專(zhuān)利名稱(chēng)：衍生自人胚胎干細(xì)胞的用于脊髓損傷的再髓鞘化和治療的少突膠質(zhì)細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及胚胎細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。更具體的是，本發(fā)明提供了少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體的富集細(xì)胞群，適合用于生物學(xué)研究、藥物篩選和人類(lèi)治療。
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2002年7月11日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/395,382的優(yōu)先權(quán)和2003年4月4日提交的美國(guó)實(shí)用專(zhuān)利申請(qǐng)10/406,817的優(yōu)先權(quán)。這些優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容被引入本文作為參考。
背景在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的支持中，少突膠質(zhì)細(xì)胞起著重要的生理作用。用于人類(lèi)治療的少突膠質(zhì)細(xì)胞的可用性可促進(jìn)隔離神經(jīng)細(xì)胞的髓鞘中的受損導(dǎo)致的無(wú)能癥狀康復(fù)。
多發(fā)性硬化癥是一種漸進(jìn)的并喪失能力的脫髓鞘疾病，與大腦和脊髓神經(jīng)細(xì)胞周?chē)乃枨实闹饾u破壞相關(guān)。這種病的癥狀程度從麻木、視覺(jué)損傷以及認(rèn)知變化到癱瘓。這種病被確信有免疫學(xué)的和遺傳方面的因素，出現(xiàn)臨床癥狀的經(jīng)常在20到40歲間。僅在美國(guó)這種病就影響了大約300,000人。目前治療方案涉及β-干擾素類(lèi)或皮質(zhì)甾類(lèi)。這些藥在發(fā)病時(shí)能縮短癥狀出現(xiàn)的時(shí)間，但是通常不能防止長(zhǎng)期的能力喪失。
脊髓的外傷性創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)傷點(diǎn)附近完整軸索脫髓鞘化，從而破壞了它們的神經(jīng)傳導(dǎo)能力。在美國(guó)每年大約有11,000例新的脊髓損傷病例。SCI信息網(wǎng)(SCI Information Network)預(yù)測(cè)，對(duì)于遭受任何級(jí)別運(yùn)動(dòng)功能不完整的病人，其生存期直接花費(fèi)的范圍從400,000美元到2,200,000美元，不包括工資損失和生活質(zhì)量的影響。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞上的髓磷脂被少突膠質(zhì)細(xì)胞放在適當(dāng)?shù)奈恢?，包裹在軸索周?chē)?，形成髓鞘。Keirstead和Blakemore闡述了少突膠質(zhì)細(xì)胞及其祖細(xì)胞在疾病癥狀中的作用(Adv.Exp.Med.Biol.468183，1999)。被稱(chēng)為O-2A細(xì)胞的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞存在于正常成人的CNS中和多發(fā)性硬化癥病灶中，并參與了再髓鞘化(Scolding等，Brain 1212221，1998；以及Scolding等，Neuroscience891，1999)。充分再髓鞘化的失敗可能會(huì)發(fā)生，因?yàn)樯偻荒z質(zhì)細(xì)胞的對(duì)稱(chēng)增生會(huì)用盡大面積損傷地方的祖細(xì)胞儲(chǔ)備。
已進(jìn)行了大量的研究工作，目的是建立能應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)以恢復(fù)神經(jīng)功能的細(xì)胞群(參見(jiàn)Park等，J.Neurotrauma，16675，1999)。Keirstead等(J.Neuroscience 197529，1999)已從出生后的老鼠大腦中分離出CNS前體，該前體在移植后能產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膜細(xì)胞。Svendsen等(J.Neurosci.Meth.85141，1998)已從發(fā)育的人皮質(zhì)中分離出前體細(xì)胞。Mujtaba等(Dev.Biol.214113，1999)報(bào)道從胚胎干細(xì)胞中分離出神經(jīng)前體。
PCT出版物WO97/07200(Stanford U.)公布了從成年大鼠大腦中分離出的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的培養(yǎng)物。PCT出版物WO 01/28342(Washington U.)提出了在以預(yù)處理的少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的某些方法。美國(guó)專(zhuān)利5,753,506(Johe，CNS干細(xì)胞技術(shù))涉及一種用于維持從神經(jīng)組織中分離的具備分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)。美國(guó)專(zhuān)利6,238,922(StemCells Inc.)提出了神經(jīng)組織分化變異成具備分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)能力的細(xì)胞。美國(guó)專(zhuān)利6,235,527(Rao等，U.Utah)涉及從哺乳動(dòng)物神經(jīng)管組織分離并基于A2B5細(xì)胞表面標(biāo)記物選擇的哺乳動(dòng)物CNS神經(jīng)膠質(zhì)限制性前體細(xì)胞群。
美國(guó)專(zhuān)利5,968,829(Cytotherapeutics)要求保護(hù)含有具備生成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的CNS神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。PCT出版物WO97/32608涉及遺傳工程改造的初級(jí)少突膠質(zhì)細(xì)胞，用于CNS中的移植介導(dǎo)的傳遞。美國(guó)專(zhuān)利5,830,621(Signal Pharmaceuticals)描述了保藏于ATCC的登錄號(hào)為CRL11881的人少突膠質(zhì)細(xì)胞系。這個(gè)細(xì)胞株基本上沒(méi)有GFAP、GalC、O4和A2B5特征性標(biāo)記物。
不幸的是，至今還不清楚從神組織中分離的祖細(xì)胞是否具備足夠的復(fù)制能力來(lái)產(chǎn)生用于人類(lèi)臨床治療的必要數(shù)量的細(xì)胞。
一個(gè)備選來(lái)源是從早期胚胎組織中分離的多能細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞(ES)是25多年以前首先從小鼠胚胎中分離出來(lái)的(G.R.Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.787634，1981)。據(jù)信胚胎干細(xì)胞實(shí)際上能產(chǎn)生同一種類(lèi)任何組織類(lèi)型的后代。
Fraichard等(J.Cell Sci.1083181，1995)報(bào)道在體外小鼠的胚胎干細(xì)胞分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和功能性神經(jīng)元。Mujtaba等(Dev.Biol.214113，1999)報(bào)道從小鼠胚胎干細(xì)胞中分離到神經(jīng)前體。Li，Smith等(Cur.Biol.8971，1998)報(bào)道通過(guò)譜系選擇從小鼠胚胎干細(xì)胞中產(chǎn)生神經(jīng)元前體。Brüstle，McKay等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9414809，1997；Science 285754，1999)報(bào)道衍生自小鼠胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)前體可作為髓鞘移植物的潛在來(lái)源。McDonald等(Nat.Med51410，1999；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976126，2000)報(bào)道小鼠胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)和脊髓移植后可形成少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘。
直到最近才分離出人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(Thomson等，Science 282114，1998)。人類(lèi)胚胎干細(xì)胞需要非常不同的條件來(lái)保持它們處于未分化狀態(tài)或引導(dǎo)它們沿著特定的分化途徑分化(美國(guó)專(zhuān)利6,090,622和6,200,806；PCT出版物WO99/20741和WO01/51616)。由于這個(gè)原因，極少知道如何從人類(lèi)胚胎干細(xì)胞中制備相對(duì)較同類(lèi)的分化細(xì)胞群。
PCT出版物WO01/88104(Carpenter，Geron Corporation)描述了通過(guò)分化人類(lèi)胚胎干細(xì)胞得到的神經(jīng)祖細(xì)胞群。已獲得超過(guò)90％NCAM陽(yáng)性、35％β-微管蛋白陽(yáng)性和75％A2B5陽(yáng)性的細(xì)胞群。Zhang等(Nature Biotech.191129，2001)報(bào)道了從人類(lèi)胚胎干細(xì)胞中分化得到的可移植的神經(jīng)前體。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US02/19477(Carpenter等，Geron Corporation)描述了胚胎干細(xì)胞衍生的神經(jīng)細(xì)胞群，其中在已產(chǎn)生的細(xì)胞群中，至少10％的MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)了酪氨酸羥化酶，該酶是多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)記物。
最近，Billon等(J.Cell Sci.1153657，2002)描述了來(lái)自遺傳工程改造的小鼠胚胎干細(xì)胞的少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的同步性。Kuo等(Biol.Reprod.Dec11/02)報(bào)道了猴ES衍生的細(xì)胞種群，該種群是28％GFAP陽(yáng)性；Xian等(StemCells 2141，2003)報(bào)道了采用譜系特異的轉(zhuǎn)錄因子Olig2從小鼠胚胎干細(xì)胞中得到少突膠質(zhì)細(xì)胞。
為了在人類(lèi)健康和疾病的治療中實(shí)現(xiàn)pPS細(xì)胞的所有潛力，有必要建立新的方法(paradigms)來(lái)產(chǎn)生可用于治療脫髓鞘病癥的富集細(xì)胞群。
概要本發(fā)明提供了一個(gè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能有效生產(chǎn)用于研究或藥物組合物制備的神經(jīng)膠質(zhì)譜系的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明的分化細(xì)胞群是在體外分離或培養(yǎng)的，高度富含神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或能對(duì)神經(jīng)組織髓鞘化的細(xì)胞的特征。這些細(xì)胞可具備少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征，表達(dá)本文所列出的某些可檢測(cè)的抗體或可擴(kuò)增標(biāo)記物，或者具備進(jìn)一步分化后形成少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力。這些細(xì)胞還可具備少突膠質(zhì)細(xì)胞的某些功能特征，例如在協(xié)同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中使神經(jīng)節(jié)髓鞘化的能力、在體內(nèi)恢復(fù)脫髓鞘軸突的髓磷脂的能力、或者改善人或非人動(dòng)物神經(jīng)功能的能力。一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)這些特征可以任何組合出現(xiàn)。
所述細(xì)胞群可以從不同種類(lèi)的較少分化的干細(xì)胞中制得。潛在的原始細(xì)胞包括衍生自胚泡的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的多能干(pPS)細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞是個(gè)例證)或者早期胚胎的生殖組織。因此，這些細(xì)胞將具備成為它們來(lái)源組織的后代的特征，這一點(diǎn)可以由原始細(xì)胞和分化細(xì)胞具有同一基因組的結(jié)果來(lái)證實(shí)。
本發(fā)明其他方面涉及生產(chǎn)或維持已經(jīng)描述的分化細(xì)胞的方法。這些方法包括在一種或多種生長(zhǎng)或分化因子存在時(shí)培養(yǎng)多潛在的或多能性的干細(xì)胞，如在本發(fā)明中隨后舉例的。
作為一個(gè)例子，干細(xì)胞可以在含有一種或多種分化因子如三碘甲腺原氨酸(T3)、硒或維甲酸，加入或不加入促分裂原如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分化細(xì)胞的初始形成可以在培養(yǎng)懸液中發(fā)生，在這少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞可以形成相對(duì)均一的球形體。其他細(xì)胞類(lèi)型可以通過(guò)適當(dāng)?shù)姆蛛x方法去除，例如把培養(yǎng)基鋪在能選擇性吸附所需細(xì)胞類(lèi)型的表面上。任選地，通過(guò)加入促分裂原如FGF或表皮生長(zhǎng)因子(通常存在一種或多種分化因子，如細(xì)胞初始衍生時(shí)用的那些)進(jìn)行培養(yǎng)，可導(dǎo)致分化細(xì)胞在選擇前或后進(jìn)一步增殖。隨后，通過(guò)培養(yǎng)時(shí)不加促分裂原，或加入能增強(qiáng)后期分化的表面如聚-L-賴(lài)氨酸，可任選地使這些細(xì)胞進(jìn)一步成熟。
本發(fā)明的細(xì)胞可應(yīng)用于許多商業(yè)性重要應(yīng)用。例如，這些細(xì)胞適用于基于對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響來(lái)篩選化合物，其中化合物的存在與細(xì)胞的維持、毒性、進(jìn)一步分化或者作為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞起作用的能力相關(guān)聯(lián)。這些細(xì)胞也適合于引起相鄰神經(jīng)組織的髓鞘化，無(wú)論在體外還是在體內(nèi)。
本發(fā)明的細(xì)胞也可用于制備人類(lèi)或動(dòng)物治療用的藥物組合物。然后可使用這些組合物治療各種疾病，如與軸突髓鞘化中的缺陷或脊髓受損相關(guān)的病癥。
本發(fā)明更多方面見(jiàn)于如下描述。
附1是通過(guò)倒置顯微鏡(inverted microscope)拍攝的相襯圖，顯示了在含有堿性FGF和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化因子的培養(yǎng)基懸液培養(yǎng)2天后的人類(lèi)胚胎(ES)干細(xì)胞。
圖2顯示了用維甲酸培養(yǎng)7天后的細(xì)胞?？梢钥吹酱蠖宄募?xì)胞球，代表了培養(yǎng)基中80-90％的細(xì)胞。
圖3顯示了去除維甲酸后的情況，這些細(xì)胞維持在低濃度FGF中。
圖4顯示了去除FGF后出現(xiàn)的變化。大的聚合體分解，整個(gè)培養(yǎng)基充滿(mǎn)了單個(gè)細(xì)胞和小的群落。同時(shí)，可觀察到新的亮黃色球形體(箭頭)。
圖5顯示了在FGF缺乏的情況下，用表皮生長(zhǎng)因子培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)亮黃色球形體(箭頭)的生長(zhǎng)。
圖6顯示接種在Matrigel上2或3天后，來(lái)自球形體的定向?yàn)樯窠?jīng)膠質(zhì)的神經(jīng)前體的移動(dòng)和分支。
圖7顯示通過(guò)粘附到Matrigel上僅10-20小時(shí)來(lái)選擇少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的結(jié)果。丟棄未吸附的細(xì)胞，這實(shí)質(zhì)上排除了不具有少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞。然后將吸附的細(xì)胞重新懸浮并在含有FGF、EGF和神經(jīng)膠質(zhì)前體的培養(yǎng)基中增殖7天。這樣有利于生產(chǎn)一種更分散的更適合于治療給藥和其他目的細(xì)胞群。這些細(xì)胞然后在促分裂原缺乏時(shí)，在聚-L-賴(lài)氨酸層粘連細(xì)胞上成熟。此顯微鏡圖片顯示了針對(duì)半乳糖腦苷脂(GalC，空心箭頭)的染色，細(xì)胞核用溶血毒素(hematoxin)復(fù)染(實(shí)心箭頭)。針對(duì)GalC染色的細(xì)胞百分比在這些條件下至少為～95％。
圖8顯示了胚胎干細(xì)胞衍生的少突膠質(zhì)細(xì)胞的更高放大倍數(shù)。這些細(xì)胞具有成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)許多復(fù)雜的突起，這些突起看起來(lái)是在它們之間使髓磷脂形成網(wǎng)狀物。
圖9顯示了在分化中細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)展。(A)未分化的hES細(xì)胞。(B)在含有維甲酸的培養(yǎng)基懸液中從胚狀體中生長(zhǎng)的透明球形體。(C)在EGF存在時(shí)，含有少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的黃色球形體的擴(kuò)張。(D)通過(guò)接種在Matrigel上陽(yáng)性選擇獲得的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞。(E，F(xiàn))在培養(yǎng)中增加少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的隆起(prominence)。(G，H)隨后的接種導(dǎo)致進(jìn)一步分化成成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。


圖10顯示成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)分析。接種一個(gè)星期后，這些細(xì)胞的早期神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物NG2(A)呈陽(yáng)性。種植八個(gè)星期后，這些細(xì)胞的GalC(C)、O4(D)和RIP(E)呈陽(yáng)性。圖B顯示用所示標(biāo)記物染色的細(xì)胞數(shù)目。
圖11顯示給予大鼠脊髓的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的組織剖面圖，用對(duì)人核蛋白特異的抗體染色。
圖12顯示移植九星期后這些細(xì)胞已經(jīng)遷移或增殖到白質(zhì)中。
圖13顯示通過(guò)測(cè)量脊索(cord)橫截面積，移植的少突膠質(zhì)細(xì)胞不會(huì)使由挫傷性損傷后的第二次放大導(dǎo)致的損傷更壞。
圖14顯示了hES細(xì)胞誘導(dǎo)軸突分支。新的軸突在移植了少突膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)物的圖片中(上圖)顯示為BDA染色的暗窄線(xiàn)。在沒(méi)有處理的動(dòng)物中沒(méi)有觀察到分支。移植的細(xì)胞正誘導(dǎo)再生的可塑性。
圖15顯示了在受損位置(中心)分支的神經(jīng)元定量結(jié)果(平均值±SEM，每柱3個(gè)切片)。治療過(guò)的動(dòng)物具有明顯更高水平的標(biāo)記軸突，從右側(cè)一直到損傷位置吻端的中心。
圖16顯示了在移入人類(lèi)胚胎干細(xì)胞來(lái)源的少突膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)物中大量再髓鞘化的證據(jù)。在電子顯微照片上部的密集圓圈是正常髓鞘化纖維。在這個(gè)部位軸突的其余部分顯示了一個(gè)髓磷脂薄層。右上圖中的軸突顯示了大約5或者6個(gè)纏繞，以及正在進(jìn)行再髓鞘化的證據(jù)。只有被移植的動(dòng)物才顯示新的髓磷脂，可歸于少突膠質(zhì)細(xì)胞的活性。這提供了一個(gè)解釋在移植動(dòng)物中行為改善的機(jī)制。
圖17顯示了在未分化的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞集落中檢測(cè)到的標(biāo)記物(左側(cè)抗體加上DAPI；右側(cè)抗體單獨(dú)染色)。上圖顯示的是針對(duì)SSEA-4(一種多能細(xì)胞的標(biāo)記物)標(biāo)記的克隆。下圖顯示的是圍繞在針對(duì)中胚層標(biāo)記物BMP4標(biāo)記的集落周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞。
圖18顯示了在分化過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子Pax6的短暫出現(xiàn)。上圖顯示的是朝向第10天群落中心的染色，在朝向外圍的更多分化細(xì)胞中已經(jīng)被往下調(diào)。下圖顯示在分化過(guò)程的第35天事實(shí)上沒(méi)有染色。
圖19顯示了在早期少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞中檢測(cè)到的標(biāo)記物，出現(xiàn)在分化過(guò)程的第10天。上圖轉(zhuǎn)錄因子Olig1。中圖轉(zhuǎn)錄因子SOX10。下圖少突膠質(zhì)細(xì)胞前體標(biāo)記物A2B5。
圖20A-20B顯示了適合在第35天移植的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligoprogenitors)中占優(yōu)勢(shì)的標(biāo)記物。第一和第二行(20A)NG2(硫酸軟骨素蛋白聚糖，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的標(biāo)記物)；第三行(20A)GalC；第四行(20B)O4；第五行(20B)Tuj1(神經(jīng)元的一種標(biāo)記物)。事實(shí)上所有細(xì)胞都攜帶有少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，但不是針對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、或未分化的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記物(20B，底圖)。
圖21顯示了給予發(fā)抖(Shiverer)小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)果，這種小鼠在產(chǎn)生髓磷脂堿性蛋白的能力上存在遺傳性缺陷。超微結(jié)構(gòu)上，發(fā)抖小鼠的軸突缺乏髓磷脂或者被一個(gè)或二個(gè)不緊湊的髓磷脂纏繞包圍著(上圖)。移植細(xì)胞六個(gè)星期后，電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)多層稠密的髓磷脂，揭示了移植細(xì)胞群產(chǎn)生髓鞘的能力(下圖)。稠密的髓磷脂由所給予的少突膠質(zhì)細(xì)胞直接產(chǎn)生。
圖22顯示了一個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，在該試驗(yàn)中，用沖擊器挫傷大鼠的脊髓，然后定量(BBB級(jí))評(píng)價(jià)隨后階段中的脊髓功能。上圖200千達(dá)因挫傷；下圖250千達(dá)因挫傷。(■)受損后1周，ES衍生的少突膠質(zhì)細(xì)胞治療的動(dòng)物(n＝5)；(▲)接受同樣的損傷但沒(méi)有給予細(xì)胞進(jìn)行治療的對(duì)照動(dòng)物(n＝3)。平均值±SEM，用盲法評(píng)定。移植了ES衍生的少突膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)物表現(xiàn)出更好的地上運(yùn)動(dòng)(overground locomotion)，在治療后持續(xù)超過(guò)5周。
詳細(xì)描述本發(fā)明通過(guò)有效地從多能干細(xì)胞中生產(chǎn)少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體解決了生產(chǎn)它們的大細(xì)胞群的問(wèn)題。
這些分化細(xì)胞群非常相似。圖7顯示了一個(gè)具有少突膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)特征的人細(xì)胞的制品例子。這個(gè)細(xì)胞群已經(jīng)針對(duì)GalC進(jìn)行染色，這是一種針對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的標(biāo)記物。圖8是一幅更高放大倍數(shù)的視圖，顯示了能使髓鞘化附近任何神經(jīng)元平衡的髓磷脂層的生產(chǎn)。這些細(xì)胞的功能性質(zhì)使它們很適合于少突膠質(zhì)細(xì)胞性質(zhì)的進(jìn)一步表征，并適合用于人類(lèi)治療。
本發(fā)明的細(xì)胞理想來(lái)源是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物不同種類(lèi)的多能干(pPS)細(xì)胞。根據(jù)下面描述的策略，通過(guò)在幾種合適的培養(yǎng)條件和輔助因子中進(jìn)行選擇，可以使pPS細(xì)胞被誘導(dǎo)進(jìn)入少突膠質(zhì)細(xì)胞路徑。已發(fā)現(xiàn)，在最優(yōu)化的條件下，未分化的pPS細(xì)胞轉(zhuǎn)換成少突膠質(zhì)細(xì)胞的效率可大25％。
本發(fā)明的組合物和方法提供優(yōu)于先前可獲得技術(shù)的重要優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)從所需同種異型的pPS細(xì)胞中分化少突膠質(zhì)細(xì)胞，可產(chǎn)生具有任何組織相容性類(lèi)型的少突膠質(zhì)細(xì)胞。如果需要，可以任何增強(qiáng)移植的方式在分化前或后遺傳修飾這些細(xì)胞。因?yàn)檫@些細(xì)胞來(lái)自天然細(xì)胞系而不需要進(jìn)行組織解剖，因此它們能理想地滿(mǎn)足規(guī)章批準(zhǔn)所提出的質(zhì)量控制要求。
重要的是，產(chǎn)生于每一個(gè)起始干細(xì)胞群的細(xì)胞的供應(yīng)幾乎是無(wú)限制的。如實(shí)施例1中所舉例的，一旦產(chǎn)生和選擇得到少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞，可通過(guò)在存在生長(zhǎng)因子的情況下培養(yǎng)而大量增殖這些細(xì)胞。此外，幾乎能誘使原始pPS細(xì)胞無(wú)限增殖，從而為更多分化的細(xì)胞提供持續(xù)的來(lái)源。
下文提供如何制備和使用本發(fā)明分化細(xì)胞的進(jìn)一步描述。這些種群非常地一致，并因此適合用于許多商業(yè)上地重要應(yīng)用。
本發(fā)明一個(gè)方面提供一種分化的細(xì)胞群，其中至少大約80％的細(xì)胞是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物多能干(pPS)細(xì)胞的后代；能被對(duì)NG2蛋白聚糖(或其他少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物)特異的的抗體染色；并且呈NeuN(或其他神經(jīng)元細(xì)胞和潛在污染物的標(biāo)記物)陰性。分化的細(xì)胞群可能是適合產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的組成系統(tǒng)的一部分。這個(gè)系統(tǒng)可能還包含分化細(xì)胞從中產(chǎn)生的pPS細(xì)胞株(例如人類(lèi)胚胎干細(xì)胞)。任選地，分化細(xì)胞群至少80％的細(xì)胞也表達(dá)A2B5或PDGFRα。至少20％的細(xì)胞可顯示少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的兩極形態(tài)學(xué)特征。
在一些環(huán)境下，細(xì)胞群植入發(fā)抖突變小鼠的脊髓中后，這些分化的細(xì)胞群會(huì)引起神經(jīng)元軸突周?chē)旅艿乃枇字某练e；或者在挫傷性損傷的大鼠的脊髓內(nèi)或周?chē)踩爰?xì)胞群后，導(dǎo)致其地上運(yùn)動(dòng)改善。或者，可在體外進(jìn)一步分化本發(fā)明的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(例如，在缺乏促分裂原時(shí)在聚-L-賴(lài)氨酸和層粘連蛋白上培養(yǎng)3天)。這樣可以產(chǎn)生一個(gè)更加成熟的細(xì)胞群，其中至少10％的細(xì)胞具有成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的復(fù)雜突起的特征，并且大約80％、90％、95％或更多的細(xì)胞具有成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物如GalC。在增殖階段制備的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的特征不僅在于它們?cè)谧娲A段表達(dá)的標(biāo)記物，還在于它們產(chǎn)生富集的成熟細(xì)胞群的能力或者在體內(nèi)執(zhí)行所需功能的能力。
如下面所闡述的，本發(fā)明一些分化的細(xì)胞群可采用以下方法獲得，其中未分化的pPS細(xì)胞培養(yǎng)在含有促分裂原和至少二種少突膠質(zhì)細(xì)胞分化因子的培養(yǎng)基中。例如，在堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、三碘甲腺原氨酸(T3)、維甲酸存在時(shí)(可能還有硒)，未分化的pPS細(xì)胞可以懸液培養(yǎng)，以形成細(xì)胞聚集體。
下文將進(jìn)一步解釋和闡述本發(fā)明。
定義少突膠質(zhì)細(xì)胞是來(lái)源于外胚層的神經(jīng)細(xì)胞，形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外膜結(jié)構(gòu)部分(神經(jīng)膠質(zhì))。它們具有不同數(shù)量的云幔狀或片層狀的突起(process)，纏繞在單個(gè)軸突周?chē)纬蒀NS的髓鞘。可由本發(fā)明隨后所解釋的形態(tài)學(xué)的、表型的或功能的標(biāo)準(zhǔn)加以區(qū)別它們。
“神經(jīng)前體細(xì)胞”或“神經(jīng)上皮干細(xì)胞”是指能產(chǎn)生后代的細(xì)胞，這些后代不是神經(jīng)元細(xì)胞(如神經(jīng)元前體或成熟神經(jīng)元)就是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞”包含成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和任一這些細(xì)胞類(lèi)型或兩種的定向化前體。
“少突膠質(zhì)細(xì)胞前體”是指定向用于產(chǎn)生含有成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞和/或更多前體細(xì)胞的后代的細(xì)胞，優(yōu)先于神經(jīng)元或非神經(jīng)學(xué)組織。除非另外說(shuō)明，它們可能但不一定具備產(chǎn)生其它類(lèi)型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力。本發(fā)明涉及“少突膠質(zhì)細(xì)胞”或“少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞”的描述都是指少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟細(xì)胞，除非另有說(shuō)明。
在關(guān)于細(xì)胞個(gè)體發(fā)育學(xué)的內(nèi)容中，形容詞“分化的”是個(gè)相對(duì)而言的術(shù)語(yǔ)。一個(gè)“分化的細(xì)胞”是指與與其所比較的細(xì)胞相比，沿著發(fā)育途徑更進(jìn)一步發(fā)育的細(xì)胞。這樣，多能胚胎干細(xì)胞能分化成譜系限制性前體細(xì)胞，例如上面列出的不同的前體類(lèi)型。這些細(xì)胞能依次沿著該途徑進(jìn)一步分化成細(xì)胞，或者分化成末期分化細(xì)胞，例如成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞。
“分化劑”本發(fā)明中指用于本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)的用于生產(chǎn)少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系(包括前體細(xì)胞和末期分化細(xì)胞)的分化細(xì)胞的化合物一個(gè)集合。關(guān)于化合物的作用方式是沒(méi)有限制的。例如，該制劑可以通過(guò)誘導(dǎo)或輔助表型中的變化、促進(jìn)具有特定表型的細(xì)胞生長(zhǎng)或者延遲其他細(xì)胞的生長(zhǎng)，或者與其他制劑一起通過(guò)不明機(jī)制來(lái)輔助分化過(guò)程。
除非另外規(guī)定，本發(fā)明涉及“硒”的描述指硒的任何氧化形式，包括亞硒酸鹽(SeO32-)、硒酸鹽(SeO42-)或者是具有任何平衡離子的溶液中的硒離子(Se2-)。
原型“靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物多能干細(xì)胞” (pPS細(xì)胞)是指衍生自受精后任何時(shí)期的胚前期的、胚胎期的或胎兒期組織的多能細(xì)胞，這些細(xì)胞具備在適當(dāng)條件下能夠生成幾種不同細(xì)胞類(lèi)型〔這些細(xì)胞類(lèi)型是所有三個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的衍生物〕的后代的特征(參照公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)試驗(yàn))的能力，例如具備在成年SCID小鼠中在8-12周內(nèi)形成畸胎瘤。包括在pPS細(xì)胞的定義內(nèi)的是各種類(lèi)型的胚胎細(xì)胞，例如人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(hES)和人類(lèi)胚胎的生殖細(xì)胞(bEG)。pPS細(xì)胞較佳不衍生自惡性來(lái)源。需要的是(但不總是必需的)細(xì)胞是整倍性的。依賴(lài)于pPS細(xì)胞的來(lái)源和培養(yǎng)方法，從它們有能力發(fā)育成人體所有不同的細(xì)胞類(lèi)型這一角度看，它們可能是或可能不是全能的。
當(dāng)細(xì)胞群中大量的干細(xì)胞及其衍生物顯示出未分化細(xì)胞的形態(tài)特征，并區(qū)別于胚胎或成年來(lái)源的分化細(xì)胞，pPS細(xì)胞被描述成“未分化的”。應(yīng)理解，細(xì)胞群中未分化細(xì)胞的集落經(jīng)常會(huì)被相鄰的分化的細(xì)胞所包圍。
術(shù)語(yǔ)“飼養(yǎng)細(xì)胞”或“飼養(yǎng)者”是指與另一類(lèi)細(xì)胞共同培養(yǎng)的一類(lèi)細(xì)胞，用于提供第二種類(lèi)型細(xì)胞能夠生長(zhǎng)的環(huán)境。如果pPS細(xì)胞在分裂后至少生長(zhǎng)了一輪，而其中沒(méi)有加入用于支持該pPS細(xì)胞生長(zhǎng)的新鮮的飼養(yǎng)細(xì)胞，則pPS細(xì)胞群可認(rèn)為是基本上不需要飼養(yǎng)細(xì)胞的。
術(shù)語(yǔ)“胚狀體”是指分化的和未分化的細(xì)胞的團(tuán)聚體，當(dāng)pPS細(xì)胞在單層培養(yǎng)基中過(guò)度生長(zhǎng)或保持在培養(yǎng)基懸液中時(shí)出現(xiàn)。胚狀體是不同細(xì)胞類(lèi)型的混合物，通常來(lái)自幾個(gè)胚層，通過(guò)形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)和免疫細(xì)胞化學(xué)可測(cè)的細(xì)胞標(biāo)記物來(lái)辨別。
“生長(zhǎng)環(huán)境”是指感興趣的細(xì)胞能在體外增殖、分化或成熟的環(huán)境。環(huán)境特征包括進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可能存在的任何生長(zhǎng)因子或分化誘導(dǎo)因子，以及支持結(jié)構(gòu)(例如在固體表面的基質(zhì))，如果存在的話(huà)。
在對(duì)單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群上的表型標(biāo)記物的評(píng)估中，除非另有說(shuō)明，如果與同種型對(duì)照相比，在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中使用特異性抗體顯示出明顯較強(qiáng)的染色，則認(rèn)為細(xì)胞對(duì)該標(biāo)記物是“陽(yáng)性的”。除非另外聲明，如果這個(gè)標(biāo)記物不是通過(guò)這種免疫細(xì)胞化學(xué)分析而可檢測(cè)到的抗體，則這個(gè)細(xì)胞認(rèn)為是“陰性的”。
當(dāng)一種多聚核苷酸通過(guò)任何合適的人工操作方式被移入細(xì)胞中，或細(xì)胞是經(jīng)遺傳得到多聚核苷酸的初始變異細(xì)胞的后代，則該細(xì)胞可以認(rèn)為是“遺傳變異的”、“轉(zhuǎn)染的”或“遺傳轉(zhuǎn)化的”。該多聚核苷酸經(jīng)常包含編碼感興趣蛋白的轉(zhuǎn)錄序列，該序列能使該細(xì)胞以可評(píng)價(jià)的水平表達(dá)蛋白。如果變異細(xì)胞的后代具有相同的變異，這個(gè)遺傳變異認(rèn)為是有“遺傳性的”。
一般技術(shù)分子遺傳和遺傳工程的一般方法在“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(Sambrook等，冷泉港)的當(dāng)前版本；“哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體”(Miller和Calos編輯)；和“分子生物學(xué)當(dāng)前方案”(F.M.Ausubel等編輯.Wiley & Sons)描述。細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、和抗體技術(shù)可以在“蛋白科學(xué)中的當(dāng)前方案”(J.E.Colligan等編輯，Wiley & Sons)、“細(xì)胞生物學(xué)中的當(dāng)前方案”(J.S.Bonifacino等，Wiley & Sons)和“免疫學(xué)中的當(dāng)前方案”(J.E.Colligan等編輯，Wiley &Sons)中找到。與本發(fā)明相關(guān)的試劑、克隆載體、和基因操作試劑盒可從商業(yè)供應(yīng)商那得到，例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech以及Sigma-Aldrich公司。
細(xì)胞培養(yǎng)方法通常在“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊(cè)”目前版本(R.I.Freshney編輯，Wiley & Sons)；“細(xì)胞培養(yǎng)一般技術(shù)”(M.A.Harrison和I.F.Rae，劍橋大學(xué)出版)；和“胚胎干細(xì)胞方法和操作規(guī)定”(K.Turksen編輯，Humana出版)中有描述。組織培養(yǎng)基供應(yīng)和試劑可從商業(yè)供應(yīng)商那得到，例如Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma Chemical Co.、以及ICNBiomedicals。
本發(fā)明相關(guān)的特定參考書(shū)包括“神經(jīng)科學(xué)原理”，第4版，Kandel等編輯，McGraw-Hill 2000；“CNS再生基礎(chǔ)科學(xué)和臨床發(fā)展”，M.H.Tuszynski和J.H.Kordower編輯，Academic Press，1999；“神經(jīng)元細(xì)胞和分子生物學(xué)”，第3版，I.B.Levitan和L.K.Kaczmarek，牛津大學(xué)出版，2001；“神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞它們?cè)谛袨橹械淖饔谩?，P.R.Laming等編輯，劍橋大學(xué)出版，1998；“在健康和疾病中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能作用”，Matsas和Tsacopoulos編輯，Plenum Pub公司，1999；“神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育”，Jessen和Richardson編輯，牛津大學(xué)出版，2001；以及“Man of Steel”，Adrian Havill，1996。
干細(xì)胞來(lái)源本發(fā)明可以用各種類(lèi)型的干細(xì)胞實(shí)施。特別適用于本發(fā)明的是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物多能干細(xì)胞(pPS)，衍生自妊娠后形成的組織，如胚泡，或在妊娠中的任何階段得到的胎兒或胚胎組織。非限制性例子是初期培養(yǎng)物或已建立的胚胎干細(xì)胞或胚胎生殖細(xì)胞系，如下所述。本發(fā)明的技術(shù)也可以直接用初生(primary)胚胎或胎兒組織來(lái)實(shí)現(xiàn)，在未首先建立未分化細(xì)胞株的情況下，從原始初生的胚胎細(xì)胞中可直接衍生得到神經(jīng)細(xì)胞。
在實(shí)施例部分提供的例子是繼采用人類(lèi)胚胎干細(xì)胞所做的工作后而進(jìn)行的。然而，除了另外說(shuō)明的地方，本發(fā)明可以用任何脊椎動(dòng)物種類(lèi)的干細(xì)胞進(jìn)行操作，包括人類(lèi)的、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和其他非人哺乳動(dòng)物的多能干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞可從靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物組織中分離出胚胎干細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利5,843,780；Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927844，1995)?？刹捎肨homson等(美國(guó)專(zhuān)利6,200,806；Sience 2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133 ff.，1998)以及Reubinoff等(Nature Biotech 18399，2000)所述的技術(shù)從人卵裂球中制備人類(lèi)胚胎干(hES)細(xì)胞。與hES細(xì)胞相當(dāng)?shù)募?xì)胞類(lèi)型包括它們的多能衍生物，如原始外胚層樣(EPL)細(xì)胞，如在WO01/51610中所述(Bresagen)。
在一個(gè)方法中，通過(guò)短暫暴露在鏈霉蛋白酶(Sigma)中，可從發(fā)育的胚泡中取出透明帶。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)可以通過(guò)免疫切除方法分離，在這方法中，胚泡暴露于1∶50稀釋的兔抗人脾細(xì)胞抗血清稀釋液中30分鐘，然后在DMEM中清洗三次共5分鐘，然后放在1∶5稀釋的豚鼠補(bǔ)體(Gibco)稀釋液中3分鐘(Solter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 725099，1975)。在DMEM中進(jìn)一步洗兩次后，用移液管輕輕地從完整的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)上去除裂解的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，并把ICM接種在mEF飼養(yǎng)細(xì)胞層上。
9到15天后，要么通過(guò)暴露在含有1mM EDTA的無(wú)鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液中，通過(guò)暴露在分散酶或胰島素中，或通過(guò)微量移液管機(jī)械性分離，使衍生自?xún)?nèi)細(xì)胞團(tuán)的生成物分解成多個(gè)塊狀物，然后重新接種在新鮮培養(yǎng)基的mEF細(xì)胞上。用微量移液管單個(gè)挑選出具有未分化形態(tài)學(xué)的生長(zhǎng)集落，將其機(jī)械性分解成小塊，并重新接種。ES樣形態(tài)學(xué)特征為致密的集落，具有明顯高的核質(zhì)比和顯著的核仁。然后每1-2周進(jìn)行短暫的胰蛋白酶消化、暴露于Dulbecco’s PBS(包含2mM EDTA)、暴露在IV型膠原酶(～200U/mL；Gibco)、或通過(guò)微量移液管選擇單個(gè)克隆而對(duì)生成的ES細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)的分離。約50到100個(gè)細(xì)胞的塊狀物大小是最理想的。
胚胎生殖細(xì)胞從原生殖細(xì)胞中制備人類(lèi)胚胎生殖細(xì)胞(hEG)，可參考Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998和美國(guó)專(zhuān)利6,090,622。
簡(jiǎn)要地說(shuō)，用等滲緩沖液清洗～8-11周后取出的生殖嵴，然后放在0.1mL、0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA鈉溶液中(BRL)并切成＜1mm3的大塊。分解后，這些細(xì)胞在～3.5mL EG生長(zhǎng)培養(yǎng)基(包含D-葡萄糖，NaHCO3；15％ES合格的胎牛血清；2mM谷氨酰胺；1mM丙酮酸鈉；1000-200U/mL人類(lèi)重組白血病抑制因子；1-2ng/ml人類(lèi)重組bFGF；以及10μM毛喉素(在10％DMSO中)的DMEM)中37℃培養(yǎng)1小時(shí)或過(guò)夜。
然后這些細(xì)胞在1-3mL EG生長(zhǎng)培養(yǎng)基中重新懸浮，并接種到飼養(yǎng)細(xì)胞層上(例如，STO細(xì)胞，ATCC No.CRL 1503，用5000 rad γ-射線(xiàn)滅活)。7-10天后進(jìn)行第一次傳代，然后在每天更換培養(yǎng)基下培養(yǎng)，一直到觀察到與EG細(xì)胞一致的細(xì)胞形態(tài)學(xué)，通常，7-30天或1-4次傳代后。
其他干細(xì)胞本發(fā)明的實(shí)施也不要求分解人胚胎或胚泡以獲得作為生產(chǎn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的起始原料的pPS或胚胎干細(xì)胞。hES細(xì)胞可以從公共保藏單位中已建立的細(xì)胞系中得到(例如，WiCell研究機(jī)構(gòu)，Madison WI U.S.A.，或者美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中性，Manassas VA，U.S.A.)。美國(guó)專(zhuān)利出版物2003-0113910 A1報(bào)道不需要利用胚胎或胎兒組織能得到多能干細(xì)胞。采用誘導(dǎo)多能表型的因子將臍帶血或其他祖細(xì)胞改變成(reprogram)pPS細(xì)胞也是可能的(Chambers等，Cell113643，2003；Mitsui等，Cell 113631，2003)。在適當(dāng)?shù)臈l件下，任何滿(mǎn)足pPS或hES細(xì)胞定義的細(xì)胞都可用于本發(fā)明少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的衍生。
本發(fā)明提供的一些技術(shù)也能用于維持或促進(jìn)更多指定細(xì)胞類(lèi)型的分化，例如外胚層細(xì)胞，和來(lái)自胎兒或成年組織的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)前體。得到這樣的細(xì)胞的方法已有記載，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,852,832；5,654,183；5849553和5,968,829；以及PCT出版物WO98/50526和WO99/01159。
未分化狀態(tài)pPS細(xì)胞的增殖采用促進(jìn)增殖而不促進(jìn)分化的培養(yǎng)條件，pPS細(xì)胞在培養(yǎng)基中可以持續(xù)增殖。含血清的ES培養(yǎng)基的例子由80％DMEM(例如Knockout DMEM，Gibco)，20％確定成分的胎牛血清(FBS，Hyclone)或血清替代物(WO98/30679)，1％非必需氨基酸，1mM L-谷氨酰胺，和0.1mM β-巰基乙醇制得。僅在使用前，加入人bFGF至4ng/ml(WO99/20741，Geron Corp.)。
只有在抑制分化的環(huán)境下培養(yǎng)，pPS細(xì)胞才能在未分化狀態(tài)下增殖。傳統(tǒng)上，pPS細(xì)胞是被培養(yǎng)在衍生自小鼠的胚胎或胎兒組織的飼養(yǎng)細(xì)胞層上。培養(yǎng)板上每孔接種375,000個(gè)輻照的mEF，輻照培養(yǎng)板以抑制增生但允許支持pPS細(xì)胞的因子合成，并且在接種后使用5小時(shí)到4天(美國(guó)專(zhuān)利6,200,806)。最近已開(kāi)發(fā)人飼養(yǎng)細(xì)胞，用于支持人胚胎干細(xì)胞的增殖而不引起分化(WO 01/51616；USSN 09/888309；Geron Corp.)。通過(guò)分化hES細(xì)胞、選擇具有所需活性的細(xì)胞、然后通過(guò)轉(zhuǎn)染它們表達(dá)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶而無(wú)限增殖而獲得這些細(xì)胞。
即使沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞也能將pPS細(xì)胞維持在一種未分化狀態(tài)。無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境包括合適的培養(yǎng)基，特別是細(xì)胞外的基質(zhì)如Matrigel或?qū)诱尺B蛋白。以＞15000個(gè)細(xì)胞每平方厘米接種pPS細(xì)胞(最佳的是90,000cm-2到170,000cm-2)。無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是由含有能支持細(xì)胞增殖而不分化的因子的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基支持的?？赏ㄟ^(guò)使該培養(yǎng)基與分泌該因子的細(xì)胞如被照射的(～4,000rad)初生小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、端粒化的小鼠成纖維細(xì)胞、或者衍生自pPS細(xì)胞的人飼養(yǎng)細(xì)胞一起培育而引入所述因子?？赏ㄟ^(guò)將飼養(yǎng)細(xì)胞以～5-6×104/cm2的密度接種在無(wú)血清、補(bǔ)充了20％血清替代品和4-8ng/mL bFGF的培養(yǎng)基(如KODMEM)中而調(diào)理該培養(yǎng)基。進(jìn)一步用bFGF補(bǔ)充調(diào)理了(conditioned)1-2天的培養(yǎng)基，并用該培養(yǎng)基來(lái)支持pPS細(xì)胞培養(yǎng)1-2天。無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)方法的特點(diǎn)在國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 99/20741和WO 01/51616；以及Xu等，Nat.Biotechnol.19971，2001中有進(jìn)一步的討論。
在顯微鏡下，ES細(xì)胞看起來(lái)具有高核/質(zhì)比，顯著的核仁，以及具有難以辨別的細(xì)胞連接的致密集落。靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞通常表達(dá)階段特異性的胚胎抗原(SSEA)3和4、用抗體可檢測(cè)的標(biāo)記物Tra-1-60和Tra-1-81(Thomson等，Science2821145，1998)、以及端粒酶活性。pPS細(xì)胞在體外的分化導(dǎo)致了SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表達(dá)的消失，并提高了SSEA-1的表達(dá)，這也在未分化的hEG細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。
從干細(xì)胞中生成少突膠質(zhì)細(xì)胞本發(fā)明中的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞是通過(guò)在能富集和擴(kuò)增具有所需表型的細(xì)胞的特定生長(zhǎng)環(huán)境中培養(yǎng)干細(xì)胞而得到的。這個(gè)生長(zhǎng)環(huán)境可以特異地指引分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系，促進(jìn)所需細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制其他細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)，或者表現(xiàn)出這些活性的任一組合。
這一部分向讀者闡述一些得到本發(fā)明的少突膠質(zhì)細(xì)胞所采用的方法。除了另外要求的地方，所提供的關(guān)于突起的潛在機(jī)理的解釋僅僅作為幫助進(jìn)一步研究的指導(dǎo)性假設(shè)，使用者不用必須理解這個(gè)假設(shè)，也不需要為了用于實(shí)踐而使本發(fā)明符合這個(gè)假設(shè)。現(xiàn)在申請(qǐng)人已證明少突膠質(zhì)細(xì)胞能從多能干細(xì)胞中制備，可對(duì)這些方案進(jìn)行調(diào)整，也可采用其它的方法獲得本文所述的新穎產(chǎn)物。
從pPS細(xì)胞獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞的步驟包括a)獲得確定產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞群；b)少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的擴(kuò)增；以及c)這些細(xì)胞進(jìn)一步成熟為后期少突膠質(zhì)細(xì)胞。
指引干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系生成少突膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程通常包括二個(gè)方面引起起源(originating)干細(xì)胞群分化，以及使少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞類(lèi)型。這些事件可相繼發(fā)生或同時(shí)發(fā)生。
分化過(guò)程可通過(guò)引起pPS細(xì)胞形成胚狀體或團(tuán)聚體來(lái)誘導(dǎo)例如，通過(guò)供體pPS細(xì)胞培養(yǎng)物的過(guò)渡生長(zhǎng)，或通過(guò)在具有低粘附性質(zhì)底部的培養(yǎng)容器中懸浮培養(yǎng)pPS細(xì)胞，這種低粘附性質(zhì)允許胚狀體形成。在一個(gè)典型的方法中，收獲匯合的hES細(xì)胞單層培養(yǎng)物后接種在非粘附細(xì)胞培養(yǎng)板上，保持細(xì)胞懸浮，并用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基提供定期的飼養(yǎng)。
作為選擇或另外地，通過(guò)與防止細(xì)胞保持未分化表型的某些因子一起培養(yǎng)可啟動(dòng)分化過(guò)程。初期的分化因子并不需要限制分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系，但是在分化群中的細(xì)胞類(lèi)型的范圍內(nèi)應(yīng)包括少突膠質(zhì)細(xì)胞或它們的前體。這種類(lèi)型的典型生長(zhǎng)因子是結(jié)合類(lèi)維生素A受體的配體，或者是能活化細(xì)胞外信號(hào)激酶(ERK)途徑的配體。當(dāng)分化過(guò)程進(jìn)行時(shí)，培養(yǎng)基中包含有促分裂原如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(或在下一個(gè)部分列出的那些)，以促進(jìn)增殖。
在一些時(shí)期，可將該培養(yǎng)物更特異地引向少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系。這可通過(guò)在培養(yǎng)基中包含一個(gè)更特異地促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的因子來(lái)完成。典型的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化因子是結(jié)合細(xì)胞表面或細(xì)胞核中的甲狀腺激素受體的配體和抗體，濃度大約在40ng/mL的T3(3，5，3’-三碘-L-甲狀腺原氨酸)和T4(L-甲狀腺素)是這樣的例子。據(jù)信甲狀腺激素能增加維甲酸受體的表達(dá)，并且能促進(jìn)分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞。
另一種少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化因子是硒，一種被認(rèn)為在分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞中參與髓磷脂基因上調(diào)的抗氧化劑。其他候選的分化因子是另外的抗氧化劑如維生素E，以及提高硒是其輔助因子的酶的活性的因子，例如硫氧還蛋白還原酶和碘化甲狀腺素脫碘酶(iodothyronine deiodinase)家族。當(dāng)硒在培養(yǎng)基中含有相對(duì)高濃度，至少20ng/mL或100ng/mL，并以亞硒酸鹽離子(SeO32-)形式存在時(shí)，硒尤其有效。其他候選分化因子或輔助因子包括骨形成蛋白(BMP)，和sonic hedge hog(SHH)，以及白血病抑制因子(LIF)。還考慮的是神經(jīng)組織產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化因子的組合，它們產(chǎn)生于與含有選擇的分離神經(jīng)組織或細(xì)胞系的共培養(yǎng)，胚胎的CD-1小鼠大腦以及從組織或細(xì)胞系中得到的包含因子的提取物是這樣的例子。
已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)把所有這些技術(shù)結(jié)合起來(lái)，少突膠質(zhì)細(xì)胞能以驚人有效的方式產(chǎn)生在促分裂原、常規(guī)分化因子如維甲酸、和特定分化因子如甲狀腺激素和亞硒酸鈉的存在下形成胚狀體而啟動(dòng)分化。在實(shí)施例部分提供的非限制性例子包括了這些因子和其他標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)組分，例如養(yǎng)分補(bǔ)充劑，生長(zhǎng)因子如胰島素，以及抗生素。在分化起始時(shí)包含有合適的分化因子組合，培養(yǎng)會(huì)快速地產(chǎn)生更定向于少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
增殖少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞作為將細(xì)胞用于所需目的之前的一個(gè)任選步驟，本發(fā)明的使用者可能想通過(guò)在培養(yǎng)中進(jìn)一步增殖來(lái)增加少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的數(shù)目。
這可以通過(guò)在營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中存在一種或多種促分裂原時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)完成。例子是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員，例如FGF-2(堿性FGF)，以及FGF-4。同樣可以舉例的是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，功能性同系物，以及其他結(jié)合EGF受體的因子。其他候選的生長(zhǎng)因子是衍生自血小板的生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，以及提高環(huán)AMP水平的因子，如毛喉素。
當(dāng)存在這樣的促分裂原時(shí)，分化因子引發(fā)劑如維甲酸能被取消。因?yàn)榇俜至言瓕?dǎo)致細(xì)胞非特異地生長(zhǎng)，繼續(xù)使培養(yǎng)基中包含少突膠質(zhì)細(xì)胞特異的分化因子常會(huì)有利于保持少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的優(yōu)先生長(zhǎng)。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中促分裂原的平衡也能有助于少突膠質(zhì)細(xì)胞的優(yōu)先生長(zhǎng)。例如，EGF可維持外胚層細(xì)胞但不是成纖維細(xì)胞，當(dāng)FGF不再存在時(shí)，外胚層細(xì)胞可能會(huì)死亡。一旦嚴(yán)格依賴(lài)FGF的細(xì)胞被除去，則可將FGF加回培養(yǎng)基中以加速所需細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)。
作為細(xì)胞制備中的另一可選步驟，本發(fā)明的使用者可能會(huì)希望把少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞從培養(yǎng)基中可能存在的其他細(xì)胞類(lèi)型中分離出來(lái)?？煽紤]采用多種分離方法，例如介導(dǎo)粘附或針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行挑選的抗體或外源凝集素。用于陽(yáng)性和陰性選擇的合適的表型標(biāo)記物在下面列出。還考慮的是利用啟動(dòng)子-報(bào)告子(promoter-reporter)質(zhì)粒篩選少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞，該質(zhì)粒利用組織特異性啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建，例如UDP-半乳糖神經(jīng)酰胺半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT)、2’，3’-環(huán)核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNP)、NG2蛋白聚糖、NCAM、髓磷脂堿性蛋白(MBP)、或各種髓磷脂相關(guān)的蛋白的啟動(dòng)子，連接于報(bào)道子基因，如堿性磷酸酶、綠熒光蛋白、或熒光素酶。
已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)把細(xì)胞吸附在合適的底物上，能以更簡(jiǎn)單的方式從在存在少突膠質(zhì)細(xì)胞分化因子條件下繁殖的其它細(xì)胞中分離出少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞。少突膠質(zhì)細(xì)胞攜帶有細(xì)胞特異性的碳水化合物和細(xì)胞表面受體，并將優(yōu)先吸附到共軛配體上。具體而言，可以通過(guò)吸附于特定基底膜成分來(lái)分離少突膠質(zhì)細(xì)胞，所述成分如層粘連蛋白、明膠、或Matrigel，后者是一種商業(yè)上能得到的來(lái)自Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤細(xì)胞的胞外基質(zhì)制品，它在室溫中膠化成一種再生(reconstituted)的基底膜(實(shí)施例1)。一旦少突膠質(zhì)細(xì)胞已吸附在基質(zhì)上(幾小時(shí)到幾天)，其他細(xì)胞類(lèi)型能被洗去，吸附的細(xì)胞可通過(guò)如短暫的胰島素消化回收。除了富集所需的細(xì)胞類(lèi)型外，這個(gè)操作方法具有打碎大細(xì)胞塊的優(yōu)點(diǎn)，使得進(jìn)一步的操作省力。
分離操作程序的有效性能通過(guò)測(cè)量針對(duì)下面所列標(biāo)志的富集來(lái)評(píng)定。一旦少突膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)這種方式被純化，它們能如已經(jīng)敘述的那樣在存在促分裂原時(shí)進(jìn)一步增殖，如下面部分所描述的那樣成熟，或者以適用于最終用途的方式配制。
進(jìn)一步成熟當(dāng)需要時(shí)，本發(fā)明的細(xì)胞在復(fù)制期后能夠進(jìn)一步分化成有功能的表型。這樣做以表征祖細(xì)胞的潛力，或者得到用于治療或藥物篩選目的的末期細(xì)胞。
通過(guò)以抑制前體表型進(jìn)一步增殖的方式改變生長(zhǎng)條件而實(shí)現(xiàn)成熟。例如，細(xì)胞可以接種在如能促進(jìn)成熟表型出現(xiàn)的聚-L-賴(lài)氨酸的底物上。作為選擇或另外地，一種或多種用于增殖細(xì)胞的生長(zhǎng)因子被取消。可將促進(jìn)成熟的因子包含在成熟培養(yǎng)基中，例如睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)，和CNTF受體的其它激動(dòng)劑。一旦細(xì)胞達(dá)到所要求的的成熟度，它們可以從培養(yǎng)基中收獲(例如使用胰蛋白酶或膠原蛋白)并被配制，以用于分析或最終用途。
分化細(xì)胞特征可根據(jù)許多表型標(biāo)準(zhǔn)表征細(xì)胞。這些標(biāo)準(zhǔn)包括但不局限于顯微鏡觀察到的形態(tài)特征、表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記物的檢測(cè)或定量、體外可測(cè)量的功能性標(biāo)準(zhǔn)，以及灌注給宿主動(dòng)物后的行為。
表型標(biāo)記物可根據(jù)是否表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)記物特征表征本發(fā)明的分化細(xì)胞。針對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的可能依賴(lài)于細(xì)胞群成熟而存在的經(jīng)典免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記物為下列各項(xiàng)●NG2，硫酸軟骨素蛋白聚糖，由巨噬細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞表達(dá)●半乳糖腦苷脂(GalC)，針對(duì)指定少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物●髓磷脂堿性蛋白(MBP)，成熟髓磷脂和生產(chǎn)髓磷脂細(xì)胞的標(biāo)記物由少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞表達(dá)的其它有用標(biāo)記物包括如下●PDGFRα，PDGF的膜受體，由少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligoprogenitors)、少突膠質(zhì)細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)●TRα1，甲狀腺激素的細(xì)胞核受體，由少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligoprogenitors)、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和其他細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)●髓磷脂蛋白脂質(zhì)蛋白，髓磷脂的一種成分，在少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)前體上表達(dá)●O4抗體定義的表位，少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及它們前體的標(biāo)記物●波形蛋白，成纖維細(xì)胞類(lèi)型的絲狀蛋白，標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞前體(在少突膠質(zhì)細(xì)胞上經(jīng)常為陰性)
●膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物(在少突膠質(zhì)細(xì)胞上陰性)●A2B5，II型星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞和胰腺的β細(xì)胞上表達(dá)的表位●RIP抗體識(shí)別的表位，能染色少突膠質(zhì)細(xì)胞和它們的突起，并與脊髓和小腦中髓鞘化軸突相一致在向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的路徑中在不同時(shí)間表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子包括如下●Olig1，一種螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)家族的轉(zhuǎn)錄因子，由少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligoprogenitors)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞和腎臟細(xì)胞表達(dá)●Olig2，HLH家族的轉(zhuǎn)錄因子，由少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligoprogenitors)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞(progenitors)和松果腺表達(dá)●Sox10，Sox家族轉(zhuǎn)錄因子，由少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligoprogenitors)、少突膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)膜細(xì)胞，神經(jīng)嵴(neural rest)、耳蝸、前列腺和黑素細(xì)胞表達(dá)●Nkx2.2，Hox家族轉(zhuǎn)錄因子，由少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligoprogenitors)、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元祖細(xì)胞、胰腺α和β細(xì)胞表達(dá)●Pax6，HLH家族轉(zhuǎn)錄因子，由少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(oligoprogenitors)、神經(jīng)元祖細(xì)胞、胰腺α和β細(xì)胞、晶狀體視網(wǎng)膜、垂體、肝臟和脾表達(dá)其他細(xì)胞類(lèi)型的有用標(biāo)記物包括如下●神經(jīng)元核抗原(NeuN)，神經(jīng)元成熟的標(biāo)記物(一般在少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞中陰性)●III級(jí)β-微管蛋白(TuJ1)，另一種神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物●微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)，CNS細(xì)胞的標(biāo)志(可能是陽(yáng)性的)● SSEA-4、Oct-4和端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)，未分化pPS細(xì)胞的標(biāo)記物(在少突膠質(zhì)細(xì)胞和它們的前體上陰性)組織特異性標(biāo)記物可以用任何合適的免疫學(xué)技術(shù)來(lái)檢測(cè)——例如針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的流式免疫細(xì)胞化學(xué)，或者針對(duì)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)(例如，固定細(xì)胞或組織切面的免疫組織化學(xué))。一種針對(duì)流式細(xì)胞術(shù)分析的詳細(xì)方法見(jiàn)于Gallacher等，Blood 961740，2000。如果在免疫細(xì)胞化學(xué)或流式細(xì)胞儀試驗(yàn)中，任選地在固定細(xì)胞后，以及任選地使用標(biāo)記的二級(jí)抗體或其它用于放大標(biāo)記的偶聯(lián)物，顯著可檢測(cè)量的抗體與抗原結(jié)合，則細(xì)胞表面抗原的表達(dá)被定義為陽(yáng)性。
組織特異性基因產(chǎn)物的表達(dá)也可以通過(guò)Northern印跡分析、斑點(diǎn)雜交分析或者通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法中采用序列特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶起始的多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)而在mRNA水平上檢測(cè)到。更多細(xì)節(jié)參閱美國(guó)專(zhuān)利No.5,843,780。特定標(biāo)記物的序列信息可從公共數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank中得到。例如，髓磷脂半乳糖脂生物合成酶UDP-半乳糖神經(jīng)酰胺半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT，GenBank登錄號(hào)No.AH006651)是一種在GalC合成中催化最后一步的酶。
為了促進(jìn)在研究或治療中的應(yīng)用，把細(xì)胞群中具有少突膠質(zhì)細(xì)胞和它們前體特征的細(xì)胞比例最大化常常是有益的。如以下實(shí)施例部分所描述的，有可能獲得幾乎具有從大約至少20％，到大約超過(guò)60％、80％、90％、95％或甚至98％的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體或成熟細(xì)胞(或兩者混合物)的細(xì)胞群，這些細(xì)胞的任何表型標(biāo)記物特征中的一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)被確定為陽(yáng)性(如上所述)。
對(duì)于涉及神經(jīng)功能重組的治療應(yīng)用，經(jīng)常需要使細(xì)胞器形成其它細(xì)胞類(lèi)型的能力最小化——尤其是未分化的pPS細(xì)胞和非外胚層譜系的細(xì)胞。取決于實(shí)際的應(yīng)用，把神經(jīng)元譜系細(xì)胞和它們的指定前體，星形膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞和它們的指定前體，以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或所有神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型的普通前體的比例最小化也是有利的。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的少突膠質(zhì)細(xì)胞群受這些其它細(xì)胞類(lèi)型的污染少于～1％、0.2％、或0.05％。
熟練的技術(shù)人員早已知曉作為少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞特點(diǎn)的形態(tài)特征。少突膠質(zhì)細(xì)胞有時(shí)會(huì)出現(xiàn)雙極形狀，從身體中央向相反的極延伸出兩個(gè)突起。它們可能也會(huì)具有相對(duì)扁平細(xì)胞的形狀，攜帶有少突膠質(zhì)細(xì)胞許多相同的標(biāo)記物和其他特征。通過(guò)相對(duì)緩慢的生長(zhǎng)速度和對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和可溶解的因子的依賴(lài)性，它們能與其他細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)區(qū)分出來(lái)。雙極形的細(xì)胞和扁平的細(xì)胞可相互轉(zhuǎn)換，依賴(lài)于促進(jìn)扁平細(xì)胞占優(yōu)的生長(zhǎng)因子(例如EGF，bFGF)的存在或缺乏。本發(fā)明的前體細(xì)胞群可包含至少約20％、40％、60％、80％或更多的兩極形的或扁平的細(xì)胞表型。
在分化成更成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞后，突起的數(shù)目和復(fù)雜性通常會(huì)增加。突起之間會(huì)出現(xiàn)髓磷脂網(wǎng)狀物，后者纏繞在單根軸突周?chē)?，形成促進(jìn)神經(jīng)沿著該軸突傳遞的髓鞘。
基因型特征當(dāng)衍生自分離的pPS細(xì)胞或已建立的pPS細(xì)胞株時(shí)，本發(fā)明的少突膠質(zhì)細(xì)胞可被表征為作為起源細(xì)胞或細(xì)胞系的后代。因此，少突膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)具有與衍生它們的細(xì)胞相同的基因組。這意味著除任何核型變化之外，在pPS細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之間染色體DNA會(huì)有超過(guò)90％是相同的。經(jīng)重組方法引入一個(gè)轉(zhuǎn)基因或剔除一個(gè)內(nèi)源性基因的少突膠質(zhì)細(xì)胞仍然被認(rèn)為具有和衍生它們的細(xì)胞系一樣的基因組，因?yàn)樗蟹遣僮鞯倪z傳成分都被保留著。
可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的遺傳指紋法技術(shù)鑒別少突膠質(zhì)細(xì)胞和pPS細(xì)胞具有相同的基因組。具有相同的基因組也可推測(cè)少突膠質(zhì)細(xì)胞是否通過(guò)正常的有絲分裂從未分化細(xì)胞系獲得。
在某些工業(yè)應(yīng)用中，這一特征是本發(fā)明少突膠質(zhì)細(xì)胞有價(jià)值的特征。特別地，原始pPS細(xì)胞的可獲得性進(jìn)一步提供遺傳學(xué)匹配的少突膠質(zhì)細(xì)胞，因?yàn)榭纱俪蓀PS細(xì)胞增殖、再分裂和分化成更多所需要的少突膠質(zhì)細(xì)胞。此外，pPS細(xì)胞能分化成其他治療上重要的譜系。例如，它們可以分化成能幫助將所需的受體耐性呈遞給具有匹配的少突膠質(zhì)細(xì)胞的植入物(engraftment)的免疫耐受細(xì)胞群(國(guó)際申請(qǐng)PCT/US01/43434，Geron Corp.)。
通過(guò)在分化前或后使細(xì)胞增殖，本申請(qǐng)所述的技術(shù)允許產(chǎn)生具有相同基因組的大細(xì)胞群的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞。具有108、1010、或1012個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群理論上是可能的。這樣大的細(xì)胞群通常被分裝入適合進(jìn)一步培養(yǎng)、藥物篩選或治療給藥的獨(dú)立容器中。
本發(fā)明某些實(shí)施方式包括原始細(xì)胞(例如未分化的pPS細(xì)胞系或中間的細(xì)胞群)與具有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞特征的分化細(xì)胞的結(jié)合。這兩個(gè)細(xì)胞群可以放在同一容器中，在同一設(shè)備的獨(dú)立容器中，或兩個(gè)不同地方。未分化的和分化的細(xì)胞可以同時(shí)存在或在不同時(shí)間存在，例如當(dāng)未分化細(xì)胞的培養(yǎng)物被誘導(dǎo)使它或它的全部分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞時(shí)，如已敘述的。
功能特點(diǎn)為了質(zhì)控目的，通常需要按照功能標(biāo)準(zhǔn)表征本發(fā)明的分化細(xì)胞特點(diǎn)。不同功能可能具有相對(duì)不同的興趣，這依賴(lài)于所要的最終用途。例如，可針對(duì)于它們?cè)诮M織培養(yǎng)中再髓鞘化神經(jīng)組織的能力、在體內(nèi)修復(fù)誘導(dǎo)了脫髓鞘化的位置的能力，或它們?cè)谑軗p對(duì)象中恢復(fù)神經(jīng)功能的能力來(lái)評(píng)估細(xì)胞。許多實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拇嬖谑菫榱藴y(cè)定這些特征，包括下面非限制性例子。
1.在協(xié)同培養(yǎng)中體外髓鞘化從2-3月齡大鼠收獲腰椎和頸DRG神經(jīng)元制得成年背側(cè)根神經(jīng)節(jié)(DRG)培養(yǎng)物。將這些細(xì)胞搗碎，離心，并在DMEM F12培養(yǎng)基中以每毫升～100,000活神經(jīng)元的濃度再懸浮，然后接種到包涂有層粘連蛋白的盤(pán)中4個(gè)星期。加入～2.5×104少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞、并每天給料(feeding)培養(yǎng)額外4周，從而進(jìn)行體外髓鞘化。Target和Blakemore(Eye 8(part2)238，1994)闡述了采用人少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)嚙齒動(dòng)物軸突進(jìn)行的髓鞘化。
為了檢測(cè)少突膠質(zhì)細(xì)胞形成髓磷脂的能力，協(xié)同培養(yǎng)物用4％多聚甲醛過(guò)夜固定并對(duì)GalC染色。選擇鄰近神經(jīng)節(jié)的可見(jiàn)區(qū)域，并針對(duì)每個(gè)區(qū)域內(nèi)髓磷脂片斷的數(shù)目記分。分化能力是通過(guò)對(duì)低密度培養(yǎng)物的標(biāo)記物如巢蛋白(nestin)、β-微管蛋白III、GFAP、CNP、GalC、Ki-67抗原、NeuN、或神經(jīng)絲70染色而測(cè)定的。
培養(yǎng)中DRG髓鞘化的證據(jù)通常與少突膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)功效相關(guān)聯(lián)。采用合適的動(dòng)物模型可進(jìn)一步獲得細(xì)胞在體內(nèi)存活并增強(qiáng)髓鞘化或軸突再生長(zhǎng)的能力。另一方面，協(xié)同培養(yǎng)中的髓鞘化將依賴(lài)于培養(yǎng)的條件，并且陰性結(jié)果不能排除在體內(nèi)的功效。可通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件而改善體內(nèi)試驗(yàn)的預(yù)期價(jià)值例如加入據(jù)認(rèn)為能增強(qiáng)髓鞘化的因子，如IGF，或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白樣NT-3。
2.慢性脫髓鞘模型慢性脫髓鞘的區(qū)域可以在成年大鼠背柱中被誘導(dǎo)(Keirstead等，J Neurosci.197529，1999)。在采用鉛屏蔽下，脊髓在2cm的距離(集中在T9上)處暴露于40G的X輻射下，這樣會(huì)把缺口引入被暴露的細(xì)胞DNA中，導(dǎo)致正在分裂的細(xì)胞死亡。此后，2天后在T9直接的溴化乙錠脊髓內(nèi)注射。溴化乙錠是一種DNA嵌入螯合劑(interchelating)，能殺死暴露于其中的細(xì)胞，提供慢性脫髓鞘的非細(xì)胞區(qū)域和背柱面積的～60％無(wú)活性少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。
三天后，將少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞移植到這些動(dòng)物脫髓鞘的位置中。任選地，這些細(xì)胞可以用48h前加入到培養(yǎng)基中的溴脫氧尿苷(BrdU)預(yù)標(biāo)記。起初，以～30個(gè)前體的群落制備細(xì)胞，濃縮到每微升～60,000個(gè)細(xì)胞的密度。使用一個(gè)～80um外徑的牽引式玻璃微移液管在10分鐘內(nèi)將一微升細(xì)胞給予到受損位置。大約2～4周后，準(zhǔn)備好組織樣本，以用于樹(shù)脂或恒冷箱切片成1mm橫塊。
來(lái)自冠狀正面的部分用甲苯胺藍(lán)染色，并對(duì)普通病理學(xué)、再髓鞘化證據(jù)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析。因?yàn)楸徽T導(dǎo)區(qū)域是非細(xì)胞性的，移植后出現(xiàn)的細(xì)胞是衍生自所給予的細(xì)胞。恒冷箱切片可針對(duì)相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記物進(jìn)行染色，例如GFAP(星形膠質(zhì)細(xì)胞)、CNP(少突膠質(zhì)細(xì)胞)、RIP(少突膠質(zhì)細(xì)胞)，或NeuN(神經(jīng)元)。超薄部分也能用電子顯微鏡分析髓磷脂薄層數(shù)量和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。貫穿脫髓鞘過(guò)程的移植細(xì)胞的重新分配，以及向成熟髓鞘化細(xì)胞的分化能被檢測(cè)到。大約25％、50％或75％脫髓鞘軸突的再髓鞘化百分率是生物功效提高的證據(jù)。
也可在先天性髓鞘化異常(dysmyelination)的模型中測(cè)試少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的治療能力。涉及髓磷脂堿性蛋白突變或缺陷的已建立模型包括發(fā)抖突變小鼠(Roach等，Cell42149，1985)和Long Evans shaker大鼠(Kwiecien等，J.Neurocytol.27581，1989；Delaney等，Lab.Anim.Sci.45547，1995)。可通過(guò)腦內(nèi)室(intracerebroventricular)或池移植(Mitome等，Brain 1342147，2001)、或者通過(guò)直接給予到脊髓中(Liu，McDonald等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA976126，2000)測(cè)試重新構(gòu)建。在涉及MBP突變或缺陷的模型中形成的致密髓磷脂直接歸于所給予的細(xì)胞，因?yàn)檫@些動(dòng)物通常不具備正確的髓鞘化能力，結(jié)果遭受神經(jīng)學(xué)缺陷所困。
3.脊髓損傷模型針對(duì)SCI的模型包括挫傷性損傷和背對(duì)切(dorsalhemisection)。對(duì)于挫傷性損傷，采用適當(dāng)?shù)募怪靷該p傷設(shè)備，將脊柱路線(xiàn)(course)被移位～0.9mm(中等損傷)超過(guò)23msec。對(duì)于對(duì)切損傷，采用定向控制器用尖頭解剖刀片將脊髓的背側(cè)一半切掉。兩個(gè)操作之后都進(jìn)行適當(dāng)?shù)男g(shù)后護(hù)理。
為了促進(jìn)植入細(xì)胞的移動(dòng)和去除髓磷脂相關(guān)的生長(zhǎng)抑制物，任選地將脊髓脫髓鞘(Keirstead等，Exp Neurol.151303，1998)。在軸突損傷部位尾部和脊椎管的中央產(chǎn)生2mm的孔。向暴露的脊髓注入約4微升的用33％豚鼠補(bǔ)體(Herlan SeraLab)磷酸鹽緩沖液以1∶2稀釋的多克隆抗-GalC抗體(Chemicon)。
在損傷后～24小時(shí)，通過(guò)牽引式玻璃微移液管向這些動(dòng)物植入少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞?；蛘撸ㄟ^(guò)停止治療1-3個(gè)月來(lái)建立慢性損傷模型。用細(xì)胞治療后，可使用錄像磁帶記錄功能反應(yīng)，并定期監(jiān)測(cè)臨床改善證據(jù)。例如，可使用BBB等級(jí)(BBB scale)定量測(cè)定地上運(yùn)動(dòng)，該BBB等級(jí)是一個(gè)基于關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)、體重支持、四肢協(xié)調(diào)的其它特征的21-點(diǎn)等級(jí)(實(shí)施例2)。
對(duì)于組織學(xué)檢查，可對(duì)動(dòng)物預(yù)注射示蹤劑，如生物素標(biāo)記的霍亂毒素β-亞單位(CTB，4ul0.1％雙側(cè)進(jìn)入坐骨神經(jīng))，或者生物素化葡聚糖胺(BDA，10ul10％，進(jìn)入感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮層)。大約2周后，制備脫髓鞘模型的組織切片，用于定位移植細(xì)胞的位置并作為再髓鞘化的證據(jù)，通過(guò)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)能將它們與正常髓鞘化或部分脫髓鞘區(qū)別。還分析切片中標(biāo)記有注入的示蹤劑的軸突，以獲得特征性神經(jīng)突生長(zhǎng)錐的證據(jù)?？赏ㄟ^(guò)對(duì)神經(jīng)元標(biāo)記物如RT97抗原(神經(jīng)絲的一種標(biāo)記物)、血清素(5HT)、去甲腎上腺素(NE)和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)進(jìn)行染色而評(píng)估軸突再生的免疫細(xì)胞化學(xué)證據(jù)。
少突膠質(zhì)細(xì)胞的遺傳修飾本發(fā)明某些少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞群具有真實(shí)的增殖能力。如果需要，通過(guò)增加內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄或?qū)朕D(zhuǎn)基因而增加細(xì)胞中端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的水平，從而可進(jìn)一步增強(qiáng)這種復(fù)制能力。特別適合的是人端粒酶(hTERT)的催化組件，提供于國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 98/14592。Bodnar等(Science 279349，1998和Jiang等，Nat.Genet.21111，1999)描述了在人細(xì)胞中端粒酶的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。
可提高未分化pPS細(xì)胞中端粒酶(telomerase)的表達(dá)，然后這些細(xì)胞能分化成本發(fā)明所述的少突膠質(zhì)細(xì)胞。或者，這些pPS細(xì)胞能分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞前體，然后轉(zhuǎn)染以提高TERT的表達(dá)?？筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)RT-PCR、端粒酶活性(TRAP試驗(yàn))、針對(duì)TERT的免疫細(xì)胞化學(xué)染色或復(fù)制能力評(píng)估遺傳改變的細(xì)胞在某些應(yīng)用中也考慮使細(xì)胞無(wú)限增殖的其它方法，例如用編碼myc、SV40大T抗原或MOT-2的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利5,869,243，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 97/32972和WO 01/23555)。
如果需要，可制備或進(jìn)一步處理本發(fā)明的細(xì)胞，以體外除去未分化的細(xì)胞，或體內(nèi)提供針對(duì)回復(fù)體的保護(hù)。使細(xì)胞群中未分化干細(xì)胞耗盡的方法，是用其效應(yīng)子基因受誘導(dǎo)未分化細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)的啟動(dòng)子(如TERT啟動(dòng)子或OCT-4啟動(dòng)子)控制的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞群。該效應(yīng)子基因可以是引導(dǎo)細(xì)胞篩選的報(bào)告子，如綠熒光蛋白。該效應(yīng)子可以直接裂解到細(xì)胞中，編碼如毒素，或者細(xì)胞凋亡的介體，例如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)(Shinourad等，Cancer Gene Ther.7739，2000)。該效應(yīng)子基因可具有使細(xì)胞易感于外源制劑如抗體或前體藥物的毒性效應(yīng)的作用。代表性的例子是單純皰疹胸腺苷激酶(tk)基因，能導(dǎo)致表達(dá)它的細(xì)胞對(duì)9-〔1，3-二羥-2-丙氧甲基〕鳥(niǎo)嘌呤易感(美國(guó)專(zhuān)利6,576,464 B1)?；蛘?，該效應(yīng)子能引起外來(lái)決定簇在細(xì)胞表面表達(dá)，這種決定簇能使回復(fù)到未分化表型的任何細(xì)胞對(duì)體內(nèi)自然產(chǎn)生抗體易感(美國(guó)2003-0032187 A1)。
還可遺傳改變本發(fā)明的細(xì)胞，以增強(qiáng)它們?cè)诮M織再生中的能力，或者增強(qiáng)它們將治療基因送遞到治療對(duì)象中的能力。采用所需基因的已知編碼序列來(lái)設(shè)計(jì)載體，操作性連接于組成型(如CMV啟動(dòng)子)或在少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞中特別有活性(如髓磷脂堿性蛋白的啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子。可根據(jù)此策略表達(dá)各轉(zhuǎn)基因，例如增強(qiáng)少突膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)、激活再髓鞘化、或促進(jìn)軸突再生的那些轉(zhuǎn)基因。代表性例子是編碼神經(jīng)生長(zhǎng)因子的基因(美國(guó)專(zhuān)利5,885,584和6,268,340)。
在研究和臨床治療中少突膠質(zhì)細(xì)胞的用途本發(fā)明提供了用于各種重要研究、開(kāi)發(fā)和商業(yè)目的的生產(chǎn)大量少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的細(xì)胞能用于制備相對(duì)沒(méi)有被在來(lái)自其他譜系的細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的cDNA污染的cDNA文庫(kù)。本發(fā)明的分化細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法還可用于制備對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞和它們的衍生物的標(biāo)記物特異的單克隆或多克隆抗體。
特別感興趣的是本發(fā)明組合物在藥物開(kāi)發(fā)和臨床治療中的用途。
藥物篩選本發(fā)明的細(xì)胞能用于篩選影響少突膠質(zhì)細(xì)胞前體和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞特性的各種因子(如溶劑、小分子藥物、肽、多核苷酸)或環(huán)境條件(如培養(yǎng)條件和操作)。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用pPS細(xì)胞(未分化的或啟動(dòng)進(jìn)入分化程序(paradigm)的)篩選促進(jìn)成熟為少突膠質(zhì)細(xì)胞或促進(jìn)長(zhǎng)期培養(yǎng)中少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和維持的因子。例如，將候選的成熟因子或生長(zhǎng)因子加到不同孔中的細(xì)胞中，然后根據(jù)細(xì)胞的進(jìn)一步培養(yǎng)和用途的所需標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)所產(chǎn)生的任何表型變化。這可導(dǎo)致改進(jìn)的針對(duì)pPS衍生的少突膠質(zhì)細(xì)胞和從初生(primary)神經(jīng)組織中分離出來(lái)的少突膠質(zhì)細(xì)胞和它們的祖代的衍生和培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的其他篩選方法涉及測(cè)試藥學(xué)化合物對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育的潛在不利影響或毒性。這種類(lèi)型的篩選不僅在化合物被設(shè)計(jì)成對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞本身有藥理學(xué)影響時(shí)是適當(dāng)?shù)?，而且它們也適用于測(cè)試針對(duì)它處基本藥理學(xué)影響而設(shè)計(jì)的化合物的少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)副作用。
其他篩選方法涉及使用少突膠質(zhì)細(xì)胞測(cè)量在其髓鞘化軸突的作用中對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞活性具有潛在影響的小分子藥物的作用。為此，可體外混合這些細(xì)胞和待測(cè)化合物，并測(cè)定該化合物對(duì)髓磷脂相關(guān)活性的影響——例如，髓磷脂相關(guān)組分如髓磷脂堿性蛋白的表達(dá)；組織學(xué)上可檢測(cè)的髓鞘的形成；以及在與神經(jīng)細(xì)胞的協(xié)同培養(yǎng)中髓鞘化相鄰軸突的能力。
對(duì)于藥物篩選的一般原則，讀者可參考美國(guó)專(zhuān)利5,030,015以及教科書(shū)“Invitro Methods in Pharmaceutical Research”，Academic Press 1997。候選藥學(xué)化合物活性的評(píng)估通常包括將本發(fā)明的分化細(xì)胞和候選化合物混合，可單獨(dú)或與其他藥物混合。研究者測(cè)定歸因于該化合物的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、標(biāo)記物表型或功能活性方面的任何變化(與未處理的細(xì)胞或用惰性化合物處理過(guò)的細(xì)胞相比較)，然后使化合物的作用與觀察到的變化相關(guān)聯(lián)。
臨床治療中的少突膠質(zhì)細(xì)胞本發(fā)明提供少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞和它們的衍生物在需要這樣治療的病人中保持或恢復(fù)神經(jīng)功能的用途。具體而言，為了使神經(jīng)元阻止再髓鞘化，或者為了給神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的維持或再生提供支持，可給予本發(fā)明的細(xì)胞。不包含任何限制，所給予的細(xì)胞可以具有穩(wěn)定或提高已經(jīng)在適當(dāng)位置的神經(jīng)元的功能，或者輔助神經(jīng)元在相互之間或與它們控制的組織形成新的連接。
藥物組合物的性質(zhì)將部分依賴(lài)于待治療的病癥。在一些實(shí)例中，采用具有良好的復(fù)制能力和操作復(fù)原的前體細(xì)胞(NP2或GalC陽(yáng)性)配制組合物是適當(dāng)?shù)?。在其他?shí)例中，采用更成熟的細(xì)胞(GalC或MBP陽(yáng)性)配制組合物以提供更直接的髓鞘化能力也是適當(dāng)?shù)摹?br> 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)把懸浮培養(yǎng)中形成的大團(tuán)聚體吸附到合適的基質(zhì)上，如Matrigel，可容易地從pPS衍生的細(xì)胞獲得相對(duì)分散的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞群。把培養(yǎng)的細(xì)胞接種在底物上幾小時(shí)到幾天，并去除未吸附的細(xì)胞。然后采用合適的化學(xué)或機(jī)械方法收獲少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞，例如經(jīng)短暫酶消化后進(jìn)行研磨。據(jù)信，不多于～30個(gè)細(xì)胞的單分散細(xì)胞群或簇在細(xì)胞操作、保持性能和給予后提供有益作用的能力方面是有利的。通常洗滌這些細(xì)胞，然后以適合于給予有效劑量以將細(xì)胞維持在疾病部位的濃度將其懸浮在藥學(xué)上兼容的培養(yǎng)液中(即每微升20,000到100,000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)治療區(qū)域的體積來(lái)測(cè)量)。
根據(jù)針對(duì)神經(jīng)學(xué)適應(yīng)治療的通常程序來(lái)準(zhǔn)備患者。采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫抑制治療(如環(huán)孢霉素A)來(lái)治療患者，以防止排斥。選擇地或另外地，采用造血細(xì)胞或來(lái)自同一pPS細(xì)胞系的未分化細(xì)胞，他們可以特異性耐受少突膠質(zhì)細(xì)胞的異型(WO 02/44343；WO 03/050251)。在一些實(shí)例中，使損傷部分的神經(jīng)元短暫脫髓鞘化可能是有利的，這可改善給予的細(xì)胞的進(jìn)入(access)或去除可能抑制再髓鞘化的因子。實(shí)現(xiàn)這些的一個(gè)方法是將局部環(huán)境補(bǔ)體固定的抗體給予髓鞘上的一個(gè)或多個(gè)表位，如GalC、O4、或髓磷脂相關(guān)糖蛋白。參見(jiàn)Keirstead等，Brain Res.Bul.44727，1997；以及加拿大專(zhuān)利2,253,078。然后在需要神經(jīng)功能髓鞘化或再生的部位或其周?chē)o予一劑或多劑本發(fā)明的分化細(xì)胞。
然后讓對(duì)象接受支持性的術(shù)后護(hù)理，并監(jiān)視其移植接受性或神經(jīng)功能的再生。適當(dāng)時(shí)，患者可同時(shí)接受據(jù)信能恢復(fù)少突膠質(zhì)細(xì)胞功能的其他方法的治療，例如Fampridine-SR(4-氨基吡啶)?？刹捎妹庖呒?xì)胞化學(xué)分析組織學(xué)樣本的相關(guān)標(biāo)記物，如先前所述的，并評(píng)估各種功能性事情，例如由所給予的細(xì)胞的存在引起的軸突再髓鞘化以及軸突萌發(fā)?？筛鶕?jù)患者疾病的典型病理特征監(jiān)測(cè)患者臨床癥狀的維持或改善，并進(jìn)行功能評(píng)估，例如在增殖無(wú)能狀態(tài)等級(jí)的基礎(chǔ)(expanded disability status scale，EDSS)上。
適合用本發(fā)明組合物治療的病癥包括但不限于涉及漸進(jìn)性脫髓鞘的病癥，以及其維持或生產(chǎn)髓磷脂的能力可能有助于治愈或幫助預(yù)防進(jìn)一步惡化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。
多發(fā)性硬化是一種以大腦或脊髓中脫髓鞘的彌散性修補(bǔ)(patch)為特征的緩慢漸進(jìn)性疾病。脫髓鞘斑以及少突神經(jīng)膠質(zhì)的破壞和血管周?chē)难装Y發(fā)生在整個(gè)CNS中，主要在白質(zhì)(尤其在頸部或背側(cè)地區(qū))、視神經(jīng)以及室周區(qū)域。中腦、腦橋和小腦、大腦中的灰質(zhì)和脊髓也受到影響。
急性彌散性腦脊髓炎(感染后腦脊髓炎)的特征是血管周?chē)鶦NS脫髓鞘化，它可自發(fā)地發(fā)生，但通常發(fā)生在病毒感染或病毒疫苗接種之后。慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)根神經(jīng)病(CIDP)的特征是神經(jīng)內(nèi)膜間隙和血管周?chē)盏窖仔訲細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，并導(dǎo)致末梢神經(jīng)的節(jié)段性脫髓鞘。HTLV相關(guān)的脊髓病是以雙腿痙攣性無(wú)力為特征的一種慢性漸進(jìn)性脊髓疾病。一些末梢神經(jīng)病，例如急性熱病性多神經(jīng)炎，也是以脫髓鞘為特征的。
先天性代謝病(例如苯丙酮尿癥和其他氨基酸尿癥；泰-薩病、尼曼-皮克病、和戈謝??；胡爾勒綜合征、克拉貝病和其他腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良)會(huì)影響CNS中發(fā)育的髓鞘，并會(huì)導(dǎo)致永久性、廣泛性的神經(jīng)缺陷。腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(adernoleukodystrophy)和腎上腺髓神經(jīng)病(adrenomyeloneuropathy)以腎上腺功能障礙和神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛脫髓鞘為特征的X-連鎖退行性代謝病。家族性中葉性硬化是一種由于蛋白脂質(zhì)蛋白基因中點(diǎn)突變而無(wú)法形成髓磷脂的疾病。Leber’s遺傳性視神經(jīng)萎縮和相關(guān)的線(xiàn)粒體疾病首先主要以中心視力的兩邊喪失為特征。
任何急性或長(zhǎng)期的由CNS的創(chuàng)傷所導(dǎo)致的異常，以及與通過(guò)缺氧和缺血引起髓磷脂的損失的病癥都可以考慮加以治療。包括于這一類(lèi)的病癥有中風(fēng)或創(chuàng)傷性腦損傷相關(guān)的病癥。
導(dǎo)致任何級(jí)別的截癱或不完善的運(yùn)動(dòng)功能的各種脊髓損傷是采用本發(fā)明細(xì)胞進(jìn)行治療的首要候選者。依賴(lài)于性質(zhì)和可及性，對(duì)于頸部、腰部、胸部和骶骨脊柱的損傷都可獲得它們癥狀的改善或穩(wěn)定。導(dǎo)致SC功能完全或不完全喪失的急性損傷可同時(shí)或在減壓外科手術(shù)后立即治療。慢性病癥在需要的時(shí)候治療或再治療?？墒褂冕槨⒉骞?、或其它合適的裝置在損傷部位上或在其周?chē)酝饪剖中g(shù)、內(nèi)窺鏡檢查或經(jīng)皮注射給予細(xì)胞。如果得到批準(zhǔn)，可使用誘發(fā)電位試驗(yàn)測(cè)試電生理學(xué)功效。也可使用各種標(biāo)準(zhǔn)，如美國(guó)脊椎損傷協(xié)會(huì)(ASIA)運(yùn)動(dòng)評(píng)分、Ferrans和Powers生命指數(shù)質(zhì)量(QLI)，評(píng)估患者運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)傳導(dǎo)路(sensory pathway)中的臨床改善。
總的說(shuō)，對(duì)于患者選擇、給藥方式、以及復(fù)原監(jiān)測(cè)的最終職責(zé)是臨床醫(yī)生的責(zé)任。
為了商業(yè)配送的目的，通常以藥物組合物的形式提供本發(fā)明的少突膠質(zhì)細(xì)胞，該組合物含有等滲賦形劑，并且在對(duì)人給藥時(shí)充分無(wú)菌的條件下制備。本發(fā)明也包括了一個(gè)試劑系統(tǒng)，包含有在制造、配送或使用中存在于任何時(shí)間的細(xì)胞集合(set)或組合(combination)。這個(gè)細(xì)胞集合包含本發(fā)明描述的兩個(gè)或更多細(xì)胞群的任一組合，例子包括但不限于一類(lèi)分化的pPS衍生的細(xì)胞(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、它們的前體和亞型等)與未分化的pPS細(xì)胞或其他分化的細(xì)胞類(lèi)型(有時(shí)候具有相同的基因組)的組合。同一集合中的各細(xì)胞類(lèi)型在同一時(shí)間或不同時(shí)間，在相同實(shí)體或具有商業(yè)關(guān)系的不同實(shí)體的控制下，可一起包裝，或包裝在相同設(shè)備的獨(dú)立容器中，或在不同的地方。
對(duì)于細(xì)胞組合物的藥學(xué)配制中的一般原則，讀者可以參考“細(xì)胞治療干細(xì)胞移植，基因治療，以及細(xì)胞免疫治療”，由G.Morstyn和W.Sheridan編輯，劍橋大學(xué)出版，1996；以及“針對(duì)神經(jīng)疾病的細(xì)胞移植”，T.B.Freeman等編輯，Humana Press，1998。細(xì)胞可以被包裝在一個(gè)適合配送或臨床使用的設(shè)備或容器中，任選地伴有涉及細(xì)胞保存或它們作為藥物治療上述臨床病癥的用途，或用于任何其他值得做的目的的信息。
提供下面的實(shí)施例用于進(jìn)一步闡述本發(fā)明的特定實(shí)例，但不起限定作用實(shí)施例實(shí)施例1hES細(xì)胞分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞在用原代小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)理過(guò)且含加入bFGF的剔除型(knockout)(無(wú)血清)培養(yǎng)基中，在Matrigel基質(zhì)上，在沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，人類(lèi)胚胎干(hES)細(xì)胞H7和H1細(xì)胞系以未分化的狀態(tài)繁殖(WO 99/20741；WO 01/51616，GeronCorp)。
根據(jù)下面的方案，hES細(xì)胞被分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞表1從hES中產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞

GRM是神經(jīng)膠質(zhì)限制培養(yǎng)基(見(jiàn)表2)。
轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基(TR)的制備是GRM和用于制備hES細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的1∶1混合物。
表2神經(jīng)膠質(zhì)限制培養(yǎng)基(GRM)的組成部分

分化方案的實(shí)施如下●第1天用膠原酶IV(Gibco 17101-015)分離來(lái)自粘附基質(zhì)上的ES集落，并且將該集落置于低粘附6孔培養(yǎng)板的含4ng/mLbFGF(Gibco 13256-029)的TR中。僅在分化方案的開(kāi)始時(shí)，使用青霉素-鏈霉素(Gibco 10378-016)3天。
●第2-10天細(xì)胞與維甲酸一起培養(yǎng)(RA；全反式維甲酸，Sigma223018)，10μM，每天供料共計(jì)8天。RA原液被配制在DMSO中，濃度為6mg/mL(約為0.02M)。
●從第3天起，培養(yǎng)基用GRM替換，并且不再把bFGF加到培養(yǎng)中。培養(yǎng)基每天替換。在飼養(yǎng)過(guò)程中，因?yàn)镽A對(duì)光敏感，所以光線(xiàn)被調(diào)暗至最小。從含ES細(xì)胞團(tuán)聚體的孔中的培養(yǎng)基收集于15毫升試管中。在低速短暫離心(800rpm，1分鐘)后，吸出上層清液并加入新鮮培養(yǎng)液。輕輕地用吸管上下吸取(2-3次)，確保6孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中4mL液體分布均勻。
●第10到15天第10天后，在每天的供料過(guò)程中，添加濃度為20ng/mL的EGF(Sigma E9644)和2ng/mL的bFGF。
●第15到21天從培養(yǎng)基中去除bFGF，而EGF持續(xù)維持濃度20ng/mL。
●第21天后通過(guò)維持含20ng/mL EGF的GRM培養(yǎng)基，產(chǎn)生了具有神經(jīng)特征的新的團(tuán)聚體/簇(即使在第42天后)。
●為了選擇這些神經(jīng)球形體(neurospheres)，在分化過(guò)程的第28天時(shí)，不采用任何解離方案，將全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到Matrigel包被的6-孔板上(Matrigel130，BD Bioscience 356231)，培養(yǎng)12-20小時(shí)(過(guò)夜)。第二天，在輕輕搖晃培養(yǎng)物之后，只有神經(jīng)球形體保持粘附，然后將其余培養(yǎng)液用新鮮的GRM培養(yǎng)液替代。
●在第35天，這些神經(jīng)團(tuán)聚體被接種于包被有聚-L-賴(lài)氨酸(Sigma P2636)和層粘連蛋白的4室成像玻片(Nalgene-Nunc International 154917)。用胰蛋白酶-EDTA的短時(shí)間處理(5分鐘)，以解離細(xì)胞團(tuán)聚體。細(xì)胞在PLL-層粘連蛋白上生長(zhǎng)7天，在該期間培養(yǎng)物每隔一天供料。
●在第42天，培養(yǎng)物用多聚甲醛固定，并用免疫組織化學(xué)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表征。采用的標(biāo)志物是NeuN、半乳糖腦苷脂(GalC)、Map2、O4、波形蛋白(Vimentin)、GFAP。
結(jié)果顯示在所附的相倒置(phase inverted)顯微照片中。
圖1顯示了在轉(zhuǎn)換培養(yǎng)液(50％神經(jīng)膠質(zhì)前體培養(yǎng)液)中懸浮培養(yǎng)兩天的胚狀體。
圖2顯示了在維甲酸中培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在分化第7天的球形體。從前3天起，清晰的球形體(sphere)開(kāi)始出現(xiàn)在培養(yǎng)懸液中。至第7天，這些球形體占培養(yǎng)液中80-90％的細(xì)胞。
圖3顯示了在去除RA處理后，球形體發(fā)生瓦解。通過(guò)添加細(xì)胞到球形體的里面和外面，某些小泡繼續(xù)生長(zhǎng)；細(xì)胞的凝集表現(xiàn)出深陰影球狀形態(tài)。在20ngEGF單獨(dú)存在時(shí)，球形體瓦解。然而，通過(guò)加入低濃度bFGF，球形體可以被維持。某些球形體通過(guò)新細(xì)胞的加入能繼續(xù)生長(zhǎng)，導(dǎo)致了球狀形態(tài)的、深陰影的細(xì)胞凝集形式。一些具有厚壁的小球形體可繼續(xù)生長(zhǎng)，但在幾天后完全消失。因此，bFGF以低濃度(2ng/ml)在培養(yǎng)液中維持5天，并且通過(guò)加入細(xì)胞層，使球形體繼續(xù)生長(zhǎng)。
圖4顯示了在bFGF去除后出現(xiàn)的變化。大多數(shù)細(xì)胞團(tuán)聚體開(kāi)始解離，并且整個(gè)培養(yǎng)基充滿(mǎn)單個(gè)細(xì)胞和小集落。同時(shí)，觀察到新的明黃色的球形體(箭頭)。
圖5顯示了在培養(yǎng)繼續(xù)時(shí)，亮黃色球形體(箭頭)被選擇性地維持。新的球形體每天出現(xiàn)，一些是從其他球形體中以出芽方式形成，一些來(lái)自分離的細(xì)胞塊，一些來(lái)自深色的細(xì)胞團(tuán)聚體。
在第28天，整個(gè)培養(yǎng)基被吸附在Matrigel基質(zhì)上過(guò)夜。只有定向?yàn)樯窠?jīng)的(neural committed)的球形體吸附到基質(zhì)上，而其余培養(yǎng)物繼續(xù)漂浮。
圖6顯示了在接種于Matrigel上2-3天后，來(lái)自球形體的神經(jīng)膠質(zhì)定向的神經(jīng)前體的遷移和分支情況。通過(guò)各細(xì)胞的縱向分裂，較小的集落形成一個(gè)圓圈，而大的集落表現(xiàn)出星狀遷移并具有長(zhǎng)突起。在生長(zhǎng)于Matrigel上數(shù)天后，出現(xiàn)了更多的遷移細(xì)胞。
一周后，用胰蛋白酶使培養(yǎng)物從Matrigel上解離下，然后以低密度接種于包被聚-L-賴(lài)氨酸和層粘連蛋白(Gibco 12163-010)的Nunc成像室，以便進(jìn)一步表征。在層粘連蛋白基質(zhì)上生長(zhǎng)3-4天后，接種的細(xì)胞就具有少突膠質(zhì)細(xì)胞的特征形態(tài)。
隨后發(fā)現(xiàn)，Matrigel選擇步驟能減少至10-20小時(shí)。非吸附的細(xì)胞被去除，然后將吸附細(xì)胞懸浮，并在含F(xiàn)GF、EGF和神經(jīng)膠質(zhì)前體的培養(yǎng)基中增殖。這有利于產(chǎn)生更分散的細(xì)胞群，更適合于治療性給藥及其他目的。
圖7顯示了該技術(shù)的結(jié)果。在吸附于Matrigel后，細(xì)胞增殖7天，接種于包被聚-L-賴(lài)氨酸層粘連蛋白上，并在無(wú)促分裂原下培養(yǎng)。這些細(xì)胞用4％多聚甲醛固定，并在3％羊血清和0.3％Triton-X 100去污劑中被封閉。免疫細(xì)胞化學(xué)分析的進(jìn)行，是采用抗半乳糖腦苷脂(GalC，Chemicon)的抗體，之后用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白。細(xì)胞核用溶血毒素復(fù)染(第一圖，20倍放大率；第二圖40倍放大率)。
在視野中至少大約95％細(xì)胞的顯示出GalC染色，(GalC是成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的標(biāo)志物)。
圖8顯示了對(duì)GalC進(jìn)行染色的ES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞的更高倍數(shù)的放大圖(60倍放大率)。至少約10％或20％的細(xì)胞具有少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征具體地，有許多突起，并且在突起之間有髓磷脂層所引起的網(wǎng)狀物(webbing)。
實(shí)施例2hES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)導(dǎo)致再髓鞘化和神經(jīng)發(fā)芽(sprouting)對(duì)于該實(shí)施例，采用與實(shí)施例1類(lèi)似的策略(稍有改動(dòng))，將來(lái)自H7細(xì)胞系的hES細(xì)胞分化成用于移植的少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞。GRM配方是相同的，不同點(diǎn)在于黃體酮濃度重新計(jì)算為65ng/mL。EGF從開(kāi)始起就包含在培養(yǎng)物中，并且bFGF在第2天后被取消。
表3 來(lái)自hES細(xì)胞的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖代的生產(chǎn)

在第一周，在供料之前先在低速離心4-5分鐘。在球形體開(kāi)始生長(zhǎng)后，通過(guò)使培養(yǎng)物在培養(yǎng)箱內(nèi)于15-50mL錐形管中沉淀5-10分鐘來(lái)進(jìn)行飼養(yǎng)。在單次細(xì)胞懸浮中，表達(dá)粘附因子的細(xì)胞比非粘附細(xì)胞更快形成團(tuán)聚體(球形體)和更快沉淀。這提高了具有細(xì)胞間粘附特征的培養(yǎng)物的純度。
圖9顯示了在分化過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的進(jìn)展過(guò)程。(A)在mEF條件培養(yǎng)基中，在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)下，生長(zhǎng)在Matrigel上的未分化hES細(xì)胞。(B)第3天之前，在含維甲酸的培養(yǎng)基中，在懸浮培養(yǎng)中，從胚狀體中長(zhǎng)出的透明球形體，這表明了快速的細(xì)胞擴(kuò)散。(C)用維甲酸(階段3)誘導(dǎo)神經(jīng)譜系細(xì)胞，隨后在EGF(階段4)存在下出現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的定向化和增殖，其證據(jù)是黃色球形體的大量積累。(D)細(xì)胞然后接種于Matrigel，以便對(duì)所需細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行陽(yáng)性選擇。(E，F(xiàn))當(dāng)增殖階段前進(jìn)時(shí)，球形體的尺寸和占培養(yǎng)物的百分比是增加的。在優(yōu)先選擇之后，定向?yàn)樯窠?jīng)膠質(zhì)的祖細(xì)胞能被維持和并增殖長(zhǎng)達(dá)8周。(G，H)隨后在無(wú)促分裂原下，將少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞接種于聚-L-賴(lài)氨酸和層粘連蛋白上，導(dǎo)致它們?cè)谝恢軆?nèi)具有成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。
圖10顯示了對(duì)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果。接種后一周，超過(guò)94％細(xì)胞被抗NG2的抗體所標(biāo)記(NG2是一種早期神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物)(A)。接種后八周，95％以上細(xì)胞的GalC(C)、O4(D)以及RIP(E)染色呈陽(yáng)性。當(dāng)細(xì)胞用抗-GFAP染色并用DAPI復(fù)染時(shí)，幾乎所有未被少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物標(biāo)記的細(xì)胞，都是GFAP陽(yáng)性(B)。
然后，少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞被施用于麻醉的成年Sprague Dawley大鼠的低胸脊髓，該大鼠具有用Infinite HorizonTM沖擊設(shè)備(Precision Systems andInstrumentation，LLC)所導(dǎo)致的脊柱中等挫傷性損傷。
圖11顯示了用特異性抗人類(lèi)核蛋白的抗體染色的，在施用了細(xì)胞后獲得的組織切片。深暗的染色證實(shí)人細(xì)胞在移植后存活著。
圖12顯示了移植后9周后，用抗人核蛋白染色的、環(huán)繞脊髓的區(qū)域的橫切片。這些動(dòng)物已用環(huán)孢霉素A處理過(guò)以防排斥。這些細(xì)胞已經(jīng)遷移或已經(jīng)增殖成白質(zhì)。
圖13顯示了用于檢測(cè)細(xì)胞植入是否在給藥位置產(chǎn)生不利影響的詳細(xì)分析結(jié)果。沿著脊髓長(zhǎng)度方向，貫穿未治療動(dòng)物和接受移植的動(dòng)物的損傷位置，獲得連續(xù)切片(serial section)。每棒(bar)顯示在五個(gè)切片中測(cè)得的平均橫截面積。(平均值±SEM)?？拷靷妮^小橫截面積是損傷后繼發(fā)擴(kuò)大的結(jié)果。少突膠質(zhì)細(xì)胞不會(huì)引起保護(hù)(sparing)，但也不會(huì)使損傷加劇。這表明，hES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞是安全的，即使在脊髓損傷的1mm以?xún)?nèi)給藥時(shí)。
圖14是從測(cè)量神經(jīng)分支的實(shí)驗(yàn)中得到的。損傷后八周，對(duì)動(dòng)物注射BDA，作為在皮質(zhì)脊髓束中運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的順向示蹤物。這些切片是在兩周后獲得的。只有在用hES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞治療過(guò)的動(dòng)物中，才存在軸突分支的跡象在上部?jī)蓚€(gè)圖中是染成深色的窄線(xiàn)。剛好在損傷上面的脊髓區(qū)域中觀察到分支。
圖15顯示了在損傷和細(xì)胞植入位置(中心)起按1mm間隔測(cè)量得到的神經(jīng)分支定量結(jié)果(針對(duì)每段3個(gè)切片的平均值±SEM)。在受到損傷且在該位置上3mm處沒(méi)有接受治療的動(dòng)物中，計(jì)數(shù)被標(biāo)記的軸突。治療過(guò)的動(dòng)物在損傷吻端(rostral side)直到中心處，具有明顯更高水平的標(biāo)記軸突。這證實(shí)了植入的細(xì)胞正在誘導(dǎo)再生可塑性。
圖16是來(lái)自接受移植的動(dòng)物的一系列切片的電子顯微鏡圖片，顯示了大量再髓鞘化的證據(jù)。在上面左圖中的濃密圓圈是正常地髓鞘化的纖維。在這個(gè)區(qū)域中的其他軸突顯示出薄的髓磷脂層。鞘與軸突的直徑比表明，這些軸突是新髓鞘化的。上面右圖是新髓鞘化的軸突的更高分辨率圖像。有大約5或6個(gè)纏繞(wrap)，并且在頂部有軸突舌狀物(tongue)，這代表了少突膠質(zhì)細(xì)胞的前導(dǎo)邊緣。這顯示出這個(gè)軸突的髓鞘化是一個(gè)正在進(jìn)行的過(guò)程。下圖顯示了神經(jīng)膜細(xì)胞(Schwann cell)正在沉積形成厚的髓磷脂鞘。該過(guò)程的發(fā)生與移植體無(wú)關(guān)，并該過(guò)程在未治療動(dòng)物中提供有限程度的恢復(fù)。然而，只有接受hES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞移植的動(dòng)物，才顯示出在上圖中觀察到的那種少突膠質(zhì)細(xì)胞特有的髓鞘化證據(jù)。
實(shí)施例3少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞的表型特征在這個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)表4中方案，在用hES細(xì)胞系H7產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程中，跟蹤標(biāo)志物的表達(dá)。
表4 從hES細(xì)胞產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞

在該方案的一般應(yīng)用中，適合移植的少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞是在固相選擇步驟之后獲得的(在約第23天后的任何時(shí)間)。在最后階段中，可按需要進(jìn)行培養(yǎng)使細(xì)胞增殖(至少8周)，并用胰蛋白酶的每隔一周進(jìn)行一次傳代。
為了該實(shí)施例的表型分析目的，用含5％剔除型血清替代物的GRM，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低密度培養(yǎng)。當(dāng)接種于Matrigel時(shí)，從第21天開(kāi)始存在5％KO-SR會(huì)提高雙極性細(xì)胞的增殖。當(dāng)細(xì)胞以低密度接種于層粘連蛋白(15μg/mL，位于聚L-賴(lài)氨酸上)時(shí)，KO-SR改善了細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。在方案中更早期使用KO-SR不影響分化過(guò)程，正如觀察到的生長(zhǎng)率和黃色球形體的比例所顯示的那樣。
圖17顯示了在未分化的hES細(xì)胞集落中檢測(cè)到的標(biāo)志。左圖以黑白方式顯示了特異針對(duì)每個(gè)標(biāo)志物的抗體的紅色熒光，該紅色熒光被疊加DAPI染色的藍(lán)色熒光上，從而標(biāo)出了區(qū)域中所有細(xì)胞核的位置。右圖顯示了單獨(dú)對(duì)標(biāo)志物染色的結(jié)果。比較兩個(gè)圖片使得觀察者能夠評(píng)估在區(qū)域的所有細(xì)胞中表達(dá)有關(guān)標(biāo)志物的比例。
頂部圖顯示了SSEA-4標(biāo)記陽(yáng)性的集落(SSEA-4是一種多能細(xì)胞標(biāo)志物)。底部圖顯示了在對(duì)中胚層標(biāo)志物BMP4呈標(biāo)記陽(yáng)性的集落四周的基質(zhì)細(xì)胞。在每個(gè)集落中的未分化細(xì)胞都是BMP4陰性的。
圖18顯示了在分化過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子Pax6的短暫出現(xiàn)(左側(cè)抗體加上DAPI；右側(cè)僅抗體染色)。頂部圖顯示了在第10天的對(duì)簇中心的染色，在朝向外周的方向上，更多分化細(xì)胞已經(jīng)被下調(diào)了。底部圖顯示在第35天的樣本細(xì)胞中幾乎沒(méi)有染色。
圖19顯示了在早期階段(正好在第10天去除維甲酸之后)的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞中檢測(cè)到的標(biāo)志物(左側(cè)抗體加上DAPI；右側(cè)僅抗體染色)。頂部圖轉(zhuǎn)錄因子Olig1(83％±7％)。中部圖轉(zhuǎn)錄因子SOX10(72％±12％)。底部圖非特異性少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞標(biāo)志物A2B5(97％±3％)。
圖20A-20B顯示了在第35天完全分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞中占優(yōu)勢(shì)的標(biāo)志物(左側(cè)抗體加上DAPI；右側(cè)僅抗體染色)。第一和第二行圖(20A)NG2(硫酸軟骨素蛋白多糖，一種少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的標(biāo)志物)；第三行圖(20A)GalC；第四行圖(20B)O4；第五行圖(20B)Tuj1(一種神經(jīng)元標(biāo)記物)。
這些結(jié)果顯示至少大約80％的細(xì)胞是對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物NG2、GalC和O4呈陽(yáng)性。沒(méi)有被少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物所標(biāo)記的細(xì)胞，主要對(duì)神經(jīng)元標(biāo)記物GFAP或Tuj1呈陽(yáng)性(20B，底部圖)。雙重免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，GFAP或Tui1呈陽(yáng)性的細(xì)胞不共表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。此外，沒(méi)有檢測(cè)到BMP4或SSEA-4，表明這些培養(yǎng)物缺乏未分化細(xì)胞或中胚層譜系細(xì)胞。該細(xì)胞群能在至少8個(gè)隨后的傳代中增殖。
實(shí)施例4在髓磷脂缺陷型的動(dòng)物中hES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞使軸突再髓鞘化為了證明這些細(xì)胞在體內(nèi)所導(dǎo)致的髓鞘化是直接效果(而不是內(nèi)源性少突膠質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo))，將來(lái)自分化方案第28天的細(xì)胞移植入脫髓鞘的發(fā)抖小鼠模型中。對(duì)于位于1 8號(hào)染色體的髓磷脂堿性蛋白基因的突變而言，發(fā)抖小鼠是純合的(Mbpshi/Mbpshi)。該基因被復(fù)制，并且大部分復(fù)制的基因是反向的，導(dǎo)致形成反義RNA；這導(dǎo)致了在整個(gè)CNS中嚴(yán)重的髓磷脂缺陷。
從培養(yǎng)物中收獲少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞，在DMEM中洗滌，濃縮，然后上樣于包被硅的Hamilton注射器中。在該實(shí)驗(yàn)中，就象在所有實(shí)驗(yàn)中一樣用10mg/kg環(huán)孢霉素A來(lái)免疫抑制動(dòng)物。六周后，殺死這些動(dòng)物，取切片用于EM分析。
圖21顯示了結(jié)果。在超微結(jié)構(gòu)上，發(fā)抖小鼠的軸突是缺乏髓磷脂的，或者圍繞一或兩層不緊密的髓磷脂纏繞物(上圖)。細(xì)胞移植后六周，電子顯微鏡分析顯示有多層稠密的髓磷脂，這表明移植細(xì)胞群能夠產(chǎn)生髓鞘(下圖)。
因?yàn)檫@些小鼠缺乏產(chǎn)生髓磷脂堿性蛋白的能力，因此稠密的髓磷脂必然是植入的少突膠質(zhì)細(xì)胞所直接產(chǎn)生的，并不能歸咎于營(yíng)養(yǎng)作用。
實(shí)施例5ES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞使脊髓功能恢復(fù)在脊髓損傷的挫傷性大鼠模型中，測(cè)定ES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系細(xì)胞使神經(jīng)活性恢復(fù)的能力。
采用沖擊設(shè)備，在被麻醉的Sprague Dawley大鼠的低胸脊髓中誘導(dǎo)中度挫傷性損傷。損傷后一周，挫傷位置植入在4μl培養(yǎng)基中的2.5×105個(gè)細(xì)胞。移植細(xì)胞群的制備如下在分化方案第35天(實(shí)施例1)，將細(xì)胞暴露于胰蛋白酶和EDTA3分鐘，從而使細(xì)胞不粘附。然后在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中漂洗細(xì)胞，并濃縮到每微升6×104個(gè)細(xì)胞。
損傷后六周，將順向示蹤物BDA(生物素化的右旋糖酐胺)注射到這些動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中。將翠綠(emerald green)注射到脊柱腰段，以標(biāo)記腰神經(jīng)束。當(dāng)實(shí)驗(yàn)在8周結(jié)束時(shí)，檢測(cè)這些標(biāo)記物的位置。
圖22顯示了在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，兩組中每個(gè)組的地上運(yùn)動(dòng)的評(píng)分。上圖顯示了受到200千達(dá)因挫傷的動(dòng)物的結(jié)果。下圖顯示了250千達(dá)因挫傷的結(jié)果。BBB等級(jí)是基于關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)、體重支撐、四肢協(xié)調(diào)、足部位置和步態(tài)穩(wěn)定性的地上運(yùn)動(dòng)21-分的度量法(Basso，Beattie，和Bresnahan，J.Neurotrauma，121，1995)。(■)在損傷后1星期用ES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞治療的動(dòng)物(n＝5)；(▲)接受相同的挫傷但不植入細(xì)胞的對(duì)照動(dòng)物(n＝3)。平均值±SEM，用于盲法評(píng)估。
植入hES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)物顯示出明顯地更好的功能(p＜0.05)，在治療后持續(xù)5周以上。
這些結(jié)果表明，在脊髓損傷的動(dòng)物模型中，ES衍生少突膠質(zhì)細(xì)胞可幫助恢復(fù)功能。更早的實(shí)施例顯示了植入的少突膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)芽以及髓磷脂缺陷型軸突的再髓鞘化。這兩種效果或其中之一可能導(dǎo)致了本實(shí)驗(yàn)中所觀察到的行為改善。
應(yīng)理解，本發(fā)明的某些改動(dòng)形式事實(shí)上是常規(guī)優(yōu)化，并且在不脫離本發(fā)明精神和所附權(quán)利要求的范圍的情況下實(shí)施。
權(quán)利要求
1.作為產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的系統(tǒng)的一部分的分化細(xì)胞群，其中該分化細(xì)胞群的至少～80％的細(xì)胞是少突膠質(zhì)細(xì)胞前體，所述前體具有如下特征·它們是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物多能干(pPS)細(xì)胞的后代；·它們采用特異針對(duì)NG2蛋白聚糖的抗體染色；并且·它們是神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN陰性；并且其中該系統(tǒng)還包含產(chǎn)生所述分化細(xì)胞的pPS細(xì)胞系。
2.用于產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的系統(tǒng)，它包含未分化的pPS細(xì)胞系和分化細(xì)胞群，其中該分化的細(xì)胞群中至少80％的細(xì)胞具有如下特征·它們是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物多能干(pPS)細(xì)胞的后代；·它們采用特異針對(duì)NG2蛋白多糖的抗體染色；并且·它們是神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN陰性。
3.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，至少80％的所述細(xì)胞也表達(dá)A2B5。
4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，至少80％的所述細(xì)胞還表達(dá)血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體α(PDGFRα)。
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，至少20％的所述細(xì)胞顯示少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的兩極形態(tài)特征。
6.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，在促分裂原缺乏時(shí)在聚-L-賴(lài)氨酸和層粘連蛋白上培養(yǎng)3天，至少10％的細(xì)胞具有成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的復(fù)雜突出特征。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，將所述細(xì)胞群植入發(fā)抖突變小鼠脊髓內(nèi)導(dǎo)致在神經(jīng)元軸突周?chē)练e稠密的髓磷脂。
8.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，在挫傷性損傷大鼠脊髓里或周?chē)乃黾?xì)胞群的植入導(dǎo)致地上運(yùn)動(dòng)的改善。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，采用在含有促分裂原和至少兩種少突膠質(zhì)細(xì)胞分化因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未分化pPS細(xì)胞的方法獲得所述分化的細(xì)胞群。
10.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，采用將未分化的pPS細(xì)胞在堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、三碘甲腺原氨酸(T3)和維甲酸存在時(shí)懸浮培養(yǎng)以形成細(xì)胞團(tuán)聚體的方法獲得所述分化細(xì)胞群。
11.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，采用從非神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中分離神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法獲得所述分化的細(xì)胞群。
12.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，采用在含有甲狀腺激素和硒的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法獲得所述分化的細(xì)胞群。
13.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，采用在促分裂原缺乏時(shí)培養(yǎng)而使細(xì)胞進(jìn)一步分化的方法獲得所述分化的細(xì)胞群。
14.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分化細(xì)胞群，其特征在于，所述pPS細(xì)胞是人胚胎干(hES)細(xì)胞。
15.一種從未分化靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物多能干(pPS)細(xì)胞生產(chǎn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括在含有促分裂原和至少兩種少突膠質(zhì)細(xì)胞分化因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未分化的pPS細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括在存在生長(zhǎng)因子、甲狀腺激素受體的配體、以及維甲酸受體的配體的條件下將未分化pPS細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)懸液中以形成細(xì)胞團(tuán)聚體。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述生長(zhǎng)因子是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
18.如權(quán)利要求15-17所述的方法，其特征在于，所述方法包括在含有甲狀腺激素T3和硒的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求15-18任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)懸液中，細(xì)胞團(tuán)聚體形成黃色球形體。
20.如權(quán)利要求15-19所述的方法，其特征在于，所述方法還包括從非神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中分離神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求15-20所述的方法，其特征在于，通過(guò)將所述細(xì)胞接種到固體表面上，并收獲黏附于所述表面的細(xì)胞而進(jìn)行所述分離。
22.如權(quán)利要求15-21所述的方法，其特征在于，在不存在促分裂原條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步分化。
23.如權(quán)利要求15-22所述的方法，其特征在于，所獲得細(xì)胞具有權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的分化細(xì)胞的特征。
24.一種基于化合物對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的作用而篩選化合物的方法，它包括a)獲得權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的分化細(xì)胞群；b)使細(xì)胞群與所述化合物混合；c)檢測(cè)細(xì)胞群中細(xì)胞的任何變化或者由與所述化合物混合所導(dǎo)致的它們的活性的變化；以及d)使所述變化與該化合物對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響相關(guān)聯(lián)。
25.一種髓鞘化軸突的方法，該方法包括使權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分化細(xì)胞群與軸突從中延長(zhǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞混合。
26.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分化細(xì)胞群。
27.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分化細(xì)胞群在制備改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的藥劑的中的用途。
28.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分化細(xì)胞群在制備治療脊髓損傷的藥劑中的用途。
29.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分化細(xì)胞群改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的用途。
30.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分化細(xì)胞群治療脊髓損傷的用途。
31.一種改善對(duì)象CNS功能的方法，其特征在于，該方法包括給予所述對(duì)象權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分化細(xì)胞群。
32.一種改善對(duì)象脊髓功能的方法，其特征在于，該方法包括給予所述脊髓權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分化細(xì)胞群。
33.權(quán)利要求1-14和26中任一項(xiàng)所述的組合物，基本上如上文結(jié)合任一實(shí)施例所述。
34.權(quán)利要求15-25和27-30中任一項(xiàng)所述的方法或用途，基本上如上文結(jié)合任一實(shí)施例所述。
全文摘要
本發(fā)明提供具有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞如少突膠質(zhì)細(xì)胞和它們的前體的標(biāo)記物的神經(jīng)細(xì)胞群。通過(guò)在促進(jìn)具有所需表型或功能性能力的細(xì)胞富集的條件下分化多能干細(xì)胞如人胚胎干細(xì)胞而產(chǎn)生所述細(xì)胞群?？墒褂梅只蜃雍痛俜至言母鞣N組合來(lái)生產(chǎn)攜帶有少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞群。進(jìn)一步分化后形成成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的復(fù)雜突起特征。這些細(xì)胞能形成髓鞘，并可用于治療性地改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1852971SQ03816184
公開(kāi)日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月11日
發(fā)明者G·I·尼斯托爾, H·S·基爾斯特德 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)