專利名稱：藍(lán)色黑鴨草的類硫氧還蛋白反義基因在抗穗發(fā)芽小麥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因小麥培育技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及藍(lán)色黑鴨草(Phalariscoerulescens)的類硫氧還蛋白反義基因(Antisense Thioredoxin S，Anti-TrxS)在抗穗發(fā)芽小麥中的應(yīng)用。包括Anti-TrxS基因抗穗發(fā)芽功能、轉(zhuǎn)基因抗穗發(fā)芽小麥新材料和以轉(zhuǎn)基因抗穗發(fā)芽小麥為親本的小麥品種培育。
背景技術(shù)：
小麥穗發(fā)芽(Pre-harvest Sprouting)是指小麥?zhǔn)斋@前遇雨或在潮濕環(huán)境中出現(xiàn)籽粒在田間母體植株穗上發(fā)芽的現(xiàn)象。收獲前穗發(fā)芽現(xiàn)象除在小麥(Triticum aestiyum L)上發(fā)生外，在大麥(Hordeum sativun L)、燕麥(Secalecereale L)、水稻(Oryza sativa L)、玉米(Zea mays L)等禾谷類作物上均有發(fā)生。小麥?zhǔn)斋@前穗發(fā)芽是一種世界性的自然災(zāi)害，在加拿大、美國(guó)、英國(guó)、澳大利亞、巴西、德國(guó)、瑞典等世界主要小麥生產(chǎn)國(guó)，穗發(fā)芽發(fā)生頻繁而嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，英國(guó)從1967-1978年的10年間，有3次小麥穗發(fā)芽記錄。1978-1988年加拿大紅粒小麥由于穗發(fā)芽影響經(jīng)濟(jì)損失達(dá)4億美元。在澳大利亞，從1972/73至1983/84年由于穗發(fā)芽小麥產(chǎn)量平均每年損失7％(達(dá)998065噸)，其中穗發(fā)芽嚴(yán)重的年份產(chǎn)量損失高達(dá)20％。1966-1992年的25年間日本嚴(yán)重的穗發(fā)芽發(fā)生過7次。小麥?zhǔn)斋@前穗發(fā)芽也是我國(guó)黃淮冬麥區(qū)、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)、北部冬麥區(qū)、東北春麥區(qū)和西南麥區(qū)等的重要災(zāi)害。根據(jù)河南省34年的統(tǒng)計(jì)，幾乎每年不同地區(qū)都有不同程度的小麥穗發(fā)芽發(fā)生，尤其豫南地區(qū)小麥成熟期多雨年(160mm)占90％以上，大面積穗發(fā)芽三年一遇。
在北方麥區(qū)，常年雖無梅雨季節(jié)，但個(gè)別年份也曾出現(xiàn)過因麥?zhǔn)掌陂g遇到連陰雨造成穗發(fā)芽的情況。如在1956年，河南、陜西等省就曾因麥?zhǔn)占竟?jié)陰雨連綿造成大面積麥田穗發(fā)芽和場(chǎng)上麥垛發(fā)芽霉?fàn)€，導(dǎo)致斷種和面粉不能食用的災(zāi)情，損失非常嚴(yán)重。在關(guān)中西部麥區(qū)，1956、1972、1978、1983、1984年川、堰山區(qū)小麥均嚴(yán)重穗發(fā)芽，損失小麥達(dá)1-1.5億公斤，1990年風(fēng)翔一帶發(fā)生大面積穗發(fā)芽，粒芽率達(dá)到30％。據(jù)報(bào)道，僅1991年全國(guó)就因陰雨氣候小麥穗發(fā)芽使產(chǎn)量損失達(dá)100億公斤。尤其在進(jìn)入80年代以后，面粉加工業(yè)和農(nóng)戶更偏愛出粉率較高的白皮小麥品種，使小麥生產(chǎn)中的穗發(fā)芽問題日趨嚴(yán)重。
由于穗發(fā)芽會(huì)導(dǎo)致小麥種子內(nèi)部一系列生理生化變化，相關(guān)水解酶活性迅速升高，小麥籽粒中蛋白質(zhì)、淀粉等貯藏物質(zhì)被降解，造成籽粒產(chǎn)量、容重、出粉率降低，同時(shí)面粉降落值下降，從而使小麥各種食品加工品質(zhì)發(fā)生惡化面包心黏結(jié)、色澤改變以及面條的可食口感消失；嚴(yán)重的穗發(fā)芽能使小麥的加工品質(zhì)、食用和種用價(jià)值喪失，從而造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，小麥穗發(fā)芽問題一直是世界各國(guó)小麥育種研究的重要領(lǐng)域，是小麥育種專家和生理學(xué)家廣泛關(guān)注但至今尚未解決重要問題。
大量研究表明，小麥穗發(fā)芽現(xiàn)象是一個(gè)綜合癥狀，受休眠期、種皮顏色、穗部性狀、籽粒吸水速率、內(nèi)源激素(GA3、ABA)、淀粉酶和蛋白酶的活性等多因素影響，其中α-淀粉酶活性的高低與穗發(fā)芽關(guān)系密切，可作為鑒定穗發(fā)芽抗性的重要指標(biāo)。在解決小麥穗發(fā)芽問題上，目前廣泛使用的方法是利用休眠性選育白?？顾氚l(fā)芽品種，利用紅?？剐云贩N與白粒品種雜交選育。另外，已經(jīng)證明攜帶有基因RHt3的極矮桿類型如大拇指矮(Tom Thumb)，α-淀粉酶含量極低，但直到現(xiàn)在仍無法打破矮桿、低產(chǎn)、低水平α-淀粉酶之間的連鎖。利用α-淀粉酶抑制基因?qū)肟刂扑氚l(fā)芽和α-淀粉酶活性來選育抗性品種，由于基因表達(dá)不清楚，尚未篩選出普通小麥品種間α-淀粉酶抑制物活性的遺傳變異。目前生產(chǎn)中使用的大多數(shù)小麥栽培品種均存在一定的穗發(fā)芽，據(jù)1991年四川省農(nóng)科院對(duì)269份地方品種和育成品種進(jìn)行的抗穗發(fā)芽鑒定，育成品種平均穗發(fā)芽率72.6％，60％的品種穗發(fā)芽率在70-90％，少數(shù)品種穗發(fā)芽率達(dá)100％，所有品種穗發(fā)芽率高于20％，地方品種平均穗發(fā)芽率27.6％，沒有發(fā)現(xiàn)完全不發(fā)生穗發(fā)芽的品種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供藍(lán)色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白反義基因(Anti-TrxS)在抗穗發(fā)芽小麥中的應(yīng)用。包括轉(zhuǎn)基因抗穗發(fā)芽小麥新材料和以轉(zhuǎn)基因小麥為親本的抗穗發(fā)芽小麥品種培育。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案藍(lán)色黑鴨草的類硫氧還蛋白反義基因在抗穗發(fā)芽小麥中的應(yīng)用，把藍(lán)色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白反義基因(Anti-TrxS)轉(zhuǎn)至普通小麥中得到抗穗發(fā)芽小麥材料。
利用所得抗穗發(fā)芽小麥材料培育抗穗發(fā)芽小麥品種。
應(yīng)用方法包括(1)受體材料準(zhǔn)備、(2)目的基因與標(biāo)記基因質(zhì)粒構(gòu)建與繁殖、(3)微彈制備與轟擊、(4)愈傷組織的誘導(dǎo)、篩選與植株再生培養(yǎng)。
在受體材料準(zhǔn)備階段，選用目前生產(chǎn)上大面積推廣的白皮小麥作為供試材料，篩選分化再生能力好的基因型作為轉(zhuǎn)化受體材料。方法為取小麥開花后12-14天的麥穗，剝?nèi)∮啄圩蚜?，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用70％的乙醇表面消毒1分鐘，無菌水沖洗1次，再用0.1％的升汞溶液消毒8分鐘，無菌水沖洗3-4次，然后剝?nèi)∮着?幼胚直徑1-1.5毫米)，盾片朝上接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25±1℃暗培養(yǎng)，作為基因槍轟擊的靶材料。
在目的基因與標(biāo)記基因質(zhì)粒構(gòu)建與繁殖階段，采用質(zhì)粒載體為pBluescript SK+，目的基因?yàn)閬碓从赑halaris coerulescens的類硫氧還蛋白反義基因(Anti-TrxS)，標(biāo)記基因?yàn)榭购Y選劑PPT的Bar基因。將種子發(fā)芽啟動(dòng)子(Gli)及其下游的類硫氧還蛋白反義基因(Anti-TrxS)插入pBluescriptSK+多克隆位點(diǎn)(MCS)；將CaMV 35S啟動(dòng)子及位于下游的Bar基因插入另一質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)作為篩選標(biāo)記，獲得兩個(gè)重組質(zhì)粒(圖1)。重組質(zhì)粒DNA繁殖的受體菌株采用E.coli-DH5a工程菌。用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，即接種一個(gè)“DH5a”菌或用接種針蘸取少許菌株在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)，至菌落長(zhǎng)到1-3毫米之間。挑取單菌落至50毫升含10毫升LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜(轉(zhuǎn)速≤200轉(zhuǎn)/分鐘)，按1％的量轉(zhuǎn)入500毫升含100毫升LB培養(yǎng)基的三角瓶中，強(qiáng)烈震蕩3-4小時(shí)，使OD＝0.45-0.50。將100毫升LB培養(yǎng)基倒入兩個(gè)冰預(yù)冷的50毫升離心管中，冰浴10分鐘，4℃下8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，此時(shí)稀釋1M的CaCl2儲(chǔ)存液至0.1M，用0.22微米的網(wǎng)篩過濾滅菌，倒盡上清液，吸干殘液，用10毫升冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸沉淀(此時(shí)兩管合一管)，冰上放置4-5小時(shí)，4℃下6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清液，吸干殘液，再用2毫升冰預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液懸浮，冰浴1-2小時(shí)，以200微升分裝。轉(zhuǎn)化時(shí)取1微升重組質(zhì)粒到9微升TE緩沖液中混勻作為A液，再取1微升A液到9微升TE緩沖液中混勻作為B液，取1微升B液到無菌的1.5毫升離心管中，再加入200微升的感受態(tài)細(xì)菌液，上下顛倒混勻，冰上放置30分鐘，立刻轉(zhuǎn)移到42℃水浴中準(zhǔn)確放置90秒，加入800微升SOC培養(yǎng)基，37℃下水浴15分鐘，在37℃搖床上輕搖45分鐘(轉(zhuǎn)速≤85轉(zhuǎn)/分鐘)，用無菌涂布器將50微升/皿培養(yǎng)液涂到含有氨芐青霉素、IPTG、X-GAL的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。第二天，篩選白色重組轉(zhuǎn)化菌落，繁殖擴(kuò)增重組質(zhì)粒。采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，并溶于含RNAase的TE緩沖液中分裝保存待用。用PEG法純化質(zhì)粒并始終濃度達(dá)1微克/微升，置于-20℃保存。
在微彈制備與轟擊階段，微彈載體選用(美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn))顆粒大小為1微米的金粉，取40毫克金粉放入1.5毫升離心管中，加入1毫升96％乙醇充分振蕩30秒使金粉充分散開，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，除去上清液，再加入1毫升96％乙醇重懸金粉，重復(fù)上述步驟3次。用1毫升無菌蒸餾水按上述步驟清洗金粉3次，最后將金粉懸于1毫升無菌蒸餾水中，以50微升等分液分裝金粉懸浮液。取50微升等分液，依次加入兩種質(zhì)粒DNA(Anti-TrxS、Bar)各5微升(微克/微升)，振蕩混勻，再依次加入50微升2.5M的CaCl2和20微升0.1M的亞精胺(Spermidine)溶液混勻，冰浴15分鐘。在12000轉(zhuǎn)/分鐘下離心30秒，除去上清液，用250微升純乙醇旋渦振蕩1分鐘，離心棄上清液。最后將金粉-DNA重懸于240微升無水乙醇中備用。每槍取5微升轟擊。在轟擊前6小時(shí)、轟擊后18小時(shí)對(duì)受體材料進(jìn)行0.4摩爾/升甘露醇高滲處理，用壓縮空氣為動(dòng)力用基因槍進(jìn)行轟擊。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中采用美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)PDS-1000/He型基因槍，基因槍轟擊參數(shù)為裂膜與載片間距2.5厘米，載片與阻擋網(wǎng)間距1.1厘米，阻擋網(wǎng)與轟擊材料間距5.5厘米，轟擊氣體壓力1100/900inch Hg，真空度27psi，每槍金粉-DNA量為4.2-0.21微克。
在愈傷組織的誘導(dǎo)、篩選與植株再生培養(yǎng)階段，選用培養(yǎng)基為L(zhǎng)3；幼胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為L(zhǎng)3+2毫克/升2，4-D+0.7％瓊脂粉+3％糖，PH＝5.8；高滲培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基+0.4mol/L甘露醇；篩選培養(yǎng)基L3+2毫克/升2，4-D+3～5毫克/升PPT(Phosphinothricin，除草劑Basta的有效成分)。分化培養(yǎng)基L3+1毫克/升NAA(奈乙酸)+2毫克/升ZT(玉米素)。生根培養(yǎng)基1/2MS+0.8毫克/升IAA(吲哚乙酸)+3％蔗糖+1毫克/升PPT+0.7％瓊脂，PH＝5.8。培養(yǎng)方法為將幼胚暗培養(yǎng)2周，轟擊前4-6小時(shí)轉(zhuǎn)入高滲培養(yǎng)基，轟擊后16-18小時(shí)，將幼胚從高滲培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，同時(shí)將槍擊后的幼胚24小時(shí)后散開，愈傷組織在26℃暗誘導(dǎo)培養(yǎng)14天，然后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天，再轉(zhuǎn)移到分化篩選培養(yǎng)基上光照分化培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的分化，培養(yǎng)條件為25±1℃、光強(qiáng)3000Lx、光照時(shí)間16小時(shí)/天，光照培養(yǎng)約1個(gè)月。待分化的芽長(zhǎng)至2-3厘米時(shí)轉(zhuǎn)移到生根篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。在26℃光照培養(yǎng)條件下，當(dāng)植株長(zhǎng)至3-4片真葉，且有發(fā)育較好的根系時(shí)，敞開瓶口置于室內(nèi)煉苗2-3天后，移栽于花盆，置于溫室并保持高濕度。轉(zhuǎn)化苗長(zhǎng)至6片真葉，且長(zhǎng)勢(shì)良好時(shí)，取葉片進(jìn)行目的基因檢測(cè)。
利用本發(fā)明將藍(lán)色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白反義基因(Anti-TrxS)導(dǎo)入普通小麥，可獲得穩(wěn)定遺傳、正常表達(dá)，具有抑制穗發(fā)芽特性的轉(zhuǎn)基因小麥。


圖1為pBluescript SK+中插入Anti-TrxS和bar基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建圖；圖2為T0代再生植株的PCR檢測(cè)電泳圖(P1、P4)(MDL200；1水樣；2陽(yáng)性對(duì)照；3陰性對(duì)照；4～11T0代再生植株)；圖3為T0代再生植株的PTT抗性檢測(cè)圖(a對(duì)照植株；b轉(zhuǎn)化植株)；圖4為T1代植株的PCR檢測(cè)電泳圖(P1、P2引物)(M為Marker(DL2000)；1～18為T1植株)圖5為T1代植株的嵌套PCR檢測(cè)電泳圖(P1、P3引物)(M為Marker(DL2000)；1～9-T1代植株)圖6為T1代植株P(guān)1、P2引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切分析圖(M為Marker(DL2000)，1～7為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Csp6I酶切結(jié)果)圖7為T1代植株目的基因Southern雜交檢測(cè)圖(λEcoRI/HindIII酶切DNA；1重組質(zhì)粒；2～8轉(zhuǎn)基因植株)；圖8為T1代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)PT抗性測(cè)定對(duì)比圖(AT1代轉(zhuǎn)基因植株，B對(duì)照植株)；圖9為T2代植株的PCR檢測(cè)電泳圖(P1、P3引物)(M為Marker(DL2000)；1-16為T2代植株)；圖10為轉(zhuǎn)基因小麥(A)與對(duì)照(ck)Trx-h催化活性的結(jié)果變化圖；圖11為轉(zhuǎn)基因種子(A)與對(duì)照(ck)α-淀粉酶活性變化圖；圖12為轉(zhuǎn)基因種子(A)與對(duì)照(ck)68h發(fā)芽情況；圖13為轉(zhuǎn)基因小麥與對(duì)照(ck)穗發(fā)芽情況；圖14為轉(zhuǎn)基因小麥與對(duì)照(ck)大田出苗情況。
具體實(shí)施例方式
按前述方案對(duì)揚(yáng)麥5、895004、豫麥18-64、豫麥70等品種進(jìn)行受體材料準(zhǔn)備、目的基因與標(biāo)記基因質(zhì)粒構(gòu)建與繁殖、微彈制備與轟擊、愈傷組織的誘導(dǎo)、篩選與植株再生培養(yǎng)，在895004、豫麥18-64、揚(yáng)麥5、豫麥70受體材料上獲得移栽成活的幼胚轉(zhuǎn)化T0代再生植株105株，其中來自895004的33株、豫麥18-64的36株、揚(yáng)麥5號(hào)的26株、豫麥70的10株。
為確定目的基因的轉(zhuǎn)化情況，用PCR檢測(cè)和Southern雜交檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了系統(tǒng)檢測(cè)，PCR和Southern雜交檢測(cè)方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.Sambrook等編寫，科學(xué)出版社，1996)。用引物P1(5’-CGT ACCGAC CGT GTC TTG AAC C-3’)和P4(5’-GAA CCT GTG CTG GAT CCA GAG CTG-3’)對(duì)T0代幼苗目的基因進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖2)和PPT抗性檢測(cè)(圖3)，共得到T0代895004轉(zhuǎn)基因植株23株、48穗、1323粒；揚(yáng)麥5號(hào)轉(zhuǎn)基因植株16株、25穗、831粒；豫麥18-64轉(zhuǎn)基因植株12株、29穗、262粒，豫麥70轉(zhuǎn)基因植株1株、2穗、48粒(表1)。
表1 T0代轉(zhuǎn)基因再生植株統(tǒng)計(jì)表

為了進(jìn)一步證實(shí)外源基因(Anti-TrxS)已整合到小麥基因組并能遺傳到后代，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的T1、T2、T3代進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)與遺傳分析。
1、T1代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR、Southern雜交檢測(cè)與遺傳分析用引物P1和P2(5’-GCA GAA GCA AAC AAG GAT GGG -3’)對(duì)T1代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖4)，擴(kuò)增到預(yù)期的目的片段(927bp)；以PCR產(chǎn)物為模板，用引物P1和P3(5’-AGT GCC ACC GAA CAC AAC ATA CC -3’)進(jìn)行嵌套PCR擴(kuò)增(圖5)，結(jié)果也得到了預(yù)期的目的片段(714bp)。對(duì)P1和P2引物擴(kuò)增產(chǎn)物做進(jìn)一步的酶切分析(圖6)，CSP6I限制性內(nèi)切酶酶切得到了3個(gè)片段(555bp、263bp、109bp)，其結(jié)果也完全符合預(yù)期的目的片段。選取經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)的T1代植株進(jìn)行Southern雜交分析，以未經(jīng)酶切的質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照(重組質(zhì)粒片斷大小約為4.3Kb)，用PCR擴(kuò)增的1.4Kb的抗穗發(fā)芽基因(包括基因及啟動(dòng)子)為探針，地高辛標(biāo)記，通過毛細(xì)血管吸印轉(zhuǎn)移基因組DNA至尼龍膜上進(jìn)行雜交，化學(xué)發(fā)光顯影。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照在預(yù)期的位置上(4.3Kb)有明顯的雜交條帶，被檢測(cè)的7株T1代植株，均在2.3-4.3kb之間有一條微弱的雜交信號(hào)(圖7)。表明抗穗發(fā)芽基因已整合進(jìn)小麥的基因組中，進(jìn)一步驗(yàn)證了目的基因在T1代植株中的完整性，也說明外源目的基因完整的整合到小麥的基因組中并遺傳給了T1代。
對(duì)部分T1代植株的PCR檢測(cè)結(jié)果作遺傳分析(表2)，在第1、19和28株系中表現(xiàn)為1∶0純合，在第18株系中表現(xiàn)為3∶1分離；這在一定程度上說明目的基因在T0代轉(zhuǎn)基因植株中整合情況良好，而且在其后代中遺傳也較穩(wěn)定，第20及第34株系的分離比例分別為1∶1和5∶1，偏離了孟德爾遺傳規(guī)律，可能是本試驗(yàn)中，再生植株移栽時(shí)遭遇高溫，而轉(zhuǎn)基因植株本身生理異常也導(dǎo)致T0代育性偏低，結(jié)實(shí)率差，T1代群體較小，因此造成部分遺傳偏離。
同時(shí)，對(duì)T1代植株進(jìn)行了PPT抗性檢測(cè)(圖8)，部分T1代植株的PPT抗性試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，在18株小麥材料中有16株處理葉片涂抹后表現(xiàn)出PPT抗性，2株的應(yīng)試葉片發(fā)黃；在所檢測(cè)的6個(gè)T0代株系中，4個(gè)株系表現(xiàn)為純合，分離比為1∶0；2個(gè)株系表現(xiàn)為雜合，分離比為3∶1。對(duì)照葉片在表2 T1代部分植株遺傳分析T0代株系 T1代植株數(shù) PCR陽(yáng)性株數(shù) 分離比例(％) PPT陽(yáng)性株數(shù) 分離比例1 11 1∶01 1∶018 43 3∶13 3∶119 11 1∶01 1∶020 42 1∶13 3∶128 22 1∶02 1∶034 65 5∶16 1∶0總計(jì)18 14 16PPT處理后一周枯黃死亡。說明Bar基因在T1代植株中整合良好并能正常表達(dá)。
2、T2代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)與遺傳分析經(jīng)對(duì)T2代6個(gè)株系147株轉(zhuǎn)基因后代PCR(圖9)和除草劑PPT抗性分析，整理統(tǒng)計(jì)并經(jīng)卡方檢測(cè)分析匯總成表3。
表3結(jié)果表明，目標(biāo)基因和選擇性標(biāo)記基因均呈一定的分離，抗穗發(fā)芽基因在T2代中，有3個(gè)T1代雜合株系(2-1，39-7，39-8)呈現(xiàn)典型的孟德爾單基因傳遞規(guī)律即3∶1分離規(guī)律；Bar基因在后代中有4個(gè)株系(2-1，2-3，39-7，39-8)呈現(xiàn)3∶1的分離。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，目的基因在2-2和2-3株系和Bar基因在2-2株系呈1∶1的分離。在對(duì)后代的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)株系39-9共11株，都顯示PCR陽(yáng)性和對(duì)除草劑的抗性反應(yīng)，未發(fā)生分離，因此可初步鑒定為純合體。說明目的基因已穩(wěn)定遺傳給T1代。
表4 T2代植株遺傳分析

3、與穗發(fā)芽有關(guān)的轉(zhuǎn)基因小麥生理生化特性的分析(1)轉(zhuǎn)基因小麥的Trx-h活性的分析用二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)還原牛胰島素的反應(yīng)來檢測(cè)Trx-h的催化活性(Xinming Li，Jan D，David Hayman，et al.Thio redoxin activity in the Cterminus of Phalaris coerulescens[J].The Plant Journal，1995，8(1)133-138)。牛胰島素(insulin)被還原后，分子中兩個(gè)亞基間的二硫鍵斷裂，產(chǎn)生難溶的自由態(tài)B亞基，呈白色沉淀狀，并在650nm處有最大吸光值。白色還原產(chǎn)物的產(chǎn)生速度越快，OD650上升越快表明Trx-h催化活性越高。
參照Myeong的方法(Holmgren A.Thioredoxin[J].Ann.Rev.Biochem.1985，54237-271)制備TRX h待測(cè)樣品。將轉(zhuǎn)基因籽粒的胚切去，研磨粉碎后按V/W＝5毫升/克加入提取液(50mM Tris-HCl buffer，pH8.0，1mM EDTA，0.5mM PMSF)振蕩浸提2小時(shí)，25000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收上清。重復(fù)一次、合并上清。用HCl調(diào)到中性，加入(NH4)2SO4鹽析，離心去除蛋白質(zhì)后，收上清液。上清液經(jīng)透析除鹽后，將透析袋埋在干燥的交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50(Sephadex G-50)中吸水濃縮(4℃)，定期更換Sephadex G-50。對(duì)濃縮后的提取液進(jìn)行65℃水浴熱處理15分鐘，離心、收集上清液作為TRX h待測(cè)樣品，-20℃保存。分析轉(zhuǎn)基因小麥與對(duì)照小麥Trx-h催化活性的結(jié)果見圖10。圖10中，陽(yáng)性對(duì)照(CK，非轉(zhuǎn)基因小麥的Trx-h提取物)的反應(yīng)體系中OD650值上升明顯，而陰性對(duì)照(Blank，不含Trx-h提取物)的OD650值增長(zhǎng)緩慢。這表明小麥Trx-h提取物對(duì)DTT還原牛胰島素的反應(yīng)有明顯的催化作用。轉(zhuǎn)基因種子(A)的反應(yīng)體系中OD650值增量低于陽(yáng)性對(duì)照，說明轉(zhuǎn)基因種子的Trx-h催化活性下降了。對(duì)還原產(chǎn)物發(fā)生量進(jìn)行回歸分析，得出反映還原產(chǎn)物增長(zhǎng)率的回歸線斜率分別為b陽(yáng)＝7.5×10-4，bA＝1.7×10-4，b陰＝0.4×10-4。由b陽(yáng)/b陰＝18.75可知小麥Trx-h提取物的催化作用使還原反應(yīng)速度加快了18.75倍；由bA/(b陽(yáng)-b陰)＝0.24可知，Anti-TrxS基因的導(dǎo)入使轉(zhuǎn)基因材料的Trx-h催化活性下降了76％。表明Anti-TrxS基因?qū)牒笠种屏诵←淭rx-h基因的表達(dá)，從而降低了Trx-h催化活性。
(2)蛋白質(zhì)組分中巰基含量的分析種子中Trx-h/NADPH還原系統(tǒng)能提高胚乳的還原狀態(tài)，催化S-S還原形成還原態(tài)的巰基，因此巰基含量反映著蛋白質(zhì)的還原狀態(tài)。按陳毓荃(陳毓荃主編，生物化學(xué)研究技術(shù)[M].北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.1994)的方法提取轉(zhuǎn)基因種子水溶蛋白和醇溶蛋白組分。取等體積的待測(cè)樣兩份，一份用于測(cè)定反映巰基含量的OD412(黃惠華，郭乾初，梁漢華等.豆奶蛋白組份和胰蛋白酶抑制劑活性的熱變化[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào).2001，23(2)140-144)，另一份用于測(cè)定反映該樣品蛋白質(zhì)含量的OD280(李建武，余瑞元，袁明秀等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].北京北京大學(xué)出版社.1994)。設(shè)K＝OD412/OD280，比值K反映了待測(cè)樣品中巰基含量與蛋白質(zhì)含量間的比率狀況。對(duì)水溶蛋白和醇溶蛋白中巰基量在蛋白總量中所占的比率K(K＝OD412/OD280)的測(cè)定和計(jì)算結(jié)果見表5。表5顯示，轉(zhuǎn)基因材料的K水溶蛋白和K醇溶蛋白比CK分別下降了5.24％和5.56％。說明含有Anti-TrxS基因的種子中，由于Trx-h催表5水溶蛋白和醇溶蛋白中巰基含量比較材料 K水溶蛋白K醇溶蛋白CK0.38a0.47a轉(zhuǎn)基因材料0.36b0.44b注a，b不同字母表示5％的差異顯著?；钚越档?，巰基含量下降了，胚乳的還原狀態(tài)較低。
(3)α-淀粉酶活性的變化用DNS法測(cè)定α-淀粉酶活性(K.Cui，S.Peng，Y.Xing，et al.Moleculardissection of seedling-vigor and associated physiological traits inrice.Theoretical and Applied genetics.2002，105745-753)，取0.5g不同處理的種子(去除根、芽)置于研缽中，加少量蒸餾水和石英砂，研磨成勻漿后按V/W＝5毫升/克加蒸餾水繼續(xù)研磨5分鐘，靜置60分鐘后15000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收上清作為總淀粉酶提取物。取20微升總淀粉酶提取物于70℃加熱15分鐘后與80微升1％的淀粉溶液混合，37℃下反應(yīng)分鐘后迅速加入3，5-二硝基水楊酸(DNS)溶液于沸水中水浴5分鐘顯色，用水稀釋后在520nm下比色求出還原糖含量并計(jì)算出α-淀粉酶活力?；钚詥挝话?克植物材料1分鐘內(nèi)水解淀粉產(chǎn)生的麥芽糖量(毫克)計(jì)算，結(jié)果見圖11。圖11表明，在5天測(cè)定時(shí)期內(nèi)，轉(zhuǎn)基因種子(A)和對(duì)照(CK)的α-淀粉酶活性都呈上升趨勢(shì)；CK的α-淀粉酶活性始終高于轉(zhuǎn)基因材料A，表明含有Anti-TrxS基因的轉(zhuǎn)基因種子中α-淀粉酶活性降低了。對(duì)α-淀粉酶活性的變化進(jìn)行回歸分析，得出反映α-淀粉酶活性增加速率的回歸線斜率如下bCK＝0.639，bA＝0.485。斜率的絕對(duì)值越大，α-淀粉酶活性上升得也越快。由bA/bCK＝0.75可知，同CK相比，轉(zhuǎn)基因材料的α-淀粉酶活性上升速率降低了25％。
4、轉(zhuǎn)基因小麥的抗穗發(fā)芽特性在培養(yǎng)箱中觀察種子的發(fā)芽情況(圖12)，培養(yǎng)20小時(shí)對(duì)照子粒開始萌動(dòng)，轉(zhuǎn)基因籽粒到68小時(shí)時(shí)候才開始萌動(dòng)，直到5天兩者都有明顯的差別。對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥整穗進(jìn)行15天誘導(dǎo)穗發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果表明，在3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥品系上，與對(duì)照相比都表現(xiàn)出明顯的抗穗發(fā)芽特性(圖13)。轉(zhuǎn)基因小麥在大田播種后，可正常出苗(圖14)。表明轉(zhuǎn)基因小麥既獲得了抗穗發(fā)芽特性，又不影響大田正常出苗。
權(quán)利要求
1.藍(lán)色黑鴨草的類硫氧還蛋白反義基因在抗穗發(fā)芽小麥中的應(yīng)用，把藍(lán)色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白反義基因(AntisenseThioredoxin S，Anti-TrxS)轉(zhuǎn)至普通小麥中得到抗穗發(fā)芽小麥材料。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，利用所得抗穗發(fā)芽小麥材料培育抗穗發(fā)芽小麥品種。
全文摘要
藍(lán)色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白反義基因(Antisense Thioredoxin S，Anti－TrxS)在抗穗發(fā)芽小麥中的應(yīng)用。屬于轉(zhuǎn)基因小麥培育技術(shù)領(lǐng)域。通過把藍(lán)色黑鴨草(Phalaris coerulescens)的類硫氧還蛋白反義基因(Anti－TrxS)導(dǎo)入普通小麥，得到的轉(zhuǎn)基因小麥可抗穗發(fā)芽，從而有效避免因小麥生產(chǎn)過程中穗發(fā)芽帶來的減產(chǎn)減收和收獲期籽粒發(fā)芽造成的小麥品質(zhì)下降。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1626657SQ20031011021
公開日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者尹鈞, 任江萍, 李志崗, 李磊 申請(qǐng)人:國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心