(xì)胞質(zhì)和線粒體兩個(gè)亞細(xì)胞 結(jié)構(gòu)進(jìn)行協(xié)同調(diào)控對(duì)于釀酒酵母中類異戊二烯、脂類等代謝產(chǎn)物的生物合成具有重要意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的至少一個(gè)不足，提供一種提高釀酒酵母內(nèi)乙酰輔酶A 的綜合利用的調(diào)控策略，實(shí)現(xiàn)提高釀酒酵母內(nèi)乙酰輔酶A的綜合利用能力的發(fā)明目的。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供一種釀酒酵母內(nèi)線粒體內(nèi)乙酰輔酶A利用的調(diào)控策略，將MVA途徑的7 個(gè)基因定位到線粒體中實(shí)現(xiàn)線粒體內(nèi)乙酰輔酶A的利用。
[0008] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，基因在線粒體內(nèi)的定位方法為，在基因的前端引入 氨基酸序列SEQ ID N0:1，其中SEQ ID NO: 1的前25個(gè)氨基酸為細(xì)胞色素 c氧化酶IV亞基的 前導(dǎo)肽序列，第25和26位氨基酸為蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)LQ。在前導(dǎo)肽的作用下，基因可以定位到 線粒體中，之后在螯合劑感應(yīng)的蛋白酶作用下，蛋白序列LQ之間的肽鍵會(huì)發(fā)生斷裂，生成成 熟蛋白多肽。
[0009] 編碼氨基酸序列SEQ ID NO: 1的堿基序列為SEQ ID NO:2。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種釀酒酵母內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)乙酰輔酶A利用的雙調(diào)控策 略，將通過(guò)以上方法構(gòu)建的線粒體代謝工程菌株和細(xì)胞質(zhì)工程菌進(jìn)行雜交，構(gòu)建雙倍體菌 株，該菌株可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)跟線粒體調(diào)控策略的結(jié)合，提高細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A的綜合利用 率。
[0011] 其中線粒體工程菌將MVA途徑的7個(gè)基因定位到線粒體中實(shí)現(xiàn)線粒體內(nèi)乙酰輔酶A 的利用。
[0012] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述細(xì)胞質(zhì)工程菌采用釀酒酵母內(nèi)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)乙酰輔 酶A利用的調(diào)控策略，即推-拉-阻策略，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)乙酰輔酶A到異戊二烯的合成。推即過(guò) 表達(dá)細(xì)胞質(zhì)代謝途徑中的限速酶，拉是過(guò)表達(dá)目的途徑的催化酶，阻是弱化競(jìng)爭(zhēng)途徑中的 關(guān)鍵酶的表達(dá)量或者酶活。
[0013] 進(jìn)一步，作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，線粒體工程菌和細(xì)胞質(zhì)工程菌選擇具有不 同交配型的野生菌作為基礎(chǔ)菌株。如BY4741(交配型a)(ATCC201388)、BY4742(交配型a型） (ATCC201389)等。
[0014] 進(jìn)一步，線粒體工程菌和細(xì)胞質(zhì)工程菌兩者具有不同的影響缺陷型，然后將其進(jìn) 行雜交，在含有雙營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行篩選。
[0015] 本發(fā)明的有益效果：
[0016]通過(guò)引入細(xì)胞色素 c氧化酶IV亞基的前導(dǎo)肽，成功地將基因定位到線粒體內(nèi)，建立 了線粒體內(nèi)乙酰輔酶A代謝調(diào)控的方法。建立了細(xì)胞質(zhì)的推-拉-阻代謝調(diào)控策略。最后通過(guò) 菌株雜交的方式，建立了細(xì)胞質(zhì)和線粒體雙調(diào)控的策略。在具體實(shí)施實(shí)例中，成功將以上策 略用于類異戊二烯中的關(guān)鍵合成單體異戊二烯的生物合成中。此發(fā)明為代謝工程改造釀酒 酵母生產(chǎn)異戊二烯的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。此外，以上策略也為釀酒酵母內(nèi)其他高附加值的 化學(xué)產(chǎn)品的生物合成提供了新的技術(shù)方法。
[0017] 為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為雙調(diào)控策略的示意圖。
[0019] 圖2為實(shí)施例1中PUG35-MLS26圖譜。
[0020] 圖3為實(shí)施例1中MLS26的線粒體定位能力的驗(yàn)證圖。
[0021 ]圖4A為實(shí)施例2中MVA途徑在線粒體內(nèi)定位的基因表達(dá)盒結(jié)構(gòu)。
[0022]圖4B為實(shí)施例2中MVA途徑在線粒體內(nèi)定位基礎(chǔ)組裝工具圖。
[0023] 圖5為實(shí)施例2中MVA在線粒體定位后的基因型鑒定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 圖1為雙調(diào)控策略的示意圖。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0025] 實(shí)施例1基因在線粒體中的定位方法及鑒定
[0026] 選用具有較強(qiáng)熒光度的EGFP基因（EGFP為GFP根據(jù)白色念球菌偏好型優(yōu)化后，通過(guò) 2個(gè)位點(diǎn)的改變?cè)黾恿藷晒鈴?qiáng)度基因序列）單拷貝質(zhì)粒PUG35(GenBank:AF298787.1)作為報(bào) 告載體。在線粒體定位序列的表征中，在EGFP的ATG前端引入細(xì)胞色素 c氧化酶IV亞基的前 導(dǎo)肽序列的堿基序列為SEQ ID勵(lì):2，構(gòu)建?呢35-]\0^26質(zhì)粒，？1^35-]\0^26圖譜如圖2所示。 即以釀酒酵母BY4742基因組為模板，利用BamHI-MLS26-Fl及HindIII-MLS26-Rl為引物（弓丨 物的具體序列見附表1)，擴(kuò)增出MLS26序列，與PUG35質(zhì)粒一起用BamHI和Hindlll雙酶切后， 連接。將HJG35及重組質(zhì)粒PUG35-MLS26分別轉(zhuǎn)入BY4742,用SD-MET-URA雙缺陷培養(yǎng)基平板 篩選并培養(yǎng)后，用共聚焦熒光顯微鏡鑒定熒光蛋白的定位。結(jié)果如圖3所示，融合有MLS26序 列的熒光蛋白定位與線粒體熒光染料定位一致，該結(jié)果表明可以通過(guò)融合MLS26序列將基 因成功定位到線粒體中。
[0027]實(shí)施例2乙酰輔酶A的線粒體調(diào)控
[0028]為驗(yàn)證線粒體代謝調(diào)控策略的實(shí)用性，以MVA途徑為例，對(duì)異戊二烯的生物合成進(jìn) 行了探究。在基因于線粒體的定位實(shí)驗(yàn)中，基因表達(dá)盒由啟動(dòng)子-定位序列-基因-抗原標(biāo) 記-終止子組成（圖4A)，為了實(shí)現(xiàn)MVA途徑的快速整合型組裝，如圖4B所示，構(gòu)建了 pURMI-21-MLS(SEQIDN0:3)及pUMRI-22-MLS兩個(gè)載體(SEQIDN0:3)。質(zhì)粒構(gòu)建方法為體外同源 同組法（即無(wú)縫克隆法），采用NovoRec?PCR-步定向克隆試劑盒。構(gòu)建過(guò)程為:首先以P MG35-MLS26 為模板，MLS26-BamHI-F2&MLS26-BamHI-R2，MLS26-BamHI-F3&MLS26-BamHI-R2，MLS26-EcoRI-F2&MLS26-EcoRI-R2，MLS26-EcoRI-F3&MLS26-EcoRI-R3 為引物對(duì)，擴(kuò)增出 MLS26-BamHI-2/3及MLS26-EcoRI-2/3片段;然后采用Dpnl酶將PCR產(chǎn)物中殘留的模板降解 掉，清洗備用;利用同源重組的方法，將MLS26-BamHI-2和MLS26-BamHI-3片段分別重組到的 線性化的 pURMI-22 及 pURMI-21 的 BamHI 酶切位點(diǎn)處，構(gòu)建 pURMI-22-MLS(B)及 pURMI-21-MLS (B);利用同源重組的方法，將MLS26-EcoRI-2和MLS26-EcoRI-3片段分別重組到的線性化的 pURMI-22 及 pURMI-21 的 EcoRI 酶切位點(diǎn)處，構(gòu)建 pURMI-22-MLS(B)-MLS(E)及 pURMI-21-MLS (B) -MLS(E)，即pURMI-22-MLS和pURMI-21-MLS，具體引物可見表 1。
[0029] 表1引物序列
[0030]
[0031] 在 MVA 途徑于線粒體的組裝中，構(gòu)建了 PUMRI-21-MLS-A LPP1-HMGS-ERG10、PUMRI- 21-MLS-Δ DPPl-PMK-tHMGl-2、PUMRI-22-MLS-Δ H0-tHMGl-ERG12和PUMRI-22-MLS-Δ GAL80-MVD1-IDI1四個(gè)重組質(zhì)粒。以上基因序列均來(lái)源于釀酒酵母BY4741(GenBank: JRIS00000000.1)。以pUMRI-21-MLS-ERG10-HMGS 為例，HMGS 和 ERG10 分別用 HMGS-F1&HMGS-R1和ERG10-F1&ERG10-R1為引物，以釀酒酵母基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后插入到 pUMRI-21-MLS的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，生成質(zhì)粒pUMRI-21-MLS-HMGS-ERGlO。以LPPl-UpFl&LPPl-UpR 1為引物，擴(kuò)增得到LPP1 -UP同源臂，以LPP1-DF1 &LPP 1 -DR 1為引物，擴(kuò)增得到LPP1 -Do wn 同源臂，然后用生成的LPP1 -UP同源臂和LPP1 -Down同源臂為模板，LPP1 -UpR 1 and LPP1 -DF1 為引物，通過(guò)重疊衍生PCR的方法擴(kuò)增出LPP1同源臂，通過(guò)同源重組的方法整合到pUMRI-21-MLS-HMGS-ERG10的Sf i I位點(diǎn)，生成質(zhì)粒pUMRI-21-MLS-Δ LPP1-HMGS-ERG10。同理，其它 的三個(gè)重組質(zhì)粒均按以上方法構(gòu)建，涉及引物如表2所示。
[0032] 表 2
[0033]

[0035] 來(lái)源于銀白楊的異戊二稀合酶（ispS)基因序列來(lái)自Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Bank:AB198180)，密碼子優(yōu)化后的序列為（SEQ ID N0:5)，其序列不含有信號(hào)肽，由上海生 工公司化學(xué)合成。為將ISPS定位到線粒體中，構(gòu)建了 pESC-URA-2MISPS質(zhì)粒：以pUMRI-21-MLS為模板，MLS-F4及MLS-R4為引物，擴(kuò)增出MLS26-PGAL1-PGAL10-MLS26片段，然后插入到 pESC-URA 載體(GenBank: AF063585 · 2)的 BamHI 和 Not 頂每切位點(diǎn)處，生成 pESC-URA-2MISPS。
[0036] 將以上四個(gè)重組質(zhì)粒卩1]]\?1-21-]\11^-&1^?1-腿6541^10、？1]]\?1-21-]\11^-&〇??1-PMK-tHMGl-2、PUMRI-22-MLS- Δ H0-tHMGl-ERG12和PUMRI-22-MLS- Δ GAL80-MVD1-IDI1 依次 用Sf i I酶切線性化，通過(guò)電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)入BY4742，實(shí)現(xiàn)MVA途徑在線粒體的基因整合，最后 菌株的基因型經(jīng)PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示，所有的PCR擴(kuò)增DNA片段大小均與理論值一致，最 后檢測(cè)目的產(chǎn)物異戊二烯的產(chǎn)量提高了 4倍。通過(guò)好氧發(fā)酵后異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到108mg/L。
[0037] 實(shí)施例3細(xì)胞質(zhì)的推-拉-阻策略及細(xì)胞質(zhì)&線粒體的雙調(diào)控策略的建立
[0038] 為了綜合利用工程菌釀酒酵母中的乙酰輔酶A，同樣以異戊二烯的生物合成為例， 首先，對(duì)細(xì)胞質(zhì)自身的MVA途徑進(jìn)行調(diào)控，建立了推-拉-組的結(jié)合策略。然后，將以上方法進(jìn) 行了組合，建立了細(xì)胞質(zhì)和線粒體的雙調(diào)控策略。
[0039] 1)推策略的建立-過(guò)表達(dá)HMGR
[0040]用真菌基因組提取試劑盒提取釀酒酵母BY4741的基因組DNA，利用引物tHMGlF3 (CCCGGATCCAAAAATGGACCAATTGGTGAAAACTGAAG)/tHMGlR (CCCGTCGACTTAGGATTTAATGCAGGTGACG)從BY4741 基因組DNA上擴(kuò)增了 HMG1 基因的催化區(qū)段 tHMGl。反應(yīng)程序?yàn)?98 °C變性10s，55 °C退火5s，72°C延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5分鐘。 BamHI+SalI酶切后克隆到pMRI-11 (SEQ ID N0: 6)載體上，形成pMRI-11-tHMGl。通過(guò)在 tHMGl基因內(nèi)部選用內(nèi)切酶Bglll對(duì)載體線性化后電轉(zhuǎn)釀酒酵母BY4741，涂布于含有G418 的Yro平板上，待3天長(zhǎng)出菌落后，接種于YH)培養(yǎng)液，1天后提取基因組，進(jìn)行基因型驗(yàn)證，通 過(guò)培養(yǎng)，氣相分析產(chǎn)量提高了一倍，達(dá)到〇.〇9mg · Γ1。
[0041 ] 2)拉策略-ISPS過(guò)表達(dá)
[0042]以克隆好的i spS基因作為模板，利用高保真DNA聚合酶(TAKARA，上海）以上游引物 P5(AAATATGCGGCCGCAAAAAATGTGTTCTGTTAGCACT)和下游弓| 物 P6 (GGAAGATCTTTAACGTTCAAACGGCAGG)作為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?98 °C 變性 10 s，5 5 °C 退火5s，72°C延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸5分鐘。所得的DNA與質(zhì)粒pESC-URA-ispS分別 用No 11和Bgl II雙酶切，通過(guò)T4DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入制備好的大腸桿菌化轉(zhuǎn)感受態(tài)，然 后加入LB培養(yǎng)基37度復(fù)蘇1小時(shí)，離心后均勻涂布在含有氨芐抗性的LB平板上。挑取若干單 菌落，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過(guò)per或雙酶切的方式篩選出陽(yáng)性克隆。其陽(yáng)性質(zhì)粒 命名為pESC-URA-ispS-ispS。將pESC-URA-ispS-ispS通過(guò)電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)化入過(guò)程1菌株，涂 布在營(yíng)養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基SD-URA-上。挑取形態(tài)大小正確的菌株，接種于3ml SD-URA-培養(yǎng) 液中，1天后轉(zhuǎn)接l〇〇ul于裝有5ml新的SG-URA-培養(yǎng)基的密閉小瓶中，厭氧發(fā)酵，2天后，通過(guò) 氣相檢測(cè)異戊二烯的產(chǎn)量，其產(chǎn)量達(dá)到〇.2mg · Γ1。
[0043] 3)阻策略-ERG20的下調(diào)
[0044] 為了削弱這些競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑代謝流，我們采用了啟動(dòng)子替換的方式，將弱啟動(dòng) 子pBTSl和pHXTl整合到ERG20基因的啟動(dòng)子位點(diǎn)，用同源重組的方法替換掉ERG20基因自身 的啟動(dòng)子區(qū)段，其方法如下：
[0045]制備ERG20啟動(dòng)子替換的同源臂
[0046]上游同源臂克隆片段為ERG20啟動(dòng)子上游區(qū)段，其序列如下：
[0047]
ACAGTGTGAGGTATTCTAAGC，其克隆方法為以釀酒酵母BY4741基因組作為模板，引物P9
CCTCACACTG)作為引物，利用Pr imer Star高保真聚合酶進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?8 °C變性 10s，55°C退火5s，72°C延伸1分鐘，32個(gè)循環(huán)，72°C延伸5分鐘。
[0048]下游同源臂克隆片段為ERG20編碼區(qū)段的前l(fā)OOObp，其序列如下：
[0049]
其克隆方法為以釀酒酵母B Y 4 7 4 1基因組作為模板，P 1 1
作為引物，利用Primer Star高保真聚合酶進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序?yàn)?98°C變性10s，55°C退火 5s，72 °C延伸1分鐘，32個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5分鐘。
[0050] 上下游同源臂的拼接:上述上下游per片段具有20個(gè)堿基左右的同源序列，故可以 通過(guò)over lap PCR的方法進(jìn)行拼接。其步驟為：以上述PCR的兩個(gè)片段作為模板，P11
CCTCACACTG)作為引物，利用Primer Star高保真聚合酶進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?8°C變性 10s，55 °C退火5s，72 °C延伸2分鐘，32個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5分鐘。所得PCR片段通過(guò)凝膠電泳的 方法進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)割膠回收或者PCR清洗的方法獲取較純的融合PCR片段。
[0051 ] 將上述融合PCR片段與之前構(gòu)建好的質(zhì)粒PMRI-28(SEQ ID N0:7WPPMRI-29(SEQ ID觀:8)分別用化丨1〇4以1^)和3^1〇41^1^)進(jìn)行分步雙酶切0〇丨1酶切體系為：26111 DNA+3ul buffer+lul酶，37度酶切3h; Sf iI酶切體系同上，50度酶切3h;(注:單步酶切后要 用per清洗試劑盒清洗過(guò)后進(jìn)行下步反應(yīng)）。用PCR清洗試劑盒清洗過(guò)后，用T4DNA連接酶進(jìn) 行連接(體系：20ul = 8ul酶切質(zhì)粒+9ul酶切PCR產(chǎn)物+2ul反應(yīng)緩沖液+lul T4DNA連接酶，混 勻后，放置在22度金屬浴中反應(yīng)20-30分鐘)然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)，涂布于含有卡納 的LB平板上。按照上述同樣的方法進(jìn)行菌株的驗(yàn)證，挑選出陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒。
[0052] 將PMRI-28-ERG20和PMRI-29-ERG20用Sail酶進(jìn)行單酶切，酶切體系為：43ul質(zhì)粒+ 5ul buffer+2ul酶，37度酶切3h。然后進(jìn)行PCR清洗，最后濃縮到20ul。取10ul感受態(tài)轉(zhuǎn)化入 50ul過(guò)程2的電轉(zhuǎn)感受態(tài)中，750V電壓電擊（1mm電轉(zhuǎn)杯），添加 lmlYNB培養(yǎng)液復(fù)蘇lh，然后涂 布在含有G418的YH)平板上。最后的陽(yáng)性克隆厭氧發(fā)酵2天后進(jìn)行氣相檢測(cè)。檢測(cè)條件為:柱 子為HP-FFAP，載氣為氮?dú)?，柱溫設(shè)為80度，檢測(cè)器與進(jìn)樣口分別為180度。用密封型取樣器 頂空取樣800ul進(jìn)行分析，最后檢測(cè)異戊二烯產(chǎn)量分別達(dá)到4. Omg/L和9. Smg/LJ)雙調(diào)控 [0053]以異戊二烯的生物合成作為應(yīng)用實(shí)例，對(duì)細(xì)胞質(zhì)和線粒體的乙酰輔酶A進(jìn)行雙調(diào) 控。以HJG23 (GenBank: AF298783 · 1)為模板，以Hi s3-Fl (CGTTTTAAGAGCTTGGTGAGC)和出83-R1 (CGCCTCGTTCAGAATGACA)為引物進(jìn)行PCR，將PCR片段轉(zhuǎn)入實(shí)例2的菌株，將Hi s 3標(biāo)記補(bǔ)齊； 同時(shí)，以pESC-LEU(GenBank:AF063849. 1)為模板，以 markerF
PCR片段轉(zhuǎn)入實(shí)例3的菌株，將Leu標(biāo)記補(bǔ)齊，同時(shí)將調(diào)解因子GAL80P敲除;然后將兩個(gè)工程 菌株進(jìn)行雜交涂布在SD-HIS-LEU雙營(yíng)養(yǎng)缺陷平板上進(jìn)行篩選，長(zhǎng)出來(lái)的菌株即為雜交菌 株，最后將雜交菌株好氧發(fā)酵，檢測(cè)異戊二烯的生物量達(dá)到246mg/L。
[0054] 本發(fā)明所述的PCR，米用takara公司（大連）的PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Code No. :R010A)試劑盒，按照其操作說(shuō)明進(jìn)行操作。
[0055] 本發(fā)明所述的無(wú)縫克隆米用Seamless Cloning and Assembly Kit(Invitrogen) 無(wú)縫克隆試劑盒，并按其操作說(shuō)明進(jìn)行操作。
[0056]本發(fā)明中所用的引物，合成的DNA序列均由上海生物工程有限公司提供。
[0057]本發(fā)明中所述的酶切如無(wú)特別說(shuō)明，均按照Takara公司所購(gòu)買的限制性內(nèi)切酶操 作說(shuō)明進(jìn)行操作;所述的回收如無(wú)特別說(shuō)明均按照Axygen公司凝膠回收試劑盒或者PCR清 洗試劑盒進(jìn)行操作;所述的連接如無(wú)特別說(shuō)明，均采用Fermentas公司的T4DNA連接酶進(jìn)行 連接;所述大腸桿菌轉(zhuǎn)化如無(wú)特別說(shuō)明，其宿主菌都為DH5a，轉(zhuǎn)化方法均采用熱擊法進(jìn)行。 [0058]雖然本發(fā)明已由較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟知此技 藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可作些許的更動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng) 視權(quán)利要求書所要求保護(hù)的范圍為準(zhǔn)。

















【主權(quán)項(xiàng)】
1. 釀酒酵母內(nèi)線粒體內(nèi)乙酰輔酶A利用的調(diào)控策略，其特征在于，將MVA途徑的7個(gè)基因 定位到線粒體中實(shí)現(xiàn)線粒體內(nèi)乙酰輔酶A的利用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母內(nèi)線粒體內(nèi)乙酰輔酶A利用的調(diào)控策略，其特征在 于，其中所述基因在線粒體內(nèi)定位的方法為:在基因的前端引入氨基酸序列SEQ ID N0:1， 其中SEQ ID NO: 1的前25個(gè)氨基酸為細(xì)胞色素 c氧化酶IV亞基的前導(dǎo)肽序列，第25和26位氨 基酸為蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)LQ。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母內(nèi)線粒體內(nèi)乙酰輔酶A利用的調(diào)控策略，其特征在 于，在前導(dǎo)肽的作用下，基因可以定位到線粒體中，之后在螯合劑感應(yīng)的蛋白酶作用下，蛋 白序列LQ之間的肽鍵會(huì)發(fā)生斷裂，生成成熟蛋白多肽。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母內(nèi)線粒體內(nèi)乙酰輔酶A利用的調(diào)控策略，其特征在 于，編碼氨基酸序列SEQ ID NO: 1的堿基序列為SEQ ID NO:2。5. 釀酒酵母內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)乙酰輔酶A利用的雙調(diào)控策略，其特征在于，首先分別 構(gòu)建線粒體代謝工程菌株和細(xì)胞質(zhì)工程菌，然后通過(guò)雜交的方式構(gòu)建雙倍體菌株，該菌株 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)跟線粒體調(diào)控策略的結(jié)合，提高細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A的綜合利用率； 其中線粒體工程菌將MVA途徑的7個(gè)基因定位到線粒體中實(shí)現(xiàn)線粒體內(nèi)乙酰輔酶A的利 用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述釀酒酵母內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)乙酰輔酶A利用的雙調(diào)控策略，其 特征在于，所述細(xì)胞質(zhì)工程菌過(guò)表達(dá)細(xì)胞質(zhì)代謝途徑中的限速酶，過(guò)表達(dá)目的途徑的催化 酶，弱化競(jìng)爭(zhēng)途徑中的關(guān)鍵酶的表達(dá)量或者酶活。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述釀酒酵母內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)乙酰輔酶A利用的雙調(diào)控策略，其 特征在于，線粒體工程菌和細(xì)胞質(zhì)工程菌選擇具有不同交配型的野生菌作為基礎(chǔ)菌株。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述釀酒酵母內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)乙酰輔酶A利用的雙調(diào)控策略，其 特征在于，線粒體工程菌和細(xì)胞質(zhì)工程菌兩者具有不同的影響缺陷型，然后將其進(jìn)行雜交， 在含有雙營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行篩選。
【文檔編號(hào)】C12N15/04GK105950648SQ201610321188
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】于洪巍, 王凡, 呂小妹, 謝文平, 葉麗丹
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)