專利名稱：一種水稻分泌型硫氧還蛋白基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻中一個編碼分泌型硫氧還蛋白的基因，該基因通過調(diào)控水稻體內(nèi) 氧化還原來調(diào)節(jié)水稻抗衰老，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細胞中的活性氧影響著許多生物學過程，如細胞增殖、分化、衰老及細胞程序性 死亡。在生物體中低水平的活性氧能夠作為信號分子發(fā)揮作用，而高水平的活性氧會導致 生物大分子的氧化損傷。硫氧還蛋白通過可逆的二硫鍵和硫醇變化參與到氧化還原反應(yīng) 中，進而影響細胞內(nèi)的活性氧水平，調(diào)節(jié)細胞的生命活動。硫氧還蛋白最早是在大腸桿菌中 發(fā)現(xiàn)的，它能夠還原核苷酸還原酶。動物體內(nèi)只有一種類型的硫氧還蛋白(Trxl和Trx2)， 在小鼠基因敲除實驗中發(fā)現(xiàn)Trxl或Trx2的缺失都會使小鼠在胚胎發(fā)育早期死亡。同動物 相比，植物體內(nèi)有多種類型的硫氧還蛋白，并且其分布十分廣泛，近年來越來越多的硫氧還 蛋白家族成員被發(fā)現(xiàn)，在擬南芥基因組中目前發(fā)現(xiàn)有42個基因編碼硫氧還蛋白。在擬南芥 中，AtTrxhl及AtTrxh4的表達與細胞周期相關(guān)，暗示與細胞增殖時的氧化還原控制相關(guān)； 相反，AtTrxh5特異參與到防御及抗氧化脅迫反應(yīng)中。在谷類植物中，Trxh遍布植物所有組 織中，但在種子中最為豐富，種子萌發(fā)時，TaTrxhA存在于糊粉和盾片細胞的核中，這種定位 與此組織的氧化環(huán)境有關(guān)。在大豆根瘤的發(fā)育過程中，一種GmTrxh扮演著重要的角色，其 能使酵母突變體恢復對過氧化氫的抗性，并且利用RNAi技術(shù)在大豆中將其干涉之后，轉(zhuǎn)基 因大豆的根瘤則不能正常形成。目前，在水稻中關(guān)于h型硫氧還蛋白的功能研究還沒有報 道。在正常情況下，植物細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，活性氧濃度 較低，不會引起傷害。而植物在逆境(如干旱，熱、冷、高鹽等)脅迫條件下，體內(nèi)會產(chǎn)生過 量的活性氧及過氧化物等分子，從而導致氧化損傷，引起植物衰老的發(fā)生，造成農(nóng)作物的減 產(chǎn)。因此進一步搞清楚植物衰老的原因，延緩植物衰老進程，進而提高葉片的光合效率，對 于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻分泌型硫氧還蛋白基因，該基因通過抗氧化功能可 以降低正常及鹽脅迫下水稻體內(nèi)氧化還原水平，具有延緩水稻衰老的效果。實現(xiàn)本發(fā)明的目的采取的技術(shù)方案如下本發(fā)明利用本申請人前期在做雙向電泳 時發(fā)現(xiàn)的一個水稻根質(zhì)外體在鹽脅條件下表達上調(diào)的蛋白，使用RT-PCR技術(shù)克隆出水稻 硫氧還蛋白基因OsTRXhl相應(yīng)的編碼序列。在工程菌中重組表達并純化得到OsTRXhl蛋白， 還原胰島素測試表明此純化后的OsTRXhl蛋白具有氧化還原活性。將此OsTRXhl基因轉(zhuǎn)入 硫氧還蛋白缺失的酵母突變體中發(fā)現(xiàn)此基因的表達能夠使酵母突變體恢復對H202的抗性， 表明此基因參與了體內(nèi)的氧化還原調(diào)控。將此基因在水稻中進行過量表達發(fā)現(xiàn)在正常生長 條件下及鹽脅迫條件下能夠降低過氧化氫含量，提高植物葉綠素含量，從而延緩轉(zhuǎn)基因植
3株的衰老；而用RNA干擾技術(shù)使此基因在水稻中表達下調(diào)，則會引起轉(zhuǎn)基因植株過氧化氫 含量升高，葉綠素含量降低，植株提早衰老。本發(fā)明為通過基因工程手段進行分子育種提高 水稻抗衰老，進而提高農(nóng)作物產(chǎn)量提供了可能。本發(fā)明取得的有益效果是本發(fā)明通過體外氧化還原測試和酵母互補測試表明 OsTRXhl是一個有氧化還原活性的硫氧還蛋白，亞細胞定位表明其為質(zhì)外體蛋白。將此基因 在水稻中過量表達發(fā)現(xiàn)能夠降低過氧化氫含量，延緩水稻衰老。在利用基因工程手段調(diào)控 植物體內(nèi)氧化還原水平并在延緩水稻衰老，提高農(nóng)作物產(chǎn)量上具有潛在利用價值。


圖1.純化后的OsTRXhl-GST融合蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。其中，第 1泳道為蛋白Marker ；第2泳道為OsTRXhl-GST ；第3泳道為OsTRXhle43S_GST ；第4泳道為 GST。圖2. OsTRXhl的體外氧化還原活性。其中空心正方形為5uM OsTRXhl-GST ； 實心正方形為2. 5uM OsTRXhl-GST ；空心圓為5uM 0sTRXhlc43S_GST ；實心圓為2. 5uM 0sTRXhlc43S-GST ；星號為 5uM GST。圖3. OsTRXhl在硫氧還蛋白酵母突變體EMY63中具有抗過氧化氫活性試驗。其中 1 為轉(zhuǎn) YcpIF5 空載體的 EMY63 ；2 為轉(zhuǎn) OsTRXhl 的 EMY63 ；3 為轉(zhuǎn) 0sTRXhlG43S 的 EMY63 ；4 為 轉(zhuǎn) ScTRX 的 EMY63。圖4. OsTRXhl的亞細胞定位研究證明其能夠分泌到胞外。在洋蔥及煙草葉片的表 皮細胞瞬時表達發(fā)現(xiàn)，OsTRXhl-YFP和OsTRXhl-GFP融合蛋白的熒光分布于細胞壁及細胞 膜(2和4)，這說明OsTRXhl能夠分泌到質(zhì)外體；而對照YFP和GFP的熒光主要分布于細胞 質(zhì)及細胞核(1和3)。圖中箭頭所指為細胞壁。圖5.在轉(zhuǎn)錄水平OsTRXhl (白色柱形圖)在水稻中受鹽和脫落酸誘導，但其同源 基因0sTRXh2(黑色柱形圖)不受誘導。圖6. OsTRXhl在水稻生長發(fā)育過程中的表達情況。轉(zhuǎn)Pr0()sTKXhl :GUS的轉(zhuǎn)基因水稻 的⑶S染色結(jié)果表明OsTRXhl在水稻生長發(fā)育過程中表達廣泛。圖7. OsTRXhl過表達株系在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的鑒定。實驗結(jié)果表明OsTRXhl 在水稻中過表達成功。圖8. OsTRXhl的RNA干涉株系在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的鑒定。實驗結(jié)果表明 OsTRXhl在水稻中RNA干涉成功。圖9. OsTRXhl的RNA干涉，過表達及野生型植株的表型比較。圖10.水稻葉片的葉綠素含量測定。植株最上面的葉子為劍葉，依次向下分別 為第二，三，四，五葉。結(jié)果表明OsTRXhl的RNA干涉植株葉綠素含量明顯低于野生型，而 OsTRXhl過表達植株葉綠素含量明顯高于野生型。圖中數(shù)據(jù)為三次重復的統(tǒng)計結(jié)果。圖11.水稻葉片過氧化氫含量測定。結(jié)果表明過表達植株葉片過氧化氫含量低于 野生型，RNA干涉植株葉片過氧化氫含量高于野生型。圖12.水稻根質(zhì)外體活性氧含量檢測。結(jié)果表明鹽處理后過表達株系質(zhì)外體活性 氧含量低于野生型，RNA干涉株系質(zhì)外體活性氧含量高于野生型。
具體實施例方式1.基因的獲得此硫氧還蛋白是本申請人在做雙向電泳時發(fā)現(xiàn)的水稻根質(zhì)外體在鹽脅條 件下表達上調(diào)的一個蛋白，蛋白Accession No.為gi | 3915131，其基因序列號為 AK121423。為了獲得該基因，申請人提取了野生型水稻(Oryza sativa)的RNA，利用引物 5，-CCATGGCCGCCGAGGAGGGA-3，和 5，-CCATGGCGGCAGAAGCAGATGCAGCAGTG-3，進行 RT-PCR 擴 增，反應(yīng)體系如下超純水31ul，lOXPyrobest Buffer II 5ul，dNTP Mixture 4ul，上下游 引物各 4ul，Pyrobest DNA Polymerase 0. 2ul, cDNA 2ul。PCR 程序為94°C 5 分鐘，94°C 30秒，61°C 30秒，72°C 50秒，第二到第四步循環(huán)27次，72°C 10分鐘。PCR產(chǎn)物進行電泳， 膠回收，連接到T載體上，通過測序得到編碼OsTrxhl的全長核苷酸序列(序列1)。2. OsTRXhl的還原胰島素活性實驗利用引物5，-CGGGATCCATGGCCGCCGAGGAGGGA-3，和 5，-CGGGATCCGGCAGAAGCAGATG CAGCAGTG-3’將OsTRXhl的編碼序列擴增，用BamHI酶切上述PCR產(chǎn)物，把酶切后的片段連 接到PGEX-2T載體上。測序正確后，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌XA90。將鑒定為陽性的 克隆在LB Amp+平板上劃線培養(yǎng)，挑取單克隆，接種到20mL LB Amp+液體培養(yǎng)基中，37°C， 200rpm搖培過夜后，按1 50擴培到1000mL LB Amp+液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm搖培，至 0D600到0. 6-0. 7，加入IPTG至0. 5mM, 30°C搖培誘導4h。用SDS-PAGE檢測誘導效果。利 用GSTrap FF純化得到融合蛋白GST-OsTRXhl (步驟參照Amersham Biosciences)并進行 SDS-PAGE(圖 1)。還原胰島素試驗參照(Holmgren，1979)方法.反應(yīng)體系中包括100mM磷酸鉀緩 沖液，pH 7. 0,0. ImM EDTA，0. 13mM 牛胰島素(sigma 15500)以及 5uM GST-OsTRXhl 蛋白或 GST蛋白.以加入0. 33mM DTT來起始反應(yīng).反應(yīng)在室溫進行，并每隔5分鐘利用分光光度 計(HITACHI U-2001)檢測650nm的光吸收。結(jié)果表明OsTRXhl具有還原胰島素的能力(圖 2)。3. OsTRXhl的酵母互補試驗將OsTrxhl 連接到載體 YCpIF5 上，用 LiAc/PEG 方法轉(zhuǎn)化酵母EMY63 (MATa ；ade2_l ade3-100 his3_ll leu2_3 lys2-801 trpl-lura3-l trxl: : TRPltrx2: :LEU2),以空載 YCpIF5為陰性對照，ScTrxl為陽性對照。硫氧還蛋白的表達及過氧化氫的抗性實驗參照 Lee et al.，2005。結(jié)果表明OsTrxhl的表達能夠使酵母突變體恢復對H202的抗性(圖3)。4. OsTRXhl的亞細胞定位利用引物5，-CCATGGCCGCCGAGGAGGGA-3，和 5，-CCATGGCGGCAGAAGCAGATGCAGCAG TG-3’擴增OsTRXhl基因，并通過Ncol進行酶切，把酶切得到的片段連接到pAVA321載體 上。測序正確后基因槍法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入洋蔥表皮瞬時表達OsTRXhl-YFP融合蛋白，同時轉(zhuǎn) PAVA321空載體作對照，培養(yǎng)22小時后，加質(zhì)壁分離液0. 9M甘露醇進行質(zhì)壁分離，激光共 聚焦顯微鏡觀察YFP熒光定位情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsTRXhl-YFP能夠分泌到細胞外(圖4)。同 樣把OsTRXhl編碼序列構(gòu)建到pCAMBIA1300載體上，測序正確后把質(zhì)粒轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌EHA105 中，并用此農(nóng)桿菌侵染煙草葉片表皮細胞，在侵染40-48小時后，用1M NaCl處理煙草葉片 進行質(zhì)壁分離，激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光定位情況(圖4)。5. OsTrxhl的表達受鹽和ABA誘導
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生長10天的水稻幼苗用200mM NaCl處理0、1、3、6、12小時，取其地上部分為 材料，用RNArose Reagent提取RNA(步驟參考其說明書)，采用購買自Takara公司的 PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)進行反轉(zhuǎn)錄，利用SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time)試劑，在熒光定量PCR儀ABI PRISM 7000上進行實時定量熒光 PCR檢測OsTrxhl的表達，用水稻ACTim基因表達水平做內(nèi)參。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsTrxhl的表達 受鹽和ABA誘導(圖5)。6.0sTRXhl轉(zhuǎn)基因株系的分子鑒定 Southern Blot 轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA提取及純化參考Sambrook et al. (1989)的方法。15微克的DNA用Hindlll和EcoRI進行消化酶切，酶切后的DNA片段 通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳進行分離。DNA在原位進行變性，然后轉(zhuǎn)移和交叉鏈接到帶正 電的尼龍膜上。用[a_32P]dCTP標記潮霉素B抗性基因作為探針進行雜交。膜漂洗后，用 Typhoon 9200掃描。semiquantitative RT-PCR 提取轉(zhuǎn)基因植株的RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，用 得到的cDNA為模板進行半定量PCR，用水稻ACTim基因表達水平做內(nèi)參。如圖7和圖8所 示，在過表達植株中OsTRXhl表達水平大大上調(diào)，而在RNAi植株中OsTRXhl表達水平被下 調(diào)。Western blot 提取轉(zhuǎn)基因植株的蛋白進行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上， 膜在室溫下用TBS洗3次，每次5分鐘；然后將膜放于封閉液(TTBS，pH 7.5，5%脫脂奶粉) 封閉2小時；一抗在TTBS中1 1000稀釋，4°C孵育過夜，TTBS淋洗PVDF膜3次，每次5 分鐘；堿磷酶標記的馬抗小鼠二抗1 1000稀釋，室溫孵育2小時，TTBS洗5次，每次5分 鐘；5ml顯色液(BCIP/NBT)中顯色至最佳對比度。以蒸餾水充分沖洗，膜晾干后進行掃描。 如圖5C所示，在過表達植株中OsTRXhl蛋白表達水平大大上調(diào)，而在RNAi植株中OsTRXhl 蛋白表達水平被下調(diào)。7.水稻葉片葉綠素含量測定取大田里生長的水稻的葉片0.05g，剪碎，放于10ml 80%的丙酮中，避光室溫放 置16小時，在652nm處測定葉綠體色素提取液的光吸收值，把測得的光吸收值代入CT(mg/ L) = A652X 1000/34. 5公式中計算出葉綠素總量，所有測定重復三次。結(jié)果表明OsTRXhl 的RNA干涉植株葉綠素含量明顯低于野生型，而OsTRXhl過表達植株葉綠素含量明顯高于 野生型。8.水稻葉片過氧化氫含量測定生長60天的水稻葉片于液氮中研磨，溶于預冷的500ul的提取液中(50mM磷酸 鈉PH = 7. 4)，震蕩混勻，離心取上清，取50ul上清加入到50ul反應(yīng)試劑(Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit)中，混勻，避光室溫反應(yīng)30分鐘，用酶標儀測 量570nm處的光吸收，進而根據(jù)標準曲線計算出過氧化氫的含量。上清的蛋白濃度用考馬 斯亮藍法測定。9.水稻根質(zhì)外體活性氧含量檢測生長10天的水稻苗的根輕輕放到含有1. 5ml的OxyBURST Green H2HFFBSA(10ug/ ml ；Molecular Probes，0-13291)的2ml EP管中，室溫避光放置30分鐘，去離子水洗3 次，用激光共聚焦顯微鏡觀察根部熒光(Zeiss LSM510，激發(fā)光波長488nm，發(fā)射光波長 530nm)。
序列1 :0sTrxhl的CDS序列
atggccgccgaggagggagtcgtgatcgcctgccacaacaaggacgagttcgacgcccag
atgaccaaggccaaggaggccggcaaagtggtcataattgacttcactgcttcctggtgt
ggcccttgccgcttcatcgccccagtgttcgctgaatacgccaaaaagttccctggtgct
gtcttcctgaaggttgatgttgatgagctgaaggaagttgctgaaaagtacaatgtcgag
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aggaaggatgacctccagaacaccatcgtgaagcacgtcggtgccactgctgcatctgct
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序列2 :0sTRXhl的氨基畫i序列
MAAEEGVVIACHNKDEFDAQMTKAKEAGKVVIIDFTASWCGPCRFIAPVF
AEYAKKFPGAVFLKVDVDELKEVAEKYNVEAMPTFLFIKDGAEADKVVG
ARKDDLQNTIVKHVGATAASASA
權(quán)利要求
一種水稻分泌型硫氧還蛋白基因，其特征是可以編碼調(diào)控水稻體內(nèi)氧化還原水平相關(guān)蛋白，該基因的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列如下核苷酸序列atggccgccg aggagggagt cgtgatcgcc tgccacaaca aggacgagtt cgacgcccagatgaccaagg ccaaggaggc cggcaaagtg gtcataattg acttcactgc ttcctggtgtggcccttgcc gcttcatcgc cccagtgttc gctgaatacg ccaaaaagtt ccctggtgctgtcttcctga aggttgatgt tgatgagctg aaggaagttg ctgaaaagta caatgtcgaggcaatgccga ccttcctatt catcaaggat ggtgctgagg ctgacaaggt cgttggcgccaggaaggatg acctccagaa caccatcgtg aagcacgtcg gtgccactgc tgcatctgcttctgcctaa氨基酸序列MAAEEGVVIACHNKDEFDAQMTKAKEAGKVVIIDFTASWCGPCRFIAPVFAEYAKKFPGAVFLKVDVDELKEVAEKYNVEAMPTFLFIKDGAEADKVVGARKDDLQNTIVKHVGATAASASA 。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻分泌型硫氧還蛋白基因，其特征是從水稻質(zhì)外體分離得 到的水稻分泌型硫氧還蛋白基因。
3.—種如權(quán)利要求1所述的水稻分泌型硫氧還蛋白基因的應(yīng)用，其特征是將其轉(zhuǎn)入受 體在水稻中進行過量表達，用于水稻抗衰老品種的培育。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻的一種分泌型硫氧還蛋白基因及其編碼蛋白以及應(yīng)用，其目的是提供水稻的一種分泌型硫氧還蛋白基因及其編碼蛋白以及利用此基因提高植物抗氧化活性及延緩植物衰老的方法。本發(fā)明所提供的水稻的一種分泌型硫氧還蛋白基因，其核苷酸序列是序列表中序列1中的DNA序列；其所編碼的氨基酸序列是序列表中序列2氨基酸殘基序列。實驗證明，將上述基因在水稻中過量表達，正常及鹽脅迫下可以降低植株過氧化氫含量，提高葉綠素含量，從而延緩水稻衰老進程。本發(fā)明可在利用分子育種提高水稻抗氧化、抗衰老上有重要應(yīng)用。
文檔編號C07K14/415GK101838653SQ20101010032
公開日2010年9月22日 申請日期2010年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月23日
發(fā)明者張翠軍, 郭毅 申請人:河北師范大學