專利名稱：突變的蛋白質(zhì)及其在制造藥物和治療患構(gòu)象病的人或動物中的應(yīng)用的制作方法
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背景技術(shù)：
雖然蛋白質(zhì)折疊的中心范例(Anfinsen，C.B.(1973)Principles That GovernFolding of Protein Chains.Science，181，223-230)，蛋白質(zhì)的氨基酸序列編碼其獨特的三維結(jié)構(gòu)得到了充分證實，但由于最近發(fā)展的“朊病毒”的概念使其共性受到了質(zhì)疑。如首先由Griffith(Griffith，J.S.(1967)Self-replication and scrapie.Nature，215，1043-1044)以通用術(shù)語所提出的，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化的傳染性羊瘙癢病物質(zhì)的生化特性顯示了疾病傳播所必需的成分是蛋白質(zhì)(Prusiner，S.B.(1982)Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.Science，216，136-144)。朊病毒增殖進一步包括由稱為PrPC的細胞型朊病毒蛋白向有毒性的羊瘙癢病形式PrPSc的轉(zhuǎn)變，通過PrPSc作為模板用于PrPC形成新的PrPSc分子推動了這一轉(zhuǎn)變(Prusiner，S.B.(1987)Prions and neurodegenerative diseases.N Engl JMed，317，1571-1581)。這種“唯蛋白質(zhì)”假說暗示同樣的多肽序列，在不存在任何翻譯后修飾的情況下，能夠采用兩種明顯不同的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)構(gòu)象。因而，對于朊病毒來說有可能，盡管沒有證實，它們違背了蛋白折疊的中心范例。有一些間接的證據(jù)即其它因子可能涉及構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程(Prusiner，S.B.(1998)Prions.Proc Natl Acad Sci U S A，95，13363-13383)，該過程包括一種由α螺旋變?yōu)棣抡郫B二級結(jié)構(gòu)的顯著改變。盡管有人提出一種假定的“因子X”可能作為一種分子伴侶而起作用，但其化學(xué)特性卻一直未得到鑒定(Zahn，R.(1999)Prionpropagation and molecular chaperones.Q Rev Biophys，32，309-370)。
對于PrPSc促進細胞同工型的轉(zhuǎn)變的分子機制已提出兩種通用的模型(見

圖1)。關(guān)于PrPSc形成的“晶核形成”或“結(jié)籽”模型(Jarrett，J.T.和Lans-bury，P.T.，Jr.(1993)Seeding″one-dimensional crystallization″of amyloida pathogenicmechanism in Alzheimer′s disease and scrapie？Cell，73，1055-1058)提出PrPC和PrPSc處于快速建立的平衡態(tài)中，并且PrPSc的構(gòu)象只有在陷入于晶體樣的晶種內(nèi)時才是熱動力學(xué)穩(wěn)定的(見圖1A)。該建議的過程類似于充分描述了特性的成核依賴的蛋白質(zhì)聚合作用的其它過程，包括微管裝配、鞭毛裝配以及鐮狀紅細胞血紅蛋白原纖維的形成，其中動力學(xué)勢壘是由單分子周圍成核所致。為闡明指數(shù)式轉(zhuǎn)變速率，必須假定聚集物不斷地分裂以產(chǎn)生增加的堆積表面，盡管分裂的機制還有待于解釋。PrPSc形成的“模板輔助”或“異二聚體”的模型(Prusiner，S.B.，Scott，M.，F(xiàn)oster，D.，Pan，K.M.，Groth，D.，Mirenda，C.，Torchia，M.，Yang，S.L.，Serban，D.，Carlson，G.A.等(1990)Transgenetic studiesimplicate inter-actions between homologous PrP isoforms in scrapie prion replication.Cell，63，673-686)提出PrPC在一定程度上是未折疊的并在作為模板起作用的PrPSc分子的作用下重折疊(見圖1B)。在沒有通過預(yù)先存在的PrPSc催化的情況下，高的能量勢壘被假定使得這種轉(zhuǎn)變不可能發(fā)生。構(gòu)象變化被認為是通過PrPC-PrPSc異二聚體分解為兩個PrPSc分子進行動力學(xué)控制的，且能被視為是一種繼Michaelis-Menten動力學(xué)自動催化之后的一種誘導(dǎo)裝配的酶反應(yīng)。一旦轉(zhuǎn)變開始啟動其就引起一種指數(shù)式的轉(zhuǎn)變級聯(lián)，與此同時PrPSc二聚體快速地解聚為單體。模板輔助模型的一個缺點是它沒有解釋為什么在增殖后PrPSc會聚集為蛋白質(zhì)原纖維。Manfred Eigen曾進行過朊病毒的兩種建議的疾病機制的比較動力學(xué)分析(Eigen，M.(1996)Prionics or the kinetic basis of prion diseases.Biophysical Chemistry，63，A1-A18)。他發(fā)現(xiàn)大體而言兩種模型在邏輯上都是可行的，但是它們作用過程中的條件似乎是過于狹窄且不切實際。自動催化的模板輔助模型需要協(xié)同效應(yīng)以啟動，但接著其在現(xiàn)象上變得與成核模型無法區(qū)分，該成核模型也是一種(被動的)自動催化的形式。盡管這兩種機制依然可能在兩種單體蛋白質(zhì)構(gòu)象的哪一種是有利的平衡態(tài)的問題上產(chǎn)生不一致，但它們二者都需要一種聚集態(tài)作為最終在平衡上有利的形式以及假定類似朊病毒蛋白質(zhì)的病理形式。Eigen推斷需要更多的實驗證據(jù)來判斷兩種模型的哪一種是正確的。原則上，對于朊病毒增殖的兩種模型都沒有排除可能的通過“因子X”的協(xié)同作用。
對一種朊病毒疾病的機理的理解需要細胞型和病理型朊病毒蛋白的三維結(jié)構(gòu)的詳細知識。只有兩種蛋白的結(jié)構(gòu)都得到了解釋，那么才能夠理解轉(zhuǎn)變是如何發(fā)生的。在體內(nèi)，“健康的”朊病毒蛋白通過一種糖基化肌醇磷酯錨和稱為脂質(zhì)筏的膜結(jié)構(gòu)域部分而附于細胞表面(Vey，M.，Pilkuhn，S.，Wille，H.，Nixon，R.，DeArmond，S.J.，Smart，E.J.，Anderson，R.G.，Taraboulos，A.和Prusiner，S.B.(1996)Subcellular colocalization of the cellular and scrapie prion proteins in caveolae-like membranous domains.Proc Natl Acad Sci USA，93，14945-14949)。近來的結(jié)構(gòu)研究集中在使用核磁共振(NMR)波譜法研究來自不同物種的可溶性重組朊病毒蛋白。這些研究顯示了哺乳動物PrPC由兩個不同的結(jié)構(gòu)域組成一個柔性無序的N端尾部，它包含殘基23-120，以及殘基121-230的一個井狀結(jié)構(gòu)的C末端球狀結(jié)構(gòu)域，它富含α螺旋二級結(jié)構(gòu)及包含一種少量反平行的β折疊(Lopez Garcia，F(xiàn).，Zahn，R.，Riek，R.和Wüthrich，K.(2000)NMR structure of thebovine prion protein.Proc Natl Acad Sci USA，97，8334-8339)。當PrPC轉(zhuǎn)變成PrPSc后，代表在哺乳動物和非哺乳動物朊病毒蛋白中最保守序列的殘基90-120(Wopfner，F(xiàn).，Weidenhofer，G.，Schneider，R.，von Brunn，A.，Gilch，S.，Schwarz，T.F.，Werner，T.和Schatzl，H.M.(1999)Analysis of 27 mammalian and 9 avian prionproteins reveals high conservation of flexible regions of the prion protein.J Mol Biol，289，1163-1178)，變得抗蛋白酶K的處理(Prusiner，S.B.，Groth，D.F.，Bolton，D.C.，Kent，S.B.和Hood，L.E.(1984)Purification and structural studies of a majorscrapie prion protein.Cell，38，127-134)，暗示該多肽片段結(jié)構(gòu)變化了。有進一步的證據(jù)即PrPC的構(gòu)象轉(zhuǎn)變伴隨著β折疊二級結(jié)構(gòu)的大量的增加(Pan，K.M.，Baldwin，M.，Nguyen，J.，Gasset，M.，Serban，A，Groth，D.，Mehlhorn，I.，Huang，Z.，F(xiàn)letterick，R.J.，Cohen，F(xiàn).E.等.(1993)Conversion of alpha-helices into beta-sheetsfeatures in the formation of the scrapie prion proteins.Proc Natl Acad Sci USA，90，10962-10966)。
在朊病毒領(lǐng)域中觀察到的問題自從mPrP(121-231)的結(jié)構(gòu)測定以來已經(jīng)知道潛在蛋白質(zhì)X抗原表位的分子表面由兩個在不同物種間具有低同源性的多肽片段構(gòu)成，它們具有相似的三維結(jié)構(gòu)(Billeter，M.，Riek，R.，Wider，G.，Homemann，S.，Glockshuber，R.和Wüthrich，K.(1997)Prion protein MR structure and species barrier for prion diseases.Proc.Natl.Acad.Sci USA 94，7281-7285)。根據(jù)在不同哺乳動物物種間靜電表面電位的明顯改變鑒定了螺旋3和環(huán)165-172這兩個節(jié)段(見圖2)人PrP因谷氨酰胺殘基168和219為谷氨酸所取代，以及在166、215和220位的保守性取代而區(qū)別于牛和小鼠的PrP。以轉(zhuǎn)染了嵌合的人/小鼠Prnp的感染羊瘙癢病的成神經(jīng)細胞瘤細胞所作的研究證實了在蛋白質(zhì)X抗原表位區(qū)的單個氨基酸取代影響重組PrP轉(zhuǎn)變成PrPSc的效率(Kaneko，K.，Zulianello，L.，Scott，M.，Cooper，C.M.，Wallace，A.C.，James，T.L.，Cohen，F(xiàn).E.和Prusiner，S.B.(1997).Evidence for protein X binding to a discontinuous epitope on the cellular prion proteinduring scrapie prion propagation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，10069-10074)。在人PrP中相應(yīng)的殘基取代殘基168、215或219，但在220位不取代，減少或阻止了在重組構(gòu)建體中向PrPSc的轉(zhuǎn)變。通過突變的和野生型PrP的共轉(zhuǎn)染研究測定突變的和野生型的蛋白質(zhì)對于蛋白質(zhì)X的相對親和性，顯示發(fā)生168、172或219位的堿性殘基對谷氨酰胺的取代抑制了突變的和野生型PrP二者的轉(zhuǎn)變，這是由于突變的PrPC無法釋放蛋白質(zhì)X。相反，以谷氨酸取代168或219谷氨酰胺阻止了突變的PrP的轉(zhuǎn)變，但允許野生型PrP的轉(zhuǎn)變，可能是通過弱化突變的PrPC-蛋白質(zhì)X的結(jié)合。
這些研究顯示在細胞培養(yǎng)中在假定的突變朊病毒蛋白質(zhì)的因子X抗原表位內(nèi)的單氨基酸取代能夠抑制野生型PrP向PrPSc的轉(zhuǎn)變。因而在人和動物中的傳播性海綿狀腦病(TSE)的治療中，體細胞基因治療看來是一種有前景的方法。但是，這種取代是否在足夠長的時間內(nèi)也具有抑制朊病毒在人和動物中的增殖的能力，而不影響野生型PrPC的生理功能還有待證實，事實上，野生型PrPC的生理功能可能依賴于與蛋白質(zhì)X的功能性相互作用。
發(fā)明目的和概述本發(fā)明的一個目的是提供在足夠長的時間內(nèi)抑制朊病毒在人和動物中增殖的PrP蛋白質(zhì)。這個目的通過權(quán)利要求1的特征得以實現(xiàn)。
本發(fā)明的另一個目的是提供該PrP蛋白質(zhì)或其片段的治療用途，以及在制備治療性處理蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變后引發(fā)的疾病的藥物中的用途，以及一種對在構(gòu)象轉(zhuǎn)變后引發(fā)疾病的蛋白質(zhì)的治療性處理的藥物。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案和附加特征體現(xiàn)在從屬權(quán)利要求中。
本發(fā)明描述了具有兩個二硫鍵的突變的人朊病毒蛋白，hPrP(M166C/E221C)的121-230位殘基的球狀結(jié)構(gòu)域的核磁共振(NMR)結(jié)構(gòu)，hPrP(M166C/E221C)在與人doppel蛋白(hDpl)相似的位置含有另一個二硫鍵。另一個突變體，hPrP(M166C/Y225C)被表達并顯示折疊成球狀結(jié)構(gòu)，但是它的聚合趨向使得無法進行詳細的結(jié)構(gòu)分析。hPrP(M166C/E221C)核磁共振結(jié)構(gòu)顯示其具有與野生型hPrP(121-230)相同的球狀折疊。它包含殘基144-154、173-194和200-228的三個α螺旋、殘基128-131和161-164的一個反平行β折疊，以及Cys166-Cys221和Cys179-Cys214二硫鍵。在假定的“因子X”結(jié)合位點上改造的額外的二硫鍵適應(yīng)于輕微的、嚴格局限的構(gòu)象變化。通過使用其它變異結(jié)構(gòu)的模型計算進一步證實了hPrP與在因子X抗原表位中插入的另外的二硫鍵的高度相容性。hPrP結(jié)構(gòu)能夠輕易容納在假定的因子X結(jié)合抗原表位內(nèi)不同位置的另外的二硫鍵，強烈地暗示了天然的另外二硫鍵對觀察到的hDpl中相應(yīng)區(qū)域中的廣延微擾(extensive perturbation)的功能性作用。在Dpl中和也可能在突變的朊病毒蛋白質(zhì)中另外的二硫鍵的功能性作用，也許包括耐抗構(gòu)象轉(zhuǎn)變成病理性同功型的傾向，所述病理性同功型引發(fā)傳播性海綿狀腦病(TSE)如在人類中的克-雅病(CJD)。
附圖簡述下面的附圖用來引證先前的技術(shù)以及本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選的實施方案將也將通過附圖來解釋，而這不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。
圖1.PrPSc促進細胞同功型轉(zhuǎn)變的分子機制提出的兩種通用模型(Zahn，R.(1999))圖1A“晶核形成”或“結(jié)籽”模型；圖1B“模板輔助”或“異二聚體”模型；圖2.人朊病毒蛋白質(zhì)節(jié)段165-230的氨基酸序列和人doppel蛋白質(zhì)節(jié)段93-153的氨基酸序列比對；圖3.(A)hPrP(M166C/E221C)和(B)hPrP(M166C/Y225C)的二維[15N，1H]-關(guān)聯(lián)能譜(COSY)波譜；圖4.hPrP(M166C/E221C)的NMR結(jié)構(gòu)的立體視圖圖4A 20種能量優(yōu)化的DYANA構(gòu)象異構(gòu)體的主鏈疊加用于殘基125-228的N、Cα和C’原子的最佳擬合；
圖4B顯示了來自(A)的構(gòu)象異構(gòu)體的所有重原子；圖4C來自(B)的構(gòu)象異構(gòu)體的飄帶圖；圖5.hPrP(121-230)氨基酸序列對13Cα化學(xué)位移差異Δδ(13Cα)作的圖圖5A hPrP(M166C/E221C)對無規(guī)卷曲位移；圖5B hPrP(M166C/Y225C)對無規(guī)卷曲位移；圖5C hPrP(M166C/E221C)對野生型hPrP(121-230)；圖5D hPrP(M166C/Y225C)對野生型hPrP(121-230)；圖6.hPrP(M166C/E221C)和hPrP(121-230)的穩(wěn)態(tài)15N{1H}-NOEs；圖7.人朊病毒蛋白質(zhì)的GdmCl依賴的平均殘基摩爾橢圓率圖7A在含有20mM磷酸鈉pH7.0的緩沖液中；圖7B在含有20mM醋酸鈉pH5.0的緩沖液中；圖8人朊病毒的圓二色譜圖8A hPrP(121-230)；圖8B hPrP(M166C/E221C)；圖8C hPrP(M166C/Y225C)；圖9.人朊病毒蛋白質(zhì)的溫度依賴的平均殘基摩爾橢圓率圖9A hPrP(121-230)；圖9B hPrP(M166C/Y225C)；圖9C hPrP(M166C/E221C)。
發(fā)明詳述人朊病毒蛋白質(zhì)和人doppel蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)顯示了相似的折疊拓撲學(xué)(Thorsten 1ührs，Roland Riek，Peter Güntert und Kurt Wüthrich，已投稿；Zahn等，2000)，帶有一個附于100個殘基的球狀C端結(jié)構(gòu)域上的柔性無序的N端“尾部”，所述C端結(jié)構(gòu)域含有三個α螺旋和一個小的反平行β折疊。這兩種蛋白質(zhì)之間的顯著差異與二硫鍵的數(shù)目有關(guān)。在hPrP和hDpl二者中，一個連接螺旋α2和α3的二硫鍵埋在疏水核中，并對球狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的整體穩(wěn)定性起著明顯的作用。已知殘基179和214的Cys的還原產(chǎn)生二硫蘇糖醇并導(dǎo)致體外PrP的解折疊和聚合(Mehlhorn，I.，Groth，D.，Stckel，].，Moffat，B.，Reilly，D.，Yansura，D.，Willett，W.S.，Baldwin，M.，F(xiàn)letterick，R.，Cohen，F(xiàn).E.，Vandlen，R.，Henner，D.和Prusiner，S.B.(1996)High-level expression and characterization of a purified 142-residue polypeptide of the prion protein.Biochemistry 35，5528-5537)，暗示到目前為止尚不知道PrP的生理功能，并且可能Dpl也依賴于這個完整的二硫鍵。
在Dpl中，在α鏈2和螺旋α2之間的環(huán)通過一個額外的二硫鍵連接到序列接近C端的位置，而在野生型PrP中沒有與之相應(yīng)部分(圖2)。
圖2顯示在考慮了兩種蛋白質(zhì)的序列以及三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，人朊病毒片段165-230的氨基酸和人doppel蛋白質(zhì)節(jié)段93-153的氨基酸序列比對(T.Lührs，R.Riek，P.Güntert和K.Wuthrich，已投稿；Zahn，R.，Liu，A，Lührs，T.，Riek，R.，vonSchroetter，C.，López García，F(xiàn).，Billeter，M.，Calzo-lai，L.，Wider，G.和Wüthrich，K.(2000) NMR solution structure of the human prion protein.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，145-150)。在這篇論文中在hPrP中被Cys替換的殘基位置為斜體。實體黑線表示天然的二硫鍵，而在野生型蛋白質(zhì)中通過黑框表示常規(guī)α螺旋二級結(jié)構(gòu)的位置。斷線和點狀線分別表示在獲得的完整結(jié)構(gòu)的hPrP(M166C/E221C)以及經(jīng)表達并表征的hPrP(M166C/Y225C)中額外的二硫鍵。
PrP的相應(yīng)區(qū)域缺乏半胱氨酰殘基，且在以表達各種PrP構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因小鼠進行的接種研究的基礎(chǔ)上(Telling，G.C.，Scott，M.，Mastrianni，].，Gabizon，R.，Torchia，M.，CohenF.E.，DeArmond，S.J.和Prusiner，S.B.(1995)Prion propagationin mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction ofcellular PrP with another protein.Cell 83，79-90)，已暗示其代表尚沒有進一步鑒定的“因子X”的結(jié)合抗原表位，所述“因子X”據(jù)推測參與疾病相關(guān)的PrP的體內(nèi)構(gòu)象轉(zhuǎn)變(Prusiner，1998)。
人和鼠Dpl蛋白質(zhì)的NMR結(jié)構(gòu)顯示在相應(yīng)于PrP中假定的“因子X”結(jié)合抗原表位的區(qū)域引入另外的二硫鍵導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)的大的改變。為研究這個區(qū)域中一個人工額外的二硫鍵對朊病毒蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的影響，我們制備了人朊病毒蛋白質(zhì)hPrP(121-230)球狀結(jié)構(gòu)域的兩種突變體。設(shè)計了hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)從而同時在hDpl(圖2)中模擬另外的二硫鍵的位置并與野生型人PrP的三維結(jié)構(gòu)相容(Zahn等，2000)。因而在hPrP中在被選擇進行氨基酸取代的位點中，Glu221在27種哺乳類和9種鳥類的蛋白質(zhì)中是完全保守的(Wopfner等，1999)，在一些物種中Tyr225被Ser、Phe或Ala取代，而Vall66只在人、黑猩猩和有袋類的PrP中被Met或Ile取代(Moore，R.C.，Lee，I.Y.，Silverman，G.L.，Harrison，P.M.，Strome，R.，Heinrich，C.，Karunaratne，A.，Pasternak，S.H.，Chishti，M.A.，Liang，Y.，Mastrangelo，P.，Wang，K.，Smit，A.F.A.，Katamine，S.，Carlson，G.A，Cohen，F(xiàn).E.，Prusiner，S.B.，Melton，D.W.，Trembla，P.，Hood，L.E.和Westaway，D.(1999)Ataxia in prion protein(PrP)-deficient mice isassociated with upregulation of the novel PrP-like proteindoppel.1.Mol.Biol.292，797-817)，在額外的二硫鍵中殘基Cys94和Cys145是完全保守的。
本發(fā)明描述了hPrP(M166C/E221C)的高質(zhì)量NMR結(jié)構(gòu)、hPrP(M166C/Y225C)定性的光譜特征，以及hPrP(121-230)額外的雙二硫鍵突變體的模型計算。對在PrP中的因子X結(jié)合抗原表位以及在Dpl中的相應(yīng)分子區(qū)域可能的功能性作用的結(jié)果進行了評估。
另外，本發(fā)明包括下列應(yīng)用1)生產(chǎn)用于傳播性海綿狀腦病(TSE)治療性處理的朊病毒蛋白質(zhì)或其片段的“二硫突變體”，特別是在節(jié)段165-175和C端殘基215-230之間導(dǎo)入額外的二硫鍵的突變的蛋白質(zhì)。額外的二硫鍵可能會阻止突變的PrPC向PrPSc的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，并且因此通過下列種類的顯性失活抑制而阻止了在共存的野生型蛋白質(zhì)中PrPC向PrPSc的構(gòu)象轉(zhuǎn)變a)突變的PrPC結(jié)合到野生型PrPC上，因而阻止了向野生型PrPSc寡聚體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變(見圖1A)。
b)突變的PrPC結(jié)合到野生型PrPSc寡聚體上，因而阻止了野生型PrPSc淀粉樣蛋白原纖維的形成(見圖1A)。
c)突變的PrPC結(jié)合到野生型PrPSc上，因而阻止了野生型PrPC/PrPSc異二聚體的形成(見圖1B)。
d)突變的PrPC結(jié)合到野生型PrPSc淀粉樣蛋白原纖維上，因而阻止了淀粉樣蛋白原纖維的延伸(見圖1A，B)或淀粉樣蛋白原纖維向PrPSc寡聚體的分解(見圖1A)。
2)在人或細胞培養(yǎng)物體內(nèi)產(chǎn)生朊病毒蛋白質(zhì)或其片段的二硫化突變體用于TSE的治療，例如通過使用載體如慢病毒載體、質(zhì)?；蛑|(zhì)體的體細胞基因治療，其中TSE包括自發(fā)性的、遺傳的、醫(yī)源性的以及不同形式的克-雅病(CJD)，致命性家族性失眠癥(FFI)和Gerstmann-Strussler-Scheinker綜合征(GSS)。
3)重組生產(chǎn)朊病毒蛋白質(zhì)的二硫化突變體或其片段，用于人類中TSE的治療，例如通過該重組蛋白質(zhì)直接應(yīng)用，其中TSE包括自發(fā)性的、遺傳的、醫(yī)源性的以及變異形式的CJD、FFI和GSS。
4)在動物或細胞培養(yǎng)物中體內(nèi)生產(chǎn)朊病毒蛋白質(zhì)的二硫化突變體或其片段，用于TSE的治療，例如通過使用載體像慢病毒載體、質(zhì)?；蛑|(zhì)體的體細胞基因治療，其中TSE包括牛海綿狀腦病(BSE)、羊的瘙癢病、貓海綿狀腦病(FSE)以及在駝鹿和鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)。
5)重組生產(chǎn)朊病毒蛋白質(zhì)的二硫化突變體或其片段，用于人類中TSE的治療，例如通過該重組蛋白質(zhì)的直接應(yīng)用，其中TSE包括BSE、羊瘙癢病、FSE以及CWD。
6)重組生產(chǎn)朊病毒蛋白質(zhì)的二硫化突變體或其片段，以作為TSE檢測的“PrPC抗轉(zhuǎn)變標準”，其中重組的PrPC由來自病理組織或體液如血液和尿液的PrPSc而擴增。TSE檢測可以應(yīng)用于人和動物如牛、貓、羊、駝鹿、鹿、豬、馬和雞。
7)體內(nèi)生產(chǎn)朊病毒蛋白質(zhì)的二硫化突變體或其片段，用于耐受TSE的動物的育種，其中動物包括牛、羊、貓、駝鹿和鹿。
8)本發(fā)明及其應(yīng)用可以用于涉及神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默癥、帕金森病和多發(fā)性硬化癥)的其它蛋白質(zhì)或通常應(yīng)用于在構(gòu)象轉(zhuǎn)變以后引發(fā)疾病的蛋白質(zhì)(構(gòu)象病如原發(fā)性系統(tǒng)淀粉樣變性、II型糖尿病、動脈淀粉樣變性)。
本發(fā)明進一步包括根據(jù)1-8點的野生型蛋白質(zhì)及其變體的生產(chǎn)和/或應(yīng)用。這樣的變體包括蛋白質(zhì)片段、突變蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物。
實驗結(jié)果1.兩種突變的朊病毒蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和光譜特征兩種突變的蛋白質(zhì)hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)在大腸桿菌(E.coli)中表達為包含體并通過高親和柱重折疊進行純化，得到了與野生型hPrP(121-230)相似的產(chǎn)量(Zahn，R.，von Schroetter，C.和Wüthrich，K.(1997)Human prion proteinsexpressed in Escherichia coli and purified by high-affinity column refolding.FEBSLett.417，400-404；Zahn等，2000)。通過質(zhì)譜分析確認形成了一個額外的二硫鍵，并且它導(dǎo)致兩種蛋白質(zhì)解鏈溫度上升了大約10℃(數(shù)據(jù)未顯示)。將突變的蛋白質(zhì)進行均一地13C、15N標記以進行共振歸屬和結(jié)構(gòu)測定。對于NMR實驗使用20℃的含有1mM蛋白質(zhì)的10mMpH4.5的醋酸鈉溶液。
兩種蛋白質(zhì)的1H NMR譜顯示制品是均質(zhì)的，而且對于球狀蛋白質(zhì)而言，化學(xué)位移離差是典型的。通過二維的[15N，1H]-關(guān)聯(lián)能譜(COSY)波譜觀察到的化學(xué)位移，顯而易見具有相似的結(jié)構(gòu)(圖3)。
圖3顯示了(A)hPrP(M166C/E221C)和(B)hPrP(M166C/Y225C)的二維的[15N，1H]-COSY波譜。以黑色字體表示選擇的交叉峰歸屬。在圖3A中，圓圈和字母顯示對于hPrP(M166C/E221C)而言，已觀察到的，但在hPrP(M166C/Y225C)或野生型hPrP(121-230)的波譜中未曾見到的交叉峰(Zahn等2000)。在圖3B中，空心圓表示由與(A)和與hPrP(121-230)的比較所預(yù)期的交叉峰的位置，矩形表示由于在三重共振波譜中喪失了連續(xù)性而不能進行歸屬的交叉峰。在兩種波譜中矩形框都包括了在Arg側(cè)鏈中HNE折疊的交叉峰。在600MHz下用含有1mM蛋白質(zhì)的90％的H2O/10％D2O、10mM[d4]乙酸鈉的溶液，在pH4.5和溫度20℃下記錄波譜。
但是，盡管在hPrP(M166C/E221C)的波譜(圖3A)中觀察到所有的108個預(yù)期的主鏈酰胺共振(凝血酶剪切位點在朊病毒蛋白質(zhì)序列的N端前添加了一個Gly-Ser二肽(Zahn等，1997)，從而也在[15N，1H]-COSY波譜中觀察到Serl20和Vall21的共振)，我們只能在hPrP(M166C/Y225C)中鑒定出103個主鏈酰胺共振(圖3B)?？傮w而言，在hPrP(M166C/Y225C)中的酰胺質(zhì)子的共振線與波譜A相比大約加寬了6Hz，顯示這種突變蛋白質(zhì)向寡聚體轉(zhuǎn)變的短暫聚合作用。
2.hPrP(M166C/E221C)的共振歸屬和結(jié)構(gòu)測定利用標準的三重共振實驗以13C、15N標記的蛋白質(zhì)獲得序列特異性的主鏈歸屬(Bax，A.和Grzesiek，S.(1993)Methodological advances in protein NMR.Acc.Chem.Res.26，131-138)，并通過連續(xù)和中度的核歐沃豪斯增強(NOE)交叉峰獨立地確證序列特異性的歸屬(Wuthrich，K.(1986)NMR of Proteins and Nucleic Acids，Wiley，New York)。將所有的多肽主鏈共振進行歸屬，包括在環(huán)165-175和Phel75的所有殘基的酰胺氮和酰胺質(zhì)子(圖3A)，而在野生型蛋白質(zhì)中沒有檢測到(Zahn等，2000)。對于每一對相鄰的殘基而言，至少觀察到一個異核連續(xù)標量連通性或一個連續(xù)的NOE。基于與野生型hPrP(121-230)的化學(xué)位移比較對側(cè)鏈進行歸屬(Zahn等，2000)，并利用三維的15N解析的[1H，1H]-全相關(guān)波譜學(xué)(TOCSY)波譜進行了確證(Marion，D.，Kay，L. E.，Sparks，S.E.，Torchia，D.A.和Bax，A.(1989)Three-dimensional heteronuclear NMR of15N-labelled proteins.J.Am.Chem.Soc.111，1515-1517)。無標記質(zhì)子的側(cè)鏈歸屬是完全的，唯一例外的是His155和His187的εCH和Phe175和Phe198的ζCH。在標記的側(cè)鏈質(zhì)子中，所有7個Asn和Gln殘基的酰胺基團和8個Arg殘基的ε-質(zhì)子共振通過分子內(nèi)殘基的NOEs(Wüthrich，1986)被歸屬。在Ser、Thr和Tyr的測鏈羥基質(zhì)子中只有Thr183的共振能觀察到并歸屬。
利用在DYANA軟件包(Guntert，P.，Mumenthaler，C.和Wuthrich，K.(1997)Torsion an-gle dynamics for NMR structure calculation with the newprogramDYANA.J.Mol.Biol.273，283-298)中運行的FOUND程序?qū)PrP(M166C/E221C)中9個Val和2個Leu的甲基進行了立體特異性歸屬，并獲得2αCH2、30βCH2、17γCH2和4δCH2基團額外的立體特異性歸屬(Gun-tert，P.，Billeter，M.，Ohlenschlager，O.，Brown，L. R.和Wüthrich，K.(1998)Con-formationalanalysis of protein and nucleic acid fragments with the new grid searchalgorithmFOUND.J.Biomol.NMR 12，543-548)。四個Cys殘基的13Cα共振都在39.6pp到41.6ppm范圍內(nèi)進行了強烈地低磁場位移，確證了它們都形成了二硫鍵(Wishart等，1995)。hPrP(M166C/E221C)的1H、13C和15N化學(xué)位移已存放于生物磁共振庫中，文檔號5378。
在水中以40ms的混合時間記錄的750MHz下三維聯(lián)合15N/13C解析的[1H，1H]-NOESY中，重復(fù)選取并積分了一共4477個核歐沃豪斯增強波譜(NOESY)交叉峰。利用這些峰的列表和化學(xué)位移列表輸入程序CANDID中進行自動的NOE歸屬(Herrmann，T.，Güntert，P.和Wuthrich，K.(2002)Protein NMR structuredetermination with automated NOE assignment using the new software CANDID andthe torsion angle dynamicsalgo-rithmDYANA.J.Mol.Biol.319，209-227)以及在DYANA中進行結(jié)構(gòu)計算(Güntert等，1997)(詳見材料和方法)，得到1775個NOE上限距離約束。作為補充的構(gòu)象約束，所有具有13Cα化學(xué)位移偏離無規(guī)卷曲值多于1.5ppm的殘基都受限于下面的二面扭角的范圍對于偏差大于1.5ppm而言，-120°＜Φ＜-20°并且-100°＜Ψ＜0°；對于偏差小于1.5ppm而言，-200°＜Φ＜-80°并且40°＜Ψ＜220°(Luginbühl，P.，Szyperski，T.和Wüthrich，K.(1995)Statistical basis for the use of13Cαchemical shift in protein structure determination.J.Magn.Reson.B 109，229-233)。來自殘基內(nèi)的和連續(xù)NOEs的組合信息以及用作程序FOUND輸入值的13Cα化學(xué)位移在二面扭角Φ、Ψ、X1和X2上產(chǎn)生了458次約束。利用三個上限的和三個下限距離約束來分別計算兩個二硫鍵Cys166-Cys221和Cys179-Cys214(Williamson，M.P.，Havel，T.F.和Wüthrich K.(1985)Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by1Hnuclear magnetic resonance and distance geometry.J.Mol.Biol.182，295-315)。用100種隨機起始結(jié)構(gòu)在CANDID標準方法(Herrmann等，2002)的第七次循環(huán)中的進行最終DYANA計算，并用程序OPALp對20種最佳DYANA構(gòu)象異構(gòu)體進行進一步能量優(yōu)化。用得到的20種能量最小化的構(gòu)象異構(gòu)體的集合來代表NMR結(jié)構(gòu)。表1給出了結(jié)構(gòu)計算結(jié)果的概觀。
表1代表hPrP(M166C/E221C)aNMR結(jié)構(gòu)的20種能量優(yōu)化的DYANA構(gòu)象異構(gòu)體的表征
a由1775個NOE的上限距離約束、116個在Φ和Ψ上二面角約束，以及6個上限距離和6個下限距離約束的輸入以計算二硫鍵166-221和179-214。
b給出具有最低DYANA靶功能值的20個能量最小化的構(gòu)象異構(gòu)體的平均值±標準偏差。
c能量最小化之前。
d相對于平均坐標的RMSD值。
小的殘基約束偏差顯示結(jié)構(gòu)與實驗約束相一致，而在20個構(gòu)象異構(gòu)體集合間的球形RMSD值代表了高質(zhì)量結(jié)構(gòu)的測定(圖4)。
圖4顯示hPrP(M166C/E221C)的NMR結(jié)構(gòu)的立體視圖。在圖4A中，將20種能量優(yōu)化的DYANA構(gòu)象異構(gòu)體的主鏈進行疊加用于殘基125-228的N、Cα和C’原子的最佳擬合。圖4B是顯示了來自(A)的具有與平均坐標最小偏差的構(gòu)象異構(gòu)體的所有重原子，其中主鏈顯示為通過Cα位置的一種鍵槽(spline)功能。圖4C是來自(B)的構(gòu)象異構(gòu)體的飄帶圖。在所有的圖中兩個二硫鍵用白色繪出。
20個構(gòu)象異構(gòu)體集合的原子坐標已保存于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，登錄號1HOL。
3.以程序DYANA和CANDID進行野生型hPrP(121-230)NMR結(jié)構(gòu)的新計算假定本項工作的主要興趣集中在突變的人朊病毒蛋白質(zhì)與野生型hPrP(121-230)的比較上，我們以新的CANDID/DYANA法(Herrmann等，2002)重新評估了NOE輸入數(shù)據(jù)并重復(fù)了以往發(fā)表過的hPrP(121-230)結(jié)構(gòu)(Zahn等，2000)的結(jié)構(gòu)計算。這確保了在這篇論文中的結(jié)構(gòu)比較不受系統(tǒng)差異的影響，所述系統(tǒng)差異可能緣于用于數(shù)據(jù)分析和突變蛋白的新結(jié)構(gòu)和參考的野生型結(jié)構(gòu)的計算的方法之間的一些差異。
4.額外二硫鍵對于hPrP(M166C/E221C)NMR結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象平衡的影響hPrP(M166C/E221C)NMR結(jié)構(gòu)具有與hPrP(M166C/E221c)相同的球狀折疊，在兩種蛋白質(zhì)的平均結(jié)構(gòu)(mean structures)中的殘基125-228的主鏈重原子之間具有1.08的RMSD值。常規(guī)的二級結(jié)構(gòu)包括具有殘基128-131和161-164的短的雙鏈反平行的β折疊、具有殘基144-154的螺旋α1、具有殘基173-194的螺旋α2，以及具有殘基200-228的螺旋α3。
在保守的球狀結(jié)構(gòu)的框架內(nèi)，在突變的和野生型hPrP(121-230)中的環(huán)165-172的結(jié)構(gòu)測定的精度上有所不同。在野生型蛋白質(zhì)中，在環(huán)165-172中的三個氨基酸的主鏈酰胺共振是觀察不到的，可能是由于線性加寬減慢了NMR化學(xué)位移時間尺度上的構(gòu)象變換(Zahn等，2000)。由于NOE上限距離約束的不足，這導(dǎo)致了片段165-172結(jié)構(gòu)測定的減弱的精度。相反，對于hPrP(M166C/E221C)獲得了主鏈歸屬的完整多肽，它使得在環(huán)165-172中能夠進行額外的中度NOEs的鑒定，因而與野生型蛋白質(zhì)相比其得到了明顯更好地限定(圖4A)。因此在Cys166和Cys221之間的二硫鍵似乎減少了可進入環(huán)165-172的構(gòu)象空間并因此大大阻止了以前觀察到在這一多肽片段中主鏈酰胺共振的交換加寬。(Zahn等，2000)。
在hPrP(M166C/E221C)和hPrP(121-230)中的螺旋α3同樣得到了充分說明，并且兩種結(jié)構(gòu)間的差異在20種構(gòu)象異構(gòu)體的集合所包含的構(gòu)象空間之內(nèi)。在結(jié)構(gòu)計算中這些觀察與NOE距離約束的近似密度相關(guān)聯(lián)，特別是中度約束dαN(i，i+3)、dαN(i，i+4)和dαβ(i，i+3)，它們對于常規(guī)的α螺旋折疊具有主要的影響(Wüthrich，1986)。由于NOE強度對距離d的六次冪反比的相關(guān)性，只有具有低d值的多肽的折疊形式才顯著地對觀察到的NOEs作出貢獻，從而在具有未折疊形式的快速構(gòu)象平衡的存在下，在基于NOE的NMR結(jié)構(gòu)測定中通常只獲得折疊的結(jié)構(gòu)。不同的平均值應(yīng)用于在觀察到的和無規(guī)卷曲的13Cα化學(xué)位移之間的差異，Δδ(13Cα)，它因而能夠與常規(guī)二級結(jié)構(gòu)對象總體定性地關(guān)聯(lián)(Luginbuhl等，1995；Wishart，D.S.和Sykes，B.D.(1994)The13C Chemical-ShiftIndexa simple method for the identification of protein secondary structure using13Cchemical-shiftdata.J.Biomol.NMR 4，171-180)。
圖5顯示13Cα化學(xué)位移差異Δδ(13Cα)相對于hPrP(121-230)氨基酸序列的圖(A)和(B)，分別為hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)對無規(guī)卷曲(Wishart，D.S.，Bigam，C.G.，Holm，A.，Hodges，R.S.和Sykes，B.D.(1995)1H，13C and15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids.I.Investigations of nearestneighboreffects.J.Biomol.NMR 5，67-81)；(C)和(D)，分別為hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)對野生型hPrP(121-230)(Zahn等，2000)。在hPrP(121-230)的兩種突變體中的氨基酸替換的位置通過序列位置表示。在(B)和(D)中的矩形表示殘基164-171，因為它13Cα化學(xué)位移無法在hPrP(M166C/Y225C)中進行歸屬。在(C)和(D)中，由于這些13Cα化學(xué)位移無法在hPrP(121-230)中進行歸屬，對殘基169和175沒有給出數(shù)據(jù)。在頂部給出了常規(guī)二級結(jié)構(gòu)元件的定位。
圖5A顯示盡管相對于無規(guī)卷曲位移，所有位于hPrP(M166C/E221C)的α3螺旋內(nèi)的13Cα原子共振都進行了低磁場位移，所有在C端兩個轉(zhuǎn)折內(nèi)的殘基的較小的Δδ(13Cα)值顯示了朝向C端的α螺旋結(jié)構(gòu)的下限值。考慮到在基于NOE的結(jié)構(gòu)中其未出現(xiàn)，這種平衡似乎帶有多肽的未折疊形式。比較hPrP(M166C/E221C)和hPrP(121-230)之間Δδ(13Cα)值進一步顯示了在突變蛋白質(zhì)的片段222-228內(nèi)除了一個以外其它所有的化學(xué)位移都是高磁場位移(圖5C)。因而額外二硫鍵的引入似乎稍微降低了在C端兩個α3轉(zhuǎn)折中螺旋結(jié)構(gòu)的數(shù)量。
在13Cα化學(xué)位移中出現(xiàn)的構(gòu)象平衡與可通過異核的15N{1H}-NOEs測量檢測到的分子內(nèi)速率進程相關(guān)。對于hPrP(121-230)和hPrP(M166C/E221C)而言，15N{1H}-NOEs顯示了在大多數(shù)氨基酸序列上的均一分布，對于具有hPrP(121-230)尺寸的球狀蛋白質(zhì)而言，具有典型值。
圖6顯示hPrP(M166C/E221C)(黑條)和hPrP(121-230)的穩(wěn)態(tài)15N{1H}-NOEs(開放的方形)。對于hPrP(121-230)而言，由于線加寬無法觀察到殘基169、170、171和175的酰胺質(zhì)子。殘基137、158和165是脯氨酸。在底部給出了常規(guī)二級結(jié)構(gòu)元件的定位。
除了螺旋α3的最后兩個轉(zhuǎn)折，只有殘基121-126和殘基191-198顯示降低的正的或負的15N{1H}-NOE值，所述殘基121-126未結(jié)構(gòu)化并且在完整PrP中通過柔性尾部與球狀結(jié)構(gòu)域聯(lián)接，所述殘基191-198形成有些無序的螺旋α2的C端末尾以及緊接的環(huán)(Zahn等，2000)。因而在兩種蛋白質(zhì)中螺旋α3都是唯一充分限定的結(jié)構(gòu)區(qū)域，帶有一定程度上高于平均值的內(nèi)部流動性，并且在hPrP(M166C/E221C)中額外二硫鍵的引入引起了α3螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量的降低及其內(nèi)部流動性的稍微增加。
5.hPrP(M166C/Y225C)的光譜特征在hPrP(M166C/Y225C)的NMR譜中增加的線寬(圖3B)使得無法進行完整的主鏈歸屬。對于Arg164、Cys166、Asp167、Glu168、Tyr169、Ser170、Asn171和Phe175的酰胺質(zhì)子和酰胺氮而言，無法獲得明確的歸屬。同時考慮到NMR數(shù)據(jù)有限的質(zhì)量以及下面描述的模型計算，我們僅完成了基于13Cα化學(xué)位移的常規(guī)二級結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果，相對于無規(guī)卷曲以及相對于野生型hPrP(121-230)(圖2)的13Cα化學(xué)位移的差異顯示了野生型hPrP(121-230)的二級結(jié)構(gòu)元件是保守的，對于這種突變蛋白質(zhì)也是保守的。
6.對于具有兩個二硫鍵的其它hPrP(121-230)突變體的模型計算為研究野生型hFrP(121-230)結(jié)構(gòu)的相容性，使用一個具有改變位置的額外二硫鍵，，我們利用程序DYANA 進行了一系列的模型計算。我們使用與前述hPrP(121-230)的新結(jié)構(gòu)測定相同的距離和二面角作為輸入數(shù)據(jù)，除此以外加入三個上限和三個下限距離約束以計算每一個不同的單獨的額外二硫鍵(Williamson等，1985)，除去被半胱氨酸取代的殘基的βCH2之外的質(zhì)子的所有NOE約束。在表II中結(jié)果顯示了所有連接殘基165或166與殘基221、222或225的二硫鍵約束的計算值都高度一致，與hPrP(121-230)的計算值相比沒有或僅有輕微的殘基DYANA靶功能值的升高。而且，這些二硫鍵的引入沒有導(dǎo)致明顯的殘基上限二硫鍵約束偏差，并且相對于hPrP(121-230)的平均坐標，突變蛋白質(zhì)的“RMSD”位于由20個構(gòu)象異構(gòu)體所包含的構(gòu)象空間之內(nèi)。作為一種分子內(nèi)控制我們也研究了具有連接野生型Cys和人工Cys殘基的二硫鍵的蛋白質(zhì)。這些計算值確實相當?shù)匾恢?，但得到的結(jié)構(gòu)顯示了明顯提高的靶功能值、二硫鍵約束偏差以及RMSD值。
表II在向以前用作野生型hPrP(121-230)a結(jié)構(gòu)測定的輸入值中加入對于引入一個額外二硫鍵的約束后計算的hPrP(121-230)的二硫突變體的特性鑒定
a通過將兩個天然Cys殘基和兩個人工的額外Cys殘基結(jié)合成兩個二硫鍵生產(chǎn)八個不同的突變蛋白質(zhì)，其中額外的半胱氨酸占據(jù)著5個不同的序列位置。進行結(jié)構(gòu)計算的輸入值采用來自野生型hPrP(121-230)的輸入值，其數(shù)據(jù)也列于頂排以作比較。對于兩個Xxx到Cys的轉(zhuǎn)換，將具有在殘基的βCH2之外的側(cè)鏈質(zhì)子的NOEs從列在第二欄中的NOE上限距離約束中減去。通過標準的三個上限和三個下限距離約束計算列在第一欄中的每個二硫鍵(Williamson等，1995)。每次運算以100種隨機化的結(jié)構(gòu)起始。
b在輸入值中NOE上限距離約束的數(shù)值。
c殘基DYANA靶功能值()。對于用來代表結(jié)構(gòu)的20種構(gòu)象異構(gòu)體的集合給出平均值±標準偏差。
d大于0.1的殘基上限二硫鍵約束偏差的平均值±標準偏差。大于0.1的殘基下限二硫鍵約束偏差的數(shù)值在所有的計算值中都在0和1之間。
e相對于殘基125-228的的主鏈重原子N、Cα和C’計算的平均坐標的20種構(gòu)象異構(gòu)體集合的RMSD值(，平均值±標準偏差)。
f對殘基125-228計算的突變蛋白質(zhì)和hPrP(121-230)的平均結(jié)構(gòu)之間的RMSD值()。
7.于pH7處球狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性
對hPrP(121-230)和蛋白變體的球狀蛋白質(zhì)穩(wěn)定性進行測定，在含不同濃度的氯化胍(GdmCl)的溶液中監(jiān)測于222nm的摩爾橢圓率。
圖7顯示人朊病毒蛋白質(zhì)的GdmCl依賴的殘基平均摩爾橢圓率(A)在含有20mM磷酸鈉的pH7.0的緩沖液中和(B)在含有20mM醋酸鈉的pH5.0的緩沖液中。(A)和(B)中的波譜在22℃30μM的蛋白質(zhì)溶液中進行記錄實心方形，hPrP(121-230)；開放方形，hPrP(M166C/Y225C)；實心圓形，hPrP(M166C/E221C)。
在pH7.0時，hPrP(121-230)發(fā)生了一種高度協(xié)同的二態(tài)轉(zhuǎn)變(圖7A)，它具有轉(zhuǎn)變的中間點[D]1/2＝2.1M以及在不存在變性劑情況下的解折疊自由能ΔG0＝19kJmol-1。這些熱動力學(xué)值近似于對hPrP(90-231)測定的那些值(Swietnicki，W.，Petersen，R.，Gambetti，P.和Surewicz，W.K.(1997)pH-dependentstability and conformation of the recombinant human prion protein PrP(90-231).J BiolChem，272，27517-27520)。對于兩種hPrP(121-230)變體而言，也觀察到了單獨的折疊轉(zhuǎn)變(圖7A)。但是，hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)顯示了轉(zhuǎn)變中間點[D]1/2的升高，提示球狀結(jié)構(gòu)被改造的二硫鍵穩(wěn)定化了(Fersht，A.R.(1993)The sixth Datta Lecture.Protein folding and stabilitythe pathway of folding ofbarnase.Febs Lett，325，5-16；Fersht，A.R.(1994)Jubilee Lecture.Pathway andstability of protein folding.Biochem Soc Trans，22，267-273)。蛋白變體較低的協(xié)同性提示了背離了二態(tài)折疊機制。
8.于pH5.0處α螺旋相對于β折疊二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性在pH5.0時，hPrP(121-230)顯示了兩種在1.3和2.7M GdmCl中具有轉(zhuǎn)變中間點的明顯的折疊轉(zhuǎn)變區(qū)域，清楚地表明在約2 M GdmCl中存在折疊中間體的最大化增加(圖7B)。對于hPrP(90-231)已經(jīng)報道了在GdmCl中于平衡解折疊期間一種穩(wěn)定的折疊中間體的存在并在緩沖液的pH小于4.0時觀察到這種穩(wěn)定的折疊中間體的存在(Swietnicki等，1997)。但是在pH5.0時，hPrP(90-231)的解折疊曲線接近于一種二態(tài)轉(zhuǎn)變模型。因而似乎柔性無序的肽片段90-120使折疊的中間體去穩(wěn)定化，可能是通過與球狀蛋白質(zhì)相互作用，這種折疊中間體在低GdmCl濃度和酸性pH下積聚(Zahn等，2000).
變性蛋白質(zhì)降低的溶解性使得在1.2 M GdmCl濃度下無法進行定性的CD測定(圖7B)，因此我們對這些蛋白質(zhì)無法測定折疊轉(zhuǎn)變模型。與在中性pH下獲得的數(shù)據(jù)相似，相對于hPrP(121-230)的第二個轉(zhuǎn)變中間點所觀察到的hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)的折疊轉(zhuǎn)變中間點向更高摩爾濃度的變性劑位移，而折疊協(xié)同性降低了(圖7B)。
為了深入了解人朊病毒蛋白質(zhì)在相應(yīng)于hPrP(121-230)的穩(wěn)定折疊中間體存在的條件下的構(gòu)象特性，我們于pH5.0處在存在或不存在2 M GdmCl的情況下測定了深紫外CD光譜。
圖8顯示了人朊病毒蛋白質(zhì)的圓二色性光譜(A)hPrP(121-230)，(B)hPrP(M166C/E221C)和(C)hPrP(M166C/Y225C)。在2 M GdmCl存在(粗線)或不存在(細線)的情況下，用在pH5.0和22℃的20mM醋酸鈉中的20μM蛋白質(zhì)溶液來記錄光譜。
三種蛋白質(zhì)在不存在變性劑時的光譜基本相似(圖8)，在208和222nm處有最小值，表示所有三種蛋白質(zhì)具有大量α螺旋結(jié)構(gòu)。在蛋白變體的光譜中相對于野生型的輕微差異可以歸因于另外的二硫鍵在深紫外區(qū)的額外吸收(Coleman，D.L.和Blout，E.R.(1968)Optical activity of disulfide bond in L-cystineand some deriva-tives of L-cystine.J Am Chem Soc，90，2405-2416)，因為除了在二硫鍵插入點周圍小的局部性變化外，結(jié)構(gòu)都十分相似。而且，從NMR的化學(xué)位移測定知道在hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)二者的螺旋α3內(nèi)，α螺旋二級結(jié)構(gòu)的數(shù)量稍微減少了(圖5)。
在hPrP(121-230)的折疊中間體最大化增加的2M GdmCl中，在hPrP(121-230)CD譜中的雙最小值由在213nm處的單個最小值所取代(圖8A)，這是富含β折疊二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的特性。對于hPrP(90-231)在pH4.0已描述了一種相似的單體折疊中間體，它在1M GdmCl中最大化增加(Swietnicki等，1997)，并且還描述了小鼠的PrP(121-231)于4M尿素中最大化增加(Hornemann，S.和Glockshuber，R.(1998)A scrapie-like unfolding intermediate of theprion protein domain PrP(121-231)induced by acidic pH.Proc Natl Acad Sci USA，95，6010-6014)。有人假定這些中間體可能代表一種PrPSc的可溶性前體。在對hPrP(90-231)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變機制更詳細了解的基礎(chǔ)上(Swietnicki，W.，Moril-las，M.，Chen，S.G.，Gambetti，和Surewicz，W.K.(2000)Aggregation and fi-brillization ofthe recombinant human prion protein huPrP(90-231).Biochemistry-Us，39，424-431)，發(fā)現(xiàn)β折疊中間體寡聚成大分子量的聚合物，它們共同具有一些PrPSc淀粉樣蛋白的物理性質(zhì)。對于小鼠PrP(121-230)(Hornemann等，1998)和hPrP(121-231)而言，沒有觀察到這些聚合物，可能是由于這些構(gòu)建體缺少肽片段90-120，它對于在腦中PrPC向PrPSc轉(zhuǎn)變期間α螺旋向β折疊二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變是必需的(Prusiner，S.B.，Groth，D.F.，Bolton，D.C.，Kent，S.B.和Hood，L.E.(1984)Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.Cell，38，127-134)；Pan等，1993)。但是，基于β折疊二級結(jié)構(gòu)相似的CD譜特征，我們相信所有的中間體在特性上是相似的，并且因此可能都牽涉到導(dǎo)致致病蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
兩種變異的朊病毒蛋白質(zhì)在2M GdmCl中的CD譜對于富含α螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)是典型的(圖8B和8C)，表示沒有折疊中間體的積累，所述折疊中間體具有增加的β折疊結(jié)構(gòu)。當與天然蛋白質(zhì)相比時208nm相對于222nm在振幅上相對增加，可以通過α螺旋向無規(guī)卷曲構(gòu)象的部分轉(zhuǎn)變而進行合理地說明，但對于在GdmCl存在下則沒有證據(jù)表明α螺旋-β折疊的轉(zhuǎn)變，如同野生型蛋白質(zhì)的情況一樣。
圖9顯示人朊病毒蛋白質(zhì)(A)hPrP(121-230)，(B)hPrP(M166C/Y225C)和(C)hPrP(M166C/E221C)的溫度依賴的平均殘基摩爾橢圓率。在10mM pH4.5醋酸鈉中蛋白質(zhì)濃度為24μM。
三種朊病毒蛋白質(zhì)在酸性條件下的熱解折疊發(fā)生在單個的轉(zhuǎn)變中(圖9)，但是相對于蛋白變體的野生型的性質(zhì)不同的折疊特征也在熱解折疊實驗中出現(xiàn)。hPrP(121-230)的二態(tài)熱解折疊與大約60℃的變性溫度高度協(xié)同(圖9A)。hPrP(M166C/Y225C)和hPrP(M166C/E221C)的折疊轉(zhuǎn)變協(xié)同性要小得多，并且向更高溫度位移超過10℃(圖9B和9C)，再次反映了更大的穩(wěn)定性。對于蛋白變體無法測定折疊轉(zhuǎn)變的精確溫度，因為即使在100℃它們還未達到解折疊后的階段并包含在222nm處具有負橢圓率的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的顯著度(significant degree)。
結(jié)果討論人Dpl和人PrP球狀結(jié)構(gòu)域的比較既揭示了相近的球狀相似性還揭示了顯著的局部差異(T.Luhrs，R.Riek，P.Gun-tert und K.Wüthrich，未發(fā)表)。對于相應(yīng)的鼠蛋白質(zhì)報道了相似的觀察結(jié)果(Mo，H.，Moore，R.C.，Cohen，F(xiàn).E.，Westaway，D.，Prusiner，S.B.，Wright，P.E.和Dyson，H.J.(2001)Two differentneuro-degenerative diseases caused by proteins with similar structures.Proc Natl AcadSci USA，98，2352-2357)。在相應(yīng)于hPrP中假定的因子X抗原表位的hDpl結(jié)構(gòu)的區(qū)域之內(nèi)(Telling等，1994；Prusiner，1998)，螺旋α3縮短了兩個以上的轉(zhuǎn)折，并且相對連接β2和α2的環(huán)，C端的肽片段144-149進行了折疊。在兩種蛋白質(zhì)之間，在PrP序列中因子X抗原表位之前緊接著β折疊平面，相對于由螺旋二級結(jié)構(gòu)形成的分子構(gòu)架旋轉(zhuǎn)了大約180°，并且在hDpl中它位于接近螺旋α1的兩個殘基處。而且，在hDpl中hPrP的螺旋α2，它在PrP序列中連接著因子X的抗原表位，被兩個較短的螺旋α2a和α2b所取代。現(xiàn)有的一種包含兩個二硫鍵的突變?nèi)穗貌《镜鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)的測定使得能夠?qū)υ谝蜃覺抗原表位中的hPrP和hDpl的分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系作出新的了解，它也可能支持正在進行的對于兩種蛋白仍舊未知的功能的研究。
突變的hPrP的球狀結(jié)構(gòu)與野生型hPrP和hDpl二者都相似。hPrP(M166C/E221C)和hDpl的平均結(jié)構(gòu)中的普通α螺旋的殘基的主鏈重原子之間的RMSD值為1.69。在三維結(jié)構(gòu)疊加為具有最小RMSD這種構(gòu)架之后，在hPrP(M166C/E221C)中的人工二硫鍵和在hDpl中相應(yīng)的天然二硫鍵的位置和取向都近似。考慮到在hDpl中二硫鍵Cys94-Cys145連接兩個沒有常規(guī)二級結(jié)構(gòu)的片段，即環(huán)91-100和殘基142-153的C端片段，而在突變的hPrP中二硫鍵Cys166-Cys221相對于螺旋α3錨定易變的環(huán)165-172(見圖2)，這是相當令人驚奇的。從目前的數(shù)據(jù)來看好像在PrP中觀察到的假定因子X抗原表位的局部結(jié)構(gòu)可能一開始也在Dpl中存在，在94位有一個半胱氨酸殘基，它與另一個半胱氨酸形成一個二硫鍵，另一個半胱氨酸位于與一直延伸到C端的螺旋α3相諧調(diào)的位置，例如147位(圖2)。在進一步的進化中，在螺旋α3中的一個缺失將這個半胱氨酸重定位于位置145(圖1)，那里它與在約殘基141范圍外的常規(guī)α螺旋不相容。隨后自然界好像選擇了這個二硫橋以及未充分結(jié)構(gòu)化的C端肽片段。由于在所有已知的哺乳類Dpl序列中這個二硫鍵普遍存在Moore等，1999)，清楚地顯示這種令人感興趣的離C端最近的Cys位置的選擇在生理性的Dpl功能中具有一種特異性的作用。環(huán)91-100在位置98包含一個Asn連接的糖基化位點的事實獨立地提出Dpl的這種結(jié)構(gòu)性區(qū)域與在PrP中因子X抗原表位具有不同的功能(Moore等，1999)，這一糖基化位點在PrP中沒有對應(yīng)部分。如果對于朊病毒增殖而言，因子X相互作用是實際上必需的，那么在Dpl的這一分子區(qū)域中二硫鍵相關(guān)的不同構(gòu)象可能為所觀察到結(jié)果提供理論基礎(chǔ)，該觀察結(jié)果即至今沒有證據(jù)表明TSE是由Dpl所引起的(Behrens，A.，Brandner，S.，Genoud，N.，和Aguzzi，A.(2001)Normal neu-rogenesis and scrapiepathogenesis in neural grafts lacking the prion proteinhomologue Doppel.EMBO Rep，2，347-352；Tuzi，N.L.，Gall，E.，Melton，D.和Manson，J.C.(2002)Expression ofdoppel in the CNS of mice does not modulate transmissible spongiformencephalopathy disease.J Gen Virol，83，705-711)。
目前為止沒有藥物可用于治療人和動物的朊病毒疾病。在惟蛋白質(zhì)假說的框架內(nèi)(Prusiner，1998)，可以設(shè)想至少兩種機制能夠阻止導(dǎo)致TSE的毒性蛋白質(zhì)的累積。第一種機制依賴于“PrPC結(jié)合物”特異性結(jié)合到朊病毒正常結(jié)構(gòu)上，因而阻止PrPC折疊成PrPSc。在“晶核形成”模型(Jarrett，I.T.and Lansbury，P.T.，Jr.(1993)Seeding″one-dimensional crystallization″of amyloida pathogenicmechanism in Alzheimer’s disease and scrapie？Cell，73，1055-1058)的內(nèi)容中，提出PrPC和PrPSc處于快速建立的平衡態(tài)中，PrPC結(jié)合分子可以簡單地穩(wěn)定PrPC的天然蛋白質(zhì)構(gòu)象從而通過降低聚合的核的濃度而減緩轉(zhuǎn)變動力學(xué)(Prusiner，S.B.，Scott，M.，F(xiàn)oster，D.，Pan，K.M.，Groth，D.，Mirenda，C.，Torchia，M.，Yang，S.L.，Serban，D.，Carlson，G.A.等.(1990)Transgenetic studies implicate interactions betweenhomologous PrP isoforms in scrapie prion replication.Cell，63，673-686)，PrPC結(jié)合物可以直接阻抑PrPSc的結(jié)合位點或另一種朊病毒增殖所必需的分子如蛋白質(zhì)X(Telling等，1994；1995)。第二種機制利用一種“PrPSc結(jié)合物”去阻抑PrPSc同種聚集成淀粉樣蛋白原纖維或去干擾與其它大分子的異種相互作用，否則這種作用將與致病途徑相關(guān)。PrPSc結(jié)合物較PrPC結(jié)合物的好處是它們不干擾蛋白質(zhì)細胞形式的尚不清楚的生理功能。
幾篇最近的報道指出直接抗PrPC的抗體具有在體外從感染瘙癢病的細胞中去除海綿狀腦病傳播因子的潛力(Enari，M.，F(xiàn)lechsig，E.和Weissmann，C.(2001)Scrapie prion protein accumulation by scrapie-infected neuroblastoma cellsabrogated by exposure to a prion protein antibody.Proc Natl Acad Sci USA，98，9295-9299；Horiuchi，M.和Caughey，B.(1999)Specific binding of nor-mal prion protein tothe scrapie form via a localized domain initiates its conver-sion to the protease-resistant state.Embo J，18，3193-3203)。一種體液免疫反應(yīng)能夠在體內(nèi)阻止羊瘙癢病的發(fā)病，顯示保護性抗朊病毒免疫的誘導(dǎo)似乎是可行的(Heppner，F(xiàn).L.，Musahl，C.，Arrighi，I.，Klein，M.A.，Rulicke，T.，Oesch，B.，Zinkernagel，R.M.，Klinke，U.和Aguzzi，A.(2001)Prevention of scrapie pathogenesis by transgenic expression of anti-prion protein antibodies.Science，294，178-182)。這些研究大多數(shù)都認定包含朊病毒蛋白質(zhì)殘基的132-156的區(qū)域為抗體結(jié)合的靶位(Heppner等，2001)。已經(jīng)對在ScN2a細胞中各種結(jié)合到PrPC上并抑制朊病毒增殖的多種化合物進行了描述，但只有少數(shù)幾個在動物實驗中顯示了短暫的治療效果(Gilch，S.，Winklhofer，K.F.，Groschup，M.H.，Nunziante，M.，Lucassen，R.，Spielhaupter，C.，Muranyi，W.，Riesner，D.，Tatzelt，J.和Schatzl，H.M.(2001)Intracellular reroutingof prion protein prevents propagation of PrPs′and delays onset of prion disease.Embo J，20，3957-3966)。最近抗瘧疾藥米帕林被鑒定為治療克-雅病(CJD)有希望的先導(dǎo)化合物(Doh-Ura，K.，Iwaki，T.和Caughey，B.(2000)Lysosomotropic agents andcysteine protease inhibitors inhibit scrapie-associatedprion protein accumulation.JVirol，74，4894-4897；Korth，C.，May，B.C.H.，Cohen，F(xiàn).E.和Prusiner，S.B.(2001)Acridine and phenothiazine derivatives as pharmacotherapeutics for prion disease.ProcNatl Acad Sci USA，98，9836-9841)。人PrP的米帕林結(jié)合位點已經(jīng)定位至“蛋白質(zhì)X”抗原表位附近的螺旋α3的殘基Tyr225、Tyr226和Gln227上(Vogtherr，M.，Grimme，S.，Elshorst，B.，Jacobs，D.M.，F(xiàn)iebig，K.，Griesinger，C.和Zahn，R.(2003)Antimalarial drug quinacrine binds to Cterminal helix of cellular prion protein.JMed Chem，(印刷中))。米帕林-PrPC復(fù)合物的毫摩爾分解常數(shù)提示這種藥物抑制朊病毒在內(nèi)溶酶體中的增殖，在那里它濃縮了10,000倍(O’Neill，P.M.，Bray，P.G.，Hawley，S.R.，Ward，S.A.和Park，B.K.(1998)4-Aminoquinolines-Past，present，and futureA chemical perspective.Pharmacol Ther，7，29-58)。盡管以米帕林治療的病人的恢復(fù)是暫時的(Follette，P.(2003)New perspectives for priontherapeutics meetingPrion desease treatment’s early promise unravels.Science，299，191-192)，基于米帕林及其類似物的第二代藥物還是為治療CJD的更加有效的藥物帶來了希望(May，B.C.H.，F(xiàn)afarman，A.T.，Hong，S.B.，Rogers，M.，Deady，L.W.，Prusiner，S.B.和Cohen，F(xiàn).E.(2003)Potent inhibition of scrapie prionreplication in cultured cells by bis-acridines.Proc Natl Acad Sci USA，100，3416-3421)。
只有少數(shù)幾種能特異性結(jié)合到朊病毒的羊瘙癢病構(gòu)象上的具有治療潛力的少數(shù)化合物得以鑒定。1997年發(fā)現(xiàn)了一種單克隆PrPSc結(jié)合抗體(Kort，C.，Stierli，B.，Streit，P.，Moser，M.，Schaler，O.，F(xiàn)ischer，R.，SchulzSchaeffer，W.，Kretzschmar，H.，Raeber，A.，Braun，U.，Ehrensperger，F(xiàn).，Homemann，S.，Glockshuber，R.，Riek，R.，Billeter，M.，Wüthrich，K.and Oesch，B.(1997)Prion(PrPSc)-specific epitopdefined by a monoclonal antibody.Nature，390，74-77)，但最近沒有報道確證特異性體內(nèi)結(jié)合活性。Soto及其同事構(gòu)建了一個13殘基的β折疊開關(guān)肽，它在體外將PrPSc部分地逆轉(zhuǎn)成PrPC樣的蛋白質(zhì)(Soto，C.，Kascsak，R.J.，Saborio，G.P.，Aucouturier，P.，Wisniewski，T.，Prelli，F(xiàn).，Kascsak，R.，Mendez，E.，Harris，D.A.，Ironside，J.，Tagliavini，F(xiàn).，Carp，R.I.和Frangione，B.(2000)Reversion of prionproteinconformational changes by syntheticp-sheet breaker peptides.Lancet，355，192-197)。該肽在完整的細胞中也具有活性并且在患瘙癢病的實驗小鼠中延緩臨床癥狀的出現(xiàn)。
另一個已提出用于TSE治療的方法是基于可溶性PrP衍生物洐的設(shè)計，它結(jié)合到PrPSc上，但不能通過一種模板輔助機制進行轉(zhuǎn)變并且因此失活結(jié)合的PrPSc分子。Bürkel及其合作者顯示小鼠PrP氨基酸114-121的存在在PrPC向PrPSc的轉(zhuǎn)變中扮演著重要角色，并且缺少這些殘基的缺失突變在細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)為PrPSc聚集的顯性失活突變(Hlscher，C.，Delius，H.and Burke，A.(1998)Overexpression of nonconvertible PrPCD114-121 in scrapie-infected mouseneuroblastoma cells leads to trans-dominant inhibition of wild-type PrPScaccumulation.J Virol，72，1153-1159)。因而顯性失活抑制能夠作為治療或預(yù)防朊病毒疾病的基礎(chǔ)。最近，Aguzzi及其合作者構(gòu)建了一種可溶性的二聚朊病毒蛋白質(zhì)，它在體內(nèi)結(jié)合PrPSc并抗朊病毒疾病(Meier，P.，Genoud，N.，Prinz，M.，Maissen，M.，Rulicke，T.，Zurbriggen，A.，Raeber，A.J.和Aguzzi，A.(2003)Solubledi-meric prion protein binds PrPScin vivo and antagonizes prion disease.Cell，113，49-60)?？扇苄缘亩跴rP由融合于人IgG1的Fcγ-尾部的全長鼠PrP所組成。在用朊病毒大腦內(nèi)和腹膜內(nèi)接種后，在Prnp+/+小鼠中這種可溶性蛋白質(zhì)的亞化學(xué)計量(substochiometric)的量明顯延緩了疾病的發(fā)作。這些研究提供了可溶性的PrP融合蛋白質(zhì)可以用作朊病毒疾病的治療的證據(jù)。
結(jié)合hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)資料暗示PrP的二硫變體也可以作為用于朊病毒疾病的顯性失活治療劑。PrP變異體的天然三維結(jié)構(gòu)使得這些變體可能與野生型PrPC具有對于PrPSc的相似的親和性。PrPC的PrPSc結(jié)合位點未知，但由遺傳實驗(Telling等，1994；1995)的證據(jù)即螺旋α1(在人PrP中殘基144-154)和前面的環(huán)區(qū)(在人PrP中殘基132-143)參與PrPSc的結(jié)合所證實。在將一個在螺旋α3和環(huán)之間的額外的二硫鍵引入后，該環(huán)連接螺旋α2及第二個β鏈，該區(qū)域結(jié)構(gòu)未改變(圖4)。在用于朊病毒增殖的“模板輔助”PrP模型內(nèi)容中(Prusiner，1998)，蛋白變體增加的[D]1/2值(圖7)和解鏈溫度(圖9)表明需要更多數(shù)量的自由能用于將PrPSc結(jié)合的PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)槟苷郫B成PrPSc的構(gòu)象。因而，在蛋白變體中的額外二硫鍵應(yīng)獨自降低朊病毒增殖的效率并且因此延緩朊病毒疾病的進展。內(nèi)含體中在pH4.7-5.8下，(Lee，R.J.，Wang，S.和Low，P.S.(1996)Measurement of endosome pH following folatereceptor-mediated endocytosis.Biochim Biophys Acta，1312，237-242)防止向致病蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的保護作用可能更加明顯，因為蛋白變體的α螺旋二級結(jié)構(gòu)耐抗向β折疊二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變(圖8B和8C)。因而，在內(nèi)含體和溶酶體的環(huán)境中PrPSc可能陷入一種具有結(jié)合PrPC二硫化物變體的復(fù)合物中。
研究是否該機制可以在細胞培養(yǎng)和動物實驗過程中得以證實將是令人感興趣的，在細胞培養(yǎng)和動物實驗中將重組的二硫化物變體朊病毒蛋白質(zhì)進行大腦內(nèi)或腹膜內(nèi)接種或利用一種基因治療方法進行體內(nèi)表達。如果成功，向PrPC內(nèi)引入穩(wěn)定的二硫鍵可能會用于治療多種神經(jīng)變性疾病。
材料和方法1.樣品的制備和特征描述對于未標記形式的和具有均一的13C，5N標記的雙二硫化hPrP(121-230)突變體的克隆、表達和純化，我們基本按照制備野生型hPrP(Zahn等，1997，2000)的方法進行，其中雙殘基交換按照Quickchange定點誘變方案(Stratagene)進行構(gòu)建。使用Ultrafree-15離心過濾Biomax設(shè)備(Millipore)獲得用于NMR譜分析的含有1mM蛋白質(zhì)的10mM pH4.5[d4]醋酸鈉、90％H2O/10％D2O溶液。
2.NMR測量和結(jié)構(gòu)計算
用裝備有四射頻通道以及帶有防護的Z-梯度線圈的三重共振探頭的BrukerDRX500、DRX600和DRX750波譜儀來進行NMR測量。為了收集構(gòu)象約束，三維結(jié)合的15N/13C解析的[1H，1H]NOESY波譜(Boelens，R.，Burgering，M.，F(xiàn)ogh，R.H.和Kaptein，R.(1994)Time-saving methods for heteronuclear multidimensionalNMR of(13C，15N)doubly labeledproteins.J.Biomol.NMR 4，201-213)在水中被記錄，具有在T＝20℃時的混合時間Tm＝40ms，256(t1)×50(t2)×1024(t3)的復(fù)合點，t1，max(1H)＝28.4ms，t2，max(15N)＝20.6ms，t2，max(13C)＝8.3ms，以及t3，max(1H)＝97.5ms，，并且這一數(shù)據(jù)系列從0一直收集到512×128×2048點。使用程序PROSA來進行波譜歸屬(Güntert，P.，Dtsch，V.Wider，G.和Wüthrich，K.(1992)Processing of multidimensional NMR data with the new softwarePROSA.J.BIOMOL，NMR 2，619-629)。相對于2，2-二甲基-2-silapentane-5-磺酸，鈉鹽，1H，15N和13C的化學(xué)位移已被校準。
按照Farow等(Farrow，N.A.，Zhang，O.，F(xiàn)orman-Kay，J.D.and Kay，L.E.(1994)Aheteronuclear correlation experiment for simultaneous determination of 15Nlongitudinal decay and chemical exchange rates of systems inslow equilibrium.J.Biomol.NMR 4，727-734)的方法對穩(wěn)態(tài)15N{1H}-NOEs于600MHZ下進行測量，通過進行20ms間隔的120度脈沖級聯(lián)以使用5秒的質(zhì)子飽和期，t1，max(15N)＝61.0ms，t2，max(1H)＝142.6ms，時域數(shù)據(jù)大小為152×1024復(fù)合點。
使用程序CANDID(Herrmann等，2002)結(jié)合結(jié)構(gòu)計算程序DYANA(Güntert等，1997)獲得NOE歸屬。CANDID和DYANA自動執(zhí)行NOE歸屬和NOE強度的距離校準、共價固定距離約束的去除、以扭角動力學(xué)進行的結(jié)構(gòu)計算以及自動的NOE上限距離約束偏差分析。作為CANDID的輸入數(shù)據(jù)，前述NOESY波譜的峰列表由程序XEASY所得到的重復(fù)峰(Bartels，C.，Xia，T.H.，Billeter，M.，Guntert，P.andWüthrich，K.(1995)The program XEASY for computer-supportedNMR spectral analysis of biologicalmacromolecules.J.Biomol.NMR 6，1-10)和用程序SPSCAN進行的峰體積的自動積分(Ralf Glaser，個人通訊)而產(chǎn)生。用CANDID和DYANA進行的運算的輸入數(shù)據(jù)包含這些峰列表、來自于以前序列特異性共振歸屬的化學(xué)位移列表和來自于13Ca轉(zhuǎn)變的主鏈角Φ和Ψ的二面角約束(Luginbühl等，1995)。按照7個循環(huán)的迭代NOE歸屬的標準方法和結(jié)構(gòu)計算來進行計算(Herrmann等，2002)。在最初的六次CANDID循環(huán)中，采用模糊距離約束。對于最終的結(jié)構(gòu)計算而言，只有NOE距離約束得以保留，它在運算的第六個循環(huán)后相應(yīng)于具有清楚歸屬的NOE交叉峰。通過比較上限距離約束與得自第六次CANDID循環(huán)的結(jié)構(gòu)，對立體特異性歸屬進行鑒定。使用AMBER力場(Cornell，W.D.，Cieplak，P.，Bayly，C.I.，Gould，I.R.，Merz，K.M.，Jr.，F(xiàn)erguson，D.M.，Spell meyer，D.C.，F(xiàn)ox，T.，Caldwell，J.W.和KoIIman，P.A.(1995)A second generation force field for the simulation of proteins，nucleic acids，andor-ganicmolecules.J.Am.Chem.Soc.117，5179-5197)，將具有最低的終極DYANA靶功能值的20個構(gòu)象異構(gòu)體用程序OPALp在水框架內(nèi)進行能量最小化(Luginbuhl，P.，Guntert，P.，Billeter，M.和Wuthrich，K.(1996)The new programOPAL for molecular dynamics simulations and energy refinements ofbiologicalmacromolecules.J.Biomol.NMR 8，136-146)。利用程序MOLMOL(Koradi，R.，Billeter，M.和Wuthrich，K.(1996)MOLMOLA program for display and analysisofmacromolecular structures.J.Molec.Graphics 14，51-55)來分析得到的20種能量最小化的構(gòu)象異構(gòu)體(表I和II)并且制備結(jié)構(gòu)圖。
3.CD測量和平衡態(tài)實驗用帶有1mm或者0.2mm徑長比色杯的與Peltier型溫度控制單元接口的Jasco J720旋光分光計記錄圓二色性光譜。222nm處的橢圓率用來監(jiān)測GdmCl誘導(dǎo)的解折疊，變性曲線與二態(tài)模型擬合，假定解折疊的自由能ΔG線性依賴于溶液中的變性劑濃度[D](Bolen，D.W.和Santoro，M.M.(1988)Unfoldingfree-energy changes determined by the linear extrapolation method.2.Incorporation ofdelta G degrees N-U values in a thermodynamic cycle.Biochemistry-Us，27，8069-8074；Santoro，M.M.and Bolen，D.W.(1988)Unfolding free-energy changesdetermined by the linear extrapolation method.1.Unfolding of phenylmethanesulfonylalpha-chymotrypsin using different denaturants.Biochemistry-Us，27，8063-8068)ΔG＝ΔG0+m[D]，其中m表示解折疊的協(xié)同效應(yīng)而ΔG0為在不存在變性劑情況下的ΔG。通過將轉(zhuǎn)變前和轉(zhuǎn)變后的基線外推入轉(zhuǎn)變區(qū)而獲得在轉(zhuǎn)變區(qū)的平衡常數(shù)的賦值。二態(tài)模型用于擬合這些數(shù)據(jù)，即假定如下相關(guān)的觀察到的信號SobsSobs＝((SN+mN[D])exp(-(ΔG+m[D])/RT+SD+mD[D])/(1+exp(-(ΔG+m[D])/RT))，其中SN和SD以及mN和mD分別為轉(zhuǎn)變前和轉(zhuǎn)變后階段的截距和斜率，T為開氏絕對溫度而R為氣體常數(shù)。因而，在轉(zhuǎn)變的中間點[D1/2]，指數(shù)形式的自變量一定為零[D]1/2＝Δ0/m。
進行熱變性實驗，于222nm處監(jiān)測圓二色性，同時以每小時50℃變化的恒速從10℃到90℃改變溫度。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)突變體，所述蛋白質(zhì)在進行了構(gòu)象轉(zhuǎn)變以后引發(fā)一種疾病，所述疾病包括a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森病的神經(jīng)變性疾?。缓?或其它b)包括原發(fā)性系統(tǒng)淀粉樣變性、II型糖尿病和動脈淀粉樣變性的構(gòu)象?。黄渲械鞍踪|(zhì)突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，所述二硫鍵在人和動物中抑制這種蛋白質(zhì)的一種構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中所述的至少一個額外的二硫鍵的改造是在位于與結(jié)構(gòu)上相關(guān)的非致病蛋白質(zhì)中二硫鍵相似的位置上進行的。
3.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)為一種朊病毒蛋白質(zhì)，所述的至少一個改造的額外二硫鍵位于球狀結(jié)構(gòu)域中。
4.權(quán)利要求3的朊病毒蛋白質(zhì)，其中所述的至少一個改造的額外二硫鍵位于與doppel蛋白質(zhì)(Dpl)中相似的位置上。
5.權(quán)利要求3的朊病毒蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含一種“因子X”結(jié)合表位并且所述的至少一個改造的額外二硫鍵位于這種“因子X”結(jié)合表位內(nèi)。
6.權(quán)利要求3的朊病毒蛋白質(zhì)，其中將所述的至少一個改造的額外二硫鍵引入到人朊病毒蛋白質(zhì)中包含氨基酸殘基165-175的第一節(jié)段和包含C端氨基酸殘基215-230的第二節(jié)段之間，或在其它物種中結(jié)構(gòu)上相應(yīng)的氨基酸節(jié)段之間。
7.權(quán)利要求6的朊病毒蛋白質(zhì)，其中所述的至少一個改造的額外二硫鍵連接氨基酸殘基M166C和E221C或連接氨基酸殘基M166C和Y225C。
8.編碼一種蛋白質(zhì)突變體的核酸序列，所述蛋白質(zhì)在進行了構(gòu)象轉(zhuǎn)變以后引發(fā)一種疾病，所述疾病包括a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森病的神經(jīng)變性疾病；和/或其它b)包括原發(fā)性系統(tǒng)淀粉樣變性、II型糖尿病和動脈淀粉樣變性的構(gòu)象??；其中該核酸序列編碼蛋白質(zhì)突變體或其變體，該蛋白質(zhì)突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，所述二硫鍵在人和動物中抑制這種蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
9.包含根據(jù)權(quán)利要求8的核酸序列的和/或由根據(jù)權(quán)利要求8的核酸序列編碼的質(zhì)粒構(gòu)建體、載體、轉(zhuǎn)化的細胞、包括牛、羊、貓、駝鹿和鹿的轉(zhuǎn)基因動物，以及重組蛋白質(zhì)。
10.一種蛋白質(zhì)突變體的應(yīng)用，該蛋白質(zhì)在進行了構(gòu)象轉(zhuǎn)變以后引發(fā)一種疾病，所述疾病包括a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森病的神經(jīng)變性疾??；和/或其它b)包括原發(fā)性系統(tǒng)淀粉樣變性、II型糖尿病和動脈淀粉樣變性的構(gòu)象??；其中蛋白質(zhì)突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，它在人和/或動物中抑制這種蛋白質(zhì)的一種構(gòu)象轉(zhuǎn)變，其中所述蛋白質(zhì)突變體被用于構(gòu)象病的治療性處理。
11.一種蛋白質(zhì)突變體應(yīng)用，該蛋白質(zhì)在進行了構(gòu)象轉(zhuǎn)變以后引發(fā)一種疾病，所述疾病包括a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森病的神經(jīng)變性疾?。缓?或其它b)包括原發(fā)性系統(tǒng)淀粉樣變性、II型糖尿病和動脈淀粉樣變性的構(gòu)象??；其中蛋白質(zhì)突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，它在人和/或動物中抑制這種蛋白質(zhì)的一種構(gòu)象轉(zhuǎn)變，其中所述蛋白質(zhì)突變體被用于制備治療性處理構(gòu)象病的藥物。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中所述改造的額外二硫鍵阻止突變的PrPC向PrPSc的構(gòu)象轉(zhuǎn)變并因此通過顯性失活抑制作用阻抑了在共存的野生型蛋白質(zhì)中PrPC向PrPSc的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中通過突變的PrPC結(jié)合到野生型PrPC上抑制所述野生型PrPC向PrPSc寡聚體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
14.根據(jù)權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中通過突變的PrPC結(jié)合到野生型PrPSc寡聚體上抑制所述野生型PrPSc寡聚體向PrPSc淀粉樣蛋白原纖維的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
15.根據(jù)權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中通過突變的PrPC結(jié)合到野生型PrPSc上抑制所述野生型PrPC向PrPC/PrPSc異源二聚體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
16.根據(jù)權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中通過突變的PrPC結(jié)合到野生型PrPSc淀粉樣蛋白原纖維上抑制淀粉樣蛋白原纖維的延伸或淀粉樣蛋白原纖維分解成PrPSc寡聚體。
17.根據(jù)權(quán)利要求8，9，10或11的應(yīng)用，其中在體內(nèi)產(chǎn)生朊病毒蛋白質(zhì)的二硫突變體或其變體以便能夠在人類中進行傳播性海綿狀腦病(TSE)的預(yù)期治療，例如通過以慢病毒載體進行的體細胞基因治療，其中TSE包括自發(fā)性的、遺傳的、醫(yī)源性的以及不同形式的克-雅病(CJD)，致命性家族性失眠癥(FEI)和Gerstmann-Strussler-Scheinker綜合征(GSS)。
18.根據(jù)權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中進行朊病毒蛋白質(zhì)的二硫突變體或其變體的重組生產(chǎn)以便能夠在人類中進行TSE的預(yù)期治療，例如通過重組蛋白質(zhì)的直接應(yīng)用，其中TSE包括自發(fā)性的、遺傳的、醫(yī)源性的以及不同形式的CJD、FFI和GSS。
19.根據(jù)權(quán)利要求8，9，10，或11的應(yīng)用，其中在體內(nèi)產(chǎn)生朊病毒蛋白質(zhì)的二硫突變體或其變體以便能夠在動物中進行TSE的預(yù)期治療，例如通過使用慢病毒載體體細胞基因治療，其中TSE包括牛海綿狀腦病(BSE)、羊瘙癢病、貓海綿狀腦病(FSE)以及在駝鹿和鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)。
20.根據(jù)權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中進行朊病毒蛋白質(zhì)的二硫突變體或其變體的重組生產(chǎn)以便能夠在動物中進行TSE的預(yù)期治療，例如通過重組蛋白質(zhì)的直接應(yīng)用，其中TSE包括BSE、羊瘙癢病、FSE以及CWD。
21.根據(jù)權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中進行朊病毒蛋白質(zhì)的二硫突變體或其變體的重組生產(chǎn)作為應(yīng)用于人或動物的TSE檢測的“PrPC抗轉(zhuǎn)變標準”，其中重組的PrPC由來自病理組織或體液如血液和尿液的PrPSc而擴增。
22.根據(jù)權(quán)利要求10或11的應(yīng)用，其中在體內(nèi)產(chǎn)生朊病毒蛋白質(zhì)的二硫突變體或其變體以便能夠通過用慢病毒載體的體細胞基因治療進行TSE抗性動物的育種，其中動物包括牛、羊、貓、駝鹿、鹿、豬、馬和魚。
23.治療人類中的a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森病的神經(jīng)變性疾?。缓?或其它b)包括原發(fā)性系統(tǒng)淀粉樣變性、II型糖尿病和動脈淀粉樣變性的構(gòu)象病的藥物，所述藥物包含一種蛋白質(zhì)突變體或其變體，該蛋白質(zhì)突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，所述二硫鍵抑制這種蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
24.治療牛海綿狀腦病、羊瘙癢病、貓海綿狀腦病以及在駝鹿和鹿中的慢性消耗性疾病的藥物，所述藥物包含一種蛋白質(zhì)突變體或其變體，該蛋白質(zhì)突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，所述二硫鍵抑制這種蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種朊病毒蛋白質(zhì)(PrP)突變體，它的球狀結(jié)構(gòu)域在與人doppel蛋白質(zhì)(hDpl)相似的位置包含一個改造的另一個二硫鍵。在一個實施方案中，朊病毒蛋白質(zhì)在假定的“因子X”結(jié)合抗原表位具有一個改造的額外二硫鍵，并適應(yīng)輕微的、嚴格局限的構(gòu)象變化以抑制在人和動物中朊病毒的增殖。還公開了朊病毒蛋白質(zhì)(PrP)突變體或其片段的用途，即在治療性處理或制備治療性處理蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變后引發(fā)的疾病的藥物中的用途，例如在人類中的傳播性海綿狀腦病(TSE)、不同形式的克－雅病(CJD)、致命性家族性失眠癥(FFI)和Gerstmann－Strussler－Scheinker綜合征(GSS)，所述PrP的球狀結(jié)構(gòu)域在與人doppel蛋白質(zhì)相似的位置包含至少一個改造的額外二硫鍵。另外，還公開了使用PrP蛋白質(zhì)突變體在體內(nèi)產(chǎn)生朊病毒蛋白質(zhì)或其片段的二硫突變體的應(yīng)用，以便能夠在動物中進行TSE的預(yù)期治療，例如通過使用慢病毒載體的體細胞基因治療，其中TSE包括牛海綿狀腦病(BSE)、羊瘙癢病、貓海綿狀腦病(FSE)以及在駝鹿和鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)。
文檔編號C12Q1/00GK1665837SQ03816220
公開日2005年9月7日 申請日期2003年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月11日
發(fā)明者R·扎恩 申請人:瑞士聯(lián)邦蘇黎世技術(shù)大學(xué)