專利名稱：淀粉制品在利用發(fā)酵的生物生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，它描述了含有能表達(dá)酶的基因的微生物宿主，所述酶能有效地將淀粉制品轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
發(fā)酵是將可再生的原料生物催化地轉(zhuǎn)化成理想產(chǎn)物的重要技術(shù)。碳水化合物是發(fā)酵工業(yè)的傳統(tǒng)原料。經(jīng)常見(jiàn)到的情況是，用作底物的碳水化合物在生產(chǎn)成本中的比重比任何其它的單一組分都大。根據(jù)具體的工藝，25～70％的總發(fā)酵成本可以歸因于碳水化合物源(Crueger和Crueger，BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology，Sinauer AssociatesSunderland，MA.，第124-174頁(yè)(1990)；Atkinson和Mavituna，Biochemical Engineering andBiotechnology Handbook，第2版；Stockton PressNew York，第243-364頁(yè)(1991))。出于這樣的經(jīng)濟(jì)原因，很少用高純化的葡萄糖或蔗糖作為底物。
淀粉(碳水化合物)是兩種不同多糖的混合物，每一種多糖由連接的重復(fù)單糖(葡萄糖)單元的鏈組成。該混合物由兩種分離的多糖組成，即直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉是線性多糖，含有專有地通過(guò)α(1，4)糖苷鍵連接的葡萄糖單元。支鏈淀粉中的葡萄糖單元也是通過(guò)α(1，4)糖苷鍵連接，另外還通過(guò)α(1，6)糖苷鍵連接，每30個(gè)葡萄糖殘基約有一個(gè)。淀粉中的支鏈淀粉與直鏈淀粉的比例根據(jù)植物物種的不同而變化，但是其范圍通常是3-4至1(Kainuma，Starch第125-150頁(yè)；Whistler，Bemiller和Pashcall編，Academic Press，Orlando，F(xiàn)L(1984))。
商業(yè)淀粉主要是通過(guò)濕磨法生產(chǎn)的。但是，濕磨的終產(chǎn)物包括非常少的未加工的淀粉。到目前為止，生產(chǎn)的大多數(shù)產(chǎn)品是完全加工的淀粉(單糖，包括葡萄糖)或源自淀粉的更小的降解產(chǎn)物的形式。一般地，用淀粉酶將淀粉分解成更小的鏈(Blanchard，Technology of Cornwet Milling(1992)，Elseiver，Amsterdam，荷蘭，第174-215頁(yè))。存在各種商業(yè)化的α-淀粉酶源，但是，無(wú)論酶源如何，反應(yīng)產(chǎn)物關(guān)于大小和鍵合類型通常是相同的。已知淀粉的淀粉酶消化產(chǎn)物是極限糊精，其包含含有2-10個(gè)葡萄糖單元(寡糖)的小淀粉鏈。因?yàn)榈矸勖覆荒芩庵ф湹矸壑械摩?1，6)糖苷鍵，所以極限糊精含有α(1，4)-和α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖?；蛘?，可以通過(guò)非酶法(例如，通過(guò)酸水解)處理粗淀粉，生產(chǎn)基本上類似于極限糊精的淀粉制品。
在濕磨工業(yè)中，極限糊精被進(jìn)一步加工成葡萄糖，其用作發(fā)酵的碳源，以生產(chǎn)各種化學(xué)制劑、商業(yè)酶或抗生素。當(dāng)流行的生物催化劑大腸桿菌(Escherichia coli)用在發(fā)酵工藝中時(shí)，相對(duì)較純的葡萄糖是優(yōu)選的碳水化合物源。這是因?yàn)?，大腸桿菌不能利用極限糊精組分(即，潘糖、異麥芽糖和鏈長(zhǎng)超過(guò)約10個(gè)α(1，4)-連接的葡萄糖單元的高分子量的寡糖)，它們通常包含在備用的廉價(jià)發(fā)酵培養(yǎng)基中(Lin，Escherichia coli and Salmonella typhimuium，第245-265頁(yè)，Neidhardt，編；American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1987))。含有α(1，6)-鍵的葡萄糖寡聚體不能運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中，當(dāng)胞外地供給該材料時(shí)，大腸桿菌不能生成能降解它的酶(Palmer等，Eur.J.Biochem.39601-612(1973))。
能從適合于大腸桿菌使用的淀粉生產(chǎn)出相對(duì)較純的葡萄糖，這需要許多工藝步驟和其它的酶，它們顯著地增加了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。
因而，要解決的問(wèn)題是，缺少一種能在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)工藝中利用廉價(jià)的淀粉制品的方法。如果能更徹底地發(fā)酵廉價(jià)的、部分地降解的淀粉，將會(huì)降低通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。
發(fā)明概述申請(qǐng)人已經(jīng)提供了一種分離的編碼α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖水解酶的選自下述的核酸分子(a)分離的核酸分子，其編碼選自SEQ IDNO2、4和6的氨基酸序列；(b)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(a)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，以及用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1X SSC，0.1％SDS洗滌；和(c)核酸分子，其與(a)或(b)互補(bǔ)。
申請(qǐng)人已經(jīng)提供了核酸組合物，其包含信號(hào)肽和α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖水解酶的編碼區(qū)，所以能表達(dá)指導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)外的(胞外的)水解活性的嵌合蛋白。分離的核酸分子可以編碼如SEQ ID NO24或SEQID NO25所述信號(hào)肽。信號(hào)序列的核酸序列是SEQ ID NO26或SEQID NO27。分離的核酸分子可以編碼如SEQ ID NO2、4、6、17或31所述能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽。
申請(qǐng)人已經(jīng)提供了重組生物，其包含α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖水解酶，它能利用外源地添加的α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖(例如，異麥芽糖和潘糖)，以發(fā)酵生產(chǎn)有用產(chǎn)物。能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽可以選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO17或SEQ ID NO31。本發(fā)明還包括SEQ ID NO1、3、5、16或30所述核酸分子編碼的能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽。本發(fā)明還包括選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO28、SEQ ID NO32、SEQ IDNO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40或SEQ IDNO42的分離的核酸分子。本發(fā)明還包括多肽SEQ ID NO4、SEQ IDNO29、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ IDNO39、SEQ ID NO41和SEQ ID NO43。
本發(fā)明還包括嵌合基因，其包含可操作地連接到合適的調(diào)控序列的本文所述分離的核酸分子。合適的調(diào)控序列選自 CYC1，HIS3，GAL1，GAL10，ADH1，PGK，PHO5，GAPDH，ADC1，TRP1，URA3，LEU2，ENO，TPI，AOX1，lac，ara，tet，trp，IPL，IPR，T7，tac，trc，apr，npr，nos和GI。本發(fā)明包括轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中嵌合基因整合在染色體中或是質(zhì)粒-攜帶的。
申請(qǐng)人還已經(jīng)提供了一種降解極限糊精的方法，其包括(a)使轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在合適的生長(zhǎng)條件下接觸有效量的極限糊精底物，所述宿主細(xì)胞包含(i)核酸分子，其編碼選自SEQ ID NO2、6、17和31的酶；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1X SSC，0.1％SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)；和
(b)任選地回收步驟(a)的產(chǎn)物。
本發(fā)明還包括一種在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)靶分子的方法，其包括在存在極限糊精、在合適的條件下使轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞與用于將單糖轉(zhuǎn)化成靶分子的嵌合基因接觸，所述宿主細(xì)胞包含(i)分離的核酸分子，其編碼由連接到能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽的信號(hào)肽組成的嵌合蛋白；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1XSSC，0.1％SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)，由此生成靶分子；和任選地回收生成的靶分子。信號(hào)肽可以選自SEQ ID NO24或SEQ ID NO25。能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽可以選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO17或SEQ ID NO31。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以選自細(xì)菌、酵母或絲狀真菌。本發(fā)明包括從極限糊精生產(chǎn)1，3丙二醇、甘油和細(xì)胞因(Cell Mass)本發(fā)明還包括多肽，當(dāng)在BLASTP比對(duì)方法的基礎(chǔ)上與具有SEQ IDNO17所述序列的多肽(具有α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖水解活性的多肽)相比較時(shí)，其氨基酸序列具有至少69％的相同性。
附圖簡(jiǎn)述，生物保藏和序列說(shuō)明

圖1a至1d顯示了大腸桿菌菌株DH5α的結(jié)果，該菌株含有質(zhì)粒pUC18(圖1a)(陰性對(duì)照)和含有來(lái)自克隆j20(圖1b)、k1(圖1c)或h12(圖1d)的成熟編碼序列的pUC18。從超聲處理的細(xì)胞分離出總蛋白提取物，與潘糖(250μg/ml)在37℃溫育2小時(shí)。顯示了消化后的產(chǎn)物的高效陰離子交換層析譜。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約中關(guān)于用于專利程序的微生物保藏的國(guó)際認(rèn)可的條款，申請(qǐng)人在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC)10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209進(jìn)行了下述生物保藏保藏人鑒別參考國(guó)際保藏編碼保藏日期大腸桿菌RJ8n ATCC PTA-4216 2002年4月9日列出的保藏物將在指定的國(guó)際保藏單位保藏至少30年，并且在公開(kāi)它的專利授權(quán)后可以由公眾獲得。該保藏物的可獲得性并不構(gòu)成對(duì)實(shí)施主題發(fā)明的許可，所述實(shí)施會(huì)損害通過(guò)政府行為授予的專利權(quán)。
申請(qǐng)人提供了含有43個(gè)序列的序列表。這些序列能滿足37 C.F.R.1.821-1.825(“對(duì)含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公開(kāi)內(nèi)容的專利申請(qǐng)的要求——序列規(guī)則”)，并且與世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)和EPO和PCT(細(xì)則5.2和49.5(a-bis)和管理規(guī)程208部分和附件C)以及相應(yīng)的美國(guó)專利商標(biāo)局細(xì)則37 C.F.R.§1.822所述的序列表要求相一致。

SEQ ID NO1-6是從短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)ATCC15700得到的3種基因/基因產(chǎn)物的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO7-15和18-23是用于PCR的引物。
SEQ ID NO16-17是公開(kāi)數(shù)據(jù)文庫(kù)中公開(kāi)的變異鏈球菌(Streptococcus mutans)(ATCC 25175D)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO24是來(lái)自短雙岐桿菌基因mbc2g.pk018.j20(也包含在SEQ ID NO3中)的天然信號(hào)肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO25是用于靶向由短雙岐桿菌mbc1g.pk026.k1和變異鏈球菌dexB基因編碼的酶的非天然的信號(hào)肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO26是短雙岐桿菌基因mbc2g.pk018.J20信號(hào)肽的核酸序列。
SEQ ID NO27是枯草芽孢芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中性蛋白酶基因信號(hào)肽的核酸序列。
SEQ ID NO28是短雙岐桿菌基因mbc2g.pk018.j20信號(hào)肽的核酸序列，其連接到短雙岐桿菌mbc2g.pk018.h12基因的編碼序列。
SEQ ID NO29是短雙岐桿菌基因mbc2g.pk018.j20信號(hào)肽的氨基酸序列，其連接到短雙岐桿菌mbc2g.pk018.h12基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO30是沒(méi)有其天然信號(hào)肽序列的短雙岐桿菌基因mbc2g.pk018.j20的核酸序列。
SEQ ID NO31是沒(méi)有其天然信號(hào)肽序列的短雙岐桿菌基因mbc2g.pk018.j20的氨基酸序列。
SEQ ID NO32是短雙岐桿菌基因mbc2g.pk018.j20信號(hào)肽的核酸序列，其連接到短雙岐桿菌mbc2g.pk018.k1基因的編碼序列。
SEQ ID NO33是短雙岐桿菌基因mbc2g.pk018.j20信號(hào)肽的氨基酸序列，其連接到短雙岐桿菌mbc2g.pk018.k1基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO34是短雙岐桿菌基因mbc2g.pk018.j20信號(hào)肽的核酸序列，其連接到變異鏈球菌dexB基因的編碼序列。
SEQ ID NO35是短雙岐桿菌基因mbc2g.pk018.j20信號(hào)肽的氨基酸序列，其連接到變異鏈球菌dexB基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO36是枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因信號(hào)肽的核酸序列，其連接到短雙岐桿菌mbc2g.pk018.h12基因的編碼序列。
SEQ ID NO37是枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因信號(hào)肽的氨基酸序列，其連接到短雙岐桿菌mbc2g.pk018.h12基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO38是枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因信號(hào)肽的核酸序列，其連接到短雙岐桿菌mbc2g.pk018.j20基因的編碼序列。
SEQ ID NO39是枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因信號(hào)肽的氨基酸序列，其連接到短雙岐桿菌mbc2g.pk018.j20基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO40是枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因信號(hào)肽的核酸序列，其連接到短雙岐桿菌mbc2g.pk018.k1基因的編碼序列。
SEQ ID NO41是枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因信號(hào)肽的氨基酸序列，其連接到短雙岐桿菌mbc2g.pk018.k1基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO42是枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因信號(hào)肽的核酸序列，其連接到變異鏈球菌dexB基因的編碼序列。
SEQ ID NO43是枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因信號(hào)肽的氨基酸序列，其連接到變異鏈球菌dexB基因的氨基酸序列。
發(fā)明詳述申請(qǐng)人已經(jīng)解決了所述問(wèn)題。本發(fā)明提供了幾種酶，當(dāng)在生產(chǎn)宿主中表達(dá)時(shí)，它們能使宿主利用α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖，該寡糖是廉價(jià)的淀粉制品組分。本發(fā)明還提供了信號(hào)序列，它能使α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖水解酶靶向胞外。
可以得到廉價(jià)的淀粉制品，例如通過(guò)市場(chǎng)上可買(mǎi)到的淀粉酶對(duì)粗淀粉和其它含有α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的原料的作用，該作用會(huì)生成極限糊精。廉價(jià)淀粉制品的有效利用需要對(duì)宿主生物(例如大腸桿菌)進(jìn)行基因工程處理，從而使該重組生物生產(chǎn)能降解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的酶。能降解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的酶是已知的(Vihinen和Mantsala Crit.Rev.in Biochem.Mol.Biol.4329-427(1989))。而且，已知能降解這些鍵的酶以其天然狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)地(在細(xì)胞質(zhì)內(nèi))和胞外地(在細(xì)胞質(zhì)外)存在。
當(dāng)宿主生物缺少運(yùn)輸系統(tǒng)時(shí)，通過(guò)添加天然的或非天然的信號(hào)肽，可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)酶進(jìn)行工程處理以使其可接近極限糊精(或其它含有α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的原料)。信號(hào)肽使能降解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的蛋白被導(dǎo)向到胞外位置(細(xì)胞質(zhì)外)，并接近沒(méi)有攝入到細(xì)胞中的底物(Nagarajan等，Gene 114121-126(1992))。能將蛋白穿過(guò)細(xì)胞膜移位的信號(hào)肽的實(shí)例包括但不限于SEQ ID NO24和25。含有信號(hào)肽的蛋白指向分泌途徑，然后穿過(guò)細(xì)胞膜移位。蛋白分泌的普通機(jī)制在所有革蘭氏陰性的和革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌都是保守的(Simonen和Palva(1993)Microbiol.Rev.57109-137；Fekkes和Driessen(1999)Microbiol.Rev.63161-173)。所有細(xì)菌的信號(hào)肽都包含13～20個(gè)疏水氨基酸串(Bae和Schneewind，J.Bacteriol.，1852910-2919(2003))。
天然的大腸桿菌不能水解α(1，6)-糖苷鍵，因而在發(fā)酵中不能利用含有(1，6)-鍵的化合物。(1，6)-鍵能被“異淀粉酶”和“葡糖苷酶”所水解(異麥芽糖和潘糖是(1，6)-連接的寡糖的模型化合物)。含有非天然的胞外“異淀粉酶”或“葡糖苷酶”的重組大腸桿菌能在發(fā)酵中利用含有(1，6)-鍵的化合物(例如，異麥芽糖和潘糖)來(lái)生產(chǎn)有用的產(chǎn)物。而且，含有非天然的胞外“異淀粉酶”或“葡糖苷酶”的任何重組生物都能更有效地利用含有(1，6)-鍵的化合物。提高的使用效率將會(huì)貫穿重組的“異淀粉酶”或“葡糖苷酶”基因的組成型表達(dá)或改變的定時(shí)。重組基因的表達(dá)也會(huì)提高活性水平，使其超過(guò)可能存在的任何內(nèi)源“異淀粉酶”或“葡糖苷酶”基因的水平，從而提高對(duì)(1，6)-連接的底物的利用。
本發(fā)明可以用于生產(chǎn)各種生物發(fā)酵產(chǎn)物，包括但不限于有機(jī)酸、抗生素、氨基酸、酶、維生素、醇(例如生物醇(bioethanol))和細(xì)胞物質(zhì)(cell mass)。通過(guò)使用信號(hào)肽，用極限糊精作為宿主微生物的碳源來(lái)生物生產(chǎn)甘油、1，3-丙二醇和細(xì)胞物質(zhì)，這是本發(fā)明的示例。
多元醇1，3-丙二醇是對(duì)生產(chǎn)聚酯纖維和生產(chǎn)聚氨基甲酸酯和環(huán)狀化合物有用的單體。通過(guò)單一生物從碳底物(例如葡萄糖或其它糖)生物生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法已經(jīng)描述在美國(guó)專利號(hào)5,686,276中，它在這里引作參考。
淀粉是葡萄糖的同多糖。它在高等植物中合成為含有兩種組分的顆粒，即直鏈淀粉和支鏈淀粉(Vihinen和Mantsala，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，24329-418(1989))。直鏈淀粉是通過(guò)α(1，4)-連接的葡萄糖殘基形成的基本上線性的多糖，占顆粒的15-25％(含量根據(jù)植物物種不同而異)。相反地，支鏈淀粉是高度分支的，約4～5％的糖苷鍵是α(1，6)-連接的葡萄糖殘基。已經(jīng)深入地研究了能降解淀粉的淀粉分解酶。高等植物物種中的淀粉代謝是通過(guò)首先將聚合物降解成單個(gè)的葡萄糖殘基，這需要幾種淀粉分解酶的相互作用。
淀粉分解酶在單獨(dú)作用時(shí)，通常僅能將淀粉部分地降解為更小的直鏈或支鏈?？梢杂玫矸鄯纸饷傅慕M合或者與酸處理一起的酶組合來(lái)提高淀粉的解聚。
酶和酶組合可以將淀粉部分地降解成更小的直鏈或支鏈，或完全降解成葡萄糖。α-葡糖苷酶能水解寡糖中的(1，4)-和(1，6)-鍵，所述寡糖是通過(guò)其它淀粉分解酶(例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、異淀粉酶和支鏈淀粉酶)或通過(guò)酸和熱處理的作用形成的。
α-葡糖苷酶(α-D-葡糖苷葡糖水解酶；例如，EC 3.2.1.20)廣泛地分布在微生物中。它們能水解(1，4)-和(1，6)-鍵，并從非還原末端釋放出α-D-葡萄糖單元。已經(jīng)在下述物種中發(fā)現(xiàn)了這些具有不同的(和廣泛的)底物特異性的酶的不同類型細(xì)菌例如芽孢桿菌屬(Bacillus)，鏈球菌屬(Streptococcus)，埃希氏菌屬(Escherichia)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，超嗜熱古細(xì)菌例如火球菌屬(Pyrococcus)、熱球菌屬(Thermococcus)和棲熱孢菌病(Thermotoga)，和真菌物種例如青霉屬(Penicillium)、四膜蟲(chóng)屬(Tetrahymena)、糖酵母屬(Saccharomyces)和曲霉屬(Aspergillus)。
已經(jīng)廣泛地研究了來(lái)自黑曲霉(Aspergillus niger)的酶多年，其具有廣泛的底物特異性。其水解這樣的底物，例如麥芽糖、曲二糖、黑曲糖、異麥芽糖、苯基-α-葡糖苷、苯基-α-麥芽糖苷、寡糖、麥芽糖糊精和可溶性的淀粉。來(lái)自米曲霉(A.oryzae)、枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)和超嗜熱古細(xì)菌的α-葡糖苷酶表現(xiàn)出類似的性質(zhì)。
寡-(1，6)-葡糖苷酶或異麥芽糖酶(糊精6-α-D-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.10；dexB基因編碼)是類似于α-葡糖苷酶的酶(Krasikov等，Biochemistry(Moscow).66332-348(2001))。它能催化由α-淀粉酶水解淀粉和糖原生成的異麥芽糖和糊精中的(1，6)-α-D-葡糖苷鍵(Enzyme Nomenclature，C.Webb，編(1984)Academic Press，SanDiego，CA.)。該酶比α-葡糖苷酶更少地分布，但是在生物中有所發(fā)現(xiàn)，例如芽孢桿菌屬物種，包括熱葡糖苷芽孢桿菌(B.thermoglucosidius)KP1006、蠟狀芽孢桿菌ATCC 7064和可能的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)ATCC 23844(Vihinen和Mantsala，Critical Reviews in Biochemistry.24329-418(1989))，以及凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)(Suzuki和Tomura，Eur.J.Biochem.，15877-83(1986))。芽孢桿菌酶的大小一般是60-63kDa。還已經(jīng)從熱厭氧菌屬(Thermoanaerobium)Tok6-B1分離出寡-(1，6)-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.10)，報(bào)道其分子量為30-33kDa。
來(lái)自變異鏈球菌的dexB酶的活性模式類似于葡聚糖酶(EC3.2.1.11)，后者能催化葡聚糖中的(1，6)-α-D-葡糖苷鍵的內(nèi)水解(endohydolysis)。dexB酶和芽孢桿菌屬物種寡-(1，6)-葡糖苷酶之間有較高程度的相似性(Whiting等，J.Gen.Microbiol.，1392019-2026(1993))。DexB大小約是62kDa(Aduse-Opoku等，J.GenMicrobiol.，137757-764(1991))。
具有α(1，6)水解酶活性的酶屬于超過(guò)81種鑒別出的葡糖基水解酶家族的非常寬的種類(Henrissat，Biochem.J.，280309-316(1991)；Henrissat和Bairoch，Biochem.J.，293781-788(1993))。通過(guò)使用少至69％氨基酸序列的相同性的酶證實(shí)本發(fā)明的用途，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了廣分類的能利用α(1，6)連接的葡萄糖單元作為發(fā)酵底物的酶。已知能解聚含有α(1，6)-連接的葡萄糖殘基的寡糖的酶，包括葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3，也稱作淀粉葡糖苷酶)，它在序列中的下一鍵是α(1，4)-α-D-葡糖苷鍵時(shí)能快速地水解(1，6)-α-D-葡糖苷鍵或連接；α-糊精內(nèi)-(1，6)-α-葡聚糖苷酶(glucanosidase)(EC3.2.1.41，也稱作支鏈淀粉酶)，它能降解支鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原和支鏈淀粉和糖原的α-和β-淀粉酶極限糊精中的(1，6)-α-D-葡糖苷鍵；蔗糖酶(EC 3.2.1.48)，它分離自腸粘膜，且具有抗異麥芽糖的活性；異淀粉酶(EC 3.2.1.68)，它能水解糖原、支鏈淀粉和它們的β-極限糊精中的(1，6)-α-D-葡糖苷鍵；和葡聚糖(1，6)-α-葡糖苷酶(EC3.2.1.70)，它能水解來(lái)自(1，6)-α-D-葡聚糖和衍生的寡糖的連續(xù)葡萄糖殘基。
在本公開(kāi)內(nèi)容的上下文中，使用了許多術(shù)語(yǔ)。
術(shù)語(yǔ)“淀粉”是指由通過(guò)糖苷鍵連接的D-葡萄糖單元組成的同多糖，其形成植物中的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存文庫(kù)。淀粉存在2種形式，即直鏈淀粉和支鏈淀粉。在直鏈淀粉中，D-葡萄糖單元專有地通過(guò)α(1，4)糖苷鍵連接。認(rèn)為由多個(gè)α(1，4)糖苷鍵組成的鏈?zhǔn)蔷€性的或未分支的。在支鏈淀粉中，盡管主要的連接是通過(guò)α(1，4)糖苷鍵，但偶爾存在的α(1，6)糖苷鍵形成了另外的線性部分的分支點(diǎn)。支鏈淀粉在每30個(gè)α(1，4)鍵中含有約1個(gè)α(1，6)鍵。
術(shù)語(yǔ)“單糖”是指經(jīng)驗(yàn)式(CH2O)n的化合物，其中n≥3，碳骨架是未分支的，除了1個(gè)碳原子外的每個(gè)碳原子都含有羥基，剩余的碳原子是在碳原子2上的醛或酮。術(shù)語(yǔ)“單糖”還指細(xì)胞內(nèi)的環(huán)狀半縮醛或半酮縮醇形式。最熟悉的單糖是D-葡萄糖。環(huán)狀形式的D-葡萄糖涉及碳原子5的羥基與碳原子1的醛形成半縮醛的反應(yīng)，其中羰基碳被稱為異頭碳。
術(shù)語(yǔ)“糖苷鍵”和“糖苷連接”是指通過(guò)異頭碳與醇羥基的反應(yīng)形成的縮醛。1個(gè)D-葡萄糖分子的異頭碳與第2個(gè)D-葡萄糖分子的碳原子4上的羥基的反應(yīng)產(chǎn)生α(1，4)糖苷鍵或連接。類似地，1個(gè)D-葡萄糖分子的異頭碳與第2個(gè)D-葡萄糖分子的碳原子6上的羥基的反應(yīng)產(chǎn)生α(1，6)糖苷鍵或連接。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到，糖苷鍵可以是α或β構(gòu)型。糖苷鍵構(gòu)型通過(guò)例如α(1，4)和α(1，6)命名。
術(shù)語(yǔ)“α”是指鍵在環(huán)平面之上的構(gòu)象。相反地，“β”是指鍵在環(huán)平面之下的構(gòu)象。
術(shù)語(yǔ)“寡糖”是指含有2～10個(gè)通過(guò)糖苷鍵連接的單糖單元的化合物。術(shù)語(yǔ)“多糖”是指含有超過(guò)10個(gè)通過(guò)糖苷鍵連接的單糖單元的化合物，且通常是指大分子量種類的混合物。由單一單體單元組成的多糖由術(shù)語(yǔ)“同多糖”表示。
術(shù)語(yǔ)“異麥芽糖(isomaltosaccharide)”是指具有至少一個(gè)α(1，6)-鍵的寡糖。
術(shù)語(yǔ)“(1，4)鍵”是指兩個(gè)糖之間的關(guān)系，其中1個(gè)糖單元的C1結(jié)合到第2個(gè)糖單元的C4。
術(shù)語(yǔ)“(1，6)鍵”是指兩個(gè)糖之間的關(guān)系，其中1個(gè)糖單元的C1結(jié)合到第2個(gè)糖單元的C6。
術(shù)語(yǔ)“淀粉酶”和“α-淀粉酶”是指能催化α(1，4)糖苷鍵的水解的酶。α(1，4)糖苷鍵的水解活性是通過(guò)術(shù)語(yǔ)“淀粉酶活性”或“淀粉分解活性”表示的。淀粉酶包括但不限于IUBMB分類EC 3.2.1.1(淀粉酶)、EC 3.2.1.60((1，4)-α-maltotetraohydrolase)和EC 3.2.1.98((1，4)-α-(maltohexaosidase))。
術(shù)語(yǔ)“異淀粉酶”和“α-異淀粉酶”是指能催化α(1，6)糖苷鍵的水解的酶。α(1，6)糖苷鍵的水解活性是通過(guò)術(shù)語(yǔ)“異淀粉酶活性”或“異淀粉分解活性”表示。異淀粉酶包括但不限于IUBMB分類EC 3.2.1.10(寡-(1，6)-葡糖苷酶)、EC 3.2.1.11(葡聚糖酶)、EC 3.2.1.41(支鏈淀粉酶)和EC 3.2.1.68(異淀粉酶)。
術(shù)語(yǔ)“葡糖苷酶”和“α-葡糖苷酶”是指能催化α(1，4)糖苷鍵和α(1，6)糖苷鍵的水解并從寡糖的非還原末端釋放出α-D-葡萄糖單元的酶。葡糖苷酶具有淀粉分解活性和異淀粉分解活性。葡糖苷酶包括但不限于IUBMB分類EC 3 2.1.3(淀粉葡糖苷酶)和EC 3.2.1.20(α-葡糖苷酶)。
術(shù)語(yǔ)“α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖水解酶”是指具有催化α(1，6)糖苷鍵水解的功能活性的酶。具有這樣的功能活性的酶的具體實(shí)例包括異淀粉酶、α-異淀粉酶、葡糖苷酶和α-葡糖苷酶。
術(shù)語(yǔ)“異麥芽糖酶”或“寡-(1，6)-葡糖苷酶”或“糊精6-α-D-葡聚糖水解酶”是指酶(EC 3.2.1.10)，它僅能水解寡糖的非還原末端的α(1，6)-鍵。
術(shù)語(yǔ)“DexB”是指由變異鏈球菌的dexB基因(GenBank登記號(hào)M77351)編碼的(1，6)-α-葡糖苷酶，它從α(1，6)-連接的異麥芽糖和葡聚糖的非還原末端釋放出葡萄糖。
術(shù)語(yǔ)“極限糊精”是指含有單糖和寡糖的淀粉的淀粉分解降解產(chǎn)物。淀粉酶對(duì)支鏈淀粉的作用會(huì)生成單糖(D-葡萄糖)、二糖(α(1，4)連接的麥芽糖和α(1，6)連接的異麥芽糖)和更高的寡糖的混合物。更高的寡糖可以是線性的(專有地含有α(1，4)鍵)或分支的(主要含有α(1，4)鍵和α(1，6)鍵)。
術(shù)語(yǔ)“聚合度”或“DP”是指在糖混合物的各組分中的單體單元的數(shù)目；例如，單糖例如D-葡萄糖)的DP為1，二糖(例如麥芽糖)的DP為2，三糖(例如潘糖)的DP為3，等。當(dāng)應(yīng)用到多糖混合物或寡糖混合物時(shí)，DP是指每個(gè)分子中的單體的平均數(shù)目。
術(shù)語(yǔ)“葡萄糖當(dāng)量”(″DE″)是指通過(guò)Lane-Eynon滴定測(cè)定的“表示為干物質(zhì)的葡萄糖百分比的還原糖含量”(Handbook of StarchHydrolysis Products and their Derivatives，M.W.Kearsely和S.Z.Dziedzic，編，Blackie Academic&Professional，第86頁(yè))。DE大小表示了淀粉的水解度，淀粉具有0DE標(biāo)稱值而最終水解產(chǎn)物具有100DE值。
淀粉酶和異淀粉酶活性可以是胞內(nèi)的或胞外的。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“胞內(nèi)活性”是指當(dāng)提供底物時(shí)能從破碎的細(xì)胞或細(xì)胞提取物觀察到、但是當(dāng)胞外地提供底物時(shí)不能從完整細(xì)胞觀察到的酶活性。術(shù)語(yǔ)“胞外活性”是指當(dāng)胞外地提供底物時(shí)能從完整細(xì)胞(包括生長(zhǎng)的細(xì)胞)觀察到的活性。酶底物不能被動(dòng)擴(kuò)散或主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞，由術(shù)語(yǔ)“胞內(nèi)活性”和“胞外活性”暗示。
“靶分子”是指生物催化地生成的產(chǎn)物。這可以是通過(guò)生物催化劑自然地生成的化合物，或者非天然的基因可以進(jìn)行基因工程處理進(jìn)入微生物中，以用于它們?cè)谏锇l(fā)酵中的功能表達(dá)。在本上下文中的“靶分子”還指生物發(fā)酵的任何副產(chǎn)物，它們可以理想地從生物發(fā)酵系統(tǒng)中選擇性地除去，以消除反饋抑制和/或使生物催化劑活性最大化。
“體積生產(chǎn)率”是指單位時(shí)間內(nèi)在給定體積的生物發(fā)酵罐中生成的靶分子質(zhì)量，其單位為克/(升·小時(shí))(縮寫(xiě)為g/(L·hr))。該度量是通過(guò)生物催化劑的特異性活性和生物催化劑的濃度測(cè)定的。它從效價(jià)、運(yùn)行時(shí)間和生物發(fā)酵罐的工作體積計(jì)算出。
“效價(jià)”是指靶分子的濃度，其單位為克/升(縮寫(xiě)為g/L)。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“多核苷酸序列”、“寡核苷酸”、“核酸序列”和“核酸片段”或“分離的核酸片段”在本文中互換地使用。這些術(shù)語(yǔ)包括核苷酸序列等。多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的RNA或DNA的聚合物，所述RNA或DNA任選地含有合成的、非自然的或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以由cDNA、基因組DNA、合成的DNA的一個(gè)或多個(gè)片段或它們的混合物組成。
術(shù)語(yǔ)“分離的”是指諸如核酸分子和/或蛋白的材料基本上不含有通常在自然環(huán)境中伴隨該材料或與其相互作用的組分，或者已經(jīng)從其中分離出。分離的多核苷酸可以是從它們自然存在的宿主細(xì)胞中純化出的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法來(lái)獲取分離的多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)還包括重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。
如本文所使用的，“分離的核酸分子”或“分離的核酸片段”是單鏈的或雙鏈的RNA或DNA的聚合物，所述RNA或DNA任選地含有合成的、非自然的或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸片段可以由cDNA、基因組DNA或合成的DNA的一個(gè)或多個(gè)片段組成。
術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”用于描述能與另一個(gè)核苷酸堿基雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如，關(guān)于DNA，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補(bǔ)，胞嘧啶與鳥(niǎo)嘌呤互補(bǔ)。因此，本發(fā)明還包括能與所附序列表報(bào)道的完整序列以及基本上類似的核酸序列互補(bǔ)的分離的核酸片段。
如本文所使用的，“基本上類似的”是指核酸片段，其中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的變化造成了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代，但是不影響該核苷酸序列編碼的多肽功能性質(zhì)。因此可以明白，本發(fā)明不僅包括具體示例的核苷酸或氨基酸序列，還包括它們的功能等同物。術(shù)語(yǔ)“基本上類似的”和“基本上對(duì)應(yīng)的”在本文中互換地使用。
而且，本領(lǐng)域熟知能導(dǎo)致在指定的位點(diǎn)生成化學(xué)上等同的氨基酸、但是不影響編碼的多肽的功能性質(zhì)的核酸片段中的改變。因此，氨基酸丙氨酸(一種疏水氨基酸)的密碼子可以替代為編碼另一個(gè)更少疏水性殘基(例如甘氨酸)的密碼子或編碼另一個(gè)更多疏水性殘基(例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子。類似地，可以預(yù)期能導(dǎo)致一個(gè)帶負(fù)電荷的殘基替代另一個(gè)(例如天冬氨酸替代谷氨酸)或一個(gè)帶正電荷的殘基替代另一個(gè)(例如賴氨酸替代精氨酸)的變化也能生成功能上的等價(jià)產(chǎn)物。還可以預(yù)期，能導(dǎo)致多肽分子的N-端和C-端部分的改變的核苷酸變化不會(huì)改變多肽的活性。每一種推定的修飾都是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，保持編碼產(chǎn)物的生物學(xué)活性的測(cè)定也是如此。
而且，基本上類似的核酸片段還可以通過(guò)它們的雜交能力來(lái)表征。這種同源性是通過(guò)嚴(yán)格條件下的DNA-DNA或DNA-RNA雜交來(lái)估計(jì)的，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的(Hames和Higgins，編(1985)NucleicAcid Hybridisation，IRL Press，Oxford，英國(guó))。可選擇嚴(yán)格條件以用于篩選中等相似的片段，例如來(lái)自關(guān)系較遠(yuǎn)的生物的同源序列，至高度相似的片段，例如能加倍來(lái)自密切相關(guān)的生物的功能酶的基因。雜交后的洗滌決定了嚴(yán)格條件。一組優(yōu)選的條件使用一系列的洗滌開(kāi)始是6X SSC，0.5％SDS，在室溫進(jìn)行15分鐘，然后重復(fù)2XSSC，0.5％SDS，在45℃進(jìn)行30分鐘，然后重復(fù)2次0.2X SSC，0.5％SDS，在50℃進(jìn)行30分鐘。一組更優(yōu)選的嚴(yán)格條件使用更高的溫度，其中的洗滌與上面相同，只是最后2次在0.2X SSC，0.5％SDS中的30分鐘洗滌的溫度提高到了60℃。另一個(gè)優(yōu)選的高度嚴(yán)格的條件使用兩次在0.1X SSC，0.1％SDS中、在65℃的最終洗滌。
本發(fā)明的基本上類似的核酸片段還可以通過(guò)它們編碼的氨基酸序列與本文所公開(kāi)的氨基酸序列的百分比相同性來(lái)表征，如通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常采用的算法所測(cè)定的。合適的核酸片段(本發(fā)明的分離的多核苷酸)編碼的多肽與本文所報(bào)道的氨基酸序列至少70％相同、優(yōu)選地至少80％相同。優(yōu)選的核酸片段編碼的氨基酸序列與本文所報(bào)道的氨基酸序列至少85％相同。更優(yōu)選的核酸片段編碼的氨基酸序列與本文所報(bào)道的氨基酸序列至少90％相同。最優(yōu)選的核酸片段編碼的氨基酸序列與本文所報(bào)道的氨基酸序列至少95％相同。合適的核酸片段不僅具有上述的相同性，一般還編碼具有至少50氨基酸、優(yōu)選地至少100氨基酸、更優(yōu)選地至少150氨基酸、再優(yōu)選地至少200氨基酸和最優(yōu)選地至少250氨基酸的多肽。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，序列相同性的許多水平可以用于鑒別相關(guān)的多肽序列。百分比相同性的有用實(shí)例是50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或55％至100％之間的任何整數(shù)百分比。如本領(lǐng)域所知的，術(shù)語(yǔ)“％相同性”是指兩個(gè)或多個(gè)多肽序列或兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列之間的關(guān)系，如通過(guò)序列比較所測(cè)定的。在本領(lǐng)域“相同性”還指多肽或多核苷酸序列之間的序列關(guān)聯(lián)性程度，根據(jù)具體情況而定，如通過(guò)這些序列串之間的匹配所測(cè)定的?！跋嗤浴焙汀跋嗨菩浴笨梢匀菀椎赝ㄟ^(guò)已知方法計(jì)算出，包括但不限于下面所述Computational Molecular Bioloay(Lesk，A.M.，編)OxfordUniversity Press，New York(1988)；BiocomputingInformaticsand Genome Projects(Smith，D.W.，編)Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，編)Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.，編)Academic Press(1987)；和Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.，編)Stockton Press，New York(1991)。測(cè)定相同性的優(yōu)選方法能能在測(cè)試的序列之間產(chǎn)生最佳匹配。測(cè)定相同性和相似性的方法已經(jīng)編程成公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序。可以使用LASERGENE生物信息計(jì)算組件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序進(jìn)行序列比對(duì)和百分比相同性計(jì)算。使用Clustal比對(duì)方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5151-153)、默認(rèn)參數(shù)(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)進(jìn)行了多次序列比對(duì)。使用Clustal方法進(jìn)行逐對(duì)比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)是KTUPLE 1，GAPPENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。
合適的核酸片段(本發(fā)明的分離的多核苷酸)編碼的多肽與本文報(bào)道的氨基酸序列有至少約60％的相同、優(yōu)選地至少約80％的相同。優(yōu)選的核酸片段編碼的氨基酸序列與本文報(bào)道的氨基酸序列有至少約85％的相同。更優(yōu)選的核酸片段編碼的氨基酸序列與本文報(bào)道的氨基酸序列有至少約90％的相同。最優(yōu)選的核酸片段編碼的氨基酸序列與本文報(bào)道的氨基酸序列有至少約95％的相同。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”包含足以提供氨基酸或核苷酸序列含有的蛋白或基因的推定鑒別的氨基酸或核苷酸序列。通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員手工地或通過(guò)使用基于計(jì)算機(jī)的序列對(duì)比和鑒別工具，可以評(píng)價(jià)氨基酸或核苷酸序列，所述工具采用算法例如BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool；Altschul等(1993)J.Mol.Biol.215403-410；還參見(jiàn)國(guó)家健康研究所國(guó)家醫(yī)藥圖書(shū)館的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information atthe National Library of Medicine of the National Institutesof Health)的環(huán)球網(wǎng)站點(diǎn)上的對(duì)BLAST算法的解釋)。通常，為了推定地鑒別多肽或核酸序列與已知蛋白或基因的相同性，10個(gè)或更多的連續(xù)氨基酸或30個(gè)或更多的連續(xù)核苷酸的序列是必須的。而且，關(guān)于核苷酸序列，含有30個(gè)或更多的連續(xù)核苷酸的基因-特異性的寡核苷酸探針可以用于依賴于序列的基因鑒別(例如，DNA雜交)和分離(例如，細(xì)菌菌落或噬菌體噬斑的原位雜交)方法。另外，含有12個(gè)或更多的核苷酸的短寡核苷酸可以用作PCR的擴(kuò)增引物，以得到含有該引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含能提供含有該序列的核酸片段的特異性的鑒別和/或分離的核苷酸序列。本說(shuō)明書(shū)教導(dǎo)了編碼含有一個(gè)或多個(gè)特定植物蛋白的多肽的氨基酸和核苷酸序列。利用本文報(bào)道的序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員現(xiàn)在可以使用公開(kāi)的序列的全部或基本部分用于本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的目的。因此，本發(fā)明包含所附序列表報(bào)道的完整序列以及上面定義的那些序列的基本部分。
“密碼子簡(jiǎn)并性”是指能允許核苷酸序列變化而不影響編碼的多肽的氨基酸序列的遺傳密碼的趨異。因此，本發(fā)明涉及含有編碼本文所述氨基酸序列的全部或基本部分的核苷酸序列的任何核酸片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知特定的宿主細(xì)胞在使用核苷酸密碼子以指定特定的氨基酸時(shí)表現(xiàn)出來(lái)的“密碼子偏倚”。因此，當(dāng)合成用于提高宿主細(xì)胞中的表達(dá)的核酸片段時(shí)，需要設(shè)計(jì)核酸片段，使其密碼子的使用頻率接近宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子的使用頻率。
從使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成的寡核苷酸結(jié)構(gòu)單元可以裝配出“合成的核酸片段”或“合成的基因”。連接和退火這些結(jié)構(gòu)單元以形成更大的核酸片段，然后可以將它們酶切地裝配，構(gòu)建完整的理想的核酸片段。與核酸片段相關(guān)的“化學(xué)合成的”是指組分核苷酸是體外裝配的。使用充分確立的方法可以手工地化學(xué)合成核酸片段，或者使用許多市場(chǎng)上可買(mǎi)到的裝置之一來(lái)自動(dòng)地化學(xué)合成。因此，可以將核酸片段裁剪以進(jìn)行最佳的基因表達(dá)，其基于核苷酸序列的最優(yōu)化以反映宿主細(xì)胞的密碼子偏倚。如果密碼子使用偏倚于宿主偏好的密碼子，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明白成功的基因表達(dá)的可能性。優(yōu)選密碼子的確定可以以調(diào)查源自宿主細(xì)胞的基因?yàn)榛A(chǔ)，該基因的序列信息是可獲得的。
術(shù)語(yǔ)“序列分析軟件”是指能用于核苷酸或氨基酸序列分析的任何計(jì)算機(jī)算法或軟件程序。可以從市場(chǎng)上買(mǎi)到或獨(dú)立地開(kāi)發(fā)出“序列分析軟件”。一般的序列分析軟件包括但不限于GCG程序套(WisconsinPackage Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)，BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228 S.Park St.Madison，WI 53715美國(guó))和采用Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)Suhai，Sandor.PublisherPlenum，New York，NY)。在本申請(qǐng)的上下文中應(yīng)當(dāng)明白，在用序列分析軟件進(jìn)行分析時(shí)，除非另有說(shuō)明，分析的結(jié)果是基于使用的程序的“默認(rèn)值”的。如本文所使用的，“默認(rèn)值”是指當(dāng)初次啟動(dòng)時(shí)在軟件中原始調(diào)用的數(shù)值或參數(shù)的任何設(shè)置。
“基因”是指能表達(dá)特定蛋白的核酸片段，其包括在編碼序列之前(5′非編碼序列)和之后(3′非編碼序列)的調(diào)控序列?！疤烊换颉笔侵妇哂衅渥约旱恼{(diào)控序列的自然存在的基因。“嵌合基因”是指非天然基因的任何基因，其含有非自然地一起存在的調(diào)控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以含有不同來(lái)源或相同來(lái)源、但是以不同于自然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列?！扒逗系鞍住笔怯汕逗匣蚓幋a的蛋白?！皟?nèi)源基因”是指在生物的基因組中的自然位置的天然基因。“外源基因”是指在宿主生物中通常不存在的基因，但是它通常經(jīng)基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入了宿主生物。外源基因可以包含插入到非天然的生物中的天然基因、重組DNA構(gòu)建體或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是已經(jīng)通過(guò)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組中的基因。
“編碼序列”是指編碼特定的氨基酸序列的核苷酸序列。
“調(diào)控序列”和“合適的調(diào)控序列”是指位于編碼序列的上游(5′非編碼序列)、之中或下游(3′非編碼序列)的核苷酸序列，其影響相關(guān)的編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)控序列可以包含啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列。
“啟動(dòng)子”是指能夠控制編碼序列或功能性RNA的表達(dá)的核苷酸序列。通常，編碼序列是位于啟動(dòng)子序列的3’。啟動(dòng)子可以整體地源自天然基因，或者可以由源自不同的自然存在的啟動(dòng)子的不同元件組成，或者可以甚至包含合成的核苷酸片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明白，不同的啟動(dòng)子可以指導(dǎo)不同組織或細(xì)胞類型、或不同發(fā)育階段，或者作為對(duì)不同環(huán)境條件的反應(yīng)的基因表達(dá)。能使核酸片段在大多數(shù)細(xì)胞類型中在大多時(shí)間表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱作“組成型啟動(dòng)子”。還認(rèn)識(shí)到，由于在大多數(shù)情況下尚未完整地定義調(diào)控序列的精確邊界，不同長(zhǎng)度的核酸片段可以具有相同的啟動(dòng)子活性。
有許多能用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的基因在理想宿主細(xì)胞中的表達(dá)的啟動(dòng)子，且該啟動(dòng)子是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。實(shí)際上，能驅(qū)動(dòng)這些基因的任何啟動(dòng)子都是適用于本發(fā)明的，包括但不限于CYC1，HIS3，GAL1，GAL10，ADH1，PGK，PHO5，GAPDH，ADC1，TRP1，URA3，LEU2，ENO，TPI(用于糖酵母屬中的表達(dá))；AOX1(用于畢赤酵母屬(Pichia)中的表達(dá))；和lac，ara，tet，trp，IPL，IPR，T7，tac和trc(用于大腸桿菌中的表達(dá))，Streptomyces lividins GI，以及amy，apr和npr啟動(dòng)子和用于在芽孢桿菌屬中表達(dá)的不同噬菌體啟動(dòng)子。
“翻譯前導(dǎo)序列”是指位于基因的啟動(dòng)子序列和編碼序列之間的核苷酸序列。翻譯前導(dǎo)序列位于翻譯起始序列的完全加工的mRNA的上游。翻譯前導(dǎo)序列會(huì)影響mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的加工、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例已經(jīng)描述在(Turner和Foster(1995)Mol.Biotechnol.3225-236)。
“3′非編碼序列”是指位于編碼序列下游的DNA序列，其包括多腺苷酸化識(shí)別序列和編碼能影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的其它序列。多腺苷酸化信號(hào)的特征通常是影響多腺苷酸序列段向mRNA前體的3′端的添加。不同的3′非編碼序列的使用由Ingelbrecht等((1989)Plant Cell 1671-680)示例。
“RNA轉(zhuǎn)錄物”是指RNA聚合酶-催化的DNA序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA序列的完全互補(bǔ)拷貝時(shí)，它稱作初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，或者它可以是源自初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列，此時(shí)它稱作成熟的RNA。“信使RNA(mRNA)”是指不含有內(nèi)含子且可以被細(xì)胞翻譯成多肽的RNA。“cDNA”是指與mRNA模板互補(bǔ)且來(lái)自它的DNA。cDNA可以是單鏈形式，或者使用例如DNA聚合酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。“有義-RNA”是指包括mRNA且因而可以由細(xì)胞翻譯成多肽的RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA”是指與全部或部分目標(biāo)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA互補(bǔ)的RNA轉(zhuǎn)錄物，其能阻止目標(biāo)基因的表達(dá)(見(jiàn)，美國(guó)專利號(hào)5,107,065，本文中引作參考)。反義RNA的互補(bǔ)性可以是特定核苷酸序列的任何部分的，即在5′非編碼序列、3′非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列?！肮δ苄缘腞NA”是指有義RNA、反義RNA、核酶RNA或其它的不能被翻譯但是仍然對(duì)細(xì)胞過(guò)程有影響的RNA。
術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指位于一個(gè)多核苷酸上且彼此相連的2個(gè)或更多的核酸片段，所以一個(gè)的功能會(huì)影響其它的功能。例如，當(dāng)它能影響編碼序列的表達(dá)時(shí)，該啟動(dòng)子是可操作地連接到該編碼序列(即，該編碼序列是在該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下)。編碼序列可以以有義的或反義的方向可操作地連接到調(diào)控序列。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指源自本發(fā)明的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)還可以指mRNA向多肽的翻譯?！胺戳x抑制”是指能抑制目標(biāo)蛋白的表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生?！俺磉_(dá)”是指在轉(zhuǎn)基因生物中的基因產(chǎn)物的產(chǎn)生超過(guò)了在正常的或非轉(zhuǎn)化的生物中的產(chǎn)生水平?！肮惨种啤笔侵改芤种葡嗤幕蚧旧项愃频耐庠椿騼?nèi)源基因的表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生(美國(guó)專利號(hào)5,231,020，本文中引作參考)。
“蛋白”或“多肽”是以編碼多肽的多核苷酸中的編碼序列決定的特定順序排列的氨基酸鏈。每一種蛋白或多肽具有獨(dú)特的功能。
“信號(hào)序列”是指編碼信號(hào)肽的核苷酸序列。
“轉(zhuǎn)化”是指核酸片段向宿主生物或宿主生物的基因組中的轉(zhuǎn)移，其導(dǎo)致遺傳上穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物稱作“重組的”、“轉(zhuǎn)基因的”或“轉(zhuǎn)化的”生物。因此，本發(fā)明的分離的多核苷酸可以整合進(jìn)能導(dǎo)入宿主細(xì)胞并在其中復(fù)制的重組構(gòu)建體中，一般是DNA構(gòu)建體。這樣的構(gòu)建體可以是包括復(fù)制系統(tǒng)和能在給定的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼多肽的序列的序列的載體。一般地，表達(dá)載體包括例如一個(gè)或多個(gè)在5′和3′調(diào)控序列和選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)錄控制下的克隆基因。這樣的載體還可以含有啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(例如，控制誘導(dǎo)型的或組成型的、環(huán)境地或發(fā)育地調(diào)節(jié)的或位置特異性的表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或多腺苷酸化信號(hào)。
術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”或“宿主生物”是指能接受外源基因或異源基因或內(nèi)源基因的多個(gè)拷貝并表達(dá)這些基因以生成有活性的基因產(chǎn)物的微生物。
術(shù)語(yǔ)“DNA構(gòu)建體”或“構(gòu)建體”是指人工構(gòu)建的DNA片段。這樣的構(gòu)建體可以單獨(dú)使用或者與載體結(jié)合使用。
術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！薄ⅰ拜d體”和“盒”是指通常攜帶基因的染色體外的元件，所述基因不是細(xì)胞中心代謝的部分，其通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這樣的元件可以是自主復(fù)制序列、整合入基因組的序列、噬菌體或任何來(lái)源的單鏈的或雙鏈的DNA或RNA的線性的或環(huán)狀的核苷酸序列，其中許多核苷酸序列已經(jīng)插入或重組進(jìn)獨(dú)特的構(gòu)建體中，該構(gòu)建體能將選定的基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子片段和DNA序列與合適的3′非翻譯序列一起導(dǎo)入細(xì)胞中?！稗D(zhuǎn)化盒”是指含有外源基因的特定載體，除了外源基因以外，其還含有能促進(jìn)特定宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的元件?！氨磉_(dá)盒”是指含有外源基因的特定載體，除了外源基因以外，其還含有能增強(qiáng)該基因在外源宿主中的表達(dá)的元件。
術(shù)語(yǔ)“編碼”是指基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制生產(chǎn)氨基酸序列的過(guò)程。編碼特定氨基酸序列的過(guò)程包括這樣的DNA序列，其可以含有不造成編碼的氨基酸變化的堿基變化，或者其含有可以改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸、但是不影響該DNA序列編碼的蛋白的功能性質(zhì)的堿基變化。因此應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明不只包括具體的示例性序列。
“PCR”或“聚合酶鏈反應(yīng)”是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的用于擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)(美國(guó)專利號(hào)4,683,195和4,800,159)。
“ORF”或“可讀框”是編碼肽或蛋白的DNA分子中的核苷酸序列。在已經(jīng)確定了DNA片段的序列、但是不知道編碼的蛋白的功能時(shí)，經(jīng)常使用該術(shù)語(yǔ)。
術(shù)語(yǔ)“可發(fā)酵的碳底物”是指能被本發(fā)明的宿主生物代謝的碳源，更具體地是選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物或其混合物的那些碳源。
同系物的分離本發(fā)明的核酸片段可以用于從相同的或其它微生物物種中分離編碼同源蛋白的基因。使用序列依賴性的方法分離同源基因是本領(lǐng)域熟知的。序列依賴性的方法的例子包括但不限于核酸雜交方法、DNA和RNA擴(kuò)增方法，如通過(guò)核酸擴(kuò)增技術(shù)的各種應(yīng)用所示例的(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，Mullis等，美國(guó)專利4,683,202)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，Tabor等，Proc.Acad.Sci.USA 82，1074，(1985))或鏈置換擴(kuò)增(SDA，Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89，392，(1992))。
一般地，在PCR-類擴(kuò)增技術(shù)中，引物具有不同的序列，且彼此不互補(bǔ)。根據(jù)所需的實(shí)驗(yàn)條件，引物序列應(yīng)該設(shè)計(jì)成能有效地和正確地復(fù)制目標(biāo)核酸。PCR引物設(shè)計(jì)的方法是常見(jiàn)的和本領(lǐng)域熟知的(Thein和Wallace，″The use of oligonucleotide as specifichybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders″，in Human Genetic DiseasesA Practical Approach，K.E.Davis編，(1986)第33-50頁(yè)IRL PRESS，Herndon，Virginia)；Rychlik，W.(1993)In White，B.A.(ed.)，Methods in Molecular Biology，Vol.15，第31-39頁(yè)，PCR ProtocolsCurrent Methods andApplications.Humania Press，Inc.，Totowa，NJ.)。
雜交方法被充分地詳細(xì)說(shuō)明了。一般地，必須將探針和樣品在能允許核酸雜交的條件下混合。這包括在有無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)鹽存在的情況下、在合適的濃度和溫度條件下使探針與樣品接觸。探針和樣品核酸必須接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，使探針和樣品核酸之間能夠發(fā)生任何可能的雜交?；旌衔镏械奶结樆蚰繕?biāo)的濃度會(huì)決定發(fā)生雜交所需的時(shí)間。探針或目標(biāo)的濃度越高，所需的雜交溫育時(shí)間越短。
可以采用各種雜交溶液。一般地，它們包括約20～60％體積、優(yōu)選地30％的極性有機(jī)溶劑。常用的雜交溶液含有約30-50％v/v甲酰胺、約0.15～1M氯化鈉、約0.05～0.1M緩沖液例如檸檬酸鈉、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范圍約6-9)、約0.05~0.2％去污劑例如十二烷基硫酸鈉或0.5-20mM之間的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(約300-500千道爾頓)聚乙烯吡咯烷酮(約250-500千道爾頓)和血清清蛋白。一般的雜交溶液還包括約0.1～5mg/mL未標(biāo)記的載體核酸，片段化的核DNA(例如小牛胸腺或鮭魚(yú)精子DNA)或酵母RNA和任選地約0.5～2％重量/體積的甘氨酸。還可以包括其它的添加劑，例如體積排阻劑，其包括多種極性的水溶性的或可膨脹的試劑例如聚乙二醇，陰離子聚合物例如聚丙烯酸酯或聚丙烯酸甲酯，和陰離子糖類聚合物例如葡聚糖硫酸酯。
重組表達(dá)-微生物本發(fā)明的序列的基因和基因產(chǎn)物可以導(dǎo)入到微生物宿主細(xì)胞中。用于表達(dá)本發(fā)明的基因和核酸分子的優(yōu)選宿主細(xì)胞是微生物宿主，其可以廣泛發(fā)現(xiàn)于真菌或細(xì)菌家族中，且可以在廣范圍的溫度、pH值和溶劑耐受性生長(zhǎng)。在光合的或化能自養(yǎng)的宿主的情況下，大規(guī)模的微生物生長(zhǎng)和功能基因的表達(dá)可以使用廣范圍的簡(jiǎn)單的或復(fù)雜的碳水化合物、有機(jī)酸和醇、飽和烴(例如甲烷)或二氧化碳。但是，功能基因可以由特定的生長(zhǎng)條件所調(diào)節(jié)、抑制或降低，所述條件可以包括氮、亞磷、硫、氧、碳或任何痕量微量營(yíng)養(yǎng)物(包括小無(wú)機(jī)離子)的形式和量。另外，功能基因的調(diào)節(jié)可以通過(guò)存在或不存在特定的調(diào)節(jié)分子來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述調(diào)節(jié)分子是加入到培養(yǎng)物中但是一般不認(rèn)為是營(yíng)養(yǎng)物或能源。生長(zhǎng)速率也可以是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。合適的宿主菌株的示例包括但不限于真菌或酵母物種例如曲霉屬、木霉菌屬(Trichoderma)、糖酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)，或細(xì)菌物種例如多變細(xì)菌(Proteotacteria)和放線菌以及特定的紅球菌屬(Rhodococcus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、短桿菌屬(Brevitacterium)、食酸菌屬(Acidovorax)、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、埃希氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、假單胞菌屬和棒桿菌屬(Corynebacterium)的成員。
大腸桿菌特別適用于用作本發(fā)明的發(fā)酵工藝中的宿主微生物。大腸桿菌不能代謝含有α(1，6)鍵的寡糖，也難以代謝DP＞7的任何寡糖。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知含有能指導(dǎo)外源蛋白的高水平表達(dá)的調(diào)控序列的微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體。它們中的任意一個(gè)都可以用于構(gòu)建嵌合基因，以生成本發(fā)明的任何基因產(chǎn)物。然后可以通過(guò)轉(zhuǎn)化技術(shù)將這些嵌合基因?qū)牒线m的微生物中，以高水平地表達(dá)酶。
用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞的載體或盒是本領(lǐng)域熟知的。一般地，載體或盒含有能指導(dǎo)相關(guān)基因、選擇性標(biāo)記和使得能進(jìn)行自主復(fù)制或染色體整合的序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。合適的載體包含含有轉(zhuǎn)錄起始控制的基因的5′區(qū)域和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段的3′區(qū)域。當(dāng)兩個(gè)控制區(qū)都源自與轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞同源的基因時(shí)是最優(yōu)選的，盡管能夠明白，這樣的控制區(qū)不需要源自對(duì)于選擇的作為生產(chǎn)宿主的特定物種而言是天然的基因。
起始控制區(qū)或啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)基因產(chǎn)物的表達(dá)。終止控制區(qū)也可以源自對(duì)于優(yōu)選的宿主而言是天然的基因。任選地，終止位點(diǎn)可以是非必須的，但是，如果包括則是最優(yōu)選的。
對(duì)于一些應(yīng)用，可以有益地指導(dǎo)本發(fā)明的蛋白進(jìn)入不同的細(xì)胞隔室。因而可以想象，通過(guò)改變編碼序列使其編碼具有合適的胞內(nèi)導(dǎo)向序列(例如轉(zhuǎn)運(yùn)序列)的酶，可以進(jìn)一步補(bǔ)充上述的嵌合基因。
具有提高的活性的酶可以預(yù)期，本發(fā)明的序列可以用于生產(chǎn)具有提高的或改變的活性的基因產(chǎn)物。已知用于突變天然基因序列、生產(chǎn)具有改變的或提高的活性的基因產(chǎn)物的多種方法，包括但不限于易錯(cuò)的PCR(Melnikov等，Nucleic Acids Research，(Feb.15，1999)Vol.27，No.4，第1056-1062頁(yè))；定點(diǎn)誘變(Coombs等，Proteins(1998)，259-311，1plate.Editor(s)Angeletti，Ruth Hogue.PublisherAcademic，San Diego，CA)和″基因改組(gene shuffling)″(US 5,605,793；US 5,811,238；US 5,830,721；和US 5,837,458，本文中引作參考)。
途徑調(diào)控關(guān)于本發(fā)明的基因序列的知識(shí)將用于操作具有這樣的途徑的任何生物中的糖代謝途徑。操縱遺傳途徑的方法是常見(jiàn)的，也是本領(lǐng)域熟知的。特定途徑中的選定的基因可以通過(guò)多種方法上調(diào)或下調(diào)。另外，競(jìng)爭(zhēng)途徑的生物可以通過(guò)基因破壞和類似技術(shù)消除或升華。
一旦已經(jīng)鑒別出了關(guān)鍵的遺傳途徑并進(jìn)行了測(cè)序，就可以上調(diào)具體基因以增加該途徑的輸出。例如，可以將目標(biāo)基因的其它拷貝在多拷貝質(zhì)粒例如pBR322上導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中?；蛘呖梢孕揎椖繕?biāo)基因，使其在非天然的啟動(dòng)子的控制下。當(dāng)需要使途徑在細(xì)胞周期的特定點(diǎn)或在發(fā)酵過(guò)程中運(yùn)行時(shí)，可以用受調(diào)節(jié)的或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換目標(biāo)基因的天然啟動(dòng)子。類似地，在一些情況下，可以修飾天然的或內(nèi)源的啟動(dòng)子來(lái)提高基因的表達(dá)。例如，可以通過(guò)突變、缺失和/或替代來(lái)體內(nèi)地改變內(nèi)源啟動(dòng)子(見(jiàn)，Kmiec，美國(guó)專利5,565,350；Zarling等，PCT/US93/03868)。
在本發(fā)明的上下文中，可以通過(guò)許多熟知方法(例如，反義、輻射-或化學(xué)-誘導(dǎo)的突變、基因改組等)中的任一種來(lái)有益地調(diào)控糖代謝途徑的表達(dá)。例如，本發(fā)明提供了許多基因，它們編碼糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶、從而生產(chǎn)簡(jiǎn)單的糖。分離的基因包括α-葡糖苷酶和異麥芽糖酶基因。當(dāng)例如需要積累葡萄糖或麥芽糖時(shí)，上述方法中的任一種都可以用于超表達(dá)本發(fā)明的α-葡糖苷酶和異麥芽糖酶基因。類似地，可以通過(guò)上述的任一種方法破壞下游基因(例如糖酵解途徑中的基因)來(lái)影響葡萄糖或麥芽糖的生物合成基因的積累。
生物發(fā)酵本發(fā)明適用于多種生物發(fā)酵方法，特別是適用于大規(guī)模工業(yè)方法的那些。本發(fā)明可以使用分批、補(bǔ)料-分批或連續(xù)工藝來(lái)實(shí)現(xiàn)，但是優(yōu)選地以補(bǔ)料-分批模式來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些生物發(fā)酵方法是常見(jiàn)的，且是本領(lǐng)域熟知的(Brock，T.D.；BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology，第2版；Sinauer AssociatesSunderland，MA(1989)；或Deshpande，Appl.Biochem.Biotechnol.36227(1992))。
“生物發(fā)酵系統(tǒng)”或“生物發(fā)酵”是指使用生物催化劑來(lái)催化底物和產(chǎn)物之間的反應(yīng)的系統(tǒng)。
生物催化劑生物催化劑能啟動(dòng)或改變底物和產(chǎn)物之間的化學(xué)反應(yīng)的速率。生物催化劑可以是整個(gè)的生物或者是分離的酶催化劑的形式。整個(gè)的微生物細(xì)胞可以不經(jīng)任何預(yù)處理(例如透化)地用作生物催化劑?；蛘?，可以通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的方法使整個(gè)細(xì)胞透化(例如，用甲苯、去污劑或凍-融處理)，以提高材料擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞的速率。
用于本發(fā)明的微生物可以包括但不限于細(xì)菌(例如腸細(xì)菌埃希氏菌屬和沙門(mén)氏菌屬，例如，以及芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、鏈霉菌屬、甲基細(xì)菌屬(Methylobacter)、紅球菌屬和假單胞菌屬)；藍(lán)細(xì)菌(例如紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)和集胞藍(lán)細(xì)菌屬(synechocystis)；酵母(例如糖酵母屬、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、克魯維酵母屬(Klayveromyces)、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、毛霉菌屬(Mucor)、畢赤酵母屬和球擬酵母屬(Torulopsis))；絲狀真菌(例如曲霉屬和節(jié)叢孢屬(Arthrobotrys))；和藻類。為了本申請(qǐng)的目的，“微生物”還包括來(lái)自昆蟲(chóng)、動(dòng)物或植物的細(xì)胞。
培養(yǎng)條件用于微生物培養(yǎng)物的維持和生長(zhǎng)的材料和方法是微生物學(xué)或生物發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(Bailey和Ollis，BiochemicalEngineering Fundamentals，第2版；McGraw-HillNY(1986))。根據(jù)微生物進(jìn)行理想的功能基因的表達(dá)的具體需要，必須考慮合適的培養(yǎng)基、pH、溫度和對(duì)需氧、微好氧或厭氧條件的要求。
培養(yǎng)基和碳底物用于本發(fā)明的生物發(fā)酵培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基或溶液)必須含有合適的碳底物，其根據(jù)生物催化劑的需要進(jìn)行選擇。合適的底物可以包括但不限于單糖(例如葡萄糖和果糖)，二糖(例如乳糖或蔗糖)，寡糖和多糖(例如淀粉或纖維素或其混合物)或來(lái)自可再生的原料的未純化的混合物(例如干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖蜜和大麥芽)。碳底物還可以是一碳底物(例如二氧化碳、甲醇或甲烷)。
除了合適的碳源外，生物發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的合適的礦物質(zhì)、鹽、微生物、輔因子、緩沖劑和其它組分(Bailey和Ollis，Biochemical Engineering Fundamentals，第2版；第383-384和620-622頁(yè)；McGraw-HillNew York(1986))。這些補(bǔ)充物必須適合于生物催化劑的生成，并促進(jìn)生成生物發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物所必須的酶途徑。
最后，能表達(dá)工業(yè)上有用的產(chǎn)物的功能基因可以由特定的生長(zhǎng)條件(例如氮、亞磷、硫、氧、碳或任何痕量微量營(yíng)養(yǎng)物(包括小無(wú)機(jī)離子)的形式和量)所調(diào)節(jié)、抑制或降低。功能基因的調(diào)節(jié)可以通過(guò)存在或不存在特定的調(diào)節(jié)分子(例如安慰誘導(dǎo)物)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述調(diào)節(jié)分子是加入到培養(yǎng)物中但是一般地不認(rèn)為是營(yíng)養(yǎng)物或能源。生長(zhǎng)速率也可以是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。
實(shí)施例在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步定義了本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)明白，盡管這些實(shí)施例顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但它們僅僅用于解釋目的。從上面的討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以明白本發(fā)明的基本特征，并且可以在不背離其精神和范圍的情況下作出本發(fā)明的各種變化和修飾，使其適用于各種用途和條件。
縮寫(xiě)的含義如下″h″代表小時(shí)，″min″代表分鐘，″sec″代表秒，″d″代表天，″mL″代表毫升，″L″代表升，″mM″代表毫摩爾，″nm″代表納米，″g″代表克，且″kg″代表千克，″HPLC″代表高效液相層析，″RI″代表折射率。
一般方法適用于細(xì)菌培養(yǎng)物的維持和生長(zhǎng)的材料和方法是本領(lǐng)域熟知的。適用于下面的實(shí)施例的技術(shù)可以參見(jiàn)Manual of Methods for GeneralBacteriology；Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Philips，編，American Society for MicrobiologyWashington，D.C.(1994)或BiotechnologyA Textbook ofIndustrial Microbiology；Brock，T.D.，第2版；SinauerAssoeiatesSunderland，MA(1989)。
通過(guò)HPLC監(jiān)控甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)變。使用層析領(lǐng)域的技術(shù)人員可獲得的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和物質(zhì)進(jìn)行分析。一種合適的方法使用WatersMaxima 820 HPLC系統(tǒng)，其采用UV(210nm)和RI檢測(cè)。將樣品注射到Shodex SH-1011柱(8mm×300mm，購(gòu)自Waters，Milford，MA)，其配備有Shodex SH-1011P前置柱(6mm×50mm)，溫度控制在50℃，使用0.01N H2SO4作為流動(dòng)相，流速0.5mL/分鐘。當(dāng)需要定量分析時(shí)，使用已知量的三甲基乙酸作為外標(biāo)物制備樣品。一般地，葡萄糖(RI檢測(cè))、甘油、1，3-丙二醇(RI檢測(cè))和三甲基乙酸(UV和RI檢測(cè))的保留時(shí)間分別是15.27分鐘、20.67分鐘、26.08分鐘和35.03分鐘。
實(shí)施例1短雙岐桿菌ATCC 15700的基因組測(cè)序短雙岐桿菌(ATCC 15700)購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，美國(guó)。得到細(xì)胞沉淀并懸浮在含有10mM Na-EDTA和50mMTris-HCl、pH 7.5的溶液中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從短雙岐桿菌(ATCC 15700)中分離出基因組DNA。根據(jù)公開(kāi)的方法制備基因組DNA和文庫(kù)構(gòu)建(Fraser等，Science 270(5235)397-403(1995))。
基因組DNA的制備懸浮后，在0.2％肌氨酸、20mM β-巰基乙醇和150單位/mL溶細(xì)胞酶中溫和地裂解細(xì)胞，并在37℃溫育30分鐘。用Tris-平衡的苯酚提取DNA兩次，再用氯仿提取兩次。使DNA在70％乙醇中沉淀，再懸浮到含有1mM Na-EDTA和10mM Tris-HCl、pH 7.5的溶液中。用核糖核酸酶的混合物處理DNA溶液，然后用Tris-平衡的苯酚提取兩次，再用氯仿提取兩次。然后在乙醇中沉淀，并懸浮到1mM Na-EDTA和10mM Tris-HCl、pH 7.5中。
文庫(kù)構(gòu)建將50~100μg染色體DNA懸浮到含有30％甘油、300mM醋酸鈉、1mM Na-EDTA，和10mM Tris-HCl、pH 7.5的溶液中，在Aeromist Downdraft Nebulizer室(IBI Medical products，Chicago，IL)中在12psi剪切60秒。沉淀、懸浮DNA，并用BAL-31核酸酶處理。在低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行大小分級(jí)后，將一個(gè)級(jí)分(2.0kb或5.0kb)切離、清潔，并使用T4 DNA連接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)連接到pUC18(Amersham Biosciences)的磷酸酶處理過(guò)的Sma I位點(diǎn)。將連接混合物上凝膠，切離代表了載體+一個(gè)插入的連接產(chǎn)物的DNA帶，用T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)處理，然后重新連接。用該兩步連接方法生產(chǎn)高效價(jià)的文庫(kù)，其具有超過(guò)99％的單一插入物。
測(cè)序采用鳥(niǎo)槍測(cè)序方法進(jìn)行整個(gè)微生物基因組的測(cè)序(Fleischmann，R.等，Science 269(5223)496-512(1995))。組合使用載體和插入物-特異性的引物，使用染料終止子技術(shù)(U.S.5,366,860；EP 272,007)，在ABI自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上進(jìn)行測(cè)序。在DNAStar(DNA Star Inc.，Madison，WI)或Wisconsin GCG程序(Wisconsin Package 9.0版，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，WI)和CONSED包(7.0版)中進(jìn)行序列編輯。所有序列代表在兩個(gè)方向上至少2倍的覆蓋度。使用Phred/Phrap軟件包(版本為0.961028.m/0.990319)進(jìn)行序列裝配。
實(shí)施例2碳水化合物降解基因的鑒別通過(guò)進(jìn)行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1993)；還參見(jiàn)，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索與包含在BLAST″nr″數(shù)據(jù)文庫(kù)中的序列(含有全部非多余的GenBank CDS翻譯，源自3-維結(jié)構(gòu)Brookhaven Protein Data Bank，SWISS-PROT蛋白序列數(shù)據(jù)文庫(kù)、EMBL和DDBJ數(shù)據(jù)文庫(kù)的序列)的相似性，鑒別出了編碼異淀粉酶活性的基因。使用國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，分析得到的序列與所有可公開(kāi)獲得的包含在″nr″數(shù)據(jù)文庫(kù)中的DNA序列的相似性。將DNA序列翻譯成所有可讀框，并使用NCBI提供的BLASTP算法(Gish和States，Nature Genetics 3266-272(1993))，對(duì)比與所有可公開(kāi)獲得的包含在″nr″數(shù)據(jù)文庫(kù)中的蛋白序列的相似性。
使用BLASTN或BLASTP算法進(jìn)行所有對(duì)比。BLAST對(duì)比的結(jié)果如表1所示，其總結(jié)了它們具有最大相似性的序列。表1顯示了基于BLASTP算法的數(shù)據(jù)，其含有以期望值表示的值。期望值(E-值)是不同比對(duì)的數(shù)目，所述比對(duì)的分?jǐn)?shù)等同于或高于在隨機(jī)數(shù)據(jù)文庫(kù)搜索中預(yù)期得到的特定分?jǐn)?shù)S。E-值越小，分?jǐn)?shù)的顯著性越大。
表1

a％相同性定義為兩種蛋白之間相同的氨基酸的百分比。
b％相似性定義為兩種蛋白之間相同的或保守的氨基酸的百分比。
c期望值。該期望值估計(jì)了與給定分?jǐn)?shù)的匹配的統(tǒng)計(jì)顯著性，說(shuō)明了匹配的數(shù)目，該分?jǐn)?shù)是在絕對(duì)隨機(jī)地搜索該大小的數(shù)據(jù)文庫(kù)時(shí)所預(yù)期的。
實(shí)施例3含有變異鏈球菌dexB基因的大腸桿菌中的胞內(nèi)異淀粉酶的活性為了克隆dexB基因，使用Jagusztyn等(J.Gen.Microbiol.1281135-1145(1982))所述方法從變異鏈球菌(ATCC 25175D)分離出基因組DNA。
在變異鏈球菌(dexB)DNA序列(Ferretti等，Infection andImmunity 561585-1588(1988))的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了寡核苷酸引物(SEQID NO7和SEQ ID NO8)，且包括BamHI和SalI限制位點(diǎn)。使用包含在HotStartTaqTM試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)中的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法擴(kuò)增dexB基因。反應(yīng)物含有1ng基因組DNA和1μm每種引物。用BamHI和SalI酶消化得到的1.6kb DNA片段。將消化的片段直接克隆進(jìn)質(zhì)粒pTRC99a(ampR)(Amersham-Pharmacia，Amersham，英國(guó))，得到與LacZ基因的翻譯融合體。該命名為pTRC99-dexB的質(zhì)粒還含有LacZ基因的前10個(gè)氨基酸的編碼序列，其在表達(dá)后融合到天然DexB蛋白的N-末端。使用生產(chǎn)商的方法(Invitrogen，Carlsbad，CA)，將pTRC99-dexB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α細(xì)胞中，并涂布到含有100μg/mL氨芐青霉素的Luria Broth(LB)培養(yǎng)基上。
在大腸桿菌中表達(dá)后，從粗蛋白提取物估計(jì)異淀粉酶活性。在LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)大腸桿菌DH5α/pTRC99-dexB的單一菌落，然后在新鮮的LB培養(yǎng)基(3.0mL)中以1∶100稀釋，在37℃再培養(yǎng)2小時(shí)。該培養(yǎng)后，通過(guò)加入異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至1mM的終濃度誘導(dǎo)DexB基因。另外培養(yǎng)2小時(shí)后，從誘導(dǎo)的細(xì)胞提取粗蛋白。為了分離粗蛋白提取物，通過(guò)離心(1×8000g)收集細(xì)胞，然后懸浮到0.5mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH 6.8)中。超聲處理懸浮液，以釋放出總細(xì)胞蛋白，離心(1×14,000g)除去細(xì)胞碎片。通過(guò)與異麥芽糖、或分開(kāi)地與潘糖在10mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中在37℃溫育2小時(shí)，檢測(cè)上清液中的總蛋白的異淀粉酶活性。通過(guò)高效陰離子交換層析(HPAEC)表征反應(yīng)產(chǎn)物。
為了進(jìn)行HPAEC，以下述方式制備和分析樣品。與異麥芽糖或潘糖溫育2小時(shí)后，通過(guò)0.22μM Spin-X(R)離心管過(guò)濾器(Costar，Corning，NY)過(guò)濾總蛋白提取物，并用無(wú)菌過(guò)濾水稀釋。使用PA10柱以100mM氫氧化鈉作為洗脫劑和0-150mM醋酸鈉線性梯度，通過(guò)HPAEC(Dionex，Sunnyvale，CA)分析樣品。使用pTRC99-dexB細(xì)胞提取物降解異麥芽糖的結(jié)果如表2所示。通過(guò)與pTRC99-dexB細(xì)胞提取物溫育降解潘糖和形成的產(chǎn)物如表3所示。
表2DexB粗蛋白提取物與異麥芽糖的活性(250μg/mL)

ND＝未檢出表3DexB粗蛋白提取物與潘糖的活性(150μg/mL)

ND＝未檢出實(shí)施例4短雙岐桿菌異淀粉分解基因在大腸桿菌中的表達(dá)將來(lái)自短雙岐桿菌(ATCC 15700)文庫(kù)的幾個(gè)可讀框鑒別為推定的備選基因，其具有針對(duì)α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的活性(實(shí)施例2)。使用含有α(1，6)-連接的葡萄糖的寡糖，選擇了3個(gè)推定的克隆mbc1g.pk007.h12(h12)、mbc1g.pk026.k1(k1)和mbc2g.pk018.j20(j20)來(lái)詳細(xì)表征異淀粉分解活性。
將含有克隆的在來(lái)自實(shí)施例1的pUC18中的推定的異淀粉分解雙歧桿菌屬基因的全長(zhǎng)編碼序列的大腸桿菌DH5α菌株接種到LB培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)。20小時(shí)后，將培養(yǎng)物在新鮮LB培養(yǎng)基中稀釋(1∶100)，并在37℃另外培養(yǎng)3-4小時(shí)。如實(shí)施例3所述從細(xì)胞中制備總蛋白提取物。通過(guò)與異麥芽糖、或分開(kāi)地與潘糖在10mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中在37℃溫育2小時(shí)，檢測(cè)上清液中的總蛋白的異淀粉分解活性。如實(shí)施例3所述，制備樣品并通過(guò)高效陰離子交換層析(HPAEC)表征反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果表明，從克隆h12、k1和j20生成的酶將異麥芽糖降解成了葡萄糖(表4)。
表4短雙歧桿菌粗提取物與異麥芽糖的活性(150μg/mL)

ND＝未測(cè)出將總蛋白提取物與潘糖(250μg/mL)溫育2小時(shí)，然后通過(guò)0.22μM Spin-X(R)離心管過(guò)濾器(Costar，Corning，NY)過(guò)濾。如實(shí)施例3所述通過(guò)HPAEC分析樣品。溫育后的潘糖的消失表明，從克隆h12、k1和j20生成的酶能降解潘糖。圖1表明，克隆h12能將潘糖徹底降解為葡萄糖(還顯示了陰性對(duì)照，大腸桿菌DH5α中的質(zhì)粒pUC18)。圖1還表明，來(lái)自k1和j20克隆的酶能將潘糖降解成葡萄糖和麥芽糖。
實(shí)施例5天然短雙歧桿菌j20異淀粉酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)天然短雙岐桿菌基因j20(從實(shí)施例1得到)似乎在成熟編碼序列的NH-端具有信號(hào)肽(通過(guò)pSort預(yù)測(cè)軟件檢測(cè)；Nakai和Kanehisa，Expert，PROTEINSStructure，F(xiàn)unction and Genetics 1195-110(1991))。編碼α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖水解活性的短雙岐桿菌j20基因的核酸和氨基酸序列分別是SEQ ID NO30和SEQ ID NO31。
因此，使用完整的全細(xì)胞測(cè)試了異麥芽糖的代謝。這是通過(guò)將能表達(dá)j20基因的大腸桿菌DH5α細(xì)胞的單一菌落在含有異麥芽糖(500μg/mL)的LB培養(yǎng)基中、在37℃培養(yǎng)24小時(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。培養(yǎng)后，從培養(yǎng)基中除去細(xì)胞，并通過(guò)實(shí)施例3所述HPAEC方法制備和分析培養(yǎng)基。通過(guò)與陰性對(duì)照(只含有原始pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α細(xì)胞)相比異麥芽糖降低的水平，證實(shí)了在能表達(dá)短雙歧桿菌j20基因的細(xì)胞中存在胞外的異淀粉酶活性。表5中的結(jié)果表明，能表達(dá)天然j20基因的大腸桿菌細(xì)胞降解了胞外供給的異麥芽糖。
表5天然的j20基因代謝的異麥芽糖

實(shí)施例6變異鏈球菌dexB和短雙歧桿菌異淀粉酶的胞外導(dǎo)向因?yàn)槎屉p岐桿菌k1和變異鏈球菌dexB基因似乎不合有天然的信號(hào)肽(pSort預(yù)測(cè)軟件；Nakai和Kanehisa，Expert，PROTEINSStructure，F(xiàn)unction and Genetics 1195-110(1991))，通過(guò)PCR方法將成熟的編碼序列在翻譯融合體中連接到信號(hào)肽上，以進(jìn)行胞外表達(dá)。
在從質(zhì)粒pBE505(Borehert和Nagarajan，J.Bacteriol.173276-282(1991))和pBE311(Nagarajan和Borchert，Res.Microbiol.142787-792(1991))開(kāi)始的一系列步驟中，構(gòu)建了含有枯草芽孢芽孢桿菌堿性和中性蛋白酶基因的模塊表達(dá)載體。用限制酶KpnI和NruI消化質(zhì)粒。分離得到的來(lái)自pBE505的969個(gè)堿基對(duì)的KpnI-NruI片段，并連接到來(lái)自pBE311的7.2kb的大KpnI-NruI片段中，生成pBE559。
然后用限制酶KpnI和EcoRV消化質(zhì)粒pBE559和pBE597(Chen和Nagarajan，J.Bacteriol.1755697-5700(1993))。將來(lái)自pBE559的941個(gè)堿基對(duì)的KpnI-EcoRV片段連接到來(lái)自pBE597的8.9kb的KpnI-EcoRV片段，生成質(zhì)粒pBE592。
將質(zhì)粒pBE26(Ribbe和Nagarajan，Mol.Gen.Genet.235333-339(1992))用作擴(kuò)增解淀粉芽孢桿菌堿性蛋白酶(apr)啟動(dòng)子區(qū)域的模板，其中使用實(shí)施例3所述PCR方法。設(shè)計(jì)并合成了寡核苷酸引物SEQ ID NO9，以在堿性蛋白酶信號(hào)斷裂位點(diǎn)導(dǎo)入NheI限制位點(diǎn)，并緊鄰該斷裂位點(diǎn)在下游導(dǎo)入EcoRV限制位點(diǎn)。寡核苷酸引物SEQID NO10用于退火到pBE26中的apr啟動(dòng)子區(qū)域的上游的5′多接頭區(qū)。使用所述引物和質(zhì)粒pBE26模板DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。用KpnI和EcoRV消化得到的1.2kb的PCR產(chǎn)物，并連接到來(lái)自pBE592的大KpnI-EcoRV片段，生成質(zhì)粒pBE92。
將質(zhì)粒pBE80(Nagarajan等，Gene 11412-126(1992))用作擴(kuò)增解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶(npr)啟動(dòng)子區(qū)域的模板，其中使用實(shí)施例3所述PCR方法。設(shè)計(jì)并合成了下游引物SEQ ID NO11，以在中性蛋白酶信號(hào)斷裂位點(diǎn)導(dǎo)入NheI限制位點(diǎn)，并緊鄰該斷裂切位點(diǎn)在下游導(dǎo)入EcoRV限制位點(diǎn)。引物SEQ ID NO12用于退火到pBE80中的Npr啟動(dòng)子的5′區(qū)。使用所述引物和DNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。用KpnI和EcoRV酶促地消化得到的350個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物，并連接到來(lái)自pBE592的大KpnI-EcoRV片段，生成質(zhì)粒pBE93。
使用表6所述寡核苷酸引物，將k1和dexB基因翻譯地融合到在載體pBE92和pBE93中的枯草芽孢桿菌堿性和中性蛋白酶基因的信號(hào)肽。通過(guò)實(shí)施例3所述方法，使用分別來(lái)自短雙岐桿菌(ATCC 15700)或pTRC99-dexB質(zhì)粒的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
用工程地加入了NheI和BamHI位點(diǎn)的寡核苷酸引物SEQ ID NO14和SEQ ID NO15擴(kuò)增1.8kb的k1基因DNA片段。含有NheI和SalI限制酶位點(diǎn)的寡核苷酸引物SEQ ID NO13和SEQ ID NO8擴(kuò)增了1.6kb的dexB基因DNA片段。用合適的酶消化該片段，并克隆進(jìn)模塊載體pBE92和pBE93中。
得到的質(zhì)粒(分別命名為pBE92-dexB、pBE93-dexB、pBE92-k1和pBE93-k1)含有翻譯地融合到信號(hào)肽的天然酶，所以該信號(hào)肽斷裂位點(diǎn)(Ala Ser Ala)是保守的。連接到短雙岐桿菌k1基因的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶信號(hào)肽的核酸和氨基酸序列分別是SEQ ID NO40和41。連接到變異鏈球菌dexB基因的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶信號(hào)肽的核酸和氨基酸序列分別是SEQ ID NO42和43。使用生產(chǎn)商的方法(Invitrogen，Carlsbad，CA)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α細(xì)胞中，并涂布到含有氨芐青霉素(100μg/mL)的Luria Broth(LB)培養(yǎng)基上。
通過(guò)接種3.0mL含有氨芐青霉素(100μg/mL)和異麥芽糖(0.250mg/mL)的LB培養(yǎng)基，研究了含有pBE93(陰性對(duì)照)、pBE93-dexB或pBE93-k1質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α細(xì)胞的活性特征。該細(xì)胞在37℃生長(zhǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)后，從培養(yǎng)基中除去細(xì)胞，并通過(guò)實(shí)施例3所述方法制備和分析。通過(guò)與陰性對(duì)照(只含有原始pBE92質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α細(xì)胞)相比異麥芽糖降低的水平，證實(shí)了在含有pBE93、pBE93-dexB或pBE93-k1質(zhì)粒的細(xì)胞中存在胞外的異淀粉酶活性。表6中的結(jié)果表明，Npr-基因融合蛋白降解了胞外供給的異麥芽糖。
表6大腸桿菌DH5α細(xì)胞中的DexB和K1胞外融合蛋白的活性

含有pBE93-dexB或pBE93-k1質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α細(xì)胞降解了異麥芽糖；但是，在含有異麥芽糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)是對(duì)異淀粉酶活性的更嚴(yán)格的測(cè)試。因此，將pBE93-dexB和pBE93-k1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)了大腸桿菌菌株FM5。與DH5α不同，F(xiàn)M5菌株具有在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力，該培養(yǎng)基除了碳源以外僅含有鹽和痕量金屬(Maniatis等(1982)Molecular Cloning；LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y；Neidhardt(1987)Escherichia coli and Salmonellatyphimurium，ASM Press，Washington，DC)。與DH5α菌株類似，天然的FM5細(xì)胞不能利用異麥芽糖作為碳源。為了證實(shí)這一點(diǎn)，將用質(zhì)粒pBE93轉(zhuǎn)化的FM5細(xì)胞接種到含有葡萄糖(1mg/mL)或異麥芽糖(1mg/mL)的M9培養(yǎng)基(Maniatis等，同上；Neidhardt，同上)中，在37℃培養(yǎng)至少20小時(shí)。20小時(shí)后，在含有葡萄糖的燒瓶中觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)，但是即使培養(yǎng)60小時(shí)后也未在含有異麥芽糖的燒瓶中觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)。
與陰性對(duì)照不同，含有Npr-DexB和Npr-k1融合蛋白(分別是pBE93-dexB和pBE93-k1)的FM5細(xì)胞在含有異麥芽糖的M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)后生長(zhǎng)良好。為此實(shí)驗(yàn)，將FM5/pBE93、FM5/pBE93-dexB和FM5/pBE93-k1菌株接種到2.0mL M9培養(yǎng)基中，其中補(bǔ)充了葡萄糖或異麥芽糖(1mg/mL)作為唯一碳源。表7所示的結(jié)果表明，當(dāng)翻譯融合地連接到Npr信號(hào)肽上的dexB或k1基因在FM5細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，異麥芽糖被代謝，且支持細(xì)胞的生長(zhǎng)。
表7大腸桿菌FM5細(xì)胞中的DexB和K1胞外融合蛋白的活性

實(shí)施例7Npr-dexB和Npr-k1融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)增強(qiáng)了各種發(fā)酵產(chǎn)物的合成當(dāng)提供糖類混合物作為碳源時(shí)，生產(chǎn)宿主的代謝含有α(1，6)-連接的葡萄糖殘基的寡糖的能力會(huì)提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。通過(guò)首先將質(zhì)粒pBE93-dexB和pBE93-k1轉(zhuǎn)化進(jìn)工程化的生產(chǎn)甘油的細(xì)胞系中，測(cè)試了Npr-dexB和Npr-k1融合蛋白的降解α(1，6)-鍵的能力。
用1微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株RJ8n(ATCC PTA-4216)，其還含有質(zhì)粒pSYCO101(specR)(描述于美國(guó)專利申請(qǐng)10/420,587，在本文中引作參考)，其編碼來(lái)自釀酒糖酵母(Saccharomycescerevisiase)的DAR1和GPP2基因和來(lái)自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的dhaB和orf操縱子。當(dāng)加入維生素B12時(shí)，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株能從葡萄糖生產(chǎn)甘油和1，3-丙二醇。從葡萄糖生產(chǎn)甘油和1，3-丙二醇的方法詳細(xì)地描述在美國(guó)專利號(hào)6,358,716和美國(guó)專利號(hào)6,013,494中，它們?cè)诒疚闹幸鲄⒖?。將轉(zhuǎn)化的RJ8n細(xì)胞涂布到含有50μg/mL壯觀霉素和100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上。將單一菌落接種到2.0mL TM2培養(yǎng)基(磷酸鉀7.5g/L；檸檬酸2.0g/L；硫酸銨3.0g/L；硫酸鎂2.0g/L；氯化鈣0.2g/L；檸檬酸鐵銨0.33g/L；酵母提取物(Difco-BD，Sparks，MD)5.0g/L；痕量元素(硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈷、硫酸錳、硫酸鐵、氯化鈉)；氫氧化銨調(diào)pH至6.5；還含有葡萄糖或異麥芽糖(1mg/mL)。培養(yǎng)物在37℃生長(zhǎng)24小時(shí)。通過(guò)實(shí)施例3所述方法制備和分析細(xì)胞。
在用葡萄糖作為碳源的TM2培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，在僅含有質(zhì)粒pSYCO101的大腸桿菌RJ8n細(xì)胞中表現(xiàn)出甘油積累(表8)。但是，當(dāng)用異麥芽糖替代培養(yǎng)基中的葡萄糖時(shí)，該陰性對(duì)照系生產(chǎn)了可忽略水平的甘油，這表明α(1，6)-連接的葡萄糖不支持發(fā)酵產(chǎn)物的積累。相反地，當(dāng)提供異麥芽糖或葡萄糖作為唯一碳源時(shí)，在含有質(zhì)粒pSYCO101和pBE93-dexB或pBE93-k1的大腸桿菌RJ8n中生產(chǎn)了甘油(表8)。當(dāng)異麥芽糖用作碳源時(shí)，與陰性對(duì)照系、只含有pSYCO101的RJ8n相比，含有pBE93-dexB和pSYCO101質(zhì)粒的大腸桿菌RJ8n生產(chǎn)的甘油高8～9倍。與陰性對(duì)照相比，利用異麥芽糖的含有pSYCO101和pBE93-k1的系的甘油積累是6～10倍。表8中的數(shù)據(jù)表明，Npr-dexB或Npr-k1基因的表達(dá)使供給了異麥芽糖的培養(yǎng)物生產(chǎn)甘油。該數(shù)據(jù)還表明，無(wú)論碳源是葡萄糖還是異麥芽糖，積累的產(chǎn)物的水平都與含有融合蛋白的培養(yǎng)物相當(dāng)。
表8Npr-DexB或Npr-K1的表達(dá)造成的甘油積累

通過(guò)在含有潘糖(1mg/mL)的TM2培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并與使用葡萄糖作為底物(1mg/mL)的相同系的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)一步表征了含有質(zhì)粒pSYCO101和pBE93-k1的大腸桿菌系RJ8n使用α(1，6)-連接的葡萄糖作為底物生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的能力。
表9中的數(shù)據(jù)還表明，當(dāng)提供潘糖作為T(mén)M2培養(yǎng)基中的唯一碳水化合物源時(shí)，僅含有質(zhì)粒pSYCO101的大腸桿菌菌株RJ8n(陰性對(duì)照)不能合成甘油。但是，當(dāng)該相同菌株中存在質(zhì)粒pBE93-k1且在含有潘糖的TM2培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，能生產(chǎn)甘油。當(dāng)提供葡萄糖或潘糖作為碳水化合物源時(shí)，含有質(zhì)粒pSYCO101和pBE93-k1的大腸桿菌RJ8n中的甘油積累是相當(dāng)?shù)摹?br> 表9Npr-K1的表達(dá)造成的甘油積累

上述數(shù)據(jù)表明，當(dāng)異麥芽糖或潘糖代表了培養(yǎng)基中的唯一碳水化合物源時(shí)，Npr-dexB或Npr-k1融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)會(huì)增強(qiáng)甘油的生產(chǎn)。通過(guò)使用相同的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)合成另一種發(fā)酵產(chǎn)物(1，3-丙二醇)證實(shí)了，該結(jié)果不只是限于甘油的生產(chǎn)。
將用質(zhì)粒pSYCO101和pBE93-dexB或pBE93-k1轉(zhuǎn)化的RJ8n細(xì)胞接種到2.0mL TM2培養(yǎng)基(如上所述)中，其還含有葡萄糖(1mg/mL)或異麥芽糖(1mg/mL)和維生素B12(100ng/L)。培養(yǎng)物在37℃生長(zhǎng)20小時(shí)。通過(guò)實(shí)施例3所述方法制備和分析細(xì)胞。
表10中的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)在僅含有異麥芽糖作為碳水化合物源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，陰性對(duì)照系(RJ8n/pSYCO101)不能合成1，3-丙二醇。但是，當(dāng)Npr-dexB或Npr-k1融合蛋白在RJ8n細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，表現(xiàn)出異麥芽糖的代謝。這導(dǎo)致了發(fā)酵產(chǎn)物1，3-丙二醇的積累。該數(shù)據(jù)還表明，當(dāng)提供葡萄糖或異麥芽糖作為唯一的碳水化合物時(shí)，能表達(dá)Npr-dexB或Npr-k1融合蛋白的RJ8n細(xì)胞合成的1，3-丙二醇水平是相當(dāng)?shù)摹?br> 表10Npr-dexB或Npr-k1的表達(dá)造成的1，3-丙二醇積累

ND＝未測(cè)出實(shí)施例8短雙歧桿菌k1基因在使用可變啟動(dòng)子的大腸桿菌中的表達(dá)用可變啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)優(yōu)選基因的表達(dá)通常是非常理想的?？勺儐?dòng)子可以用于改變基因表達(dá)的水平或定時(shí)，從而提高優(yōu)選底物的利用。
通過(guò)將質(zhì)粒pBE93-k1(實(shí)施例6)中的中性蛋白酶啟動(dòng)子替換為葡萄糖異構(gòu)酶(GI)啟動(dòng)子和GI-啟動(dòng)子的變體，證實(shí)了使用可變啟動(dòng)子的短雙歧桿菌k1異淀粉酶基因的有效表達(dá)。Streptomyces lividinsGI-啟動(dòng)子的分離和變體啟動(dòng)子的產(chǎn)生描述在美國(guó)專利申請(qǐng)10/420,587中。在替換NPR-啟動(dòng)子之前，對(duì)中性蛋白酶信號(hào)肽的非編碼核苷酸序列和k1基因進(jìn)行了修飾。該序列修飾產(chǎn)生了限制酶位點(diǎn)，它們將用于隨后的克隆步驟。
通過(guò)使用引物SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19的PCR，將限制酶位點(diǎn)SacI和PacI分別加入到中性蛋白酶信號(hào)肽和k1基因序列的5′和3′-端。通過(guò)實(shí)施例3所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分離1919個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物，并連接到如美國(guó)專利申請(qǐng)10/420,587所公開(kāi)的pSYCO109mcs野生型GI yqhD質(zhì)粒，其也用酶SacI和PacI消化過(guò)。得到的質(zhì)粒含有野生型GI啟動(dòng)子和翻譯融合地連接到k1基因的NPR-信號(hào)序列。該構(gòu)建體命名為WTGI-ss-K1。還用變體GI啟動(dòng)子指導(dǎo)NPR-信號(hào)肽/K1融合體的表達(dá)。使用SacI和PacI限制酶位點(diǎn)，將從使用引物SEQ ID NO18和SEQ ID NO19的反應(yīng)得到的1919個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物置入pSYCO109mcs-短1.6 GI yqhD質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒命名為L(zhǎng)owGI-ss-K1。當(dāng)可操作地連接到y(tǒng)qhD基因時(shí)，與野生型GI啟動(dòng)子-yqhD構(gòu)建體相比，該變體啟動(dòng)子以前表現(xiàn)出指導(dǎo)低水平的基因表達(dá)(美國(guó)專利申請(qǐng)10/420,587)。
通過(guò)活性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了使用野生型和變體GI啟動(dòng)子的k1基因的有效表達(dá)。用質(zhì)粒WTGI-ss-K1和LowGI-ss-K1轉(zhuǎn)化了大腸桿菌細(xì)胞(菌株DH5α，Invitrogen，Carlsbad，CA)，在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。通過(guò)離心回收細(xì)胞沉淀，懸浮到1/10體積的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH7.0)中。用弗氏壓碎器裂解懸浮液中的細(xì)胞，通過(guò)離心除去細(xì)胞碎片。通過(guò)Bradford實(shí)驗(yàn)(Bio-Rad，Hercules，CA)檢測(cè)總蛋白濃度。使用4-硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷(PNPG，Sigma，ST.Louis，MO)檢測(cè)總蛋白分離物中的k1基因產(chǎn)物的活性。將來(lái)自含有質(zhì)粒WTGI-ss-K1、LowGI-ss-K1、NPR-ss-K1(陽(yáng)性對(duì)照)和pSYCO109(陰性對(duì)照)的細(xì)胞的總蛋白提取物在10mM磷酸鈉緩沖液(含有10mM PNPG)中在30℃溫育多達(dá)30分鐘。從PNPG釋放出的葡萄糖殘基導(dǎo)致PNP積累，其吸收400nm光。通過(guò)在400nm波長(zhǎng)的吸光度，監(jiān)控了k1酶活性直接導(dǎo)致的PNP積累隨時(shí)間的變化。下面的表11表明，除了中性蛋白酶啟動(dòng)子之外的啟動(dòng)子可以用于指導(dǎo)有活性的K1基因的表達(dá)。該結(jié)果還表明，可變啟動(dòng)子可以用于改變K1表達(dá)水平，且K1活性與相關(guān)的啟動(dòng)子強(qiáng)度水平相對(duì)應(yīng)。
表11K1酶活性導(dǎo)致的PNP生產(chǎn)速率

實(shí)施例9短雙歧桿菌k1基因向大腸桿菌基因組的整合所需DNA向細(xì)胞基因組中的整合可以增強(qiáng)基因表達(dá)隨時(shí)間過(guò)去和在各種發(fā)酵條件下的穩(wěn)定性。但是，整合位置會(huì)影響基因表達(dá)水平，并最終影響所需酶活性的有效性。
通過(guò)首先克隆進(jìn)質(zhì)粒pKD3(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.976640-6645(2000))中，完成了k1表達(dá)盒(NPR啟動(dòng)子-信號(hào)肽-k1基因)向大腸桿菌(菌株FM5)基因組的整合，并證實(shí)了使用α(1，6)-連接的葡萄糖底物的利用。選擇了宿主的aldA(醛脫氫酶A)和aldB(醛脫氫酶B)基因組位點(diǎn)用于整合。將PCR引物設(shè)計(jì)成與質(zhì)粒pKD3、aldA或aldB和k1基因序列(SEQ ID NO20至23)同源。
通過(guò)實(shí)施例3所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分離從引物SEQ ID NO.21-23的反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物和含有k1表達(dá)盒的質(zhì)粒pKD3，連接并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌(FM5)。通過(guò)在含有氯霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，選擇含有整合的k1表達(dá)盒的細(xì)胞。使用引物SEQ ID NO7和SEQ ID NO8，通過(guò)PCR反應(yīng)檢測(cè)氯霉素陽(yáng)性菌落中k1基因的存在。
通過(guò)在含有異麥芽糖作為唯一碳水化合物源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)分析，進(jìn)一步檢測(cè)了含有整合的k1表達(dá)盒的FM5系的活性。將氯霉素和PCR陽(yáng)性的菌落接種到含有0.5％異麥芽糖(w/v)的TM2培養(yǎng)基(見(jiàn)實(shí)施例7)中，在35℃生長(zhǎng)。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，通過(guò)光密度(A600nm)和異麥芽糖消耗(通過(guò)HPLC，參考一般方法)表征細(xì)胞物質(zhì)積累。
下面的表12表明，F(xiàn)M5細(xì)胞本身不能代謝作為唯一碳水化合物源提供的異麥芽糖。當(dāng)在含有0.5％異麥芽糖的TM2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，低水平的細(xì)胞物質(zhì)積累證實(shí)了這一點(diǎn)。觀察到了陰性系FM5的低水平生長(zhǎng)，但僅僅是由于小量的可發(fā)酵的麥芽糖污染了異麥芽糖源材料(Sigma，St.Louis，MO)。含有整合的K1表達(dá)盒的細(xì)胞于高得多的速率生長(zhǎng)，并在培養(yǎng)25小時(shí)后達(dá)到更高的最終光密度。將含有整合在aldA位點(diǎn)的k1表達(dá)盒的PCR-陽(yáng)性的菌落命名為A2-3。將含有整合在aldB位點(diǎn)的k1表達(dá)盒的PCR陽(yáng)性的菌落命名為B1-1和B1-2。
表12細(xì)胞物質(zhì)積累(A600nm)

還通過(guò)HPLC分析，將含有整合的k1表達(dá)盒的細(xì)胞對(duì)異麥芽糖的消耗與FM5陰性對(duì)照系進(jìn)行了對(duì)比。表13中的數(shù)據(jù)表明，與不能利用該碳水化合物的陰性對(duì)照相比，整合后的k1表達(dá)盒是有活性的，并且能使細(xì)胞徹底利用可獲得的含有α(1，6)-連接的葡萄糖的糖。該數(shù)據(jù)還表明，在基因已經(jīng)整合進(jìn)aldA位點(diǎn)的系中，異麥芽糖的消耗速率與整合進(jìn)aldB位點(diǎn)的不同。
表13異麥芽糖消耗(g/L)

權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其編碼能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽，該核酸分子選自(a)分離的核酸分子，其編碼SEQ ID NO2、4或6的氨基酸序列；(b)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(a)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗滌；和(c)核酸分子，其與(a)或(b)互補(bǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其選自SEQ ID NO1、3和5的核酸分子。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸分子編碼的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其選自SEQ ID NO2、4和6。
5.一種分離的核酸分子，其編碼能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽，該核酸分子選自(a)分離的核酸分子，其編碼由可操作地連接到能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽的信號(hào)肽組成的嵌合蛋白；(b)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(a)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗滌；和(c)核酸分子，其與(a)或(b)互補(bǔ)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的分離的核酸分子，其中所述信號(hào)肽是SEQ ID NO24或SEQ ID NO25。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的分離的核酸分子，其中所述能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽是SEQ ID NO2、4、6、17或31。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的分離的核酸分子，其中所述信號(hào)肽是SEQ ID NO24或SEQ ID NO25，且其中所述能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽是SEQ ID NO2、4、6、17或31。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的分離的核酸分子，其中所述信號(hào)肽由SEQ ID NO26或SEQ ID NO27所述信號(hào)序列編碼。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的編碼能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽的分離的核酸分子，所述分離的核酸分子具有SEQ ID NO1、SEQ IDNO5、SEQ ID NO16或SEQ ID NO30所述序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的分離的核酸分子，其選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO28、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40或SEQ ID NO42。
12.權(quán)利要求5的核酸分子編碼的多肽。
13.權(quán)利要求9、10或11的分離的核酸分子編碼的多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的多肽，其選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO29、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ ID NO41和SEQ ID NO43。
15.嵌合基因，其含有可操作地連接到合適的調(diào)控序列的權(quán)利要求1或5的分離的核酸分子。
16.權(quán)利要求15的嵌合基因，其中所述合適的調(diào)控序列選自CYC1，HIS3，GAL1，GAL10，ADH1，PCK，PHO5，GAPDH，ADC1，TRP1，URA3，LEU2，ENO，TPI，AOX1，lac，ara，tet，trp，IPL，IPR，T7，tac，trc，apr，npr，nos和GI。
17.載體，其含有權(quán)利要求15的嵌合基因。
18.轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求15的嵌合基因。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述嵌合基因整合在染色體中或是質(zhì)粒-攜帶的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、酵母和絲狀真菌。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞選自曲霉屬、木霉菌屬、糖酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、紅球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、節(jié)桿菌屬、短桿菌屬、食酸菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、埃希氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、假單胞菌屬和棒桿菌屬。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
23.一種在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)靶分子的方法，其包括(a)在存在極限糊精、在合適的條件下接觸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含(i)分離的核酸分子，其編碼由可操作地連接到能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽的信號(hào)肽組成的嵌合蛋白；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1XSSC，0.1％ SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)；和(iv)至少一種用于將單糖轉(zhuǎn)化成靶分子的嵌合基因，由此生成靶分子；和(b)任選地回收(a)中生成的靶分子。
24.一種在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)甘油的方法，其包括(a)在存在極限糊精、在合適的條件下接觸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含(i)分離的核酸分子，其編碼由可操作地連接到能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽的信號(hào)肽組成的嵌合蛋白；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1XSSC，0.1％ SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)；和(iv)至少一種用于將單糖轉(zhuǎn)化成甘油的嵌合基因，由此生成甘油；和(b)任選地回收(a)中生成的甘油。
25.一種在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，其包括(a)在存在極限糊精、在合適的條件下接觸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含(i)分離的核酸分子，其編碼由可操作地連接到能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽的信號(hào)肽組成的嵌合蛋白；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1XSSC，0.1％ SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)；和(iv)至少一種用于將單糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的嵌合基因，由此生成1，3-丙二醇；和(b)任選地回收(a)中生成的1，3-丙二醇。
26.一種在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)細(xì)胞物質(zhì)的方法，其包括(a)在存在極限糊精、在合適的條件下接觸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含(i)分離的核酸分子，其編碼由可操作地連接到能水解α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖的多肽的信號(hào)肽組成的嵌合蛋白；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1XSSC，0.1％ SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)；和(b)任選地回收(a)中生成的細(xì)胞物質(zhì)。
27.根據(jù)權(quán)利要求23、24、25或26的方法，其中所述信號(hào)肽包含SEQ ID NO24或SEQ ID NO25。
28.一種在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)靶分子的方法，其包括(a)在存在極限糊精、在合適的條件下接觸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含(i)分離的核酸分子，其編碼選自SEQ ID NO2、6、17和31的氨基酸序列；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1XSSC，0.1％ SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)；和(iv)至少一種用于將單糖轉(zhuǎn)化成靶分子的嵌合基因，由此生成靶分子；和(b)任選地回收(a)中生成的靶分子。
29.一種在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，其包括(a)在存在極限糊精、在合適的條件下接觸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含(i)分離的核酸分子，其編碼選自SEQ ID NO2、6、17和31的氨基酸序列；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1XSSC，0.1％ SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)；和(iv)至少一種用于將單糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的嵌合基因，由此生成1，3-丙二醇；和(b)任選地回收(a)中生成的1，3-丙二醇。
30.一種在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)甘油的方法，其包括(a)在存在極限糊精、在合適的條件下接觸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含(i)分離的核酸分子，其編碼選自SEQ ID NO2、6、17和31的氨基酸序列；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1XSSC，0.1％ SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)；和(iv)至少一種用于將單糖轉(zhuǎn)化成甘油的嵌合基因，由此生成甘油；和(b)任選地回收(a)中生成的甘油。
31.一種在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)細(xì)胞物質(zhì)的方法，其包括(a)在存在極限糊精、在合適的條件下接觸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含(i)分離的核酸分子，其編碼選自SEQ ID NO2、6、17和31的氨基酸序列；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，用2X SSC，0.1％S DS洗滌，然后用0.1XSSC，0.1％ SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)；由此生成細(xì)胞物質(zhì)；和(b)任選地回收(a)中生成的細(xì)胞物質(zhì)。
32.根據(jù)權(quán)利要求28、29、30或31的方法，其中所述信號(hào)肽包含SEQ ID NO24或SEQ ID NO25。
33.一種降解極限糊精的方法，其包括(a)使轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在合適的生長(zhǎng)條件下接觸有效量的極限糊精底物，所述宿主細(xì)胞包含(i)核酸分子，其編碼選自SEQ ID NO2、6、17和31的酶；(ii)核酸分子，其能在下述雜交條件下與(i)雜交0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，用2X SSC，0.1％ SDS洗滌，然后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗滌；或(iii)核酸分子，其與(i)或(ii)互補(bǔ)；和(b)任選地回收步驟(a)的產(chǎn)物。
34.多肽，當(dāng)在BLASTP比對(duì)方法的基礎(chǔ)上與具有SEQ ID NO17所述序列的多肽相比較時(shí)，其氨基酸序列具有至少69％的相同性，所述多肽具有α(1，6)-連接的葡萄糖寡糖水解活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及在發(fā)酵工藝中使用低純化的淀粉的方法。一個(gè)實(shí)例是，具有外源性胞外異淀粉酶活性的重組大腸桿菌能在發(fā)酵中利用含有(1，6)鍵的小寡聚體(包括但不限于異麥芽糖和潘糖)來(lái)生產(chǎn)有用的產(chǎn)物。通過(guò)降低底物碳水化合物的成本，本發(fā)明可以用于大規(guī)模的工業(yè)生物發(fā)酵。
文檔編號(hào)C12P7/20GK1705750SQ03824541
公開(kāi)日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2003年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月23日
發(fā)明者P·G·凱米 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司