專利名稱：用硫氧還蛋白減輕空氣傳播性和接觸性變應(yīng)原的變應(yīng)原性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用硫醇氧化還原蛋白質(zhì)來還原種子蛋白(如谷物蛋白)，來還原酶抑制物蛋白(如蛇毒蛋白、花粉蛋白)和某些其它蛋白質(zhì)的分子內(nèi)二硫鍵。更具體的，本發(fā)明涉及使用硫氧還蛋白和谷氧還蛋白還原麥膠蛋白、麥谷蛋白、清蛋白素和球蛋白，來改進(jìn)生面團(tuán)和烘烤食物的特征，并產(chǎn)生新的生面團(tuán)和還原含半胱氨酸的蛋白質(zhì)(如淀粉酶和胰蛋白酶抑制物)，來改進(jìn)食物和谷物產(chǎn)品的質(zhì)量。另外，本發(fā)明涉及分離一種抑制支鏈淀粉酶的新穎蛋白質(zhì)和硫醇氧化還原蛋白對(duì)該新穎蛋白質(zhì)的還原。本發(fā)明還涉及儲(chǔ)油種子特有的2S清蛋白被硫氧還蛋白還原。另外，本發(fā)明還涉及在體外滅活蛇神經(jīng)毒素和某些昆蟲和蝎子毒素，并治療病人相應(yīng)的中毒。本發(fā)明還涉及利用硫氧還蛋白降低食物和花粉變應(yīng)原的過敏原性，并提高食物和花粉蛋白的蛋白酶水解，以及食物和花粉的消化性。本發(fā)明還涉及被硫辛酸或被還原的硫醇氧化還原蛋白、或被硫氧還蛋白聯(lián)合硫辛酸還原的花粉蛋白質(zhì)的免疫治療用途。本發(fā)明還涉及用硫醇氧化還原蛋白和硫辛酸治療和預(yù)防過敏和過敏癥狀。
本發(fā)明是在國(guó)家科學(xué)基金會(huì)以資助合同DCB 8825980和DMB 88-15980提供的政府資助下進(jìn)行的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
葉綠體含有一種鐵氧還蛋白/硫氧還蛋白系統(tǒng)，由鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白-硫氧還蛋白還原酶和硫氧還蛋白f和m構(gòu)成，它將光與光合作用的酶調(diào)節(jié)聯(lián)系起來(Buchanan，B.B.(1991)“氧的光合作用中CO2同化的調(diào)節(jié)鐵氧還蛋白/硫氧還蛋白系統(tǒng)，關(guān)于它的發(fā)現(xiàn)，目前狀況和未來發(fā)展的觀點(diǎn)”Arch.Biochem.Biophys.2881-9；Scheibe，R.(1991)，“葉綠體酶的氧化還原調(diào)節(jié)，獨(dú)立控制的普通原理”，Plant Physiol.961-3)。幾個(gè)研究已顯示植物也含有一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)與動(dòng)物和大部分微生物所建立的類似，其中硫氧還蛋白(h-型)被NADPH和酶NADP-硫氧還蛋白還原酶(NTR)如下還原(Florencio，F(xiàn).J.等(1988)，Arch.Biochem.Biophys.266496-507；Johnson，T.C.等(1987)，Plant Physiol.85446-451；Suske，G.等(1979)，Z.Naturforsch.C. 34214-221)。目前的證據(jù)提示，NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)廣泛分布于植物組織中，并儲(chǔ)藏在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)中(Bodenstein-Lang，J.等(1989)FEBS Lett.25822-26；Marcus，F(xiàn).等(1991)，Arch.Biochem.Biophys.287195-198)。
還知道硫氧還蛋白h是糖類代謝、焦磷酸果糖-6-P、1-磷酸轉(zhuǎn)移酶或PFP的還原性激活胞質(zhì)酶(Kiss，F(xiàn).等(1991)，Arch.Biochem.Biophys.287337-340)。
種子是植物中NADP/硫氧還蛋白賦予生理活性的唯一組織。另外，已顯示硫氧還蛋白h在實(shí)驗(yàn)室中能還原硫堇素(thionin)(Johnson，T.C.等(1987)，PlantPhysiol.85446-451)。硫堇素是可溶性的谷物種子蛋白，富含半胱氨酸。在Johnson等的調(diào)查中，NADPH通過NADP-硫氧還蛋白還原酶(NTR)和硫氧還蛋白h根據(jù)等式2和3實(shí)驗(yàn)性還原了小麥嘌呤硫堇素。
(3)嘌呤硫堇素氧化+硫氧還蛋白h還原→嘌呤硫堇素還原+硫氧還蛋白h氧化谷物種子(如小麥、黑麥、大麥、玉米、粟、高粱和稻)含有四種主要的種子蛋白組。這四組是清蛋白、球蛋白、麥膠蛋白和麥谷蛋白或相應(yīng)的蛋白質(zhì)。硫堇素屬于清蛋白組或成分。目前小麥和黑麥?zhǔn)莾H有的兩種能形成面筋或生面團(tuán)的谷物。面筋是一種膠質(zhì)的彈性和強(qiáng)韌的蛋白質(zhì)復(fù)合物，給予生面團(tuán)粘性。面筋主要由麥膠蛋白和麥谷蛋白組成。它是在用水洗滌黑麥或小麥生面團(tuán)時(shí)形成的。面筋給予面包生面團(tuán)彈性質(zhì)量。其它主要作物谷物大麥、玉米、高粱、燕麥、粟和稻的粉和大豆植物的粉在小麥和黑麥所使用的條件下不產(chǎn)生面筋樣的網(wǎng)絡(luò)。
麥谷蛋白和麥膠蛋白是含有半胱氨酸的種子儲(chǔ)藏蛋白，并且是不溶性的。儲(chǔ)藏蛋白是種子中在發(fā)芽過程中被打碎的蛋白質(zhì)，并被發(fā)芽的幼苗用于生長(zhǎng)和發(fā)育。醇溶谷蛋白是小麥以外谷物中與麥膠蛋白相應(yīng)的儲(chǔ)藏蛋白，而谷蛋白是小麥以外谷物中與麥谷蛋白對(duì)應(yīng)的儲(chǔ)藏蛋白。小麥儲(chǔ)藏蛋白占了種子總蛋白質(zhì)的80％(Kasarda，D.D.等，(1976)，Adv.Cer.Sci.Tech.1158-236；和Osborne，T.B.等(1893)，Amer.Chem.J.15392-471)。認(rèn)為麥谷蛋白和麥膠蛋白對(duì)于生面團(tuán)的形成和面包的質(zhì)量是重要的。體外實(shí)驗(yàn)已顯示種子儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)的溶解度隨著還原而增加(Shewry，P.R.等(1985)，Adv.Cer.Sci.Tech.71-83)。然而先前，認(rèn)為麥谷蛋白和麥膠蛋白的還原降低了而不是提高生面團(tuán)的質(zhì)量(Dahle，L.K.等(1966)Cereal Chem 43682-688)。這很可能是由于化學(xué)還原劑引起的非特異性還原導(dǎo)致生面團(tuán)變軟。
“一次發(fā)酵”和“預(yù)先發(fā)酵”法是制造生面團(tuán)和隨后酵母發(fā)酵產(chǎn)生面包產(chǎn)品的兩種主要的常規(guī)方法。
對(duì)于一次發(fā)酵法，將面粉、水或其它液體、和其它生面團(tuán)成分(包括但不限于酵母、谷粒、鹽、油酥、糖、酵母營(yíng)養(yǎng)物、面團(tuán)質(zhì)量改進(jìn)劑和防腐劑)全部混合在一起，形成生面團(tuán)，并拌和到部分或完全發(fā)開。可將得到的面團(tuán)發(fā)酵一段時(shí)間，視具體方法或所要的終產(chǎn)物特征而定。
該方法的下一步是將面團(tuán)機(jī)械或手工分成重量足夠、大小合適的塊，確保在烘烤、冷卻和切割后達(dá)到目標(biāo)凈重。然后常常使生面團(tuán)塊成圓形，并放置不同長(zhǎng)度的時(shí)間(中間檢驗(yàn))。這使面團(tuán)在壓片和折疊制備之前“放松”。時(shí)間通常在5-15分鐘之間，但視具體加工要求和配方變化很大。然后用機(jī)械或手工將生面團(tuán)塊搟成合適的形狀，然后在烘烤前通常作最終“檢驗(yàn)”在預(yù)先發(fā)酵方法中，將酵母與其它成分混合，使得在最終拌和面包或面包卷的生面團(tuán)之前發(fā)酵不同時(shí)間。對(duì)于這些系統(tǒng)面包師的術(shù)語包括“水釀造”、“液態(tài)發(fā)酵”、“液態(tài)發(fā)酵面團(tuán)”和“發(fā)酵面團(tuán)/生面團(tuán)”。將一定百分?jǐn)?shù)的面粉(在0-100％之間)與其它成分混合，這些成分可能包括但不限于水、酵母、酵母營(yíng)養(yǎng)物和面團(tuán)質(zhì)量改進(jìn)劑，并將混合物在受控或環(huán)境條件下發(fā)酵一段時(shí)間。典型時(shí)間范圍是1-5小時(shí)。然后可直接使用發(fā)酵物，或冷凍并儲(chǔ)藏在貯桶或槽中以后使用。加入其余的成分(面粉、特征成分、其它添加劑、額外的水等)，拌和面團(tuán)至部分或完全發(fā)開。
然后使面團(tuán)發(fā)酵不同時(shí)間。通常由于在加入其余成分前已發(fā)生了某種程度的發(fā)酵，所需該時(shí)間很短(即10-20分鐘)，然而視設(shè)備和產(chǎn)品種類可變化。在第二次發(fā)酵步驟之后，可象一次發(fā)酵法那樣處理生面團(tuán)。
本文使用的術(shù)語“生面團(tuán)混合物”描述了一種混合物，它至少含有面粉或粗粉和一種液體，如牛奶或水。
本文所用的術(shù)語“生面團(tuán)”描述了一種具有彈性的、柔韌的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)混合物，它至少含有面粉或粗面粉和一種液體，如牛奶或水。
本文所用的術(shù)語“生面團(tuán)成分”可能包括但不限于任何下列成分面粉、水或其它液體、谷粒、酵母、發(fā)酵面團(tuán)、鹽、油酥、糖、酵母養(yǎng)分、面團(tuán)質(zhì)量改進(jìn)劑和防腐劑。
本文所用的術(shù)語“烘烤食品”包括但不限于所有類型的面包，包括酵母發(fā)酵和化學(xué)發(fā)酵的，以及白面包和各種面包和面包卷、英國(guó)松餅、蛋糕和曲奇餅、糖果用涂層、克力架、炸面圈和其它甜點(diǎn)商品、攀和意大利餡餅底、椒鹽卷餅、皮塔餅和其它扁面包、未發(fā)酵的玉米粉餅、面條制品、和冷藏和冷凍面制品。
雖然已用硫氧還蛋白還原面粉中的清蛋白，但還未用硫醇氧化還原蛋白還原麥谷蛋白和麥膠蛋白和其它水不溶性儲(chǔ)藏蛋白，也未用其改善生面團(tuán)和烘烤食品的質(zhì)量。也未用硫醇氧化還原蛋白改善面筋的質(zhì)量，從而增強(qiáng)其價(jià)值或從大麥、玉米、高粱、燕麥、粟和稻或從大豆粉中制備生面團(tuán)。
許多谷物種子還含有已顯示起外源酶抑制劑作用的蛋白質(zhì)。已提出這些酶抑制劑可能賦予抵御某些有害生物的保護(hù)作用(Garcia-Olmedo，F(xiàn).等(1987)OxfordSurveys of Plant Molecular and Cell Biology 4275-335；Birk，Y.(1976)Meth.Enzymol.45695-739和Laskowski，M.Jr.等(1980)Ann.Reo.Biochem.49593-626)。這兩類酶抑制劑是淀粉酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑。另外，有證據(jù)證明大麥蛋白抑制劑(在該研究中未測(cè)試)能抑制相同來源的α-淀粉酶(Weselake，R.J.等(1983)，Plant Physiol.72809-812)。不幸的是，該抑制劑蛋白質(zhì)常常在某些食品中導(dǎo)致不良作用。大豆中的胰蛋白酶抑制蛋白，尤其是Kunitz胰蛋白酶抑制蛋白(KTI)和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白(BBTI)，必需先滅活，然后這些大豆制品才能被人或家畜所消化。已知這兩種抑制蛋白在被硼氫化鈉化學(xué)還原時(shí)變得無效(Birk，Y.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25113-131和Birk，Y.(1976)Meth.Enzymol.45695-739)。這些抑制蛋白像抑制蛋白酶的其它蛋白質(zhì)一樣，含有分子內(nèi)二硫鍵，而且通常在加熱或蛋白水解滅活時(shí)是穩(wěn)定的(Birk(1976)見上；Garcia-Olmedo等(1987)，見上和Ryan(1980))。目前，為了將抑制蛋白引起的不良作用減到最小，可通過高溫處理食物來處理動(dòng)物和人類食品中的這些大豆胰蛋白酶抑制劑和其它胰蛋白酶抑制劑。然而熱處理不能完全消除抑制蛋白活性。另外，該方法不僅昂貴，而且它還會(huì)破壞許多其它對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很重要的蛋白質(zhì)。例如，120℃加熱30分鐘導(dǎo)致大豆粉的BBTI完全失活，原來的KTI活性剩余約20％(Friedman等，1991)。完全滅活抑制蛋白所需的延長(zhǎng)或更高溫度的處理會(huì)導(dǎo)致氨基酸(如半胱氨酸、精氨酸和賴氨酸)破壞(Chae等，1984；Skrede和Krogdahl，1985)。
還有幾種工業(yè)加工需要α-淀粉酶活性。一個(gè)例子是麥芽制造，需要活性的α-淀粉酶。用硫醇氧化還原蛋白還原滅活抑制蛋白，如大麥淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶(asi)抑制蛋白和其它谷物中它的等價(jià)物，將使α-淀粉酶比現(xiàn)有方法更快成為完全活性，從而縮短了麥芽制造或類似過程的時(shí)間。
硫醇氧化還原蛋白先前并未被用于滅活胰蛋白酶或淀粉酶抑制蛋白。還原胰蛋白酶抑制蛋白(如Kunitz和Bowman-Birk抑制蛋白)降低了其抑制作用(Birk，Y.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25113-131)。用于人類或家畜消費(fèi)的豆制品中抑制蛋白的還原有關(guān)的硫醇氧化還原蛋白，不需要加熱或只需要比目前蛋白質(zhì)變性所需熱量低的熱量，從而減少了變性成本并改善了大豆蛋白的質(zhì)量。另外，一種生理學(xué)上的還原劑，一種所謂的清潔添加劑(即沒有視為“有害化學(xué)物質(zhì)”成分的添加劑)是非常理想的，因?yàn)槭称饭I(yè)正在尋找化學(xué)添加劑的代替品。另外，生理學(xué)還原劑(如硫醇氧化還原蛋白)以受控方式選擇性還原對(duì)面粉質(zhì)量重要的主要小麥和種子儲(chǔ)藏蛋白(如麥膠蛋白和麥谷蛋白)的能力可用在烘烤業(yè)中，以改進(jìn)小麥和黑麥生面團(tuán)的性能，并從其它谷物粉，如玉米粉或從木薯或大豆粉產(chǎn)生生面團(tuán)。
作為儲(chǔ)油種子(如蓖麻子和巴西果)特征的2S清蛋白家族(Kreis等，1989；Youle和Huang，1981)儲(chǔ)藏在種子胚乳或子葉的蛋白質(zhì)體內(nèi)(Ashton等1976；Weber等，1980)，通常通過兩個(gè)分子間二硫鍵由不同亞基連接而成，一個(gè)亞基7-9kDa，另一個(gè)3-4kDa。大亞基含有兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵基團(tuán)，小亞基不含二硫鍵。2S大亞基的胞內(nèi)二硫鍵顯示與大豆Bowman-Birk抑制蛋白的同源(Kreis等，1989)，但對(duì)于2S蛋白在生理?xiàng)l件下經(jīng)歷還原的能力尚不了解。
這些2S清蛋白富含甲硫氨酸。近來產(chǎn)生了產(chǎn)生巴西果2S蛋白的轉(zhuǎn)基因大豆。這些大豆中2S蛋白的還原可增強(qiáng)大豆蛋白整合入生面團(tuán)網(wǎng)絡(luò)中，得到富含甲硫氨酸的大豆面包。另外，這些2S蛋白質(zhì)常常是變應(yīng)原。還原2S蛋白可終止其過敏活性。
支鏈淀粉酶(“脫支鏈酶”)是一種通過水解切割α-1，6鍵，破壞谷物種子胚乳淀粉的酶。支鏈淀粉酶是釀造和烘烤業(yè)的一種基本酶。需要支鏈淀粉酶破壞麥芽制造和某些烘烤過程(在不加蔗糖和其它糖類的條件下進(jìn)行)中的淀粉。獲得足夠支鏈淀粉酶活性尤其在麥芽制造業(yè)中是一個(gè)問題。一段時(shí)間以來已知二硫蘇糖醇(DTT，一種硫氧還蛋白的化學(xué)還原劑)能激活谷物制品(如大麥、燕麥和稻粉)的支鏈淀粉酶。一種用生理學(xué)可接受的系統(tǒng)充分激活或提高支鏈淀粉酶活性的方法可能導(dǎo)致更迅速的麥芽制造方法，并由于提高了糖利用率，導(dǎo)致酒精含量提高的酒精飲料，如啤酒。
在許多非洲、亞洲和南美國(guó)家中蛇咬導(dǎo)致的死亡和永久傷害是嚴(yán)重的問題，在美國(guó)的幾個(gè)南部和西部地區(qū)也受到主要關(guān)注。蛇毒的特征是含有位于分子內(nèi)(鏈內(nèi))半胱氨酸和在某些情況下位于分子間(鏈間)半胱氨酸的二硫(S-S)鍵橋的活性蛋白組分(通常幾種)。某給定毒素組中半胱氨酸的位置是高度保守的。報(bào)道還原這些基團(tuán)導(dǎo)致蛇毒在小鼠中毒性的喪失證明了這些分子內(nèi)S-S基團(tuán)對(duì)毒性的重要性(Yang，C.C.(1967)Biochem.Biophys.Ac ta.133.346-355；Howard，B.D.等(1977)Biochemistry 16122-125)。蛇毒的神經(jīng)毒素是能改變運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)的蛋白質(zhì)，可以是突觸前也可以是突觸后的。在患有蛇毒神經(jīng)中毒的個(gè)體中觀察到的共同癥狀包括腫脹、水腫和疼痛，昏迷或眩暈、發(fā)麻或患處麻木、抽搐、肌肉收縮、腎衰竭、以及長(zhǎng)期壞死和個(gè)體全身虛弱等。
突觸前神經(jīng)毒素分成兩組。第一組β-神經(jīng)毒素包括三類不同的蛋白質(zhì)，每類都具有磷脂酶A2組分，它顯示了高度的保守性。負(fù)責(zé)磷脂酶A2活性的蛋白質(zhì)具有6-7個(gè)二硫鍵。β-神經(jīng)毒素組的成員是單鏈(如考多毒素(caudotoxin)、虎蛇毒素和腹蛇神經(jīng)毒素)或多鏈(如響尾蛇毒素、印度環(huán)蛇毒素和蝰屬毒素)。β-金環(huán)蛇毒素是由兩個(gè)亞基構(gòu)成的，屬于第三組。這些亞基之一與哺乳動(dòng)物胰臟的Kunitz-型蛋白酶抑制蛋白同源。多鏈β-神經(jīng)毒素的蛋白組分離子性連接，而β-金環(huán)蛇毒素的兩個(gè)亞基通過分子間二硫鍵共價(jià)連接。β-金環(huán)蛇毒素的B鏈亞基與哺乳動(dòng)物胰臟的Kunitz型蛋白酶抑制蛋白同源，具有3個(gè)二硫鍵。
第二組突觸前毒素，強(qiáng)化(facilitatory)神經(jīng)毒素缺乏酶活性，具有兩個(gè)亞組。第一亞組樹突毒素具有一條57-60個(gè)氨基酸的多肽序列，它與哺乳動(dòng)物胰臟的Kunitz型胰蛋白酶抑制蛋白同源，并能封閉電壓敏感的鉀通道。第二亞組如束毒素(如束毒素1和束毒素2)是膽堿酯酶抑制蛋白，尚未被深入研究過。
突觸后神經(jīng)毒素分類成長(zhǎng)神經(jīng)毒素和短神經(jīng)毒素。每一類含有S-S基團(tuán)，但肽是獨(dú)特的，不象磷脂酶A2或Kunitz或Kunitz型抑制蛋白。短神經(jīng)毒素(如埃拉布毒素a和埃拉布毒素b)長(zhǎng)60-62個(gè)氨基酸殘基，具有4個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。長(zhǎng)神經(jīng)毒素(如α-金環(huán)蛇毒素和α-眼鏡蛇毒素)含有65-74個(gè)殘基和5個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。另一類毒素，細(xì)胞毒素，在突觸后起作用，但其中毒患病形式不明確。這些細(xì)胞毒素顯示模糊不清的藥物學(xué)作用，如溶血、細(xì)胞溶解和肌肉去極化。它們的毒性比神經(jīng)毒素小。細(xì)胞毒素通常含有60個(gè)氨基酸和4個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。蛇毒神經(jīng)毒素都具有多個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。
目前在對(duì)病人急救處理后用于治療毒蛇咬傷的蛇抗毒素主要包括靜脈注射以馬制備的抗蛇毒血清。雖然不知道蛇咬中毒后多久可以施用抗蛇毒血清，而且是有效的，但推薦使用它直到24小時(shí)?？股叨狙逯委熗ǔ０殡S靜脈內(nèi)輸液，如血漿、清蛋白、血小板或特異性凝血因子。另外，常常施用支持藥物，例如抗生素、抗組織胺藥、抗破傷風(fēng)藥、麻醉藥和鎮(zhèn)靜劑。在某些情況下，采用全身治療標(biāo)準(zhǔn)來最大程度減少休克、腎衰竭和呼吸衰竭。除了在咬傷處附近施用鈣-EDTA和切開咬傷處外，尚不知道可導(dǎo)致毒素中和和防止毒素吸收入血管的局部治療方法。甚至這些局部治療也是明顯有問題的，而且對(duì)于對(duì)馬血清敏感的人常常是保留的(Russelll，F(xiàn).E.(1983)Snake Venom Poisoning，Schollum International，Inc.Great Neck，NY)。
本文所用的術(shù)語“病人”指動(dòng)物或人。
目前使用的大多數(shù)抗蛇毒血清是有問題的，在于它們可能產(chǎn)生有害的副作用，而且在對(duì)馬血清敏感的病人(大約5％病人)中產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)。非變應(yīng)原性反應(yīng)包括致熱原性休克和補(bǔ)體耗竭(Chippaur，J.-P.等(1991)Reptile Venom andToxins，A.T.Tu編，Marcel Dekker，Inc.，529-555頁)。
已顯示硫氧還蛋白在NADPH和硫氧還蛋白還原酶存在下，能在體外還原細(xì)菌神經(jīng)毒素破傷風(fēng)毒素和肉毒毒素A(Schiavo，G.等(1990)Infection and Immunity584136-4141；Kistner，A.等(1992)Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol345227-234)。硫氧還蛋白能還原破傷風(fēng)毒素的鏈內(nèi)二硫鍵，因而這些被還原的破傷風(fēng)毒素不再具有神經(jīng)毒性(Schiavo等，見上)。然而報(bào)道用硫氧還蛋白還原肉毒桿菌A毒素的鏈內(nèi)二硫鍵要緩慢得多(Kistner等，見上)。與本發(fā)明過程中研究的蛇神經(jīng)毒素相反，破傷風(fēng)研究組(Schiavo等，見上)在用破傷風(fēng)毒素進(jìn)行的工作中，沒有發(fā)現(xiàn)還原的硫氧還蛋白還原了毒素鏈內(nèi)二硫鍵的證據(jù)。在用肉毒桿菌A進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中也沒有證據(jù)表明硫氧還蛋白還原了鏈內(nèi)二硫鍵。破傷風(fēng)和肉毒桿菌A毒素是與蛇神經(jīng)毒素顯著不同的蛋白質(zhì)，在于后者(1)具有小分子量；(2)富含分子內(nèi)二硫鍵；(3)能抵抗胰蛋白酶和其它動(dòng)物蛋白酶；(4)沒有酶修飾，如蛋白酶水解切割也具有活性；(5)在許多情況下顯示與動(dòng)物蛋白質(zhì)，如磷脂酶A2和Kunitz型蛋白酶同源；(6)在大多數(shù)情況下缺乏鏈間二硫鍵，和(7)對(duì)于熱和蛋白酶等因素是穩(wěn)定的。
在文獻(xiàn)中已報(bào)道通過將蛇毒素與1％β-巰基乙醇培育6小時(shí)，并與8M脲和300mMβ-巰基乙醇培育可體外還原性滅活蛇毒素(Howard，B.D.等(1977)Biochemistry 16122-125；Yang，C.C.(1967)Biochem.Biophys.Acta.133346-355)。然而這些條件不是生理?xiàng)l件。本文所定義的關(guān)于毒素蛋白的術(shù)語“滅活”意味著毒素在體外不再具有生物活性，即毒素不能與受體連接。本文還使用的“解毒”是術(shù)語“滅活”的延伸，意味著毒素在個(gè)體內(nèi)已被中和，如用動(dòng)物毒性試驗(yàn)測(cè)定的。
蜂毒是至少40種獨(dú)立組分的復(fù)雜混合物，它包括主要組分，如蜜蜂毒素和磷脂酶A2，分別占總毒素重量的50％和12％，和小組分如小蛋白和肽、酶、胺和氨基酸。
蜜蜂毒素是一條由26個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，分子量為2840。它不含二硫鍵。由于它對(duì)脂肪-水界面的高親和力，該蛋白能滲透細(xì)胞膜的磷脂雙層，干擾其組織結(jié)構(gòu)。蜜蜂毒素本身不是毒素，但它改變膜結(jié)構(gòu)，從而增加磷脂酶A2的水解作用，后者是毒液中存在的另一種主要組分，也是主要的變應(yīng)原。
蜜蜂毒液的磷脂酶A2是128個(gè)氨基酸的單鏈多肽，通過4個(gè)二硫鍵交聯(lián)，并含有糖。蜜蜂毒液的主要毒性作用是由于與蜜蜂毒素關(guān)聯(lián)的磷脂酶A2的強(qiáng)水解活性。
蜜蜂毒液中其它毒素蛋白具有低分子量，并含有至少兩個(gè)二硫鍵，它們似乎起著重要的結(jié)構(gòu)作用。包括蛋白酶抑制蛋白(63-65個(gè)氨基酸)、MCD或401-肽(22個(gè)氨基酸)和蜜蜂神經(jīng)毒素(18個(gè)氨基酸)。
雖然蜂類有幾千種，僅蜜蜂(Apis mellifera)是變態(tài)反應(yīng)的主要原因。反應(yīng)從局部不適到全身性反應(yīng)，包括可導(dǎo)致死亡的休克、低血壓、呼吸困難、知覺喪失、喘鳴和/或胸悶。在這些情況下唯一的治療方法是注射腎上腺素。
治療蜂蜇不僅對(duì)于具有過敏反應(yīng)的人很重要?！皻⑷朔洹被蚍侵薹?，一種蜜蜂的變種，它比歐洲蜜蜂更具攻擊性，在南美和北美都是一種危險(xiǎn)。雖然非洲和歐洲蜜蜂毒液的致死率似乎相同(Schumacher，M.I.等(1989)Nature 337413)，但蜂群的行為模式完全不同。報(bào)道非洲蜂對(duì)群體干擾反應(yīng)更快，量更大而且蜇得更多(Collins，A.M.等(1982)Science 21872-74)。非洲蜜蜂的大量攻擊可在一個(gè)人身上制造幾千處蜇傷，并導(dǎo)致死亡?！皻⑷恕狈淇磥硎欠侵薹?Apis melliferascutellata)和歐洲蜂(Apis mellifera mellifera)種間繁殖的結(jié)果。非洲蜂最初在1956年被引入巴西，目的是產(chǎn)生更適合熱帶氣候的蜜蜂來提高蜂蜜生產(chǎn)。非洲蜂已從南美傳播到了北美，在得克薩斯和佛羅里達(dá)已有它們的報(bào)道。
在世界某些地方如墨西哥、巴西、北非和中東，蝎子是對(duì)人類生命的一種威脅。然而，僅Buthidae科的蝎子(Androctonus、Buthus、Centruroides、Leiurus和Tityus屬)對(duì)人有毒。蝎子毒液的化學(xué)組成不像蛇或蜜蜂毒液那樣復(fù)雜。蝎子毒液含有粘多糖、少量透明質(zhì)酸酶和磷脂酶、低分子量分子、蛋白酶抑制蛋白、組胺釋放劑和神經(jīng)毒素，如血清素。神經(jīng)毒素作用于神經(jīng)肌肉連接處電壓敏感的離子通道。神經(jīng)毒素是具有3-4個(gè)二硫鍵的堿性多肽，并可分成兩組61-70個(gè)氨基酸的肽，封閉鈉通道，和36-39個(gè)氨基酸的肽，封閉鉀通道。非生理性還原劑，如DTT或β-巰基乙醇(Watt，D.D.等(1972)Toxicon 10173-181)對(duì)該神經(jīng)毒素二硫鍵的還原導(dǎo)致其毒性喪失。
動(dòng)物被毒蝎子蜇后的癥狀包括興奮過度、呼吸困難、抽搐、癱瘓和死亡。目前，抗蛇毒血清是僅有的蝎蜇解毒劑。在制造抗蝎毒血清中，獲得毒液是主要問題。不像蛇毒液，蝎子毒液非常難收集，因?yàn)槊恐恍拥亩疽寒a(chǎn)量有限，而且在某些情況下，儲(chǔ)藏干燥的毒液導(dǎo)致其毒性改變。制造抗蝎毒血清中的另一個(gè)問題是神經(jīng)毒素是非常弱的抗原。
從未報(bào)道過在生理?xiàng)l件下對(duì)蛇、蜜蜂和蝎子毒素的還原性滅活，也未提出過硫醇氧化還原劑，如還原的硫辛酸、DTT或還原的硫氧還蛋白可作為這些毒液在個(gè)體中的解毒劑。
食物過敏代表了在國(guó)家和國(guó)際上的一個(gè)長(zhǎng)期存在的重要問題。在美國(guó)人口中高達(dá)5％的12歲以下兒童和1％成人受到臨床影響(Adverse Reaction to Foods-AAAI and NIAD Report，1984，NIH Pub No.84-2442，pp.2，3)。在某些國(guó)家，該數(shù)字更高，而且在世界各地，相信該問題正在增加，尤其在嬰兒中(T.Matsuda和R.Nakamura 1993 Molecular structure and immunological properties of FoodAllergens，Trend in Food Science & Technology 4，289-293)。該問題延伸到各式各樣的食品。作為轉(zhuǎn)基因食品關(guān)注的結(jié)果，近來食物過敏總體上已成了增長(zhǎng)的問題。
牛奶代表了一個(gè)顯著的問題，尤其在嬰兒中。小麥和大豆過敏在接受這些食物的新生人群中變得越來越重要，而且在寵物(尤其是狗)食品中也越來越被關(guān)注。牛肉、稻米和雞蛋也能在許多人中導(dǎo)致嚴(yán)重過敏，關(guān)于寵物食品也受到了關(guān)注。
上述食品中的許多主要變態(tài)原性蛋白具有分子內(nèi)二硫鍵(S-S)鍵，而且迄今商業(yè)上已運(yùn)用了兩種處理方法來減少食物過敏(1)加熱，和(2)蛋白酶水解。就兩種情況而言，僅獲得了部分成功。雖然減少了變態(tài)原性，熱處理即便在最好的情況下也不能消除該問題，因?yàn)橐鸬牡鞍淄ǔＪ菬岱€(wěn)定性的。另外，加熱通過破壞營(yíng)養(yǎng)上重要的氨基酸如賴氨酸、半胱氨酸和精氨酸降低了產(chǎn)品質(zhì)量。酶蛋白水解在減少變應(yīng)原性上更成功，但常常喪失理想的食物性質(zhì)，如味道，而且處理是昂貴的。因此一種生理學(xué)上安全的系統(tǒng)，它在應(yīng)用于變應(yīng)原性食物中時(shí)能減少或除去變應(yīng)原性，而不引起味道和營(yíng)養(yǎng)的損失將是極端有價(jià)值的。
已知某些主要花粉變應(yīng)原是二硫鍵蛋白質(zhì)，它們對(duì)溫度有高度抗性。在豚草花粉中描述了兩種作為主要變應(yīng)原的花粉蛋白。一種是5kDa的小蛋白，Amb a V，含有4個(gè)二硫鍵(Goodfriend，L.等(1985)，“Ra5G，一種大豚草花粉中的Ra5同源物其分離，HLA-DR相關(guān)的活性和氨基酸序列”，Mol.Immunol.22899-906；Metzler，W.J.等(1992)，“用核磁共振光譜測(cè)定豚草變應(yīng)原Amb t V的三維溶液結(jié)構(gòu)”，Biochemistry 315117-5127；Mole，L.E.等(1975)，“豚草花粉變應(yīng)原Ra5的氨基酸序列”Biochemistry 141216-1220；Metzler，W.J.等(1992)“核磁共振光譜分析豚草變應(yīng)原Amb a V的質(zhì)子共振排列和三維溶液結(jié)構(gòu)”Biochemistry318697-8705)。認(rèn)為該蛋白質(zhì)在矮和大豚草中都是同源的。矮豚草蛋白質(zhì)命名為Amb a V，而大豚草現(xiàn)在稱為Amb t V，兩者先前都稱為Ra5，它們之間顯示45％的序列相似性。
其它主要變應(yīng)原代表了一組41kDa蛋白，稱為Amb a l.1、Amb a l.2、Amb a1.3和Amb a l.4。雖然未描述過所有的二硫鍵，這些蛋白含有多個(gè)半胱氨酸(Rafnar，T.等(1991)“Amb a I(抗原E)的克隆，矮豚草花粉的主要變應(yīng)原家族”J.Biol.Chem.2661229-1236；Griffith，I.J.等(1991)，“Amb a I和Amb a II的序列多形性，Ambrosia artemisiifolia(矮豚草)的主要變應(yīng)原”Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.96296-304)。而其它已知的變應(yīng)原是二硫鍵蛋白如西方豚草Amb P 5-A和-B，各長(zhǎng)8.5kDa，具有三個(gè)二硫鍵(Ghosh，B.等(1994)“Ambrosiapsilostachya(西方豚草)花粉的Amb p V變應(yīng)原的免疫學(xué)和分子特征”J.Immunol.1522882-2889)和矮豚草11.4kDa質(zhì)體藍(lán)素樣蛋白，caUed Ra 3，具有一個(gè)二硫鍵(Klapper，D.G.等(1980)“豚草變應(yīng)原Ra3的氨基酸序列”Biochemistry 195729-5734)。
5kDa Amb V豚草花粉蛋白具有良好限定的結(jié)構(gòu)，四個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的位置是精確已知的(Metzler，W.J.等(1992)Biochemistry 315117-5127和8697-8705)。之前的工作已顯示，當(dāng)被化學(xué)試劑(脲加上二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇)在變性條件下還原時(shí)，免疫應(yīng)答從IgE(變應(yīng)原性)變到IgG(防御性)，因?yàn)樵鰪?qiáng)了IgG的產(chǎn)生(Zhu，X.等(1995)“豚草花粉變應(yīng)原Ambrosia artemisiifolia(Amb a 5)和Ambrosiatrifida(Amb t 5)的T細(xì)胞表位作圖和T細(xì)胞識(shí)別中游離巰基的作用”J.Immunol.1555064-73)。
目前正在用未變性的花粉抽提物常規(guī)免疫治療花粉過敏。然而這些治療(尤其在兒童中)具有可能致命的過敏反應(yīng)的危險(xiǎn)。因此，需要弱化的花粉蛋白或花粉抽提物用于免疫治療，以減少或消除過敏反應(yīng)的可能性。還需要一種生理學(xué)上安全的系統(tǒng)，它可測(cè)定具體患者的過敏原是否是二硫蛋白。；另外，能減輕過敏癥狀但少產(chǎn)生副作用的滴眼液、鼻用噴霧、氣溶膠或用于蒸發(fā)機(jī)或加濕器的分散劑，與常規(guī)可得的產(chǎn)品相比將是極其有價(jià)值的。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的目的是提供一種減少含非硫堇素半胱氨酸的蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供如下方法，單獨(dú)利用硫醇氧化還原蛋白或聯(lián)用還原劑或還原系統(tǒng)來減少面粉或種子中的麥谷蛋白或麥膠蛋白。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供單獨(dú)用硫醇氧化還原蛋白或聯(lián)用還原劑或還原系統(tǒng)來改進(jìn)生面團(tuán)強(qiáng)度和烘烤食品的特性，例如更好的面包屑質(zhì)量、烘烤食品的柔軟度和更大的面包體積。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有用于實(shí)施這些方法的硫醇氧化還原蛋白的制劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種從稻、玉米、大豆、大麥、燕麥、木薯、高粱或粟面粉制造生面團(tuán)的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)改進(jìn)的面筋或從小麥和黑麥以外的谷物顆粒生產(chǎn)面筋樣產(chǎn)品的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種還原具有二硫鍵的酶抑制蛋白的方法。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供表達(dá)或過度表達(dá)硫氧還蛋白的經(jīng)基因改造的酵母細(xì)胞。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供一種表達(dá)或過度表達(dá)NADP-硫氧還蛋白還原酶的經(jīng)基因改造的酵母細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用這些經(jīng)基因工程改造的酵母細(xì)胞改進(jìn)生面團(tuán)或烘烤食品質(zhì)量的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種還原非硫堇素、非葉綠體蛋白(含有一個(gè)以上的分子內(nèi)半胱氨酸)的分子內(nèi)二硫鍵的方法，包括在含有含半胱氨酸的蛋白的液體或物質(zhì)中加入硫醇氧化還原蛋白，還原硫醇氧化還原蛋白并用硫醇氧化還原蛋白還原含半胱氨酸的蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種分離的支鏈淀粉酶抑制蛋白，它具有二硫鍵，分子量在8-15kDa之間。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能增加衍生自大麥或小麥胚乳的支鏈淀粉酶活性的方法，包括在含支鏈淀粉酶的液體或物質(zhì)中加入硫氧還蛋白，并還原硫氧還蛋白，從而提高支鏈淀粉酶的活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，來還原具有一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)半胱氨酸的動(dòng)物毒液毒性蛋白質(zhì)，包括使含半胱氨酸的該蛋白與一定量的硫醇氧化還原(SH)劑接觸，有效還原該蛋白，并維持接觸足夠的時(shí)間，來還原一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)半胱氨酸形成的一個(gè)或多個(gè)二硫鍵，從而還原神經(jīng)毒素蛋白。硫醇氧化還原(SH)劑可以是還原的硫氧還蛋白、硫氧還蛋白存在下的還原的硫辛酸、DTT或硫氧還蛋白存在下的DTT，而蛇神經(jīng)毒素蛋白可以是突觸前或突觸后神經(jīng)毒素。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有蛇神經(jīng)毒素蛋白和硫醇氧化還原(SH)劑的組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種還原具有一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)半胱氨酸的動(dòng)物毒液毒素蛋白的方法，包括使該蛋白與一定量的NADP-硫氧還蛋白還原酶、NADPH或NADPH產(chǎn)生系統(tǒng)和硫氧還蛋白接觸，有效還原該蛋白，并維持接觸足夠的時(shí)間，來還原一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)半胱氨酸形成的一個(gè)或多個(gè)二硫鍵，從而還原該蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種在體外滅活具有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸的蛇神經(jīng)毒素的方法，包括在含有該毒素的液體中加入硫醇氧化還原(SH)劑，其中該試劑的量能有效還原該毒素。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療個(gè)體毒液中毒的方法，包括施給患毒液中毒的個(gè)體有效還原或減輕毒液毒性量的硫醇氧化還原(SH)試劑。
根據(jù)本發(fā)明的目的，提供了改善生面團(tuán)特性的方法，包括步驟將硫醇氧化還原蛋白與生面團(tuán)成分混合，形成生面團(tuán)并烘烤所述生面團(tuán)。
還根據(jù)本發(fā)明的目的，提供了一種滅活谷物食品中酶抑制蛋白的方法，包括步驟將硫醇氧化還原蛋白與種子產(chǎn)物混合，用還原劑或還原系統(tǒng)還原硫醇氧化還原蛋白，并用還原的硫醇氧化還原蛋白還原酶抑制蛋白，該酶抑制蛋白的還原滅活了酶抑制蛋白。
本文所用的硫醇氧化還原蛋白可包括硫氧還蛋白和谷氧還蛋白。硫氧還蛋白包括但不限于大腸桿菌硫氧還蛋白、硫氧還蛋白h、f和m以及動(dòng)物硫氧還蛋白。本文所用的硫氧還蛋白的還原劑可包括硫辛酸或一種還原系統(tǒng)，如NADPH聯(lián)合NADP硫氧還蛋白還原酶(NTR)。谷氧還蛋白的還原劑可包括還原的谷胱甘肽聯(lián)合還原系統(tǒng)NADPH和谷胱甘肽還原酶。NADPH可用NADPH產(chǎn)生蛋白或產(chǎn)生蛋白組合物(如由葡萄糖6-磷酸、NADP和酵母等來源的葡萄糖6-磷酸脫氫酶構(gòu)成的)所替代。在生面團(tuán)制備過程一開始時(shí)加入NADPH產(chǎn)生蛋白以及硫氧還蛋白和NADP-硫氧還蛋白還原酶。
應(yīng)注意本發(fā)明還可用含半胱氨酸的蛋白質(zhì)實(shí)施。可首先氧化半胱氨酸然后用硫醇氧化還原蛋白還原。
還根據(jù)本發(fā)明的目的，提供了一種降低變應(yīng)原性食物蛋白質(zhì)的變應(yīng)原性的方法，包括步驟將該蛋白與一定量的硫氧還蛋白、NTR和NADPH或一定量的DTT在硫氧還蛋白存在下接觸，有效降低該蛋白質(zhì)的變應(yīng)原性，并按下列步驟將該接觸過的蛋白質(zhì)給予(a)某動(dòng)物，從而減少所述動(dòng)物中的變應(yīng)原性癥狀，該癥狀在該動(dòng)物接受未處理蛋白時(shí)原本會(huì)發(fā)生。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種低變應(yīng)原性的可吸收食品。通過之前用硫氧還蛋白在NTR和NADPH存在下處理，使食物降低變應(yīng)原性。食物可以是牛肉、牛奶、大豆、雞蛋、稻或小麥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種改進(jìn)蛋白酶水解的方法，從而改善了食物和變應(yīng)原性蛋白的可消化性，因而還提供了更加容易消化的許多是變應(yīng)原性的食物。所制備的食品和變應(yīng)原在先用硫氧還蛋白在硫氧還蛋白的還原劑(如上文所述的那些)存在下處理后，更易被蛋白酶水解，更容易消化。
合適的食物包括大豆、堅(jiān)果、牛奶、乳清、牛肉、雞蛋、面包、其它小麥產(chǎn)品和其它谷物產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種降低變應(yīng)原性花粉蛋白的變應(yīng)原性的方法，包括步驟將該蛋白與一定量的還原的硫氧還蛋白接觸，有效減少該蛋白的變應(yīng)原性，并將用硫氧還蛋白還原的蛋白以免疫治療性劑量施給某動(dòng)物，從而降低了所述動(dòng)物的變應(yīng)原性癥狀，這些癥狀在該動(dòng)物接觸未處理的蛋白時(shí)原本會(huì)發(fā)生。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種降低變應(yīng)原性的花粉或具有還原的二硫鍵的花粉蛋白，用于免疫治療。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種測(cè)定某具體病人的變應(yīng)原是否是二硫鍵蛋白的方法，包括對(duì)所述病人進(jìn)行變應(yīng)原測(cè)試，以鑒定所述變應(yīng)原，用還原的硫氧還蛋白體外處理所述鑒定出的變應(yīng)原蛋白，并分析所述處理的變應(yīng)原蛋白二硫鍵的還原情況。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是柱狀圖，顯示通過用還原的硫氧還蛋白處理大豆變應(yīng)原性抽提物，減輕了皮膚測(cè)試對(duì)大豆變應(yīng)原性反應(yīng)。
圖2是柱狀圖，顯示通過用還原的硫氧還蛋白處理牛奶變應(yīng)原性抽提物，減輕了皮膚測(cè)試對(duì)牛奶變應(yīng)原性反應(yīng)。
圖3是柱狀圖，顯示通過用還原的硫氧還蛋白處理小麥變應(yīng)原性抽提物，減輕了皮膚測(cè)試對(duì)小麥變應(yīng)原性反應(yīng)。
圖4是柱狀圖，顯示在室溫下通過用還原的硫氧還蛋白處理牛肉變應(yīng)原性抽提物，減輕了皮膚測(cè)試對(duì)牛肉變應(yīng)原性反應(yīng)。
圖5是柱狀圖，顯示通過37℃下通過用還原的硫氧還蛋白處理牛肉變應(yīng)原性抽提物，減輕了皮膚測(cè)試對(duì)牛肉變應(yīng)原性反應(yīng)。
圖6是柱狀圖，顯示用還原的硫氧還蛋白處理食物，減輕了對(duì)大豆和小麥的胃腸道變應(yīng)原性反應(yīng)。
圖7是SDS聚丙烯酰胺電泳膠的照片，用熒光和蛋白染色方法顯示了硫氧還蛋白相關(guān)的和谷胱甘肽相關(guān)的還原的程度。
圖8是氧化的牛β-乳球蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)圖，顯示了二硫鍵和游離的巰基。
圖9是一張蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺電泳膠照片，顯示了與硫氧還蛋白相關(guān)的還原對(duì)牛β-乳球蛋白的胃蛋白酶消化的影響。
圖10A代表了蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺電泳膠照片，顯示了時(shí)間對(duì)未處理牛奶消化的作用。
圖10B代表了蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺電泳膠照片，顯示了在55℃經(jīng)過硫氧還蛋白相關(guān)的還原后，時(shí)間對(duì)牛奶消化的影響。
圖10C代表了蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺電泳膠照片，顯示了在4℃經(jīng)過硫氧還蛋白相關(guān)的還原后，時(shí)間對(duì)牛奶消化的影響。
圖11A是柱狀圖，顯示在對(duì)牛奶高度敏感的狗中皮膚測(cè)試反應(yīng)與硫氧還蛋白有關(guān)的減輕。
圖11B是柱狀圖，顯示在對(duì)牛奶輕度敏感的狗中皮膚測(cè)試反應(yīng)與硫氧還蛋白有關(guān)的減輕。
圖12A是柱狀圖，顯示硫氧還蛋白相關(guān)的還原和可消化性對(duì)β-乳球蛋白變應(yīng)原性的影響。
圖12B是柱狀圖，顯示硫氧還蛋白相關(guān)的還原和可消化性對(duì)牛奶變應(yīng)原性的影響。
圖13是氧化的牛β-乳球蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)圖，顯示了小鼠抗體(MAb)的表位。
圖14是計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的牛β-乳球蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)分子模型，顯示在半胱氨酸誘變后，預(yù)計(jì)的單克隆抗體表位的變化。
圖15是SDS聚丙烯酰胺電泳膠的照片，用熒光顯示了硫氧還蛋白相關(guān)的和谷胱甘肽有關(guān)的還原的程度。
圖16A是一張蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺電泳膠照片，顯示了時(shí)間對(duì)未處理的豚草變應(yīng)原Amb vt V消化的影響。
圖16B是一張蛋白染色的SDS聚丙烯酰胺電泳膠照片，顯示了在硫氧還蛋白相關(guān)的還原后，時(shí)間對(duì)豚草變應(yīng)原Amb vt V消化的影響。
圖17A是柱狀圖，顯示了硫氧還蛋白相關(guān)的還原和胃蛋白酶對(duì)大豚草花粉抽提物的變應(yīng)原性的影響，該狗對(duì)含二硫鍵的蛋白質(zhì)敏感。
圖17B是柱狀圖，顯示了硫氧還蛋白相關(guān)的還原和胃蛋白酶可消化性對(duì)大豚草花粉抽提物在狗中的的變應(yīng)原性的影響，該狗對(duì)含二硫鍵的蛋白不大敏感。
圖18A是蛋白染色SDS聚丙烯酰胺電泳膠的照片，顯示了在4℃發(fā)生硫氧還蛋白相關(guān)的還原后，時(shí)間對(duì)豚草花粉消化的影響。
圖18B是蛋白染色SDS聚丙烯酰胺電泳膠的照片，顯示了在37℃和55℃發(fā)生硫氧還蛋白相關(guān)的還原后，時(shí)間對(duì)豚草花粉消化的影響。
發(fā)明詳述根據(jù)本文的詳細(xì)描述，下列定義和縮寫表示CM -某種面包小麥α-淀粉酶抑制蛋白DSG-從硬粒小麥分離到的某種α-淀粉酶抑制蛋白DTNB -2’5’-二硫二(2-硝基苯甲酸)NTR- -NADP-硫氧還蛋白還原酶
mBBr -一溴二滿(monobromobimane)NADP-MDH -NADP-蘋果酸脫氫酶FBPase -果糖-1，6-二磷酸酶SDS -十二烷基磺酸鈉DTT -二硫蘇糖醇谷物 -粟、小麥、燕麥、大麥、稻、高粱或黑麥BBTI -Bowman-Birk大豆胰蛋白酶抑制蛋白KTI -Kunitz大豆胰蛋白酶抑制蛋白PAGE -聚丙烯酰胺凝膠電泳TCA -三氯乙酸酶抑制蛋白實(shí)驗(yàn)起始材料材料從實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏獲得了面包小麥Triticum aestivum L，cv.Talent和硬粒小麥(Triticun durum.Desf.，cv.Mondur)。
試劑從Sigma Chmical Co.和Biorad laboratories分別購(gòu)得了用于酶實(shí)驗(yàn)和十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳的化學(xué)藥品和精制化學(xué)藥品。一溴二滿(mBBR，商品名Thiolite)購(gòu)自Calbiochem。其它化學(xué)藥品是商品購(gòu)得的，并且是可得到的最高質(zhì)量。
酶大腸桿菌的硫氧還蛋白和NTR購(gòu)自American Diagnoticsm，Inc.，還從轉(zhuǎn)化過度表達(dá)各蛋白的細(xì)胞中分離得到。含有重組質(zhì)粒pFP1的硫氧還蛋白菌株是由Dr.J.-P.Jacquot(de la Motte Guery，F(xiàn).等(1991)Eur.J.Biochem.196287-294)慷慨贈(zèng)與的。含有重組質(zhì)粒pPMR21的NTR菌株是由Dr.Marjorie Russel和PeterModel(Russel，M.等(1988)J.Biol.Chem.2639015-9019)慷慨贈(zèng)與的。這些蛋白的分離程序如研究中所述，進(jìn)行了下列改變?cè)赗ibi細(xì)胞分級(jí)器中以25,000psi破碎細(xì)胞，如Florencio等(Florencio，F(xiàn).J.等(1988)Arch.Biochem.Biophys.266496-507)所述純化NTR，而沒有紅瓊脂糖步驟。用Florencio等開發(fā)的，用于菠菜葉的方法分離得到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(面包師酵母1型)的硫氧還蛋白和NTR，進(jìn)行了下列改變?cè)赗ibi細(xì)胞分級(jí)器中以40,000psi破碎懸浮細(xì)胞[1份細(xì)胞5份緩沖液(w/v)]，進(jìn)行3次。
從麥芽中用菠菜葉的方法(Florencio，F(xiàn).J.等(1988)Arch.Biochem.Biophys.266496-507)分離得到硫氧還蛋白h和NTR。從玉米(Jacquot，J.-P.等(1981)PlantPhysiol.68300-304)和菠菜(Crawford，N.A.等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)的葉子分別純化了NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-MDH)和果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)。從教授A.Holmgren獲得了大腸桿菌谷氧還蛋白和胎牛胸腺硫氧還蛋白。
α-淀粉酶和胰蛋白酶抑制蛋白從面包小麥面粉的清蛋白-谷氧還蛋白組分中，如前所述(Kobrehel，K.等(1991)Cereal Chem.681-6)分離得到CM-1蛋白。還用已發(fā)表的方法從硬粒小麥的麥谷蛋白組分中分離了DSG蛋白(DSG-1和DSG-2)(Kobrehel，K.等(1989)J.Sci.Food Agric 48441-452)。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中CM-1、DSG-1和DSG-2蛋白是同源的。從Sigma Chemical Co.購(gòu)得胰蛋白酶抑制蛋白，除了來自玉米芯的蛋白是購(gòu)自Fluca。就所有情況而言，商品制備物顯示在SDS-PAGE中如預(yù)計(jì)泳動(dòng)的一種蛋白組分(考馬斯藍(lán)染色)，但在某些制備物中，條帶不明顯。
其它蛋白質(zhì)面包小麥中的嘌呤硫堇素α和硬粒小麥的嘌呤硫堇素α-1和β是Dr.D.D.Kasarda和B.L.Jones分別慷慨贈(zèng)與的。當(dāng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)時(shí)，嘌呤硫堇素α樣品含有兩個(gè)嘌呤硫堇素家族的成員。嘌呤硫堇素α-1和β樣品在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中是均一的。
常規(guī)方法步驟酶激活實(shí)驗(yàn)NADP-MDH、FBPase、NTR和硫氧還蛋白h試驗(yàn)方法按照Florencio，F(xiàn).J.等(1988)Arch.Biochem.Biophys.266496-507，如標(biāo)明作了輕微改動(dòng)。對(duì)于酶激活試驗(yàn)，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間是20分鐘，除非另外說明。
mBBr熒光標(biāo)記和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析用Crawford等的方法經(jīng)改進(jìn)測(cè)定了研究蛋白質(zhì)的直接還原(Crawford，N.A.等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)。在100mM pH7.1，含有10mMEDTA和16％甘油，最終體積為0.1ml的磷酸鉀緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)。如所示，在含有1mMNADPH和10微克(2-17μM)的靶蛋白的70微升緩沖溶液中，加入0.7微克(0.1μM)NTR和1微克(0.8μM)硫氧還蛋白(都從大腸桿菌常規(guī)制備)。當(dāng)硫氧還蛋白被二硫蘇糖醇(DTT，0.5mM)還原時(shí)，省略NADPH和NTR。類似用還原的谷胱甘肽進(jìn)行了試驗(yàn)，但最終濃度是1mM。培育20分鐘后，加入100納摩爾mBBr，繼續(xù)反應(yīng)15分鐘。為了停止反應(yīng)并衍生出過量的mBBr，加入10微升10％的SDS和10微升100mMβ-巰基乙醇，然后將樣品加到凝膠上。就用谷氧還蛋白還原而言，用1微克(0.8μM)大腸桿菌谷氧還蛋白、1.4微克(0.14μM)從菠菜葉子純化得到的谷胱甘肽還原酶(Florencio，F(xiàn).J.等(1988)Arch.Biochem.Biophys.266496-507)替換硫氧還蛋白和NTR，并使用了1.5mM NADPH。
按照Laemmli(Laemmli，U.K.(1970)Nature 227680-685)制備了凝膠(17.5％w/v，1.5mm厚)并在穩(wěn)定電流(9mA)下電泳16小時(shí)。電泳后，將凝膠置于40％甲醇和10％乙酸的溶液中，浸4-6小時(shí)，換幾次溶液。然后按照Crawford等(Crawford，N.A>等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)用純紫外光檢測(cè)凝膠中的熒光條帶并拍照(曝光時(shí)間25秒)。最后，用考馬斯藍(lán)染色并如前脫色(Crawford，N.A.(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)。
標(biāo)記蛋白的定量測(cè)定為了獲得測(cè)試蛋白質(zhì)被NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原程度的定量指標(biāo)，用修改的Crawford等(Crawford，N.A.(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)的方法評(píng)估了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中所見的熒光條帶的強(qiáng)度。用PharmaciaUltrascan激光密度計(jì)掃描了照相底片，并通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較測(cè)定了各蛋白的峰面積。對(duì)于后一種測(cè)定，在0.5mM DTT存在下100℃加熱3分鐘，還原了各蛋白(濃度范圍在1-5微克之間)。然后如上所述進(jìn)行mBBr標(biāo)記，除了用SDS停止反應(yīng)后，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白100℃加熱2分鐘，并用β-巰基乙醇衍生過量的mBBr。由于熒光條帶的強(qiáng)度與加入的蛋白質(zhì)量成比例，猜想在所用的條件下完成了反應(yīng)。
實(shí)施例1α-淀粉酶抑制蛋白的硫氧還蛋白相關(guān)的還原酶激活試驗(yàn)在葉綠體酶激活中替換一種特定的硫氧還蛋白的能力是一種測(cè)試，用于測(cè)試某給定蛋白質(zhì)的硫醇基團(tuán)經(jīng)受可逆氧化還原變化的能力。盡管在質(zhì)體外蛋白的情況下不是生理狀態(tài)，但是該試驗(yàn)已證明在幾種研究中是有用的。一個(gè)相關(guān)的例子是嘌呤硫堇素，當(dāng)它被硫氧還蛋白h還原時(shí)激活葉綠體FBPase(Wada，K.等(1981)FEBS Lett.124237-240和Johnson，T.C.等(1987)Plant Physiol.85446-451)。FBPase(其生理上的激活蛋白是硫氧還蛋白f)不受硫氧還蛋白h的影響。在該實(shí)施例中，如前所述測(cè)試了富含半胱氨酸的蛋白激活FBPase和NADP-MDH的能力。發(fā)現(xiàn)硬粒小麥(DSG-1和DSG-2)的α-淀粉酶抑制蛋白對(duì)于酶激活是有效的；然而它們與嘌呤硫堇素的不同之處在于顯示對(duì)NADP-MDH的特異性，而不是FBPase的特異性(表I)。僅在還原的硫氧還蛋白h存在下α-淀粉酶抑制蛋白才具有活性，而硫氧還蛋白h本身在這些條件下不顯著激活NADP-MDH。根據(jù)反應(yīng)順序(DTT→硫氧還蛋白→DSG→NADP-MDH)，DSG-1和DSG-2在DTT-還原的硫氧還蛋白h存在下激活NADP-蘋果酸脫氫酶。包含在200微升100mMTris-HCl緩沖液，pH7.9中用于激活的整個(gè)系統(tǒng)是10mMDTT、0.7微克玉米葉NADP-MDH、0.25微克小麥硫氧還蛋白h和10微克DSG-1或DSG-2。在一個(gè)研究中使用20mMβ-巰基乙醇(β-MET)代替DTT。預(yù)培養(yǎng)后，用分光光度測(cè)量法分析了NADP-MDH。
在酶激活試驗(yàn)中，DTT還原了硫氧還蛋白h；如預(yù)期的，一硫醇如β-巰基乙醇(β-MET)在這些條件下不以顯著的速率還原硫氧還蛋白(Jacquot，J.-P.等(1981)Plant Physiol.68300-304；Nishizawa，A.N.等(1982)“葉綠體分子生物學(xué)的方法”，(M.Edelman，R.B.Hallick和N.-H.Chua，編)pp.707-714，ElsevierBiomedical Press，New York，和Crawford，N.A.等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271233-239)，不替換DTT。
NADP-MDH活性與加入的DSG-1和DSG-2水平在一恒定的硫氧還蛋白h濃度下成比例。如前述使用相同的DTT計(jì)算公式。除了改變DSG-1或DSG-2的濃度，條件與前述相同。當(dāng)在固定的DSG濃度下測(cè)試時(shí)，NADP-MDH顯示了隨著硫氧還蛋白h增加活性增加。除了改變硫氧還蛋白h濃度，條件如上述。
當(dāng)如表I所示使用20微克CM-1時(shí)，CM-1-面包小麥蛋白與DSG蛋白相似，但分子量較低—也激活了NADP-MDH，但不激活FBPase。該結(jié)果表明硫氧還蛋白h能還原各種α-淀粉酶抑制蛋白，它們進(jìn)而按照等式4-6激活NADP-MDH。當(dāng)在缺乏硫氧還蛋白時(shí)加入DTT，這些蛋白在酶激活中是無效的。
(4)DTT還原+硫氧還蛋白h氧化→硫氧還蛋白h還原+DTT氧化(5)α-淀粉酶抑制蛋白氧化+硫氧還蛋白h還原→α-淀粉酶抑制蛋白還原+硫氧還蛋白h氧化(6)α-淀粉酶抑制蛋白還原+NADP-MDH氧化→α-淀粉酶抑制蛋白氧化+NADP-MDH氧化(無活性) (有活性)表I硫氧還蛋白還原的胰蛋白酶抑制蛋白、硫堇素和α-淀粉酶抑制蛋白在激活葉綠體NADP-蘋果酸脫氫酶和果糖二磷酸酶中的作用(DTT→硫氧還蛋白→標(biāo)出的蛋白→目標(biāo)酶)如上所述在該實(shí)施例中進(jìn)行了NADPH-MDH的激活，除了測(cè)試的DSG或其它蛋白的量是20微克。采用標(biāo)準(zhǔn)DTT試驗(yàn)，用1微克大腸桿菌硫氧還蛋白和20微克示出的蛋白測(cè)試了FBPase的激活。對(duì)于大腸桿菌硫氧還蛋白在這些條件下所見的有限活性糾正上述值。*活性，nkat/mg數(shù)值蛋白質(zhì) Mr，kDaS-S組NADP-MDH FBPaseα-淀粉酶抑制蛋白**DSG-2 17 52 0**DSG-1 14 52 0 12 5 12 0胰蛋白酶抑制蛋白富含半胱氨酸(植物)玉米芯 12 55 0大豆Bowman-Birk 8 73 0其它種類類卵粘蛋白 28 92 0大豆Kunitz 20 22 0卵抑制蛋白 49 14 1 0牛肺(抑酶肽)7 3痕量 2硫堇素**嘌呤硫堇素-α16 41 39**嘌呤硫堇素-β 6 4痕量 5 嘌呤硫堇素-α 6 40 14*這些值與用菠菜葉綠體硫氧還蛋白m(NADP-MDH)和硫氧還蛋白f獲得的相應(yīng)值40和550分別比較。**來自硬粒小麥 實(shí)施例2DTNB還原試驗(yàn)硫醇氧化還原能力的第二個(gè)測(cè)試是測(cè)試催化巰基試劑2’，5’-二硫二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)還原的能力，通過412nm處的吸光值增加來測(cè)定。此處，分析的蛋白質(zhì)是由NADPH通過NTR和硫氧還蛋白還原的。證實(shí)DTNB試驗(yàn)對(duì)硬粒(DSG-1和2)和面包小麥(CM-1)的α-淀粉酶抑制蛋白都是有效的。當(dāng)被NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(在這種情況下使用大腸桿菌的NTR和硫氧還蛋白)還原時(shí)，DSG-1或DSG-2顯著提高了DTNB的還原(NADPH→NTR→硫氧還蛋白→DSG→DTNB)。用10微克硫氧還蛋白和10微克NTR和20微克DSG-1或DSG-2進(jìn)行了DTNB還原試驗(yàn)。CM-1在DTNB還原試驗(yàn)中也是有效的，而且像用NADPH-MDH激活(表I)那樣，可檢測(cè)到比DSG蛋白更高的活性。CM-1試驗(yàn)的條件與DSG/DTNB試驗(yàn)相同，除了省去DSG蛋白和使用嘌呤硫堇素α20微克或使用20微克CM-1。因此，該結(jié)果證實(shí)了實(shí)施例1中的酶激活試驗(yàn)，并顯示可用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)從生理上還原α-淀粉酶抑制蛋白。在等式7-9中總結(jié)了這些條件下α-淀粉酶抑制蛋白在促進(jìn)DTNB還原中的作用。
(8)硫氧還蛋白還原+α-淀粉酶抑制蛋白氧化→硫氧還蛋白氧化+α-淀粉酶抑制蛋白還原(9)α-淀粉酶抑制蛋白還原+DTNB氧化→α-淀粉酶抑制蛋白氧化+DTNB還原實(shí)施例3
蛋白質(zhì)還原的測(cè)定一溴二滿(mBBr)的可獲得性及其用于植物系統(tǒng)的適應(yīng)性提供了一種測(cè)量植物蛋白的巰基的新技術(shù)(Crawford，N.A.等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)。當(dāng)與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聯(lián)用時(shí)，mBBr甚至可用于定量測(cè)定復(fù)雜混合物中氧化還原活性蛋白的巰基狀態(tài)的變化。因此將該技術(shù)應(yīng)用于該抑制蛋白質(zhì)，來證實(shí)其被硫氧還蛋白還原的能力。此處，用硫氧還蛋白還原了測(cè)試的蛋白質(zhì)，其中硫氧還蛋白本身先前已用DTT或NADPH和NTR還原。然后制備還原蛋白質(zhì)的mBBr衍生物，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與其它組分分開，并用熒光檢測(cè)了它的還原狀態(tài)。在下文所述的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的硫氧還蛋白能有效還原各種靶蛋白。平行實(shí)驗(yàn)揭示了硫氧還蛋白h和胎牛胸腺硫氧還蛋白分別還原了種子和動(dòng)物來源的這種蛋白質(zhì)。
在酶激活和染料還原實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證中，在硫氧還蛋白的存在下有效還原了DSG-1。培育后用mBBr衍生得到這些蛋白質(zhì)，并在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后使熒光顯示。單用DTT還原少得多，用GSH不顯著。在還原CM-1和DSG-2中(數(shù)據(jù)未顯示)中觀察到對(duì)硫氧還蛋白的類似要求。雖然使用大腸桿菌的硫氧還蛋白，用小麥硫氧還蛋白h得到了類似結(jié)果。當(dāng)用NADPH和NTR替換DTT(數(shù)據(jù)未顯示)時(shí)，也需要硫氧還蛋白。
實(shí)施例4富含半胱氨酸的植物胰蛋白酶抑制蛋白與硫氧還蛋白相關(guān)的還原當(dāng)小麥種子的主要可溶性富含半胱氨酸的蛋白以外源性α-淀粉酶抑制蛋白起作用時(shí)，大部分其它種子富含半胱氨酸的蛋白缺乏該活性，而且在某些情況下，起著動(dòng)物來源的胰蛋白酶的特異性抑制蛋白。雖然這些蛋白可用強(qiáng)化學(xué)還原劑，如硼氫化鈉還原(Birk，Y.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25113-131和Birl，Y.(1976)Meth.Enzymol.45695-7390)還原這些蛋白，但是幾乎沒有證據(jù)證明它們可在生理?xiàng)l件下被還原。因此感興趣的是測(cè)試胰蛋白酶抑制蛋白被硫氧還蛋白還原的能力。測(cè)試的富含半胱氨酸的代表包括大豆Bowman-Birk和玉米芯胰蛋白酶抑制蛋白。兩種情況的結(jié)果都是陽性當(dāng)在DTT-還原的硫氧還蛋白(表I)存在下加入時(shí)，各抑制蛋白激活了NADPH-MDH(但不是FBPase)，每種都在NADPH、NTR和硫氧還蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)存在下還原了DTNB。
如同α-淀粉酶抑制蛋白所發(fā)現(xiàn)的，可直接通過mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)監(jiān)測(cè)富含半胱氨酸的胰蛋白酶抑制蛋白依賴硫氧還蛋白的還原。因此，僅在還原的硫氧還蛋白和Bowman-Birk(BBTI)抑制蛋白(顯示高熒光迅速移動(dòng)條帶)和玉米芯(CKTI)胰蛋白酶抑制蛋白(顯示在硫氧還蛋白后的高熒光條帶遷移)同時(shí)存在下，才能觀察到DTT的顯著還原作用。
實(shí)施例5其它胰蛋白酶抑制蛋白和嘌呤硫堇素的硫氧還蛋白相關(guān)的還原鑒于發(fā)現(xiàn)種子的富含半胱氨酸的胰蛋白酶抑制蛋白能經(jīng)歷硫氧還蛋白的特異性還原，提出了如下問題，即是否其它種類的胰蛋白酶抑制蛋白也具有這種能力。在本研究的過程中，測(cè)試了數(shù)種這樣的抑制蛋白-大豆Kunitz、牛肺抑酶肽、卵清卵蛋白抑制劑和類卵粘蛋白胰蛋白酶抑制蛋白。雖然測(cè)試的參數(shù)不像上述的富含半胱氨酸的蛋白那樣廣泛，但發(fā)現(xiàn)其它胰蛋白酶抑制蛋白也顯示能被硫氧還蛋白特異性還原，如用酶激活和mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定的那樣。如上述富含半胱氨酸蛋白質(zhì)的情況而言，在研究該階段測(cè)試的胰蛋白酶抑制蛋白(大豆Kunitz和動(dòng)物胰蛋白酶抑制蛋白)激活了NADP-MDH而不激活FBPase(表I)。牛肺抑酶肽是一個(gè)例外，因?yàn)樗せ頕BPase比激活NADP-MDH更有效。還需注意該抑酶肽與本文研究的某些種子蛋白相似，在于它顯示高含量半胱氨酸(約10％)(Kassel，B.等(1965)Biochem.Biophys.Res.Commun.20463-468)。
通過在mBBr/SDS-聚丙烯酰胺電泳膠中高熒光緩慢移動(dòng)的條帶，顯示了這些蛋白之一Kunitz抑制蛋白的硫氧還蛋白相關(guān)的還原的熒光證據(jù)。在其還原形式中，Kunitz抑制蛋白也產(chǎn)生熒光快速移動(dòng)的條帶。該較低分子量物質(zhì)的性質(zhì)未知。它在凝膠上的位置提示，它可能代表作為Kunitz制備物中一種污染物的Bowman-Birk抑制蛋白；然而，這種組分在用考馬斯藍(lán)染色的SDS膠中不明顯。這種動(dòng)物抑制蛋白產(chǎn)生了預(yù)期分子量的一條熒光條帶，也顯示還原需要硫氧還蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。
在較早期的結(jié)果的驗(yàn)證中，硫氧還蛋白還原的嘌呤硫堇素始終激活FBPase，而更早測(cè)試的類型嘌呤硫堇素-α不能激活產(chǎn)生了NADP-MDH(表I)(Wada，K.(1981)FEBS Letter 124237-240)。然而，與面包小麥的嘌呤硫堇素-α相反，這兩種之前未檢測(cè)的嘌呤硫堇素(嘌呤硫堇素α-1和β，來自硬粒小麥)以可檢測(cè)水平激活了NADP-MDH(表I)。兩種硬粒小麥嘌呤硫堇素在其激活FBPase的能力上也不同。這些嘌呤硫堇素之間的活性差異在考慮其氨基酸序列(Jones，B.L.等(1977)Cereal Chem.554511-523)及其經(jīng)歷硫氧還蛋白還原的能力上的強(qiáng)烈相似性時(shí)是出乎意料的。用SDS-PAGE熒光法觀察到嘌呤硫堇素(此處是α型)的還原需要硫氧還蛋白。
實(shí)施例6還原的定量測(cè)定上述實(shí)施例證明了硫氧還蛋白能還原各種蛋白質(zhì)，包括α-淀粉酶，如CM和DSG抑制蛋白，和種子和動(dòng)物來源的胰蛋白酶抑制蛋白。雖然在質(zhì)量意義上是明顯的，但是上述結(jié)果對(duì)于還原程度未給出定量指標(biāo)。因此，按照Crawford等(Crawford，N.A.等(1989)Arch.Biochem.Biophys.271223-239)的方案進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
如表II所示，大腸桿菌NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原種子抑制蛋白的程度視時(shí)間而定，并且視蛋白質(zhì)而定，在2小時(shí)后達(dá)到15-48％還原。根據(jù)主要蛋白組分發(fā)射的熒光，結(jié)果表明硫氧還蛋白在α-淀粉酶和胰蛋白酶抑制蛋白的還原中起催化作用。2小時(shí)后還原的蛋白與加入的硫氧還蛋白的比率比兩種還原最多的蛋白(大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白)和最少的蛋白(玉米芯胰蛋白酶抑制蛋白)之一大，即這兩種蛋白2小時(shí)還原期后比率是7和2。應(yīng)注意表II中的值是在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件下獲得的，未嘗試通過修改這些條件優(yōu)化還原。
表II用mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分析NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原種子蛋白的程度使用了下列蛋白濃度(納摩爾)硫氧還蛋白0.08；嘌呤硫堇素-β1.7；DSG-1，0.7；玉米芯胰蛋白酶抑制蛋白，1.0；Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白，1.3；和Kunitz胰蛋白酶抑制蛋白，0.5；除了標(biāo)出時(shí)間差異，其它條件與實(shí)施例1-4中相同。
％還原蛋白質(zhì) 20分鐘120分鐘嘌呤硫堇素-β 1532DSG-1 2238玉米芯胰蛋白酶抑制蛋白 3 15Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白2548Kunitz胰蛋白酶抑制蛋白 1422實(shí)施例7作為還原劑的大腸桿菌谷氧還蛋白已知細(xì)菌和動(dòng)物含有一種硫醇氧化還原蛋白，谷氧還蛋白，它能替換在核糖核苷還原等反應(yīng)中的硫氧還蛋白(Holmgren，A.(1985)Annu.Rev.Biochem.54237-271)如等式10和11所示還原谷氧還蛋白。 (11)2GSH+谷氧還蛋白氧化→GSSG+谷氧還蛋白還原目前沒有證據(jù)證明谷氧還蛋白與高等植物的蛋白質(zhì)相互作用。用大腸桿菌的谷氧還蛋白和目前正在研究的種子蛋白測(cè)試了該能力。用mBBr/SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聯(lián)合密度計(jì)掃描監(jiān)測(cè)了還原作用。觀察到在前面描述的條件下，谷氧還蛋白能在某些但不是所有情況下替換硫氧還蛋白。因此，發(fā)現(xiàn)谷氧還蛋白在下列物質(zhì)還原中有活性(數(shù)據(jù)表明相對(duì)于大腸桿菌硫氧還蛋白的還原百分?jǐn)?shù))DSG-1和CM-1α-淀粉酶抑制蛋白(分別是147％和210％)；玉米芯胰蛋白酶抑制蛋白(424％)；和嘌呤硫堇素(對(duì)于α、α1和β形式來說，分別是82％、133％和120％)。谷氧還蛋白對(duì)于DSG-2α-淀粉酶抑制蛋白和大豆Bowman-Birk和Kunitz胰蛋白酶抑制蛋白無效。動(dòng)物來源的胰蛋白酶抑制蛋白還顯示對(duì)谷氧還蛋白的混合的反應(yīng)。卵清卵抑制蛋白可被有效還原(相對(duì)于大腸桿菌硫氧還蛋白還原了55％)，而卵清類卵粘蛋白抑制蛋白和牛肺抑酶肽不受影響。顯然如前面所報(bào)道的(Wolosiuk，R.A.等(1977)Nature 266565-567)，谷氧還蛋白不能替代硫氧還蛋白，作為葉綠體硫氧還蛋白相關(guān)的酶，F(xiàn)BPase和NADP-MDH的激活中的直接還原劑(數(shù)據(jù)未顯示)。
上述實(shí)施例顯示了一些測(cè)試的酶抑制蛋白可被谷氧還蛋白以及硫氧還蛋白所還原。對(duì)于硫氧還蛋白特異性的那些包括α-淀粉酶抑制蛋白(DSG-2)和幾種胰蛋白酶抑制蛋白(Kunitz，Bowman-Birk，抑酶肽和類卵粘蛋白抑制蛋白)。被硫氧還蛋白或谷氧還蛋白還原的那些蛋白質(zhì)包括嘌呤硫堇素、兩種α-淀粉酶抑制蛋白(DSG-1、CM-1)、一種植物的富含半胱氨酸的胰蛋白酶抑制蛋白(玉米芯抑制蛋白)和動(dòng)物的胰蛋白酶抑制蛋白(卵清卵抑制蛋白)。這些結(jié)果提出了如下問題，即在植物中是否存在谷氧還蛋白。據(jù)報(bào)道谷氧還蛋白存在于綠藻中(Tsang，M.L.-S.(1981)Plant Physiol.681098-1104)，但不存在于高等植物。
雖然表I顯示的NADP-MDH和FBPase靶酶的活性比下面用生理性葉綠體蛋白(硫氧還蛋白m或f)激活后所見到的活性低，但重復(fù)發(fā)現(xiàn)這些數(shù)值因此認(rèn)為它們是真實(shí)的。似乎可能是這些抑制蛋白顯示的酶比活力雖然不是生理學(xué)上相關(guān)的，但是反映了還原所實(shí)現(xiàn)的特定結(jié)構(gòu)。仍然要看在種子或動(dòng)物細(xì)胞中這樣的還原結(jié)構(gòu)是否與功能相關(guān)。
由于靶蛋白的功能尚不清楚，對(duì)硫氧還蛋白(或谷氧還蛋白)相關(guān)的還原的生理后果引起了相當(dāng)?shù)呐d趣。本結(jié)果提供了一種新的可能性。硫氧還蛋白在生理?xiàng)l件下還原各種各樣抑制蛋白的發(fā)現(xiàn)提示，在不存在區(qū)室屏障時(shí)，還原可在細(xì)胞中發(fā)生。
實(shí)施例8大豆粕中大豆胰蛋白酶抑制蛋白的滅活本實(shí)施例的目的是滅活大豆的Bowman-Birk和Kunitz胰蛋白酶抑制蛋白。對(duì)動(dòng)物飼料制品使用下列方案。在10g大豆粕中加入0.2微克硫氧還蛋白、0.1微克NADP-硫氧還蛋白還原酶和500納摩爾NADPH與30mMTris-HCl緩沖液，pH7.9，5.25毫升。使上述混合物在室溫下保持30分鐘。用如前所述的mBBr熒光標(biāo)記/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(Kobrehel，K.等(1991)J.Biol.Chem.26616135-16140)測(cè)定大豆胰蛋白酶抑制蛋白的直接還原。用改進(jìn)的胰島素和BAEE試驗(yàn)(Na-苯甲?；?L-精氨酸乙酯)(Schoellmann，G.等(1963)Biochemistry2521963；Gonias，S.L.等(1983)J.Biol.Chem.25814682)進(jìn)行了處理過的面粉的胰蛋白酶活性的分析。從該分析確定，用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)處理大豆粕不抑制胰蛋白酶。
實(shí)施例9谷物中α-淀粉酶抑制蛋白的滅活在10g大麥麥芽中加入0.2微克硫氧還蛋白、0.1微克NADP-硫氧還蛋白還原酶和500納摩爾NADPH，以及1M HCl緩沖液，pH7.9，得到5.25毫升30mM的Tris-HCl。上述混合物在室溫下放置30分鐘。用如前所述的mBBr熒光標(biāo)記/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(Kobrehel，K.等(1991)J.Biol.Chem.26616135-16140)測(cè)定α-淀粉酶抑制蛋白的直接還原。跟蹤淀粉中麥芽糖的釋放監(jiān)測(cè)α-淀粉酶的活性(Bernfeld，P.(1955)Method in Enzymol.1149)。從該分析確定用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)處理大麥不抑制α-淀粉酶。
谷物蛋白的還原材料和方法植物材料Dr.K.Kahn慷慨贈(zèng)送了硬粒小麥的種子和胚乳粉(Triticum durum，Desf.cv.Monroe)。
小麥種子的發(fā)芽將20-30個(gè)種子置于塑料培養(yǎng)皿中的3層Whatman#1濾紙上，濾紙用5毫升去離子水濕潤(rùn)。在暗室中室溫下發(fā)芽4日。
試劑/精制化學(xué)藥品從Sigma Chmical Co.(St.Louis，MO)獲得了生物化學(xué)物質(zhì)和凍干的偶聯(lián)酶。從American Diagnostica，Inc.(Greenwich，CT)購(gòu)得大腸桿菌硫氧還蛋白和NTR。按照開發(fā)菠菜葉子的方法(Florencio，F(xiàn).J.等(1988)，Arch.Biochem.Biophys.266496-507)從幼苗中分離出小麥硫氧還蛋白h和NTR。大腸桿菌谷氧還蛋白是A.Holmgren教授慷慨贈(zèng)與的。從Bio-Rad Laboratories(Richmond，CA)購(gòu)得SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的試劑。一溴二滿(mBBr)或Thiolite從Calbiochem Co.(SanDiego，CA)獲得。乳酸鋁和甲基綠是Fluka Chmical Co.(Buchs，Switzerland)的產(chǎn)品。
麥膠蛋白和麥谷蛋白為了分離不溶性儲(chǔ)藏蛋白，用1毫升下列溶液依次在25℃下，指定時(shí)間內(nèi)抽提胚乳粉(0.2克)(1)50mM Tris-HCl，pH7.5(20分鐘)；(2)70％乙醇(2小時(shí))；和(3)0.1M乙酸(2小時(shí))。在萃取時(shí)，樣品置于電子旋轉(zhuǎn)器上，并用漩渦混合器不時(shí)攪拌。在用各溶劑萃取后，離心樣品(12,000rpm5分鐘)于Eppendorf微量離心管中，并保存上清液組分用于分析。在每次萃取之間，用1毫升水洗滌沉淀，如前用離心收集，丟棄上清液洗滌組分。依照慣例，組分稱為(1)清蛋白/球蛋白；(2)麥膠蛋白；和(3)麥谷蛋白。
蛋白質(zhì)的體外mBBr標(biāo)記在100mM Tris-HCl緩沖液pH7.9下進(jìn)行反應(yīng)。如指出的，在70微升含有1mMNADPH和10微克靶蛋白的該緩沖液中加入0.7微克NTR和1微克硫氧還蛋白(都來自大腸桿菌，除非另外說明)。當(dāng)硫氧還蛋白被二硫蘇糖醇(DTT)還原時(shí)，省去NADPH和NTR，將DTT加到0.5mM。類似的用還原的谷胱甘肽進(jìn)行了試驗(yàn)，但最終濃度是1mM。培育20分鐘后，加入100納摩爾mBBr，反應(yīng)再繼續(xù)15分鐘。為了終止反應(yīng)并衍生過量的mBBr，加入10微升10％SDS和10微升100mM β-巰基乙醇，然后在凝膠內(nèi)加入樣品。對(duì)于谷氧還蛋白的還原，用1微克大腸桿菌谷氧還蛋白、1.4微克谷胱甘肽還原酶(從菠菜葉子中純化)和1.5mM NADPH代替硫氧還蛋白和NTR。
蛋白質(zhì)的體內(nèi)mBBr標(biāo)記在指定時(shí)間，從培養(yǎng)皿中取下干種子或發(fā)芽幼苗(根據(jù)相似的根長(zhǎng)度選擇)，并取下其種胚或已發(fā)芽的軸。對(duì)每批5個(gè)胚乳稱重，然后在液氮下，用研缽和搗棒研磨。在最后一點(diǎn)液氮消失時(shí)，加入1毫升2.0mM mBBr(溶于100mM Tris-HCl，pH7.9的緩沖溶液)。然后再次研磨融化的混合物一分鐘，將其轉(zhuǎn)移到微量離心管中。用合適的mBBr或緩沖溶液將懸液體積調(diào)節(jié)到1毫升。從胚乳或發(fā)芽的幼苗如上所述抽提清蛋白/球蛋白、麥膠蛋白和麥谷蛋白的蛋白組分。將抽提的蛋白組分儲(chǔ)藏在-20℃，直到使用。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)包括一緩沖對(duì)照。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在15％凝膠，pH8.5下，如Laemmli，U.K.(1970)Nature 227680-685進(jìn)行了mBBr衍生樣品的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。1.5mm厚的凝膠在9mA恒定電流下電泳16小時(shí)。
天然凝膠電泳為了溶解不同類型的麥膠蛋白，在6％凝膠內(nèi)如Bushuk和Zillman(Bushuk，W.等(1978)Can.J.Plant Sci.58505-515)所述，并根據(jù)Sapirstein和Bushuk(Sapirstein，H.D.等(1985)Cereal Chem.62372-377)對(duì)于垂直平板凝膠修改，進(jìn)行天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(設(shè)計(jì)用于將麥膠蛋白分成4類的方法)。最終體積為100毫升的凝膠溶液含有6.0克丙烯酰胺、0.3克雙丙烯酰胺、0.024克抗壞血酸、0.2毫克七水硫酸亞鐵和0.25克乳酸鋁。用乳酸將pH調(diào)節(jié)到3.1。在冰上對(duì)凝膠溶液脫氣2小時(shí)，然后加入0.5毫升3％過氧化氫作為聚合催化劑。將電泳緩沖液也用乳酸調(diào)節(jié)到pH3.1，每升含有0.5克乳酸鋁。電泳在恒定電流50mA下持續(xù)約4小時(shí)。當(dāng)用甲基綠跟蹤染料標(biāo)記的溶劑前沿泳動(dòng)到離凝膠末端約1厘米時(shí)，停止電泳。
mBBr的去除/熒光照片電泳后，將凝膠置于12％(w/v)三氯乙酸中，浸泡4-6小時(shí)，更換一次溶液來固定蛋白；然后將凝膠轉(zhuǎn)移到40％甲醇/10％乙酸溶液中8-10小時(shí)，以除去過量的mBBr。將凝膠置于配有紫外光源(365nm)的光盒中，顯現(xiàn)游離或與蛋白質(zhì)結(jié)合的mBBr熒光。除去過量(游離)的mBBr后，用Polaroid Positive/Negative Landfilm55型膠片，通過黃色Wratten明膠濾片8號(hào)(截留值為460nm)(曝光時(shí)間在f4.5時(shí)是25-60秒)對(duì)凝膠進(jìn)行拍照(Crawford，N.A.等，1989，Arch Biochem.Biophys.271223-239)。
蛋白質(zhì)染色/脫色/照相用考馬斯亮藍(lán)R-250的40％甲醇/10％乙酸溶液染色SDS-凝膠1-2小時(shí)，并如前所述脫色過夜(Crawford，N.A.等(1989)，Arch.Biochem.Biophys.271223-239)。在含有0.1克考馬斯亮藍(lán)R-250(溶于10毫升95％乙醇)的240毫升12％三氯乙酸過濾過的溶液中染色乳酸鋁天然凝膠過夜。在12％三氯乙酸中脫色凝膠過夜(Bushuk，W.等(1978)Can.J.Plant.Sci.58505-515，和Sapirstein，H.D.等(1985)Cereal Chem.62372-377)用Polaroid55型膠片對(duì)蛋白質(zhì)染色的凝膠進(jìn)行拍照，產(chǎn)生樣片和底片。用樣片測(cè)定條帶遷移距離和負(fù)荷效率。
用激光顯像密度計(jì)(Pharmacia-LKB Ultroscan XL)掃描熒光凝膠的Polaroid底片和蛋白染色濕凝膠樣片。在用GelScan XL軟件擬合后評(píng)估峰面積定量測(cè)定熒光。
酶試驗(yàn)用前述方法測(cè)定了粗抽提物中下列活性己糖激酶(Baldus，B.等(1981)Phytochem.201811-1814)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸鹽脫氫酶(Schnarrenberger，C.等(1973)Arch.Biochem.Biophys.154438-448)、谷胱甘肽還原酶、NTR和硫氧還蛋白h(Florencio，F(xiàn).J.等(1988)Arch.Biochem.Biophys.266496-507)。
蛋白質(zhì)測(cè)定根據(jù)Bradford法(Bradford，M.(1976)Anal.Biochem.72248-256)，用Bio-Rad試劑和牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定了蛋白質(zhì)濃度。
亞基分子量測(cè)定在SDS-PAGE凝膠上用兩套分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)估計(jì)麥膠蛋白和麥谷蛋白的亞基分子量。第一套由BSA(66)、卵清蛋白(45)、大豆胰蛋白酶抑制蛋白(20.1)、肌紅蛋白(17)、細(xì)胞色素c(12.4)和抑酶肽(6.5)組成。另一套是BioRad預(yù)染色的低SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)磷酸化酶b(110)、BSA(84)、卵清蛋白(47)、碳酸酐酶(33)、大豆胰蛋白酶抑制蛋白(24)和溶菌酶(16)。
實(shí)施例10麥膠蛋白的還原作為一個(gè)世紀(jì)前Osborne和共同工作者先鋒貢獻(xiàn)的結(jié)果，種子蛋白可根據(jù)其在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度而組分分開(20)。就小麥而言，胚乳的制備物(面粉或胚乳粉)在歷史上依次用四種溶液抽提，產(chǎn)生指定的蛋白組分(i)水、清蛋白；(ii)鹽水，球蛋白；(iii)乙醇/水，麥膠蛋白；和(iv)乙酸/水，麥谷蛋白。大量證據(jù)已顯示在各組分中富含不同的蛋白質(zhì)。例如，清蛋白和球蛋白組分含有許多酶，而麥膠蛋白和麥谷蛋白組分在發(fā)芽所需的儲(chǔ)藏蛋白中。
上文實(shí)施例1、4和5描述了許多水溶性種子蛋白(清蛋白/球蛋白，如α-淀粉酶抑制蛋白、富含半胱氨酸的胰蛋白酶抑制蛋白、其它胰蛋白酶抑制蛋白和硫堇素)，它們是NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原的，從種子本身或大腸桿菌中獲得。下文描述了該系統(tǒng)還原小麥種子的不溶性儲(chǔ)藏蛋白，即麥膠蛋白和麥谷蛋白為代表的能力。在與指定的加入劑培育后，用mBBr衍生麥膠蛋白，并在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后用熒光顯示。該第一麥膠蛋白凝膠中的泳道如下1.對(duì)照無添加。2.GSH/GR/NADPH還原的谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶(來自菠菜葉子)和NADPH。3.NGSNADPH、還原的谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶(來自菠菜葉子)和谷氧還蛋白(來自大腸桿菌)。4.NTSNADPH、NTR和硫氧還蛋白(兩種蛋白都來自大腸桿菌)。5.MET/T(Ec)β-巰基乙醇和硫氧還蛋白(大腸桿菌)。6.DTT。7.DTT/T(Ec)DTT和硫氧還蛋白(大腸桿菌)。8.DTT/T(W)和7相同，除了用小麥硫氧還蛋白h。9.NGS，-麥膠蛋白與3相同，除了沒有麥膠蛋白組分。10.NTS，-麥膠蛋白與4相同，除了沒有麥膠蛋白組分。基于與mBBr的反應(yīng)性，麥膠蛋白組分已被硫氧還蛋白充分還原。經(jīng)歷還原的主要成員顯示了25-45kDa的分子量范圍。如實(shí)施例1、4和5用種子α-淀粉酶和胰蛋白酶抑制蛋白所見，天然h或大腸桿菌型硫氧還蛋白(二者是同源的)還原了麥膠蛋白；NADPH(和NTR)或DTT可能作為硫氧還蛋白的還原劑。用谷胱甘肽和谷氧還蛋白觀察到低得多的還原，這種谷氧還蛋白可代替某些大腸桿菌和哺乳動(dòng)物酶系統(tǒng)中的硫氧還蛋白，但還不知道是否在高等植物中存在。
麥膠蛋白組分由四種不同蛋白質(zhì)類型構(gòu)成，稱為α、β、γ和ω，可通過天然聚丙烯酰胺凝膠電泳在酸性條件下分開(Bushuk，W.等(1978)，Can.J.Plant.Sci.58505-515；Kasarda，D.D.等(1976)Adv.Cer.Sci.Tech.1158-236；Sapirstein，H.D.等(1985)Cereal Chem.62372-377；和Tatham，A.S.等(1990)，Adv.Cer.Sci.Tech.101-78)。除了ω麥膠蛋白，每種含有半胱氨酸(S-S)基團(tuán)，因此能被硫氧還蛋白還原。在該研究中，和指定添加劑培育以后，用mBBr衍生蛋白質(zhì)，在酸性-聚丙烯酰胺凝膠電泳后使熒光顯示。該研究中第二麥膠蛋白凝膠的泳道如下1.對(duì)照無添加劑。2.GSH還原的谷胱甘肽。3.GSH/GR/NADPH還原的谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶(來自菠菜葉子)和NADPH。4.NGSNADPH、還原的谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶(來自菠菜葉子)和谷氧還蛋白(來自大腸桿菌)。5.NGS+NTS4和6的組合。6.NTSNADPH、NTR和硫氧還蛋白(二者自大腸桿菌)。7.MET/T(Ec)β-巰基乙醇和硫氧還蛋白(大腸桿菌)。8.DTT/T(Ec)DTT和硫氧還蛋白(大腸桿菌)。9.NTS(-T)和6相同，除了沒有硫氧還蛋白。10.NGS+NTS，-麥膠蛋白和5相同，但沒有麥膠蛋白成分。當(dāng)對(duì)硫氧還蛋白還原的麥膠蛋白組分進(jìn)行天然凝膠電泳時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些蛋白可被α組分中回收的硫氧還蛋白最專一的還原。有β和γ麥膠蛋白的活性還原，但是作為表III總結(jié)的密度計(jì)結(jié)果的證據(jù)，這些組內(nèi)的還原是非特異性的，即用谷胱甘肽和谷氧還蛋白也獲得了相對(duì)高水平的還原。DTT-還原的硫氧還蛋白尤其強(qiáng)的還原γ麥膠蛋白。如預(yù)計(jì)的，ω麥膠蛋白無還原。證據(jù)表明硫氧還蛋白(天然h或大腸桿菌)能特異性還原某些麥膠蛋白，尤其是α型的。
表III
不同類型的麥膠蛋白的還原特異性用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原后α、β、γ和聚集物峰下的面積分別是是4.33、8.60、5.67和0.74吸光度單位乘以毫米。當(dāng)用DTT在如實(shí)施例10中的反應(yīng)條件還原硫氧還蛋白時(shí)，在第二塊凝膠中這些合并區(qū)域約占觀察到的65％。還原劑麥膠蛋白，％相對(duì)還原αβγ聚合物*無22.4 30.4 24.3 29.2谷胱甘肽 36.4 68.1 60.6 60.1谷氧還蛋白43.5 83.3 79.7 61.5硫氧還蛋白100.0 100.0 100.0 100.0*未進(jìn)入凝膠的蛋白質(zhì)實(shí)施例11麥谷蛋白的還原要測(cè)試對(duì)于硫氧還蛋白的反應(yīng)的剩余組的種子蛋白-最不可溶于水的麥谷蛋白也許是最令人感興趣的。麥谷蛋白多年來吸引了注意，因?yàn)樗鼈儗?duì)于面粉和粗面粉的烹調(diào)質(zhì)量很重要(MacRitchie，F(xiàn).等(1990)，Adv.Cer.Sci.Tech.1079-145)。因此，測(cè)試硫氧還蛋白還原該組蛋白的能力是本調(diào)查的一個(gè)主要目的。
當(dāng)使用mBBr/SDS-page技術(shù)時(shí)，硫氧還蛋白特異性還原了幾種麥谷蛋白，條件和實(shí)施例10中用第一種凝膠的相同。在低分子量范圍(30-55kDa)內(nèi)觀察到了最廣泛的還原。在高分子量范圍內(nèi)觀察到的還原較不明顯，但在100kDa區(qū)域和以上仍然是明顯的。雖然未顯示，在130kDa范圍內(nèi)還可能存在還原。像麥膠蛋白一樣，某些麥谷蛋白也被谷胱甘肽和谷氧還蛋白相應(yīng)的還原。
然而在所有情況下，還原反應(yīng)用硫氧還蛋白較大，而且就某些情況而言，對(duì)硫氧還蛋白是特異性的(表IV、注意30-40和60-110kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì))。如用其它測(cè)試的小麥蛋白觀察到的那樣，天然h和大腸桿菌硫氧還蛋白都具有活性，而且能被NADPH和相應(yīng)的NTR或被DTT還原。因此如麥膠蛋白所發(fā)現(xiàn)的，某些麥谷蛋白可在體外被硫氧還蛋白特異性還原，而其它還可被谷胱甘肽和谷氧還蛋白還原，雖然效力較低。
表IV
麥谷蛋白的還原劑特異性如實(shí)施例1中的條件，研究了硫氧還蛋白h濃度對(duì)NADP-MDH被DSG-1或-2α-淀粉酶抑制蛋白激活作用的影響反應(yīng)劑麥谷蛋白％相對(duì)還原*60-110kDa 40-60kDa 30-40kDa無8 23 16谷胱甘肽 3151 29谷氧還蛋白5072 40硫氧還蛋白100 100 100*用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原后，三類分子量(從高到低)下的面積分別是1. 5、5.67和5.04吸光度單位乘以毫米。
實(shí)施例12體內(nèi)還原實(shí)驗(yàn)上述實(shí)施例證明了當(dāng)在體外測(cè)試時(shí)，硫氧還蛋白特異性還原了小麥麥膠蛋白和麥谷蛋白組分的成分。然而結(jié)果并未表明發(fā)芽時(shí)這些蛋白在體內(nèi)是否被還原—這是我們的知識(shí)中以前尚未提出的一個(gè)問題(Shutov，A.D.等(1987)Phytochem.261557-1566)。
為了回答這個(gè)問題，應(yīng)用mBBr.SDS-PAGE技術(shù)監(jiān)測(cè)發(fā)芽種子中的蛋白質(zhì)還原狀態(tài)、我們觀察到Osborne組分中成分的還原隨時(shí)間進(jìn)行性增加，并在2-3日發(fā)芽后達(dá)到峰值。觀察到的還原增加麥膠蛋白是2倍，清蛋白/球蛋白是3倍和麥谷蛋白是5倍。結(jié)果提示雖然在發(fā)芽過程中主要小麥蛋白質(zhì)組的代表被還原，對(duì)于麥谷蛋白凈氧化還原變化最大。
雖然提供了新證據(jù)，證明種子儲(chǔ)藏蛋白在發(fā)芽過程中經(jīng)歷了還原，結(jié)果并未標(biāo)明還原是如何完成的，即由谷氧還蛋白或硫氧還蛋白完成。為了獲得該點(diǎn)的信息，將原來硫氧還蛋白相關(guān)的麥膠蛋白(30-50kDa)和麥谷蛋白(30-40、40-60kDa)的體內(nèi)還原水平與體外量度(比較表IV)測(cè)定的還原相比較。為此，計(jì)算了發(fā)芽過程中體內(nèi)和體外用合適的酶還原系統(tǒng)觀察到的的熒光與考馬斯染色蛋白的比率。結(jié)果(主要的與硫氧還蛋白相關(guān)的麥膠蛋白分子量范圍在25-45kDa之間，麥谷蛋白分子量范圍在30-60kDa之間)提示，雖然谷胱甘肽可能占麥膠蛋白組分體內(nèi)還原的主要部分(達(dá)90％)，但這和麥谷蛋白不同，麥谷蛋白的還原似乎需要硫氧還蛋白?？赡軞w因于谷胱甘肽(或谷氧還蛋白)的還原水平不足以說明發(fā)芽種子中測(cè)得的還原的麥谷蛋白水平。
實(shí)施例13酶測(cè)量還調(diào)查了與NTR相關(guān)的硫氧還蛋白h還原所需的NADPH來源。分析了粗面粉的酶，這些酶在其它系統(tǒng)(注意氧化性磷酸途徑的脫氫酶)的NADPH中產(chǎn)生中起作用。表V總結(jié)的結(jié)果證實(shí)了較早的證據(jù)，即胚乳抽提物含有從葡萄糖通過該途徑產(chǎn)生NADPH所需的酶己糖激酶、葡萄糖6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸鹽脫氫酶(Tatham，A.S.等(1990)Adv.Cer.Sci.Tech.101-78)。值得注意的是在表V中所見的葡萄糖6-磷酸脫氫酶活性對(duì)于還原的硫氧還蛋白不敏感(數(shù)據(jù)未顯示)。在這方面，胚乳酶與其胞質(zhì)形式相似，而不是與葉子的葉綠體對(duì)應(yīng)部分相似(Fickenscher，K.等(1986)Arch.Biochem.Biophys.247393-402；Buchanan，B.B.(1991)Arch.Biochem.Biophys.2881-9；Scheibe，R.等(1990)Arch.Biochem.Biophys.274290-297)。
如用面粉的早期研究所預(yù)測(cè)的那樣(Johnson，T.C.等(1987)Planta 171321-331；Suske，G.等(1979)Z.Naturforsch.C 34214-221)，粗面粉還含有硫氧還蛋白h和NTR(表V)。令人感興趣的是，基于活性測(cè)量，NTR看來是所檢測(cè)的農(nóng)作物制品中的限速組分。
表V影響粗面粉中硫氧還蛋白h還原的酶的活性(葡萄糖→Glu-6-P→6-P-葡萄糖酸→NADP→硫氧還蛋白h)蛋白質(zhì)活性(nkat/mg蛋白)己糖激酶 0.28葡萄糖-6-P脫氫酶 0.456-P-葡萄糖酸脫氫酶0.39NTR 0.06硫氧還蛋白h 0.35
本結(jié)果提示硫氧還蛋白h的功能是一種增強(qiáng)與小麥種子發(fā)芽有關(guān)的代謝過程的信號(hào)。在其被NTR和NADPH(通過氧化性戊糖磷酸途徑產(chǎn)生)還原后，硫氧還蛋白h看來不僅激活酶，而且還在儲(chǔ)藏蛋白遷移中起作用。
實(shí)施例14生面團(tuán)質(zhì)量的改善通過用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原面粉蛋白質(zhì)，改善了生面團(tuán)質(zhì)量。還原的硫氧還蛋白特異性的打斷硫-硫鍵，硫-硫鍵將蛋白質(zhì)的不同部分交聯(lián)起來，并穩(wěn)定其折疊構(gòu)象。當(dāng)這些交聯(lián)被切斷時(shí)，蛋白質(zhì)可展開并與面包中的其它蛋白質(zhì)連接，產(chǎn)生聯(lián)鎖網(wǎng)格，形成生面團(tuán)的彈性網(wǎng)絡(luò)。由于在發(fā)酵過程中網(wǎng)絡(luò)捕獲酵母產(chǎn)生的二氧化碳，生面團(tuán)膨脹。提出還原的硫氧還蛋白激活了面粉中的麥膠蛋白和麥谷蛋白，使它們以強(qiáng)化生面團(tuán)的方式重組。還原的硫氧還蛋白強(qiáng)化了發(fā)面過程中形成的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于這些測(cè)試(用10克從Montpellier，F(xiàn)rance的當(dāng)?shù)啬シ猾@得的中等質(zhì)量的小麥面粉，或從Montpellier，F(xiàn)rance的當(dāng)?shù)啬シ猾@得的低質(zhì)量小麥，該低質(zhì)量小麥主要是Apollo作物)，加入0.2微克大腸桿菌硫氧還蛋白、0.1微克大腸桿菌NADP-硫氧還蛋白還原酶和500納摩爾NADPH，以及1M Tris-HCl，pH7.9緩沖液，得到5.25毫升，30mM Tris-HCl酶系統(tǒng)混合物。通過在微量淀粉測(cè)定記錄儀中，30℃下將該酶系統(tǒng)混合物與10克面粉混合，進(jìn)行反應(yīng)。得到的淀粉測(cè)定值顯示加入NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)增強(qiáng)了生面團(tuán)。用低質(zhì)量面粉，在該還原系統(tǒng)存在下形成生面團(tuán)后，淀粉記錄讀數(shù)至少穩(wěn)定了4分鐘，而在未加入這些物質(zhì)的對(duì)照中，生面團(tuán)形成后讀數(shù)立即下降。該改進(jìn)效果是持久的，而且在整個(gè)運(yùn)行過程中保持。換言之，低質(zhì)量小麥對(duì)照(未加入酶系統(tǒng))在面團(tuán)形成7分鐘后的微量淀粉記錄讀數(shù)是375布拉班德爾面團(tuán)稠度單位，相對(duì)而言用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NADPH、硫氧還蛋白和NADP-硫氧還蛋白還原酶)的組分處理過的同樣低質(zhì)量小麥?zhǔn)?50布拉班德爾面團(tuán)稠度單位。
如上用10克Apollo面粉進(jìn)行了另一淀粉記錄研究，僅用500微摩爾NADPH濃度代替納摩爾。淀粉記錄儀的測(cè)量值顯示該量的NADPH也使得生面團(tuán)的質(zhì)量顯著改善。
生面團(tuán)更高的淀粉記錄儀測(cè)量值對(duì)應(yīng)于改善的生面團(tuán)強(qiáng)度和改善的烘烤品特征，如更好的面包屑質(zhì)量、改善的質(zhì)地和更大的面包體積。另外，根據(jù)分離的蛋白質(zhì)的體內(nèi)分析，天然小麥種子NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)在強(qiáng)化生面團(tuán)中也是有效的。
為了本發(fā)明的烘烤和其它方面，在每10克面粉中加入0.1-3.0微克硫氧還蛋白(優(yōu)選大腸桿菌或硫氧還蛋白h)和0.1-2.0微克還原酶和約30-500納摩爾NADPH。硫氧還蛋白和還原酶的最佳水平視面粉質(zhì)量而定。一般說，面粉質(zhì)量越高，所需的硫氧還蛋白水平和還原酶水平越高。還可用硫辛酸代替NADPH/NADP-硫氧還蛋白還原酶還原系統(tǒng)來還原硫氧還蛋白。然后加入其它生面團(tuán)成分，如牛奶或水。然而，可首先在NTR/硫氧還蛋白系統(tǒng)中加入液體，然后加到面粉中。
優(yōu)選在還原的硫氧還蛋白有機(jī)會(huì)還原儲(chǔ)藏蛋白后加入用于發(fā)酵的酵母。然后將生面團(tuán)作為常規(guī)生面團(tuán)發(fā)酵、成型等，并烘烤。
可在該實(shí)施例和下面的實(shí)施例中用NADPH產(chǎn)生系統(tǒng)(如由酵母等來源的100μM葡萄糖6-磷酸、100μM NADP和0.05單位(0.2微克)葡萄糖6-磷酸脫氫酶組成的)代替NADPH。在生面團(tuán)制備過程的一開始加入NADPH產(chǎn)生系統(tǒng)和硫氧還蛋白及NADP-硫氧還蛋白還原酶。
當(dāng)10克Apollo作物(CV)小麥與包含在4.25毫升水和0.90毫升Tris-HCl(30mM，pH7.9)中的20微升NADP(25mM)、20微升G6P(25mM)、0.25微克G6PDase、0.1微克NTR和0.2微克硫氧還蛋白h反應(yīng)時(shí)獲得了較高的淀粉記錄儀測(cè)量值。當(dāng)10克Apollo小麥與相同的反應(yīng)混合物反應(yīng)，但沒有任何NTR或硫氧還蛋白時(shí)，獲得了更高的淀粉記錄儀測(cè)量值。
實(shí)施例15小麥面包烘烤研究用計(jì)算機(jī)監(jiān)控的松下烘烤機(jī)進(jìn)行了該烘烤試驗(yàn)。
面包組分對(duì)照 面粉* 200克(干)水 70％水合鹽(NaCl) 5.3克酵母4.8克(釀酒酵母SafInstant)(干酵母粉)*從具有對(duì)比烘烤質(zhì)量的純面包小麥作物中獲得面粉樣品(包括動(dòng)物飼料級(jí)別和其它級(jí)別，具有低到高烘烤質(zhì)量)。
試驗(yàn)該試驗(yàn)的生面團(tuán)含有全部對(duì)照組分，加上示出的不同量的NADP硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)和/或NADP產(chǎn)生系統(tǒng)。
實(shí)驗(yàn)條件--稱量和混合面粉與鹽--將達(dá)到水合70％所需體積的水放在烤盤中。
--將面粉和鹽的混合物加到水中，起動(dòng)計(jì)算機(jī)監(jiān)控的烘烤程序。程序完成需要3小時(shí)9分鐘7秒。
--就該試驗(yàn)而言，將酶系統(tǒng)組分在加入面粉-鹽混合物之前先加到水中。
--在混合20分3秒后自動(dòng)加入酵母。
監(jiān)控松下設(shè)備的程序是混合區(qū)段持續(xù)時(shí)間條件 加熱混合000003 T1 關(guān)混合000500 T2 關(guān)混合000500 T1 關(guān)休息001000 T0 關(guān)混合001700 T2 關(guān)混合000700 T1 關(guān)休息003000 T0 達(dá)到32℃混合000004 T1 32℃休息011500 T0 32℃烘烤001400 T0 達(dá)到180℃烘烤002600 T0 180℃混合條件T0＝無混合(馬達(dá)停止)T1＝正?；旌蟃2＝3秒鐘混合，3秒鐘休息交替在烘烤結(jié)束后，當(dāng)面包條達(dá)到室溫時(shí)測(cè)定面包體積。
作物THESEE試驗(yàn)法國(guó)小麥作物THESEE被分類為具有良好面包制備質(zhì)量。下文表IV列出了該試驗(yàn)的結(jié)果。
表VI面包體積NADPH NTR Th 相對(duì)單位(微摩爾) (微克)(微克) (cm3)對(duì)照 0 0 0 1690100樣品 6.0 3060 18101076.0 300 17251026.0 0 60 17201026.0 0 0 1550920 3060 1800107*NADPH 3060 162096產(chǎn)生系統(tǒng)*NADPH 3060 163096產(chǎn)生系統(tǒng)加ATP、葡萄糖NTR和Th 6.0 9.4 20 1750104來自酵母*NADPH產(chǎn)生系統(tǒng)、ATP和葡萄糖的組合物。
加入體積NADP，25mM 700微升(17.5微摩爾)葡萄糖-6-磷酸，25mM700微升(17.5微摩爾)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(50微克/毫升) 175微升(8.75微克)ATP，25mM 700微升(17.5微摩爾)葡萄糖，25mM 700微升(17.5微摩爾)如表VI所示，當(dāng)用濃度為6.0微摩爾NADPH、30微克NTR和60微克Th的完整NTS以本實(shí)施例所述的量和條件烘烤200克Thesee面粉的面包時(shí)，獲得了增大的面包體積。除非另外說明，NTR和硫氧還蛋白(th)來自大腸桿菌。當(dāng)用該產(chǎn)生系統(tǒng)或當(dāng)省略NTR或Th時(shí)，未發(fā)生類似的增大。當(dāng)該系統(tǒng)中各組分量是上述量的一半或更少時(shí)，對(duì)面包體積也無顯著影響。
作物Apollo試驗(yàn)該法國(guó)小麥作物被分類為具有不良的面包制備質(zhì)量。該試驗(yàn)中使用的NTR和硫氧還蛋白來自大腸桿菌。下文表VII列出了該試驗(yàn)用200克Apollo面粉的結(jié)果。除非另外說明，量和條件和本實(shí)施例開始時(shí)所述相同。
表VII面包體積NADPH NTR Th(cm3) 相對(duì)單位(微摩爾) (微克)(微克)對(duì)照 0 0 0 1400 100樣品 6.0 30601475 105*NADPH 30601530 109產(chǎn)生系統(tǒng)加ATP、葡萄糖*NADPH 0 0 1430 102產(chǎn)生系統(tǒng)加ATP、葡萄糖*NADPH 6 0 1430 102產(chǎn)生系統(tǒng)*NADPH 6 7 1440 103產(chǎn)生系統(tǒng)*產(chǎn)生系統(tǒng)、ATP和葡萄糖的組成如表VI。
作物ARBON試驗(yàn)法國(guó)小麥作物ARBON用于飼料并被分類成不適合制造面包。下文的表VIII和IX顯示了用NTS或NADPH和NTR，以及實(shí)施例開始描述的生面團(tuán)組分和條件?？蓮腁rbon獲得改善的面包體積。在表VIII和IX中列出了該試驗(yàn)中所用的NTR、硫氧還蛋白、NADPH和NADPH產(chǎn)生系統(tǒng)成分的量。當(dāng)和對(duì)照比較時(shí)，可清楚的看到用如表IX中列出的用完整NTS對(duì)Arbon面包質(zhì)量的改進(jìn)。
表VIII面包體積NADPH NTRTh(微摩爾) (微克) 微克 (cm3)對(duì)照 0 0 0 1350樣品 0.1-0.63-43-4 比對(duì)照高達(dá)20％＞2.0 ＞20 ＞20 比對(duì)照低表IX面包體積(cm3) 相對(duì)單位處理完整NTS 1650 122減去硫氧還蛋白 1690 125減去NTR 1520 113減去硫氧還蛋白、NTR 1540 114減去NADPH 1440 107減去NADPH，加上*NADPH 1560 116產(chǎn)生系統(tǒng)減去NTS(對(duì)照) 1350 100NADPH，0.6微摩爾硫氧還蛋白，3.5微克NTR，3微克*產(chǎn)生系統(tǒng)3.5微摩爾NADP3.5微摩爾葡萄糖-6-磷酸1.75微克葡萄糖-6-磷酸脫氫酶實(shí)施例16
黑小麥面包烘烤研究黑小麥?zhǔn)且环N小麥/黑麥雜交品種，通常用于雞飼料。它比小麥更營(yíng)養(yǎng)，但通常認(rèn)為不適合用于制作面包，尤其在許多發(fā)達(dá)國(guó)家中。因此研究了NTS系統(tǒng)及其變化對(duì)用黑小麥面粉烘烤的面包的作用。除非另外說明，烘烤條件和生面團(tuán)成分如實(shí)施例15中小麥面粉所述。如表X所示，當(dāng)黑小麥生面團(tuán)含有該表所列量的硫氧還蛋白、NTR和NADPH產(chǎn)生系統(tǒng)時(shí)，面包體積有改善。然而，當(dāng)使用NTS(即硫氧還蛋白、NTR和NADPH)時(shí)，未觀察到相應(yīng)的改善。當(dāng)使用表X所列出的NTR、Th和NADPH產(chǎn)生系統(tǒng)時(shí)，面包質(zhì)地得到改善，使其更具粘合性和穩(wěn)定。
表XNADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)對(duì)用黑小麥面粉(cv.Juan)烘烤的面包的影響面包體積(cm3) 相對(duì)單位處理完整NTS1230 94減去NTS(對(duì)照) 1310 100減去NADPH，加上*NADPH 1390 106NADPH，0.6微摩爾硫氧還蛋白，3.5微克NTR，3.0微克產(chǎn)生系統(tǒng)4.5微摩爾NADP4.5微摩爾葡萄糖-6-磷酸4.5微克葡萄糖-6-磷酸脫氫酶實(shí)施例17還測(cè)定了NADPH/硫氧還蛋白系統(tǒng)對(duì)高粱、玉米和稻的面粉的作用。烘烤條件如實(shí)施例15中對(duì)小麥面粉所述。該試驗(yàn)中使用的NTS組分的量如下8微摩爾NADPH、40.5微克NTR和54微克硫氧還蛋白。硫氧還蛋白和NTR都來自大腸桿菌。該試驗(yàn)中含有NTS，特別是玉米和高粱的面包顯示改善的質(zhì)地和穩(wěn)定性。
實(shí)施例18黑小麥、黑麥、大麥、燕麥、稻、高粱、玉米和埃塞俄比亞畫眉草的乙醇可溶性和肉豆蔻鹽可溶性儲(chǔ)藏蛋白的還原除非另外說明，本實(shí)施例中使用的材料和方法按照上文標(biāo)題為“谷物蛋白質(zhì)的還原，材料和方法”部分中列出的那些。
黑小麥、黑麥、大麥、燕麥和埃塞俄比亞畫眉草反應(yīng)在30mM Tris-HCl緩沖液，pH7.9中進(jìn)行。如所示的，在70微升含有1mMNADPH和25-30微克抽提的儲(chǔ)藏蛋白的緩沖液中加入0.7微克NTR、1微克大腸桿菌硫氧還蛋白或2微克酵母硫氧還蛋白。對(duì)每10克面粉使用50毫升70％乙醇，并抽提2小時(shí)，獲得乙醇抽提的儲(chǔ)藏蛋白。就埃塞俄比亞畫眉草而言，抽提了200毫克磨碎的種子。用8毫克肉豆蔻酸鈉溶于5毫升蒸餾水，抽提1克面粉2小時(shí)，獲得了肉豆蔻酸鹽抽提的蛋白。NADPH、NTR和硫氧還蛋白的組合稱為NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)。如指出的，在不存在(GSH)或存在1.5mM NADPH和1.4微克菠菜葉子谷胱甘肽還原酶(GR/GSH/NADPH)。在培養(yǎng)20分鐘后，加入100納摩爾mBBr，繼續(xù)反應(yīng)15分鐘。為了終止反應(yīng)并衍生過量的mBBr，加入10微升10％SDS和10微升100mM 2-巰基乙醇，然后將樣品加到凝膠上。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法如N.A.Crawford等(1989 Arch.Biochem.Biophys.271.223-239)。
稻、高粱和玉米反應(yīng)在30mM Tris-HCl緩沖液，pH7.9中進(jìn)行。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被硫氧還蛋白還原時(shí)，在70微升緩沖液中加入下列1.2mM NADPH、10-30微克終止蛋白組分、0.5微克大腸桿菌NTR和1微克大腸桿菌硫氧還蛋白。為了用谷胱甘肽還原，用2.5mM還原的谷胱甘肽和1微克谷胱甘肽還原酶(面包酵母，Sigma Chemical Co.)替換硫氧還蛋白和NTR。為了用二硫蘇糖醇還原，省去了NADPH、硫氧還蛋白和NTR，加入0.5mM二硫蘇糖醇。在所有情況下，培育時(shí)間是20分鐘。然后加入10微升10mM mBBr溶液，反應(yīng)繼續(xù)15分鐘。為了終止反應(yīng)并衍生過量的mBBr，加入10微升10％SDS和10微升100mM 2-巰基乙醇，然后將樣品加到凝膠上。在每種情況下，為了獲得抽提的蛋白，用8毫克肉豆蔻酸鈉的5毫升蒸餾水溶液抽提1克磨碎的種子。除了測(cè)定蛋白質(zhì)的起始氧化還原狀態(tài)外，22℃抽提樣品2小時(shí)，然后16,000rpm離心20分鐘，然后加入mBBr。一邊測(cè)定最初氧化還原狀態(tài)，一邊在氮?dú)庀录尤雖BBr和肉豆蔻酸鹽，然后抽提。
分別制備了燕麥、黑小麥、黑麥、大麥和埃塞俄比亞畫眉草面粉的肉豆蔻酸鹽抽提的蛋白質(zhì)還原研究的SDSS-聚丙烯酰胺電泳凝膠。還制備了一塊凝膠顯示埃塞俄比亞畫眉草硫氧還蛋白相關(guān)緩沖液和乙醇抽提的蛋白質(zhì)的含量。在所有燕麥、黑小麥、黑麥、大麥、埃塞俄比亞/肉豆蔻酸鹽抽提物研究中，首先用緩沖液50mMTris-HCl，pH7.5抽提面粉20分鐘，然后用70％乙醇抽提2小時(shí)。另外，制備了玉米、高粱和稻的肉豆蔻酸鹽抽提的蛋白質(zhì)凝膠。對(duì)于玉米、高粱和稻，僅用肉豆蔻酸鹽抽提磨碎的種子。因此，玉米、高粱和稻，肉豆蔻酸鹽抽提物代表了總蛋白質(zhì)，而燕麥、黑小麥、黑麥、大麥和埃塞俄比亞畫眉草，肉豆蔻酸鹽抽提物僅代表麥膠蛋白等價(jià)物組分，因?yàn)檫@些面粉先前已用緩沖液和乙醇抽提過。凝膠描述的結(jié)果顯示，燕麥、黑小麥、黑麥、大麥和埃塞俄比亞畫眉草肉豆蔻酸鹽抽提(麥膠蛋白-等價(jià))的蛋白與GSH或GSH/GR/NADPH相比較，NTS是最有效的。NTS對(duì)于稻的總蛋白質(zhì)也是最有效的。還原的谷胱甘肽對(duì)于玉米和高粱的總蛋白質(zhì)較有效。
玉米、高粱和稻的結(jié)論第一塊凝膠與NTS相對(duì)于谷胱甘肽還原酶對(duì)肉豆蔻酸鹽抽提的蛋白質(zhì)的還原狀態(tài)的影響有關(guān)，處理方法(1)中，在mBBr存在下，在氮?dú)庀掠萌舛罐⑺猁}進(jìn)行抽提；處理方法(2)中，在肉豆蔻酸鹽抽提的蛋白質(zhì)中加入mBBr，事先不還原蛋白質(zhì)；在處理方法(3)中，用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)還原肉豆蔻酸鹽抽提的蛋白質(zhì)；在處理方法(4)中，用NADPH、谷胱甘肽和谷胱甘肽還原酶還原肉豆蔻酸鹽抽提的蛋白質(zhì)。在第二塊與肉豆蔻酸鹽抽提的蛋白質(zhì)的體內(nèi)還原狀態(tài)和硫氧還蛋白相關(guān)的體外還原有關(guān)的凝膠中，處理方法(1)類似第一塊凝膠中的處理方法(2)；處理方法(2)中，在mBBr存在下在氮?dú)庀掠萌舛罐⑺猁}抽提種子；在處理方法(3)中，用肉豆蔻酸鹽抽提種子，并用NTS還原，然后加入mBBr在處理方法(4)中條件與(3)相同，除了用DTT還原蛋白質(zhì)。第一塊凝膠中的處理方法(1)和第二塊凝膠中的處理方法(2)顯示了谷物中蛋白質(zhì)的最初氧化還原狀態(tài)。對(duì)于所有三種谷物，種子中的蛋白質(zhì)被高度還原。如果在空氣中抽提，蛋白質(zhì)會(huì)被氧化，尤其是高粱和稻的蛋白。在所有情況下氧化的蛋白質(zhì)可用NTS最大程度的重新還原。對(duì)于稻，還原對(duì)硫氧還蛋白是相對(duì)特異性；對(duì)于玉米，谷胱甘肽與硫氧還蛋白一樣有效，對(duì)于高粱，谷胱甘肽比硫氧還蛋白稍有效一些。二硫蘇糖醇作為還原劑，顯示了不同的效力。這些實(shí)驗(yàn)證明這些谷物的儲(chǔ)藏蛋白比小麥的特異性小，并提示當(dāng)嘗試構(gòu)建生面團(tuán)網(wǎng)絡(luò)時(shí)，應(yīng)同時(shí)測(cè)試存在和不存在谷胱甘肽情況下的硫氧還蛋白。
還分別制備了酵母NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原小麥麥谷蛋白和麥膠蛋白的研究得到的凝膠。每10克面粉用50毫升0.1M乙酸，并抽提2小時(shí)獲得了麥谷蛋白。每10克面粉用50毫升70％的乙醇，并抽提2小時(shí)，獲得了麥膠蛋白。凝膠顯示酵母系統(tǒng)在還原這兩種主要的小麥儲(chǔ)藏蛋白中具有高度活性。
還分別制備了黑小麥、黑麥、燕麥和大麥面粉中還原乙醇抽提蛋白質(zhì)的凝膠。結(jié)果顯示NTS對(duì)于黑小麥、黑麥和燕麥的乙醇抽提蛋白質(zhì)最有效。在對(duì)照中還原了乙醇抽提的大麥蛋白質(zhì)，而硫氧還蛋白或谷胱甘肽幾乎沒有作用。
實(shí)施例19硫氧還蛋白相關(guān)的還原對(duì)Kunitz和Bowman-Birk大豆胰蛋白酶抑制蛋白的活性和穩(wěn)定性的影響材料和方法植物材料Dr.K.Kahn慷慨贈(zèng)與了硬粒小麥(Triticum durum，Desf.cv.Monroe)。從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)獲得了麥芽。
化學(xué)藥品和酶從Bio-Rad laboratories(Richmond，CA)獲得了十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的試劑，并從Boehringer MannheimBiochemicals(Indianapolis，IN)獲得了DTT。L-1-甲苯磺?；０被?2-苯基乙基氯甲基酮(TPCK)-處理的胰蛋白酶(XIII型，T8640)、枯草桿菌蛋白酶(VIII型細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶Carbsberg，P5380)、KTI(T9003)、BBTI(T9777)、偶氮酪蛋白和其它化學(xué)藥品購(gòu)自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。大腸桿菌硫氧還蛋白和NTR分離自轉(zhuǎn)化成過度表達(dá)各種蛋白質(zhì)的細(xì)胞。含有重組質(zhì)粒pFPI的硫氧還蛋白菌株是由Dr.J.-P.Jacquot(de La Motte-Guery等，1991)慷慨提供的。含有重組質(zhì)粒pPMR21的NTR菌株是由Dr.Marjorie Russel和Peter Model(Russel和Model，1988)慷慨提供的。這些蛋白質(zhì)所用的分離方法如研究中所述，作了以下變化在Ribi細(xì)胞分級(jí)器中以25,000psi破碎細(xì)胞，如Florencio等(1988)描述的方法純化，但不經(jīng)紅色瓊脂糖步驟。大腸桿菌硫氧還蛋白和NTR用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定分別是100％和90％純。如前所述(Johnson等，1987)純化小麥硫氧還蛋白h。
小麥種子的發(fā)芽將小麥種子浸泡在50％(v/v)的Generic Bleach中室溫滅菌1小時(shí)，然后用蒸餾水充分洗滌。將無菌種子置于塑料培養(yǎng)皿中的兩層用含100微克/毫升氯霉素的蒸餾水潤(rùn)濕的Whatman濾紙上。繼續(xù)在室溫暗室中發(fā)芽達(dá)5日。
小麥蛋白酶的制備切下根和芽，從發(fā)芽5日的小麥種子上分離胚乳(10-15克鮮重)，并在4℃用5體積含有10mMβ-巰基乙醇的200mM乙酸鈉，pH4.6抽提30分鐘。4℃48,000g離心勻漿20分鐘。丟棄沉淀，用30-70％硫酸銨組分上清液。將代表蛋白酶制備物的該組分重新懸浮在最小體積的含10mM β-巰基乙醇的20mM乙酸鈉，pH4.6中，并以該緩沖液4℃透析過夜。當(dāng)用偶氮酪蛋白作為底物分析時(shí)，該蛋白酶制備物的最佳pH是約4.6，在4℃至少穩(wěn)定1星期。
胰蛋白酶抑制蛋白的還原和蛋白酶水解易感性除非指明，胰蛋白酶抑制蛋白(0.4mg/ml)的還原在含有10mM EDTA的0.1毫升20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.9中，30℃進(jìn)行2小時(shí)。硫氧還蛋白、NTR和NADPH的濃度分別是0.024mg/ml、0.02mg/ml和0.25mM。當(dāng)用DTT作為還原劑時(shí)，省去EDTA和NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)的組分。還原后，回收抑制劑混合物的等份，用于測(cè)定胰蛋白酶抑制蛋白活性或蛋白酶水解易感性。在枯草桿菌蛋白酶測(cè)試中，直接將抑制蛋白混合物(50微升)與枯草桿菌蛋白酶混合，并在室溫下培育1小時(shí)。對(duì)于小麥蛋白酶制備，首先通過混合35微升200mM的乙酸鈉，pH4.6，將抑制蛋白混合物(50微升)的pH調(diào)節(jié)到4.7；然后加入10微升小麥蛋白酶制備物，并在37℃繼續(xù)培育2小時(shí)。為了停止枯草桿菌蛋白酶的消化，在該消化混合物中加入2微升100mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)和10微升10％SDS。對(duì)于植物蛋白酶制備物，加入等體積的SDS樣品緩沖液
停止消化。用12％或16％SDS聚丙烯酰胺平板凝膠(Laemmli，1970)電泳分析蛋白酶水解產(chǎn)物。用激光密度計(jì)(Pharmacia-LKB Ultrascan XL)掃描干燥的平板膠，并通過用Pharmacia GelScanXL軟件程序擬合，計(jì)算獲得KTI或BBTI蛋白條帶的峰面積。
試驗(yàn)如前所述，用Florencio等(1988)描述的方法分析了硫氧還蛋白和NTR。在50mM Tris-HCl，pH7.9中，通過用N-苯甲?；?L-精氨酸乙酯作為底物跟蹤253nm處吸光度的增加(Mundy等，1984)，或偶氮染料從偶氮酪蛋白底物釋放入三氯乙酸(TCA)可溶性組分(見下文)，測(cè)量了胰蛋白酶的活性。對(duì)于胰蛋白酶抑制試驗(yàn)，在室溫下，在50mM Tris-HCl，pH7.9中用合適量的KTI或BBTI預(yù)先培育胰蛋白酶(5-10微克)5分鐘，然后測(cè)定蛋白酶水解活性。雖然這兩種底物得到相似的數(shù)據(jù)，結(jié)果僅用一種底物表示。
在pH4.7時(shí)跟蹤偶氮染料從偶氮酪蛋白底物釋放入TCA溶液測(cè)量了小麥蛋白酶活性。在50微升20mM乙酸鈉，pH4.6和100微升2％偶氮酪蛋白(于20mM磷酸鈉，pH7.0的溶液中)中加入50微升小麥蛋白酶的20mM乙酸鈉，pH4.6的溶液。37℃培育1小時(shí)后，加入1毫升10％TCA并使混合物在室溫下放置10分鐘。在微量離心機(jī)(8000g)中離心5分鐘后，抽吸1毫升上清液溶液，與1毫升1N NaOH混合。閱讀440納米處的吸光度。用Bio-Rad試劑測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，用牛血清清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)(Bradford，1976)。
結(jié)果胰蛋白酶抑制蛋白活性大豆的20kDaKunitz和8kD Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白分別含有2和7個(gè)二硫鍵(Birk，1976；Wilson，1988)。雖然它們的生理學(xué)功能尚未確定，由于這兩類抑制蛋白在莢果種子中的廣泛研究，及其導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)紊亂(如肥大和胰臟相關(guān)的機(jī)能紊亂)的性質(zhì)，受到了廣泛的研究。如表I和II所示，和前面實(shí)施例中所述，KTI和BBTI特異性的被大腸桿菌或植物的NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)所還原。谷胱甘肽和谷氧還蛋白(一種硫醇蛋白，能在某些動(dòng)物和細(xì)菌系統(tǒng)中代替硫氧還蛋白，但不知道是否存在于植物中(Holmgren，1985))的還原形式?jīng)]有作用。
為了確定硫氧還蛋白還原的后果，比較了KTI和BBTI的氧化和還原形式的胰蛋白酶抑制蛋白活性。如表XI所示，NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)在30℃預(yù)培育2小時(shí)導(dǎo)致胰蛋白酶抑制蛋白活性基本喪失(即相對(duì)于未受抑制的對(duì)照胰蛋白酶活性增加)。更具體的說，NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)使得KTI和BBTI的胰蛋白酶活性分別增加了3-和6-倍。用DTT(一種硫氧還蛋白的非生理性代替品)和用硫辛酸(一種天然存在的二硫醇)還原的硫氧還蛋白也獲得類似的結(jié)果。繼續(xù)單獨(dú)與DTT培育(室溫過夜)導(dǎo)致兩種抑制蛋白完全或幾乎完全被滅活(數(shù)據(jù)未顯示)。不像DTT，硫辛酸在不存在硫氧還蛋白的條件下不顯著還原(滅活)KTI和BBTI。
表XI用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)、DTT或還原的硫辛酸改變大豆胰蛋白酶抑制蛋白抑制胰蛋白酶的能力
*未受抑制的對(duì)照胰蛋白酶的比活性是0.018ΔA253nm/微克/分鐘，用N-苯甲?；?L-精氨酸乙酯作為底物。
1大腸桿菌NTS(NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng))的還原在30℃進(jìn)行2小時(shí)。
2DTT(1mM)的還原在30℃進(jìn)行1小時(shí)。
3硫辛酸(LA，0.4mM)和小麥硫氧還蛋白h(Trxh)的還原在30℃進(jìn)行1小時(shí)。在硫辛酸單獨(dú)(0.4mM)存在下，胰蛋白酶活性對(duì)于KTI是20.0％，對(duì)于BBTI是12.5％。
Friedman和同事觀察到，在硫還原劑(硫化鈉、N-乙酰基-L-半胱氨酸、還原的谷胱甘肽或L-半胱氨酸)存在下加熱大豆面粉，滅活胰蛋白酶抑制蛋白，可能是還原二硫鍵或與大豆面粉中的其它蛋白質(zhì)交換二硫鍵的結(jié)果(Friedman和Gumbmann，1986；Friedman等，1982，1984)。這些還原劑滅活胰蛋白酶抑制蛋白改善了面粉在測(cè)試大鼠中的可消化性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(Friedman和Gumbman，1986)。與這些早期觀察合起來，目前的發(fā)現(xiàn)證明作為硫氧還蛋白目標(biāo)的KTI和BBTI的二硫鍵對(duì)于維持胰蛋白酶抑制蛋白活性都是重要的。
熱穩(wěn)定性蛋白酶抑制蛋白通常對(duì)于滅活處理，如加熱，是穩(wěn)定的。該穩(wěn)定性至少一部分歸因于二硫鍵的交聯(lián)(Birk，1976；Ryan，1981)。已知還原打斷二硫鍵可降低熱穩(wěn)定性(Friedman等，1982)。從而產(chǎn)生了問題，例如硫氧還蛋白還原是否能產(chǎn)生相似的結(jié)果。
表XII顯示的結(jié)果提供了對(duì)該問題的一個(gè)肯定的答案。當(dāng)80℃加熱15分鐘時(shí)，KTI硫氧還蛋白還原的形式完全喪失其抑制胰蛋白酶的活性，而其對(duì)應(yīng)的氧化形式仍保留原活性的一半(表XII)。氧化的BBTI甚至更穩(wěn)定，100℃加熱25分鐘后仍保留其全部的胰蛋白酶抑制活性。更有甚者，和KTI相似，BBTI的還原形式完全被熱滅活(表XII)。這些結(jié)果與之前的觀察一致(i)KTI和BBTI在還原后顯示對(duì)熱的敏感度提高；和(ii)溶液中純的BBTI比溶液中純的KTI更加熱穩(wěn)定。對(duì)于面粉，反過來是這樣(即KTI比BBTI更加熱穩(wěn)定(Friedman等，1982和1991；和DiPietro和Liener，1989))。
表XIIKunitz和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白的熱穩(wěn)定性氧化的和用大腸桿菌NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原后
*胰蛋白酶的比活性是0.319ΔA440nm/毫克/分鐘，用偶氮酪蛋白作為底物。在我們的條件下用來顯示胰蛋白酶抑制蛋白的熱穩(wěn)定性的初始實(shí)驗(yàn)中測(cè)定滅活所用的溫度。
1nd未測(cè)定。
蛋白酶易感性為了測(cè)試KTI和BBTI的還原形式是否顯示對(duì)于除了胰蛋白酶以外的蛋白酶的穩(wěn)定性降低，將KTI和BBTI的還原和氧化形式同時(shí)與小麥蛋白酶制備物或枯草桿菌蛋白酶一起培育，并用SDS-PAGE分析蛋白酶水解產(chǎn)物。通過在SDS凝膠上用激光密度計(jì)測(cè)量完整蛋白質(zhì)的豐度，測(cè)定了蛋白酶水解的程度。當(dāng)測(cè)試發(fā)芽5日的小麥種子的蛋白酶制備物時(shí)，Kunitz抑制蛋白的氧化形式對(duì)消化幾乎有完全的抗性，而硫氧還蛋白還原的形式對(duì)蛋白酶是敏感的。如表XIII中所示，約80％KTI在依賴于NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)所有組分的反應(yīng)中被降解。BBTI顯示同樣的模式，除了氧化的蛋白質(zhì)顯示相對(duì)于KTI更大的蛋白酶水解易感性。當(dāng)以枯草桿菌蛋白酶代替植物蛋白酶制備物時(shí)，觀察到類似作用(數(shù)據(jù)未顯示)。未研究蛋白酶水解反應(yīng)的性質(zhì)，但注意到在SDS凝膠上檢測(cè)不到肽產(chǎn)物。
表XIII硫氧還蛋白相關(guān)的還原對(duì)Kunitz和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白對(duì)植物蛋白酶制備物的蛋白水解的易感性的影響1
1用大腸桿菌硫氧還蛋白系統(tǒng)在30℃還原2小時(shí)后，加入200mM乙酸鈉，pH4.6，將pH調(diào)節(jié)到4.7。然后加入小麥蛋白酶制備物，并在37℃培育2小時(shí)。然后用SDS-PAGE分析。
2激光密度計(jì)的測(cè)定3NTSNADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)4nd未測(cè)定。
本實(shí)施例顯示硫氧還蛋白或二硫蘇糖醇(DTT)的還原導(dǎo)致兩種蛋白質(zhì)都滅活，并提高其熱和蛋白酶易感性。該結(jié)果表明抑制蛋白的硫氧還蛋白相關(guān)還原與其工業(yè)加工和種子發(fā)芽都有關(guān)。
這些結(jié)果證實(shí)了二硫鍵對(duì)于KTI和BBTI的胰蛋白酶抑制蛋白活性是必須的(Birk，1985；Friedman和Gumbmann，1986；Friedman等，1982，1984)。這些研究還顯示還原(滅活)可在生理?xiàng)l件(即低溫，用NADPH還原的硫氧還蛋白)下發(fā)生。在較低溫度滅活胰蛋白酶抑制蛋白的能力提供了一種可能的方法，來完全滅活兩種胰蛋白酶抑制蛋白，從而改善大豆產(chǎn)品的質(zhì)量并節(jié)約能量。需要一種完全滅活KTI的方法，這是非常明顯的，因?yàn)樵贐BTI被完全滅活的條件下，其活性的20％仍穩(wěn)定的保留在大豆粉中(Friedman等，1991)。
該結(jié)果還對(duì)KTI和BBTI的蛋白酶敏感性增加了新的信息。它們?cè)谶€原后蛋白酶易感性的增加提示，如果在種子發(fā)芽時(shí)與蛋白酶抑制蛋白接觸，NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)可起作用，機(jī)制是通過改變(滅活)、并最終降解這些抑制蛋白(Baumgartner和Chrispeels，1976；Chrispeels和Baumagartner，1978；Orf等，1977；Wilson，1988；Yoshikawa等，1979)。如前所述，有證據(jù)證明NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)在小麥種子的發(fā)芽過程中的蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)中起到了相似的作用。
實(shí)施例20硫氧還蛋白對(duì)蓖麻子2S清蛋白的還原下列對(duì)于巰基試劑還原蓖麻子2S清蛋白的研究結(jié)果(Sharief和Li，1982；Youle和Huang，1978)顯示，硫氧還蛋白活躍的還原2S大亞基的分子內(nèi)二硫鍵，但不還原連接兩個(gè)亞基的分子間二硫鍵。
材料和方法材料從Bothwell Enterprises，Plainview，TX獲得了蓖麻(Ricinus communis L.var Hale)種子。從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)獲得了生物化學(xué)藥品。從過度表達(dá)各種蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離得到了大腸桿菌硫氧還蛋白和NTR。含有重組質(zhì)粒pFPI的硫氧還蛋白菌株是由Dr.J.-P.Jacquot(de La Motte-Guery等，1991)慷慨提供的。含有重組質(zhì)粒pPMR21的NTR菌株是由Dr.Marjorie Russel和PeterModel(Russel和Model，1988)慷慨提供的。硫氧還蛋白和NTR分別是用de LaMott-Guery等(1991)和Florencio等(1988)的方法純化的。從Bio-Radlaboratories(Richmond，CA)購(gòu)得了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的試劑。從Calbiochem(San Diego，CA)購(gòu)得了一溴二滿(mBBr)或Thiolite。商品購(gòu)得其它化學(xué)藥品，并且是可得到的最高質(zhì)量。從玉米葉子(Jacquot等，1981)和菠菜葉子(Nishizawa等，1982)分別純化了NADP-蘋果酸脫氫酶和果糖-1，6-二磷酸酶。按照菠菜蛋白(Florencio等，1988)所設(shè)計(jì)的方法從小麥種子中分離得到硫氧還蛋白h。從菠菜葉子制備了谷胱甘肽還原酶(Florencio等，1988)。
蛋白質(zhì)體的分離用非水方法(Yatsu和Jacks，1968)分離了蛋白質(zhì)體。將去殼干蓖麻子15克與40毫升甘油在組織搗碎機(jī)中混合30秒?；旌衔餅V過4層尼龍布。在BeckmanJ2-21M離心機(jī)中用JS-20轉(zhuǎn)頭以272xg離心粗抽提物5分鐘。離心后，收集上清液組分，并以41,400xg離心20分鐘。將含有蛋白質(zhì)體的沉淀重新懸浮于10毫升甘油中，并如前離心(41,400xg20分鐘)，收集沉淀。重復(fù)該洗滌步驟2次。通過用3毫升100mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)抽提沉淀，獲得可溶性(“基質(zhì)”)組分。用3毫升含6M脲的100mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)抽提如前離心收集的剩余不溶性(“結(jié)晶狀”)組分。
2S蛋白質(zhì)純化法用Tully和Beevers(1976)的改良方法制備了2S蛋白。將該基質(zhì)蛋白組分加到DEAE-纖維素(DE-52)柱上，用5mM Tris-HCl緩沖液，pH8.5(緩沖液A)平衡，并用0-300mM NaCl梯度的緩沖液A洗脫。合并含有2S蛋白質(zhì)的組分，并凍干濃縮。將濃縮組分加到Pharmacia FPLC Superose-12(HR 10/30)柱上，用含有150mMNaCl的緩沖液A平衡。將Superose-12柱的含有2S蛋白的組分加到用緩沖液A平衡的FPLC Mono Q HR 5/5柱上。依次用3毫升緩沖液A，20毫升線性梯度的0-300mMNaCl的緩沖液A，最終用含1M NaCl的緩沖液A洗脫該柱。用該方法純化的2S蛋白在用考馬斯藍(lán)染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠中無污染物(Kobrehel等，1991)。
分析方法用Crawford等(1989)的一溴二滿(mBBr)/SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的還原。如前面在“谷物蛋白的還原，材料和方法”一節(jié)中所述，定量測(cè)定了標(biāo)記的蛋白。用Bradford(1976)的方法測(cè)定蛋白。
酶試驗(yàn)/還原實(shí)驗(yàn)用Wada等，1981的方法分析了硫氧還蛋白和2S蛋白存在下的NADP-蘋果酸脫氫酶和果糖1，6-二磷酸酶。進(jìn)行試驗(yàn)的條件是加入的硫氧還蛋白量足夠還原蓖麻2S蛋白，但不足以明顯激活靶酶。所有試驗(yàn)在25℃下進(jìn)行。除非另外說明，所用的硫氧還蛋白和NTR來自大腸桿菌。純化過程中在它被二硫蘇糖醇和大腸桿菌硫氧還蛋白還原后用mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳監(jiān)測(cè)2S蛋白(Crawford等，1989；Kobrehel等，1991)。
用mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定了蓖麻種子基質(zhì)和晶狀蛋白的還原。凝膠(未顯示)的泳道如下1和7，對(duì)照未添加；2和8，GSH/GR/NADPH還原的谷胱甘肽，菠菜葉谷胱甘肽還原酶和NADPH；3和9，NGSNADPH，還原的谷胱甘肽，谷胱甘肽還原酶(菠菜葉子)和大腸桿菌谷氧還蛋白；4和10，NTSNADPH，NTR和硫氧還蛋白(二蛋白都來自大腸桿菌)；5和11，NADPH；6和12，NADPH和大腸桿菌NTR。還原在100mM Tris-HCl緩沖液，pH7.8中進(jìn)行。如所表明的，0.7微克NTR和1微克硫氧還蛋白加到70微升含有1mM NADPH和靶蛋白的該緩沖液中對(duì)于處理方法1-6，為8微克基質(zhì)蛋白，對(duì)于處理方法7-12，為10微克晶狀蛋白。用谷胱甘肽類似進(jìn)行了試驗(yàn)，但最終濃度是2mM、1.4微克谷胱甘肽還原酶、1微克谷氧還蛋白、和1.5mMNADPH。反應(yīng)時(shí)間20分鐘。
還用mBBr/SDS-Page技術(shù)測(cè)定了硫氧還蛋白還原蓖麻子2S蛋白的二硫鍵的特異性。凝膠(未顯示)泳道如下(1)對(duì)照(未添加)；(2)對(duì)照+NTS(與基質(zhì)和晶狀蛋白相同條件)；(3)對(duì)照(100℃加熱3分鐘)；(4)對(duì)照+2mM DTT(100℃加熱3分鐘)。將含有5微克2S蛋白和指示出的添加劑的樣品在30mM Tris-HCl(pH7.8)中培育20分鐘，然后加入80納摩爾mBBr，繼續(xù)反應(yīng)15分鐘，然后用mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析。
結(jié)果可將蓖麻儲(chǔ)藏蛋白(在種子成熟時(shí)保持在蛋白質(zhì)體中)根據(jù)其溶解性分成兩種組分?？扇苄暂^高的蛋白質(zhì)儲(chǔ)藏在蛋白質(zhì)體的外部(“基質(zhì)”)，可溶性較差的儲(chǔ)藏在內(nèi)部(“晶狀”)。在本研究中，分離出基質(zhì)和晶狀組分以測(cè)定其經(jīng)受細(xì)胞硫醇，即谷胱甘肽、谷氧還蛋白和硫氧還蛋白的還原的能力。谷氧還蛋白，一種具有催化活性的硫醇基團(tuán)的12kDa蛋白質(zhì)可在細(xì)菌和動(dòng)物的某些酶反應(yīng)中代替硫氧還蛋白(Holmgren等，1985)，但不知道植物中是否存在。
結(jié)果顯示，雖然許多蓖麻子的儲(chǔ)藏蛋白被測(cè)試的硫醇還原，僅有一種對(duì)應(yīng)于基質(zhì)2S蛋白大亞基的低分子量蛋白顯示對(duì)硫氧還蛋白的嚴(yán)格特異性。某些晶狀組分的高分子量蛋白經(jīng)過了還原，但在這些情況下在谷氧還蛋白和硫氧還蛋白之間幾乎沒有差別。因此，蓖麻子2S大亞基看來與前面在經(jīng)歷硫氧還蛋白特異性還原中所討論的含半胱氨酸的蛋白相似。設(shè)計(jì)這些實(shí)驗(yàn)確證了該特異性并闡明了該還原蛋白質(zhì)的某些性質(zhì)。如預(yù)計(jì)的那樣，由于缺乏二硫鍵，用任何測(cè)試的還原劑2S小亞基顯示，不與mBBr反應(yīng)。
當(dāng)用激光密度計(jì)監(jiān)測(cè)到其熒光條帶時(shí)，發(fā)現(xiàn)蓖麻子2S大亞基的還原依賴于NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NADPH、NTR和硫氧還蛋白)的所有組分(表XIV)。如對(duì)于其它硫氧還蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)(包括葉綠體酶)那樣，在2S大亞基還原中活躍的硫氧還蛋白可用二硫蘇糖醇(DTT)化學(xué)還原，或用NADPH和NTR酶促還原。NADP硫氧還蛋白系統(tǒng)、DTT單獨(dú)、和DTT+硫氧還蛋白的還原程度在25℃20分鐘后分別是84％、67％和90％。類似的，雖然上文討論的二硫蛋白觀察到總的廣泛的還原(Johnson等，1987)。如同其它種子蛋白，可在2S蛋白的DTT還原中互換性使用天然小麥硫氧還蛋白h和大腸桿菌硫氧還蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。
表XIV不同巰基還原劑還原蓖麻子2S蛋白的程度。反應(yīng)條件與基質(zhì)和晶狀蛋白測(cè)定的相同。100％還原相應(yīng)于當(dāng)2S在2％SDS和2.5％β-巰基乙醇存在下加熱3分鐘得到的。NTSNADPH、NTR和硫氧還蛋白(來自大腸桿菌)；GSH/GR/NADPH還原的谷胱甘肽、谷氧還蛋白還原酶(來自菠菜葉子)和NADPH；NGSNADPH，還原的谷胱甘肽，谷胱甘肽還原酶(來自菠菜葉子)和谷氧還蛋白(來自大腸桿菌)。
在酶激活試驗(yàn)中硫氧還蛋白還原蓖麻子2S蛋白的能力也是明顯的。在此，用硫氧還蛋白靶向的蛋白(在此是2S)激活葉綠體的硫氧還蛋白相關(guān)的酶，NADP-蘋果酸脫氫酶或果糖1，6-二磷酸酶。如同迄今所測(cè)試的大部分蛋白，2S蛋白更有效的激活了NADP-蘋果酸脫氫酶，并顯示對(duì)果糖二磷酸酶幾乎無活性(2.6對(duì)0.0納摩爾/分鐘/毫克蛋白)。
蓖麻子2S蛋白含有分子間和分子內(nèi)二硫鍵。因此2S蛋白提供了測(cè)定硫氧還蛋白對(duì)這兩類鍵的特異性的機(jī)會(huì)。為此，用(i)NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)在室溫下酶促還原，和(ii)用DTT在100℃化學(xué)還原了蓖麻子2S蛋白。與mBBr反應(yīng)后，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析還原的蛋白質(zhì)，不加其它巰基試劑。結(jié)果表明雖然硫氧還蛋白活躍的還原分子內(nèi)二硫鍵，但它對(duì)分子間二硫鍵效果差得多。
本結(jié)果將硫氧還蛋白的作用延伸到還原蓖麻子(一種產(chǎn)油作物)的2S蛋白。硫氧還蛋白特異性的還原了2S蛋白大亞基的分子內(nèi)二硫鍵，并顯示對(duì)于連接大小亞基的分子間二硫鍵幾乎無活性。根據(jù)大豆胰蛋白酶抑制蛋白的結(jié)果，清楚的是硫氧還蛋白對(duì)分子內(nèi)二硫鍵的還原顯著增加了二硫蛋白對(duì)蛋白酶水解的敏感性(Jiao等，1992a)。然而尚待觀察2S蛋白的還原是否發(fā)生在其蛋白酶水解前(Youle和Huang，1978)，如小麥的主要儲(chǔ)藏蛋白的情況那樣。本工作提出了一個(gè)相關(guān)問題是蓖麻子的2S蛋白以及其它產(chǎn)油植物如巴西果(Altenbach等1987；Ampe等，1986)是否具有除了儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)之外的功能。
實(shí)施例21滅活特異性抑制蛋白對(duì)谷物支鏈淀粉酶的硫氧還蛋白依賴性去抑制支鏈淀粉酶試驗(yàn)1.麥芽三糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線在微量離心管中制備了一系列濃度麥芽三糖(0-2毫克)的0.1-0.2毫升水或緩沖液溶液。在其中加入0.2毫升二硝基水楊環(huán)酸(DA)試劑(將1克DA，30克酒石酸鉀鈉，和20毫升2N NaOH與水混合，最終體積為100毫升)。將試劑溶于溫水浴中。將混合物100℃加熱5分鐘，并在水浴中冷卻(室溫)。將各樣品轉(zhuǎn)移到含有2毫升水的玻璃試管中。讀取相對(duì)于水的A493。ΔA493[含有麥芽三糖的樣品A493是減去空白(無麥芽三糖)的A493]對(duì)麥芽三糖濃度作圖。
2.支鏈淀粉酶活性試驗(yàn)測(cè)量底物支鏈淀粉還原性糖的釋放作為支鏈淀粉酶活性。通常將10-100微升支鏈淀粉酶樣品(在20mM Tris-HCl，pH7.5或5-20乙酸-NA，pH4.6中)與25-100微升200mM乙酸-NA，pH5.5(該緩沖液使試驗(yàn)最終pH為5.5)和10-20微升2％(w/v)支鏈淀粉混合?；旌衔镌?7℃培育30-120分鐘，視支鏈淀粉酶活性而定。加入200微升DA試劑停止反應(yīng)。然后如上測(cè)定還原性糖。
注意1.透析從透析過的30-60％硫酸銨組分獲得的粗抽提物或支鏈淀粉酶，獲得了支鏈淀粉酶的粗抽提物，當(dāng)將其用作支鏈淀粉酶來源時(shí)，它必須在試驗(yàn)前徹底透析，因?yàn)樵诖殖樘嵛镏杏羞€原的糖。換言之來自透析的粗抽提物或透析的30-60％硫酸銨的粗支鏈淀粉酶樣品的背景很高。為此，如下制備了空白先加入200微升DA試劑，然后加入酶樣品、支鏈淀粉和緩沖液。
2.當(dāng)DTT(或β-巰基乙醇(MET)或GSH)的最終濃度在試驗(yàn)混合物中高于2mM時(shí)，OD493值比減去DTT(MET、GSH)的樣品高。應(yīng)在空白和在試驗(yàn)中沒有DTT的樣品中在反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入DTT(MET、GSH)。應(yīng)注意確保試驗(yàn)混合物中DTT的最終濃度低于2mM。
支鏈淀粉酶抑制蛋白抽提物的純化和硫酸銨組分的純化將200克大麥芽用電動(dòng)咖啡磨磨成細(xì)粉，并用600毫升5％(w/v)NaCl在30℃抽提3小時(shí)。30,000g，4℃離心25分鐘后，用固體硫酸銨沉淀組分上清液。將30％和60％飽和硫酸銨之間沉淀的蛋白溶于最小體積的20mM Tris HCl，pH7.5中，并以該緩沖液4℃透析過夜。
DE52層析離心透析的樣品，除去不溶性物質(zhì)，并將上清液用2N甲酸調(diào)節(jié)到pH4.6。沉淀酸變性的蛋白后，將上清液用NH4OH重新調(diào)節(jié)到pH7.5，并加到DE52柱(2.5×26cm)上(已用20毫升pH7.5的Tris-HCl平衡)上。用上述緩沖液80毫升洗滌后，用線性0-500mM Tris-HCl，pH7.5洗脫柱。收集6.7毫升的各組分。約325mM NaCl時(shí)洗脫出支鏈淀粉酶，在100mM NaCl時(shí)洗脫出其抑制蛋白。支鏈淀粉酶進(jìn)一步純化通過CM32(20mM乙酸鈉，pH4.6)和Sephacryl-200 HR(300mM Tris-HCl，pH7.5，含有200mM NaCl和1mM EDTA)層析。如下純化了支鏈淀粉酶抑制蛋白。
CM32層析將DE52步驟的支鏈淀粉酶抑制蛋白樣品(約90毫升)置于150毫升燒杯中，在70℃的溫水浴中溫育20分鐘。離心后，將澄清的樣品用2N甲酸調(diào)節(jié)到pH4.6，并以20mM乙酸鈉，pH4.6透析。通過離心除去透析過程中形成的沉淀，并在用20mM乙酸鈉，pH4.6平衡的CM32柱(2.5×6cm)上層析上清液。用線性0-0.4M NaCl的200毫升20mM乙酸鈉，pH4.6洗脫蛋白質(zhì)。合并含有支鏈淀粉酶抑制蛋白活性的組分(5.0毫升/組分)，透析并重新加在CM32柱(2.5×6cm)上，用200毫升20mM乙酸鈉，pH4.0配的線性0.2-1M NaCl梯度層析。
Sephadex G-75過濾將第二次CM32層析步驟的支鏈淀粉酶抑制蛋白組分裝在透析袋中以固體蔗糖濃縮，然后用Sephadex G-75柱(2.5×85cm)分離，該柱用含有200mM NaCl和1mMEDTA的30mM Tris-HCl，pH7.5平衡。合并顯示支鏈淀粉酶抑制蛋白活性的組分(3.6毫升/組分)，以固體蔗糖透析濃縮，然后以10mM Tris-HCl，pH7.5透析。
支鏈淀粉酶抑制蛋白的鑒定和純化在發(fā)芽中，淀粉被α-、β-淀粉酶和支鏈淀粉酶(也稱為去分支酶，R-酶)轉(zhuǎn)化成葡萄糖。雖然已對(duì)淀粉酶的調(diào)節(jié)進(jìn)行了廣泛的研究，但對(duì)于種子中支鏈淀粉酶的調(diào)節(jié)知之甚少。Yamada(Yamada，J.(1981)Carbohydrate Research 90153-157)報(bào)道將谷物面粉與還原劑(如DTT)或蛋白酶(如胰蛋白酶)一起培育導(dǎo)致激活支鏈淀粉酶活性，提出還原或蛋白酶水解可能是在發(fā)芽時(shí)支鏈淀粉酶被激活的機(jī)制。和稻米粉中一樣，發(fā)芽小麥種子或大麥芽的支鏈淀粉酶抽提物顯示較低的活性，但通過與DTT預(yù)培育20-30分鐘被激活，活性提高了3-5倍。然而，陰離子或陽離子交換樹脂純化粗抽提物(30-60％硫酸銨組分的透析產(chǎn)物)后，支鏈淀粉酶總活性比不與DTT預(yù)培育而測(cè)定時(shí)加到柱上的樣品，增加了2-3倍。DTT對(duì)于支鏈淀粉酶沒有或幾乎沒有作用。一種可能性是支鏈淀粉酶可能在純化過程中因蛋白酶水解而激活，因?yàn)榘l(fā)芽的小麥種子或大麥芽顯示出高蛋白酶活性。如果是這樣，加入蛋白酶抑制蛋白混合物將防止純化時(shí)支鏈淀粉酶被活化。與該觀點(diǎn)相反，用蛋白酶抑制蛋白的許多實(shí)驗(yàn)不能證實(shí)該觀點(diǎn)。另一個(gè)可能性是，存在一種可被硫酸銨沉淀，并抑制支鏈淀粉酶的蛋白酶抑制蛋白。DTT的作用是還原并滅活該蛋白抑制物，導(dǎo)致支鏈淀粉酶的活化。沿這條線索，將大麥芽的30-60％硫酸銨組分加到DE52柱(2.5×26cm)(已用20mM Tris-HCl，pH7.5平衡)。用線性鹽梯度洗脫后，鑒定到“去除抑制的”(“激活的”)支鏈淀粉酶是325mM NaCl處(組分號(hào)44-60)洗脫下來的蛋白峰。對(duì)50微升峰支鏈淀粉酶活性組分(組分號(hào)45)與50微升其它蛋白組分組成的預(yù)培育混合物測(cè)定支鏈淀粉酶活性，表明一個(gè)顯示有支鏈淀粉酶抑制活性的蛋白峰是用約100mM NaCl，在組分號(hào)8-25之間從DE52柱上洗脫下來。
通過兩次連續(xù)陽離子交換樹脂層析步驟，才用CM32于pH4.6和4.0，和SephdexG-75過濾進(jìn)一步純化了支鏈淀粉酶抑制蛋白樣品。
支鏈淀粉酶抑制蛋白的性質(zhì)初步實(shí)驗(yàn)顯示，支鏈淀粉酶抑制蛋白對(duì)于70℃處理10分鐘和pH4.0有抗性。根據(jù)Sephadex G-75凝膠過濾和SDS-PAGE圖譜，支鏈淀粉酶抑制蛋白分子量在8-15kDa±2kDa之間。研究進(jìn)一步顯示，該蛋白質(zhì)含有硫氧還蛋白-可還原的(S-S)鍵。
這些研究如表XV中所示，發(fā)現(xiàn)普遍存在的二硫醇蛋白(硫氧還蛋白)，起著先前未知的能抑制大麥和小麥胚乳支鏈淀粉酶的含二硫鍵的蛋白質(zhì)的特異性還原劑作用。
表XV支鏈淀粉酶抑制蛋白在NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原后活性的改變
該抑制蛋白的還原清除了其抑制支鏈淀粉酶的活性，從而使支鏈淀粉酶變得活躍。表XV中所示的這些研究說明，可以用生理學(xué)系統(tǒng)(包括NADPH、NADP-硫氧還蛋白還原酶(NTR)和硫氧還蛋白(NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng))以及硫氧還蛋白(Trx)和二硫蘇糖醇)使支鏈淀粉酶活化。這些發(fā)現(xiàn)還闡明了支鏈淀粉酶的還原性活化如何發(fā)生(即特異性(先前不知道的)抑制蛋白被還原，從而被滅活，因此酶變得活躍)。可從幾種來源，如大腸桿菌或種子胚乳(硫氧還蛋白h)獲得該反應(yīng)中的活性硫氧還蛋白。等式1和2給出了硫氧還蛋白在還原性滅活抑制蛋白(I)和去除對(duì)支鏈淀粉酶(E)的抑制中的作用。
(2)硫氧還蛋白氧化+[E失活∶I氧化]→硫氧還蛋白氧化+E活化+I還原總之，可用柱層析法組分粗胚乳抽提物。這些步驟為將支鏈淀粉酶與蛋白抑制物分開服務(wù)。然后通過幾個(gè)步驟高度純化了該抑制蛋白。通過使用mBBr/SDS-PAGE法，確定了該新蛋白質(zhì)的二硫基團(tuán)已被硫氧還蛋白特異性還原，而且該還原的蛋白喪失其抑制支鏈淀粉酶的活性。與種子的其它二硫蛋白(如大豆的Kunitz和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制蛋白)一樣，支鏈淀粉酶抑制蛋白顯示活化葉綠體NADP-蘋果酸脫氫酶的能力。在這些實(shí)驗(yàn)中，用二硫蘇糖醇還原硫氧還蛋白，進(jìn)而還原抑制蛋白，并因此激活脫氫酶。
實(shí)施例22過度表達(dá)硫氧還蛋白和NADP-硫氧還蛋白還原酶的酵母細(xì)胞的基因工程構(gòu)建將兩種釀酒酵母硫氧還蛋白基因(Muller，E.G.D.(1991)J.Biol.Chem.2669194-9202)TRX1和TRX2克隆入高拷貝數(shù)目的附加型載體中，一個(gè)例子是YEp24，在強(qiáng)組成型啟動(dòng)子元件的控制下，該元件的例子是甘油醛-3-P脫氫酶、烯醇酶或磷酸甘油酸激酶基因的糖酵解啟動(dòng)子。通過定量的Wetern印跡方法，用抗硫氧還蛋白兔抗血清(Muller，E.G.D.等(1989)J. Biol.Chem.2644008-4014)評(píng)估了重組構(gòu)建物的硫氧還蛋白的過度表達(dá)，來選擇硫氧還蛋白基因和啟動(dòng)子元件的最佳組合。采用具有最佳硫氧還蛋白過度表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞作為硫氧還蛋白的來源，用于生面團(tuán)改進(jìn)。
制備自其氨基末端序列推斷出來的寡核苷酸探針，克隆了NADP-硫氧還蛋白還原酶基因。按照設(shè)計(jì)用于菠菜葉子(Florencio，F(xiàn).J.等(1988)，Arch.Biochem.Biophys.266496-507)的方法修改后，從酵母細(xì)胞制備了該酶。用自動(dòng)化Exman降解法和Applied Biosystems氣相蛋白質(zhì)測(cè)序儀微量測(cè)序，確定該純還原酶的氨基末端。根據(jù)該序列，并根據(jù)酵母中的密碼子用途，制備了20個(gè)堿基的24倍簡(jiǎn)并DNA探針。使該探針與用EcoRI和PstI切開的分離的酵母DNA雜交作DNA印跡分析。從瓊脂糖凝膠中抽提出該最活躍的區(qū)域，并引入pUC19質(zhì)粒載體中(Szekeres，M.等(1991)，J.Bacteriol.173.1821-1823)。轉(zhuǎn)化后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針通過菌落雜交篩選含質(zhì)粒的大腸桿菌菌落(Vogeli，G.等(1987)MethodEnzymol.152407-415)。如Szekers等上文給出的方法對(duì)DNA測(cè)序，鑒定得到攜帶NADP-硫氧還蛋白還原酶基因的克隆。一旦鑒定到，使NADP-硫氧還蛋白還原酶基因如上面TRX1和TRX2酵母硫氧還蛋白基因所述在酵母中過度表達(dá)。用過度表達(dá)NADP-硫氧還蛋白還原酶的酵母細(xì)胞作為還原酶來源，以改進(jìn)生面團(tuán)質(zhì)量。
實(shí)施例23用基因工程改造的酵母細(xì)胞改進(jìn)生面團(tuán)質(zhì)量工程改造釀酒酵母細(xì)胞，使其過度表達(dá)兩種酵母硫氧還蛋白。用已建立的方法，如超聲然后凍干等裂解酵母產(chǎn)生NADP-硫氧還蛋白還原酶。合并過度表達(dá)硫氧還蛋白的培養(yǎng)物的干燥細(xì)胞與NADP-硫氧還蛋白還原酶，然后加到面粉中，改善其面團(tuán)質(zhì)量。在1M Tris-HCl緩沖液，pH7.9中加入2/10克合并的裂解干燥細(xì)胞，以及約300-500納摩爾NADPH，得到5.25毫升30mM Tris-HCl。反應(yīng)在微量淀粉測(cè)定記錄儀中30℃，如實(shí)施例14所述進(jìn)行。觀察到生面團(tuán)質(zhì)量的改善，與實(shí)施例14所示的改善相似。
實(shí)施例24面筋的改善NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)對(duì)生面團(tuán)質(zhì)量的正效應(yīng)提出了在制備面筋時(shí)在面粉中加入該系統(tǒng)的選擇。目的是改變面筋的產(chǎn)量和性質(zhì)，從而增強(qiáng)其技術(shù)價(jià)值(1)通過獲得更強(qiáng)的面筋(提高的彈性，改進(jìn)的延展性)；(2)通過在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中捕獲被NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)還原的可溶性蛋白質(zhì)增加面筋產(chǎn)量，從而防止它們?cè)谏a(chǎn)面筋的過程中被洗去。在該方法(使用10克面粉)中，加入0.2微克大腸桿菌硫氧還蛋白、0.1微克大腸桿菌NADP-硫氧還蛋白還原酶和300-500納摩爾NADPH和1MTris-HCl，pH7.9緩沖液，得到5.25毫升30mM Tris-HCl。根據(jù)常規(guī)浸出法在室溫下制造面筋。稱量確定面筋產(chǎn)量，并用經(jīng)典手工拉伸法確定面筋強(qiáng)度。用該處理方法與NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)獲得的面筋產(chǎn)物被用作面粉或其它谷物的添加劑。
實(shí)施例25從非小麥或黑麥粉產(chǎn)生面團(tuán)的方法對(duì)于該試驗(yàn)(用10克磨碎的玉米、稻或高粱粉)，在1M Tris-HCl，pH7.9的緩沖液中加入0.2微克大腸桿菌硫氧還蛋白、0.1微克大腸桿菌NADP-硫氧還蛋白還原酶和500納摩爾NADPH，得到5.25毫升30mM Tris-HCl。將10克磨碎的粉與該酶系統(tǒng)在微量淀粉測(cè)定記錄儀中30℃混合，進(jìn)行反應(yīng)。淀粉測(cè)定記錄儀的測(cè)量值顯示，加入NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)與小麥相似的生面團(tuán)特征。在沒有酶系統(tǒng)的對(duì)照中，不可能有微量淀粉測(cè)定記錄儀的讀數(shù)，因?yàn)榛旌衔锊荒苄纬缮鎴F(tuán)。形成的生面團(tuán)是持久的，其堅(jiān)韌性在操作過程中保持。最終產(chǎn)物與小麥的生面團(tuán)形成的網(wǎng)絡(luò)相似。
動(dòng)物毒素的還原本發(fā)明提供了一種用化學(xué)方法還原蜜蜂、蝎子和蛇毒液中引起中毒的蛋白質(zhì)，并從而改變毒液的生物學(xué)活性，以及在硫氧還蛋白或DTT存在下，用硫醇氧化還原(SH)試劑，即還原的硫氧還蛋白、還原的硫辛酸還原動(dòng)物毒素(尤其是蛇神經(jīng)毒素)的方法。硫氧還蛋白的還原主要優(yōu)選通過NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)發(fā)生。如前所述，NTS包括NADPH、NADP-硫氧還蛋白還原酶(NTR)和硫氧還蛋白。
術(shù)語“硫醇氧化還原試劑”已在文獻(xiàn)中用了一段時(shí)間，指一種試劑存在于非還原狀態(tài)和還原或巰基(SH)狀態(tài)。如本文所限定的，術(shù)語“硫醇氧化還原(SH)試劑”表示還原的硫醇氧化還原蛋白質(zhì)，或合成制備的試劑，如DTT。
神經(jīng)毒素的還原可在液態(tài)(如血液、淋巴液或緩沖液)介質(zhì)中發(fā)生，或在固態(tài)介質(zhì)(如細(xì)胞或其它活組織)中發(fā)生。本文所用的術(shù)語“液態(tài)”本身不指存在于個(gè)體中的生物液。
推測(cè)硫醇氧化還原(SH)試劑在體外滅活毒液，和在個(gè)體內(nèi)對(duì)毒液解毒的能力依賴于本發(fā)明的試劑還原導(dǎo)致中毒的毒液組分中分子內(nèi)二硫鍵的能力。
本發(fā)明的硫醇氧化還原(SH)試劑可還原并至少可部分在體外滅活所有蛇神經(jīng)毒素(突觸前和突觸后的)。根據(jù)本發(fā)明在體外滅活的蛇神經(jīng)毒素被用作制備抗蛇毒素的抗原。優(yōu)選通過與硫醇氧化還原(SH)試劑在合適的緩沖液中一起培育來滅活神經(jīng)毒素。優(yōu)選的緩沖液是Tris-HCl緩沖液，但可用其它緩沖液如磷酸緩沖液。優(yōu)選硫醇氧化還原(SH)試劑是一種還原的硫氧還蛋白。
滅活蛇神經(jīng)毒素的有效量范圍是對(duì)于每10微克蛇神經(jīng)毒素(體積為100微升)約0.1-5.0微克，優(yōu)選約0.5-1.0微克的還原的硫氧還蛋白；約1-20納摩爾，優(yōu)選5-15納摩爾的還原的硫辛酸(在約1.0微克的硫氧還蛋白存在下)；和約10-200納摩爾，優(yōu)選50-100納摩爾的還原的DTT(優(yōu)選在約1.0微克硫氧還蛋白的存在下)。
用NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)中的組分滅活蛇神經(jīng)毒素的有效量對(duì)于每10微克蛇神經(jīng)毒素(體積為100微升)，約0.1-5.0微克，優(yōu)選約0.5-1.0微克的還原的硫氧還蛋白；約0.1-20微克，優(yōu)選0.2-1.0微克的NTR和約0.05-0.5微摩爾，優(yōu)選約0.1-0.25微摩爾的NADPH。
在滅活后，可將含有滅活的神經(jīng)毒素和硫醇氧化還原(SH)試劑等的緩沖液注射入動(dòng)物(如馬)，產(chǎn)生抗蛇毒素或在注射前可加熱或用甲醛進(jìn)一步處理。
還可用本發(fā)明的硫醇氧化還原(SH)試劑治療因毒蛇咬傷導(dǎo)致神經(jīng)中毒的病人。給予病人硫醇氧化還原(SH)試劑的優(yōu)選方法是在蛇咬傷周圍多處皮下注射。
當(dāng)然在病人中用來解除神經(jīng)毒素毒性的硫醇氧化還原(SH)試劑的正確用量將根據(jù)病人實(shí)際從咬傷接受的毒素量來決定。然而，小鼠中解除或還原蛇神經(jīng)毒素毒性的有效用量常常是每克小鼠體重約0.01-0.3微克，優(yōu)選0.02-0.05微克的還原的硫氧還蛋白；0.1納摩爾-3.0納摩爾，優(yōu)選0.2-1.0納摩爾的還原的硫辛酸(在約0.05微克硫氧還蛋白存在下)；約1.0-30納摩爾，優(yōu)選2.0-5.0納摩爾的DTT(優(yōu)選在0.05微克硫氧還蛋白的存在下)。
用NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)的組分在小鼠中解除蛇神經(jīng)毒素的有效用量對(duì)于每克小鼠體重為0.01-0.3微克，優(yōu)選約0.02-0.05微克的硫氧還蛋白；約0.005-0.12微克，優(yōu)選0.01-0.025微克的NTR，和約5-30納摩爾，優(yōu)選10-15納摩爾的NADPH。
給予病人NTS的優(yōu)選方法也是多處皮下注射。人用的優(yōu)選硫醇氧化還原試劑是人硫氧還蛋白，通過NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)或與硫辛酸或DTT一起施用。
產(chǎn)生可用本發(fā)明的方法滅活或解毒的神經(jīng)毒素的毒蛇的部分名單出現(xiàn)在Chippaur，J.-P.等(1991)Reptile Venoms and Toxins，A.T.Tu編Marcel Dekker Inc.的529-555頁上，納入本文以供參考。
下列實(shí)施例將明確本發(fā)明滅活和解除毒液毒性上的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例26蜜蜂、蝎子和蛇毒液的還原研究與mBBr標(biāo)記用50微克毒液(最終體積100微升)的30mM Tris-HCl緩沖液，pH7.9進(jìn)行反應(yīng)，該緩沖液含有下列蛋白酶抑制物苯基甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑肽酶和胃酶抑素(試驗(yàn)中使用的最終濃度分別是100μM、1μM和1μM)。NADPH作為還原劑時(shí)，混合物還含有4微克硫氧還蛋白、3.5微克NTR(都來自大腸桿菌)和12.5mM NADPH。當(dāng)DTT還原硫氧還蛋白(4微克，大腸桿菌或人)時(shí)，省去NADPH和NTR，將DTT加到0.5mM。類似進(jìn)行了用GSH的試驗(yàn)，但最終濃度為5mM，在1.5微克谷胱甘肽還原酶和12.5mM NADPH的存在下?；旌衔镌谑覝叵屡嘤?0分鐘，然后將mBBr加到1.5mM，反應(yīng)在室溫下繼續(xù)15分鐘。停止反應(yīng)，加入10微升100mM β-巰基乙醇、5微升20％SDS和10微升50％甘油來衍生過量的mBBr。然后用如前所述的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品。
不加蛋白酶抑制物，用NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)進(jìn)行了相同實(shí)驗(yàn)。
在蛋白酶抑制物的存在下樣品與不同還原劑室溫培育20分鐘后，用mBBr衍生樣品，并用電泳分離，測(cè)定熒光。顯示在所有情況下硫氧還蛋白(大腸桿菌或人)特異性的還原了毒液組分。凝膠也顯示當(dāng)反應(yīng)在蛋白酶抑制物不存在的情況下進(jìn)行時(shí)，硫氧還蛋白以類似方式還原了毒液組分。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠mBBr法顯示了NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)在有和沒有蛋白酶抑制物的情況下還原了蜜蜂、蝎子和蛇毒液。室溫下將樣品與NTS在存在或不存在任何蛋白酶抑制物的情況下培育20分鐘后，用mBBr衍生樣品，電泳分離，如前所述測(cè)定熒光。
材料毒液Apis mellifera的蜜蜂毒液，Androctonus australis的蝎子毒液和銀環(huán)蛇(Bungarus multicinctus)的蛇毒液購(gòu)自Sigma Chmical Co.(St.Louis，MO)。
蛋白酶抑制物苯基甲基磺酰氟(PMSF)、Leupeptin和Pepstatin購(gòu)自SigmaChmical Co.(St.Louis，MO)。
毒液毒性解除皮下注射入小鼠測(cè)定蜜蜂、蝎子和蛇毒液毒性的解除。試驗(yàn)重復(fù)三次。注射前，將毒液稀釋于磷酸鹽緩沖液(0.15M NaCl于10mM Na2H2PO4/NaH2PO4pH7.2)，濃度范圍為L(zhǎng)D50兩倍(每克小鼠)Apis mellifera的蜜蜂毒液2.8微克；Androctonus australis的蝎子毒液0.32微克；銀環(huán)蛇的蛇毒液0.16微克。注射后5，10，30，60分鐘和4，12和24小時(shí)，靜脈內(nèi)(1)和皮下(2)(在最初注射位點(diǎn)周圍多處局部注射)注射受攻擊的各組小鼠。用(1)大腸桿菌NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)(0.08微克硫氧還蛋白、0.07微克NTR和25納摩爾NADPH)；(2)用DTT還原的硫氧還蛋白或還原的硫辛酸(0.08微克大腸桿菌或人硫氧還蛋白，加到1納摩爾二硫蘇糖醇或1納摩爾還原的硫辛酸中來還原硫氧還蛋白)。濃度是以每微克注射入動(dòng)物的毒液計(jì)；所有溶液以磷酸鹽-鹽水緩沖液制備。
硫氧還蛋白對(duì)解毒的作用可通過(1)與沒有硫氧還蛋白的對(duì)照組比較LD50，和(2)根據(jù)局部反應(yīng)程度，如壞死、腫脹和動(dòng)物普遍不適來確定。
還原蛇神經(jīng)毒素的還原研究-材料和方法毒素豬胰磷脂酶A2、半環(huán)扁尾蛇毒素b和β-銀環(huán)蛇毒素購(gòu)自Sigma Chmical Co.(St.Louis，MO)。由于磷脂酶A2以3.2MpH5.5的(NH4)2SO4溶液提供，故用30mM pH7.9的Tris-HCl緩沖液，使用Centricon 3kDa截留的膜透析。α-銀環(huán)蛇毒素和α-銀環(huán)蛇毒素125I由Shalla Verrall博士慷慨贈(zèng)與。
試劑和精制化學(xué)藥品DL-α-硫辛酸、大豆的L-α-磷酪酰膽堿、NADPH和β-巰基乙醇購(gòu)自SigmaChmical Co.(St.Louis，MO)，一溴二滿(mBBr，商品名thiolite)購(gòu)自Calbiochem(San Diego，CA)。十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳購(gòu)自Bio-Rad Laboratories(Richmond，CA)。
蛋白質(zhì)和酶如Jiao等(1992)Ag.Food.Chem.(出版中)所述純化了大腸桿菌的硫氧還蛋白和NTR。硫氧還蛋白h純化自小麥胚芽(Florencio，F(xiàn).J.等(1988)，Arch.Biochem.Biophys.266496-507)，硫氧還蛋白f和m來自菠菜葉(Florencio，F(xiàn).J.等(1988)見上)。人硫氧還蛋白是Dr.Emanuelle Wollman慷慨贈(zèng)與的。NADP-蘋果酸脫氫酶純化自玉米葉(Jacquot，J.-P.等(1981)Plant Physiol.68300-304)，谷胱甘肽還原酶來自菠菜葉子(Florencio，F(xiàn).J.等，見上)。大腸桿菌谷氧還蛋白是A.Holmgren教授慷慨贈(zèng)與的。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在10-20％梯度，1.5毫米厚度的凝膠中進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，在40毫安的穩(wěn)定電流下電泳3小時(shí)。電泳后，將凝膠在12％(重量/體積)三氯乙酸中浸泡2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到40％甲醇和10％乙酸的溶液中，浸泡12小時(shí)除去過量mBBr。將凝膠置于裝置有紫外光源(365納米)的光盒中，測(cè)定蛋白質(zhì)-結(jié)合的mBBr的熒光。用Polaroid正片/負(fù)片Landfilm55型通過黃色Wratten明膠膜8號(hào)(截留＝460納米)對(duì)凝膠拍照(曝光時(shí)間40秒，f4.5)。用0.125％(重量/體積)考馬斯藍(lán)R-250的10％乙酸和40％甲醇溶液染色凝膠中的蛋白質(zhì)1小時(shí)。以省去了考馬斯藍(lán)的相同溶液脫色凝膠。
用激光密度計(jì)(Pharmacia-LKB Ultroscan XL)掃描熒光凝膠的Polaroid負(fù)片和干燥的染色凝膠。用Gelscan XL軟件評(píng)估峰面積或高度定量測(cè)定各條帶。
實(shí)施例27毒素的還原和mBBr標(biāo)記用10微克靶毒素，最終體積為100微升的30mM Tris-HCl緩沖液，pH7.9的溶液和0.8微克硫氧還蛋白、0.7微克NTR(都來自大腸桿菌)和2.5mM NADPH進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)DTT還原硫氧還蛋白時(shí)，省去NADPH和NTR，加入DTT至0.5mM。類似的用GSH進(jìn)行試驗(yàn)，只是最終濃度為1mM。對(duì)于谷氧還蛋白的還原，用1微克大腸桿菌谷氧還蛋白、0.38微克谷胱甘肽還原酶(以菠菜葉子部分純化)、1mM GSH和2.5mM NADPH(這四種組分的組合稱為NADP/谷氧還蛋白系統(tǒng))替換硫氧還蛋白和NTR。體積為100微升的溶液中用硫辛酸的還原形式還原，濃度為100μM和200μM，單獨(dú)或和0.8微克硫氧還蛋白。對(duì)于半環(huán)扁尾蛇毒素b和α-銀環(huán)蛇毒素而言，37℃溫育混合物2小時(shí)，對(duì)β-銀環(huán)蛇毒素室溫溫育1小時(shí)，對(duì)磷脂酶A2室溫溫育20分鐘。溫育后將mBBr加到1.5mM，反應(yīng)在室溫下繼續(xù)15分鐘。停止反應(yīng)，加入10微升100mM的β-巰基乙醇、5微升20％SDS和10微升50％甘油衍生過量mBBr。然后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品。
在2mM DTT中煮沸樣品3分鐘，完成了全部毒素的還原。冷卻后，用mBBr標(biāo)記樣品，如前處理，除了在加到凝膠上之前，將所有樣品再煮沸2分鐘。二硫蘇糖醇(DTT)和硫氧還蛋白的還原形式以及硫辛酸是二硫醇還原劑，與一硫醇還原劑，如2-巰基乙醇和谷胱甘肽相反。DTT是合成制備的化學(xué)試劑，而硫氧還蛋白和硫辛酸存在于細(xì)胞內(nèi)。半環(huán)扁尾蛇毒素b被NTS、DTT和硫氧還蛋白、還原的硫辛酸和硫氧還蛋白顯著還原。與半環(huán)扁尾蛇毒素b一起，顯示硫辛酸是比二硫蘇糖醇特異性更高的還原劑。
沒有硫氧還蛋白時(shí)，二硫蘇糖醇部分還原了該毒素，而還原的硫辛酸不這樣(泳道8)。結(jié)果還顯示NTS或DTT加硫氧還蛋白是α-銀環(huán)蛇毒素和β-半環(huán)扁尾蛇毒素的特異性還原劑。
實(shí)施例28NADP-蘋果酸脫氫酶的活化用限定的硫氧還蛋白濃度與5微克蛇毒素一起預(yù)培育(用硫氧還蛋白限制該酶的活化)測(cè)試了蛇毒素活化葉綠體NADP-蘋果酸脫氫酶的能力大腸桿菌硫氧還蛋白0.25微克；人0.9微克、小麥1.15微克；菠菜f和m分別是0.375和0.125微克。如所示，在含有100mM Tris-HCl，pH7.9的硫氧還蛋白和10mM DTT的溶液(最終體積0.2毫升)中加入1.4微克純化的玉米NADP-蘋果酸脫氫酶。25分鐘后，將160微升預(yù)培育的混合物注射到含有100mM Tris-HCl，pH7.9和0.25mM NADPH的1毫升溶劑(0.79毫升)的1厘米比色杯中。加入50微升50mM草乙酸開始反應(yīng)。然后用配備有四通管變換器的Beckman分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)340納米處的吸光度改變，跟蹤NADPH的氧化。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，半環(huán)扁尾蛇毒素b的不同的還原硫氧還蛋白的還原作用顯著改變了毒素的生物學(xué)活性，激活了NADP-蘋果酸脫氫酶。該結(jié)果證明雖然效力不同，所有測(cè)試的硫氧還蛋白在某種程度上起到了限制毒素作用的功能。
實(shí)施例29半環(huán)扁尾蛇毒素b的蛋白酶水解試驗(yàn)使半環(huán)扁尾蛇毒素b10微克與用30mM Tris-HCl緩沖液pH7.9(總體積100微升)37℃溫育2小時(shí)。如所示的，在緩沖液中添加0.8微克硫氧還蛋白、0.7微克NTR和2.5mM NADPH。當(dāng)用DTT還原硫氧還蛋白時(shí)，省去NTR和NADPH，加入DTT至0.5mM。溫育后，用0.4和2微克胰蛋白酶37℃消化樣品10分鐘。加入DTT(4.8微升的50mM溶液)、5微升20％SDS和10微升50％甘油，煮沸樣品3分鐘，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。用考馬斯藍(lán)染色凝膠，用上述密度計(jì)掃描定量測(cè)定各蛋白質(zhì)條帶。下文表XVI顯示了該試驗(yàn)結(jié)果。這些結(jié)果顯示蛇神經(jīng)毒素的還原使得毒素對(duì)蛋白酶水解更敏感。該結(jié)論的引申將表明，施用還原的硫氧還蛋白作為解毒劑應(yīng)有助于破壞毒素，因?yàn)槎疽旱牡鞍酌傅牡鞍酌杆鉁缁钤黾印?br> 表XVI半環(huán)扁尾蛇毒素b的氧化和還原形式對(duì)胰蛋白酶的敏感性
在30mM Tris-HCl緩沖液，pH7.9中預(yù)培育10微克半環(huán)扁尾蛇b37℃2小時(shí)，如下對(duì)照，無添加；用大腸桿菌NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)還原，硫氧還蛋白、NTR和NADPH；被DTT還原，DTT；和被DTT+硫氧還蛋白還原，DTT(添加大腸桿菌硫氧還蛋白)。預(yù)培育后，加入指定的0.4微克和2微克胰蛋白酶，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
實(shí)施例30磷脂酶A2試驗(yàn)用分光光度計(jì)測(cè)定β-銀環(huán)蛇毒素的磷脂酶A2組分的氧化和還原形式的活性，如Lobo de Araujo等(1987)Toxicon 251181-1188所述跟蹤活性變化。對(duì)于還原實(shí)驗(yàn)，使10微克毒素與含有0.8微克硫氧還蛋白、0.7微克NTR和7mM NADPH的30mM pH7.9的Tris-HCl緩沖液(最終體積35微升)一起培育。室溫溫育1小時(shí)后，在含有1毫升試驗(yàn)溶液(調(diào)節(jié)到pH7.6)的1厘米比色杯中加入20微升該反應(yīng)混合物，試驗(yàn)溶液含有10mM CaCl2、100mM NaCl、4mM膽酸鈉、175μM大豆磷酯酰膽堿和55μM酚紅。在Beckman Du2400型分光光度計(jì)中，測(cè)量558納米處的吸光度變化，跟蹤該反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明當(dāng)被硫氧還蛋白還原后，β銀環(huán)蛇毒素喪失了其大部分磷脂酶活性。結(jié)果和結(jié)論一致，即在蛇咬傷后給予還原的硫氧還蛋白可通過消除磷脂酶A2活性幫助解毒。
實(shí)施例31與乙酰膽堿受體結(jié)合的α-銀環(huán)蛇毒素用放射性標(biāo)記的毒素(Gu，Y.等(1985)J.Neurosci.51909-1916)測(cè)試了α-銀環(huán)蛇毒素與培養(yǎng)的小鼠細(xì)胞的結(jié)合。如Gu等(Gu，Y.等，見上)所述培養(yǎng)小鼠細(xì)胞系C2，并置于24孔塑料組織培養(yǎng)板(Falcon)中，密度為每孔3000細(xì)胞。48小時(shí)后用融合培養(yǎng)基替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基，96小時(shí)后再次替換。再培養(yǎng)2日后用培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)。
測(cè)定了α-銀環(huán)蛇毒素與細(xì)胞的結(jié)合，進(jìn)行三種不同處理[A]37℃在200微升磷酸鹽-緩沖液(0.15M NaCl的10mM Na2HPO4/Na2HPO4pH7.2)中將10nMα-銀環(huán)蛇毒素125I(262Ci/毫摩爾)與4微克硫氧還蛋白、3.5微克NTR(都來自大腸桿菌)和6.25mM NADPH一起溫育2小時(shí)。在某些情況下，用1.25mM DTT替換NTR和NADPH。2小時(shí)培育后，將混合物轉(zhuǎn)移到含有小鼠細(xì)胞的孔中，用磷酸鹽-鹽水洗滌2次，37℃溫育2小時(shí)。[B]用磷酸鹽水緩沖液洗滌細(xì)胞2次后，在每孔中加入10nMα-銀環(huán)蛇125I(于200微升磷酸鹽水中)。37℃溫育2小時(shí)后，用磷酸鹽-緩沖液洗滌細(xì)胞，除去未結(jié)合毒素。如所示，在孔中加入添加了0.68mM CaCl2、0.49mM MgCl2、4微克硫氧還蛋白、3.5微克NTR和6.25mM NADPH的200微升鹽水。37℃溫育培養(yǎng)平板2小時(shí)。用加入1.25mMDTT處理時(shí)，省去NTR和NADPH。[C]用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次后，在各孔中加入含有4微克硫氧還蛋白、3.5微克NTR和6.25mMNADPH的200微升溶液。在某些情況下，用1.25mM DTT替換NTR和NADPH。37℃培育平板2小時(shí)。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，除去加入的還原劑。在各孔中加入含有0.68mM CaCl2和0.49mM MgCl2和10nMα-銀環(huán)蛇毒素125I的200微升磷酸鹽緩沖液。37℃繼續(xù)培育2小時(shí)。表XVII顯示了該試驗(yàn)的結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)被硫氧還蛋白還原時(shí)，β-銀環(huán)蛇毒素不再與乙酰膽堿受體結(jié)合。當(dāng)延伸到動(dòng)物時(shí)，硫氧還蛋白相關(guān)的還原機(jī)制將通過消除毒素與其靶受體的結(jié)合導(dǎo)致解毒。進(jìn)行了一式三份的各α-銀環(huán)蛇毒素結(jié)合試驗(yàn)。通過向培育混合物中加入過量100倍的未標(biāo)記α-銀環(huán)蛇毒素，測(cè)量了非特異性結(jié)合。培育期后，用磷酸鹽洗滌所有情況下的細(xì)胞，除去未結(jié)合的毒素。將細(xì)胞溶于0.1M NaOH，在γ計(jì)數(shù)器中測(cè)量放射活性測(cè)定了結(jié)合的毒素量。
表XVIIα-銀環(huán)蛇毒素與小鼠細(xì)胞乙酰膽堿受體的結(jié)合
大腸桿菌NTS硫氧還蛋白、NTR和NADPH實(shí)施例32動(dòng)物中解毒的例子通過皮下注射小鼠測(cè)定蛇神經(jīng)毒素的解毒。一式三份進(jìn)行試驗(yàn)。注射前，用磷酸鹽緩沖液(0.15M NaCl的10mM Na2HPO4/NaH2PO4pH7.2)稀釋毒素，濃度范圍在LD50劑量的兩倍。(LD50定義為殺死給定組50％的動(dòng)物的劑量)。對(duì)于毒性試驗(yàn)，下列神經(jīng)毒素濃度對(duì)應(yīng)于LD50(每克小鼠)半環(huán)扁尾蛇毒素b，0.05微克-0.15微克；α-銀環(huán)蛇毒素，0.3微克；和β-銀環(huán)蛇毒素，0.089微克。在注射后5、10、30、60分鐘和4、12和24小時(shí)，(1)靜脈內(nèi)注射和(2)皮下注射(在最初注射位點(diǎn)周圍多處局部注射)各組受攻擊的小鼠。用(1)大腸桿菌NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)，采用0.08微克硫氧還蛋白、0.07微克NTR和25納摩爾NADPH；(2)硫氧還蛋白加1-2納摩爾還原的硫辛酸，用0.08微克大腸桿菌或0.20微克人硫氧還蛋白和5納摩爾二硫蘇糖醇(濃度為每微克注射入動(dòng)物的毒素；所有溶液以磷酸鹽緩沖液配制)還原硫氧還蛋白。
通過(1)與沒有硫氧還蛋白的對(duì)照組比較LD50(2)跟蹤局部反應(yīng)的程度，如壞死、腫脹和動(dòng)物的普遍不適所證明的；(3)跟蹤肌酸激酶血清水平，它是組織損傷的指標(biāo)。作為肌肉細(xì)胞破碎的結(jié)果，肌酸激酶被釋放入血液，這用從SigmaChmical Co.(St.Louis，MO)獲得的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)試劑盒監(jiān)測(cè)。該蛇咬的癥狀是多樣的，而且依賴于各種因素。結(jié)果，它們因病人與病人而不同。但是不管怎樣，硫氧還蛋白處理應(yīng)減輕人中毒的常見癥狀。特別是，硫氧還蛋白處理應(yīng)減輕蛇咬導(dǎo)致的神經(jīng)毒素和相關(guān)作用有關(guān)的癥狀，包括腫脹和水腫、咬傷周圍的疼痛和風(fēng)塊的減少；正常脈搏速率的恢復(fù)；壞死限于咬傷區(qū)域；受影響部分最小化。這些癥狀的最小化進(jìn)而改善病人的總體健康和狀態(tài)。
食物和花粉蛋白和過敏原的還原本發(fā)明提供了一種方法，用化學(xué)方法還原主要過敏原蛋白，尤其是食物和花粉過敏原蛋白中的二硫鍵，以減少或消除當(dāng)攝取含有這些蛋白質(zhì)的食物，或吸入、攝取或粘膜接觸含有這些蛋白質(zhì)的花粉時(shí)發(fā)生的變態(tài)反應(yīng)。
一種減少或消除過敏反應(yīng)的的方法涉及用不同劑量的已被還原的硫氧還蛋白還原的變應(yīng)原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一段時(shí)間的免疫治療。變應(yīng)原可以是花粉蛋白或在植物(如有毒櫟)或動(dòng)物(如塵螨)中發(fā)現(xiàn)的變應(yīng)原蛋白。
本發(fā)明還提供了一種方法，用于增加變應(yīng)原蛋白及其食物，和花粉等可被吞下或吸入的蛋白質(zhì)的可消化性。這些蛋白質(zhì)的二硫鍵被硫氧還蛋白還原成巰基(SH)基。其它主要的細(xì)胞硫醇還原劑谷胱甘肽沒有該能力。這些蛋白質(zhì)在氧化(S-S)狀態(tài)時(shí)具有變應(yīng)原活性；當(dāng)用還原的硫氧還蛋白處理時(shí)，它們被還原(SH狀態(tài))并喪失變應(yīng)原性。當(dāng)被NADPH通過酶NADP-硫氧還蛋白還原酶(生理性還原系統(tǒng))或二硫蘇糖醇(DTT)(一種合成的化學(xué)還原劑)，或硫辛酸(一種生理性還原劑)活化(還原)時(shí)，硫氧還蛋白實(shí)現(xiàn)了該還原。雖然使用BADPH作為還原劑通常在幾乎所有的情況下是優(yōu)選的，也可使用生理可接受的硫辛酸，DTT對(duì)于某些蛋白質(zhì)的處理也是可接受的。如果變應(yīng)原含有硫氧還蛋白，在某些情況下可用NADPH/NTR或硫辛酸，而不加入硫氧還蛋白。
推測(cè)還原的硫氧還蛋白降低或消除食物引起的過敏的能力依賴于還原的硫氧還蛋白還原食物中變應(yīng)原性蛋白的分子內(nèi)二硫鍵的能力。另外，分子內(nèi)二硫鍵已被硫氧還蛋白還原的變應(yīng)原將較少引致變應(yīng)原性(即它將為低變應(yīng)原性)，但仍將保留作為有效免疫治療劑的能力。
當(dāng)用硫氧還蛋白在有效溫度處理食物一段有效時(shí)間時(shí)，可用還原的硫氧還蛋白還原具有分子內(nèi)二硫鍵的的食物蛋白，并可至少減少含有這些蛋白的食物的變應(yīng)原性，提高其可消化性。溫育食物的有效溫度是約4℃-55℃，但任何可還原二硫鍵的有效溫度都是可接受的。溫育的有效時(shí)間是約20分鐘-2小時(shí)，但任何使得二硫鍵還原，但不顯著降低食物質(zhì)量的時(shí)間都是可接受的。例如，蛋白質(zhì)還可被還原，并在4℃溫育48小時(shí)，保持還原。
在用還原的硫氧還蛋白處理后顯示變應(yīng)原性降低，可消化性增加的食物的例子是牛肉、牛奶、大豆、雞蛋、稻、小麥和堅(jiān)果。
降低哺乳動(dòng)物攝取的食物的變應(yīng)原性，提高可消化性的優(yōu)選方法是用NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)的組分預(yù)處理或溫育食物?？偟恼f，這些組分的有效量范圍是食物中每1.0克蛋白約0.01毫克-4.0毫克，優(yōu)選約0.10毫克-2毫克的硫氧還蛋白；約0.01毫克-4毫克，優(yōu)選約0.20毫克-2毫克的NTR和約1微摩爾-250微摩爾，優(yōu)選約25微摩爾-100微摩爾的NADPH。當(dāng)然，各組分的有效用量將根據(jù)其它組分量，溫育的時(shí)間和溫度，以及具體食物和該食物中先天的硫氧還蛋白及其還原劑量變化。例如，上述硫氧還蛋白量是基于每克食物蛋白使用1毫克NTR和100微摩爾NADPH確定的。NADPH范圍是基于使用1毫克NTR和1毫克硫氧還蛋白確定的。合適的組分用量還可能受食物的先前處理和動(dòng)物種類及其情況的影響。
NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還能還原空氣攜帶的變應(yīng)原(如豚草和禾草花粉)和皮膚接觸變應(yīng)原(如塵螨)中的二硫鍵變應(yīng)原，從而減輕當(dāng)動(dòng)物全身性接受這些還原的變應(yīng)原時(shí)，對(duì)這些變應(yīng)原的IgE應(yīng)答。
用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)處理變應(yīng)原(如花粉變應(yīng)原)的有效溫度是約4℃-55℃，但任何能使得二硫鍵還原的溫度都是可接受的。溫育的有效時(shí)間與處理食物(約20分鐘-1小時(shí))的時(shí)間相似，但是任何能還原二硫鍵但不顯著降解蛋白質(zhì)的時(shí)間都是可接受的。例如，還可還原蛋白質(zhì)，并在4℃溫育4小時(shí)，保持其還原。
用還原的硫氧還蛋白處理后，顯示降低的變應(yīng)原性和提高的可消化性的變應(yīng)原的例子包括含二硫鍵的變應(yīng)原性蛋白，如豚草花粉、禾草花粉、有毒櫟和長(zhǎng)春藤變應(yīng)原和塵螨變應(yīng)原蛋白。
一種降低變應(yīng)原性，減輕哺乳動(dòng)物對(duì)變應(yīng)原的IgE應(yīng)答的優(yōu)選方法是用NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)中的組分預(yù)處理或溫育變應(yīng)原?？偟恼f，對(duì)于空氣攜帶和接觸變應(yīng)原(如食物)組分的有效用量范圍是每1克變應(yīng)原蛋白約0.1-6.0毫克，優(yōu)選約0.1毫克-4.0毫克硫氧還蛋白；約0.1-8.0毫克，優(yōu)選約0.2-7.0毫克的NTR，和約1-500微摩爾，優(yōu)選約25-400微摩爾的NADPH。同樣，各種組分的有效用量將根據(jù)其它組分的量，溫育的時(shí)間和溫度，以及具體變應(yīng)原蛋白或變應(yīng)原抽提物和該變應(yīng)原抽提物中先天的硫氧還蛋白及其還原劑的量而不同。上述硫氧還蛋白量是基于每克變應(yīng)原蛋白使用1毫克NTR和100微摩爾NADPH確定的。NADPH范圍是基于每1.0克花粉蛋白使用1.0微克NTR和1.0微克硫氧還蛋白確定的。
然后在一段預(yù)定的時(shí)間內(nèi)將不同劑量的用硫氧還蛋白還原的變應(yīng)原抽提物注射入動(dòng)物體內(nèi)。
變應(yīng)原的預(yù)先處理，具體變應(yīng)原和動(dòng)物類型及其狀態(tài)也可能影響組分的合適用量。
下面的實(shí)施例將確定本發(fā)明的降低特定變應(yīng)原的變應(yīng)原性和增加其可消化性的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例33用硫氧還蛋白處理牛奶、大豆、小麥和牛肉對(duì)于該研究，制備了牛奶變應(yīng)原抽提物(目錄號(hào)3390JG，Miles，Inc.，Elkhart，Indiana)儲(chǔ)液的1-5生理鹽水(PBS)稀釋液，1∶20重量/體積；大豆變應(yīng)原抽提物(目錄號(hào)3597ED，Miles，Inc.，Elkhart，Indiana)儲(chǔ)液的1-10PBS稀釋液，1∶10重量/體積；小麥變應(yīng)原抽提物(目錄號(hào)3708ED，Miles，Inc.，Elkhart，Indiana)儲(chǔ)液的1-5PBS稀釋液，1∶10重量/體積。還制備了商品牛肉變應(yīng)原抽提物(目錄號(hào)3078JF，Miles Inc.，Elkhart，Indiana)的1-5 PBS稀釋液，1∶10重量/體積。
就牛奶而言，用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)處理0.1毫升稀釋液，包括培育該變應(yīng)原與4.8微克硫氧還蛋白、4.2微克NTR和1mM NADPH(最終體積0.2毫升)。還用0.1毫升稀釋的牛奶變應(yīng)原與1.5mM DTT和4.8微克硫氧還蛋白(最終體積0.2)制備了第二樣品。在所有的變應(yīng)原研究中，包括本實(shí)施例的研究和下文的研究，如前面對(duì)已轉(zhuǎn)化而過度生產(chǎn)那些蛋白質(zhì)的大腸桿菌所述的那樣，純化了硫氧還蛋白和NTR(de La Motte-Guery，F(xiàn).等(1991)Eur.J.Biochem.196287-294，和Russel，M.等(1988)J.Biol.Chem.2639015-9019)。對(duì)于大豆和小麥，將0.05毫升稀釋液與2.4微克硫氧還蛋白、2.1微克NTR和1mM NADPH一起培育。另外，制備了相同處理的PBS對(duì)照樣品。還用0.05毫升分離的變應(yīng)原稀釋液與1.5mM DTT和2.4微克硫氧還蛋白一起培育，制備了DTT處理的大豆和小麥樣品。對(duì)照和所有大豆和小麥樣品的最終體積是0.1毫升。室溫培育牛奶和小麥制備物25分鐘，37℃培育大豆制備物1小時(shí)25分鐘。對(duì)于牛肉，用0.05毫升稀釋液與2.4微克硫氧還蛋白、2.1微克NTR和1mM NADPH(最終體積0.1毫升)一起37℃溫育25分鐘。用相同方法但在室溫下處理另一0.05毫升樣品。溫育后，對(duì)于每種處理過的食物抽提物，制備了1毫升1×103-1×106或1×103-1×107的稀釋液。在30分鐘內(nèi)用稀釋的樣品測(cè)試。
實(shí)施例34用mBBr熒光標(biāo)記/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)還原食物變應(yīng)原和提高蛋白酶水解方法對(duì)于該研究，分別制備了實(shí)施例33所述的儲(chǔ)藏的牛奶、牛肉和小麥抽提物的1-2.5、1-5和1-1.5倍PBS稀釋液。在50微升這些稀釋液中加入2.4微克硫氧還蛋白、2.1微克NTR和1mM NADPH(最終體積0.1毫升)。對(duì)照由50微升稀釋的具體抽提物和50微升PBS組成。將制備物在室溫和37℃溫育25分鐘。溫育后，加入8微升80mM mBBr，繼續(xù)在室溫下反應(yīng)15分鐘。停止反應(yīng)，加入10微升100mMβ-巰基乙醇、10微升20％SDS和10微升50％甘油衍生過量mBBr。用先前所述的mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析樣品。結(jié)果顯示NTS在室溫和37℃下都能有效還原變應(yīng)原抽提物中的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)研究中，用NTS類似處理了實(shí)施例33中所述的大豆抽提物儲(chǔ)液的PBS稀釋液，用mBBr標(biāo)記/SDS-PAGE法的分析顯示，硫氧還蛋白也還原了大豆蛋白。然而當(dāng)大豆、牛奶、小麥、雞蛋和牛肉變應(yīng)原蛋白與谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶和NADPH共同培育時(shí)，這些被處理的變應(yīng)原蛋白極少或無還原。
類似的將商品稻變應(yīng)原抽提物(目錄號(hào)3549ED，Miles INc.，Elkhart，Indiana)的PBS稀釋液與NTS-起培育，并用mBBr/SDS-PAGE技術(shù)分析，顯示還原的硫氧還蛋白能還原稻變應(yīng)原蛋白。
在一獨(dú)立的研究中，還觀察到實(shí)施例33中所述的，已被NTS還原，并與胰蛋白酶進(jìn)一步培育的商品抽提物中的食物變應(yīng)原蛋白對(duì)蛋白酶水解的敏感性提高，高于未用NTS處理的對(duì)照。用mBBr/SDS-PAGE技術(shù)進(jìn)行還原分析。進(jìn)一步在該研究中，當(dāng)用2微克胰蛋白酶處理10微克NTS還原的純化的牛奶變應(yīng)原蛋白β-乳球蛋白(Sigma Chemical Co.)時(shí)，蛋白酶水解是100％，與之相比用相同胰蛋白酶處理的氧化的β-乳球蛋白僅50％。當(dāng)用2微克胰蛋白酶類似處理10微克另一種純化的牛奶變應(yīng)原，氧化的α-乳清蛋白(Sigma Chemical Co.)時(shí)，無可注意的蛋白酶水解。然而，用NTS還原的10微克純化的α-乳清蛋白被胰蛋白酶水解了80％。另外用0.8微克硫氧還蛋白和0.5mM DTT還原的10微克α-乳清蛋白被2微克胰蛋白酶100％水解。
實(shí)施例35卵清蛋白的還原從Sigma Chemical Co.購(gòu)得干燥的雞卵清。雞卵清中總蛋白質(zhì)的約80％是變應(yīng)原。將20毫克/毫升卵清溶液重新懸浮于PBS。由于不是所有的物質(zhì)都溶解，在14,000RPM離心2分鐘。將溶解的卵清蛋白質(zhì)用于用mBBr熒光標(biāo)記和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的還原研究。所用的處理是對(duì)照(無還原劑)NTS、DTT加硫氧還蛋白、還原的谷胱甘肽(GSH)和還原的谷胱甘肽/谷胱甘肽還原酶/NADPH。在PBS中用23微升20mg/ml卵清懸液的可溶性蛋白進(jìn)行反應(yīng)，最終體積為100微升。在NTS中，使用了7.5mM NADPH、2.4微克硫氧還蛋白和2.1微克NTR。當(dāng)用DTT還原硫氧還蛋白時(shí)，省去NADPH和NTR，將DTT加到1.5mM。所用的GSH濃度是3mM。對(duì)于GSH/GR/NADPH系統(tǒng)的還原，使用了3mM GSH、4微克GR和7.5mMNADPH?；旌衔镌谑覝叵屡嘤?小時(shí)。培育后，加入7微升80mM mBBr，反應(yīng)在室溫下繼續(xù)15分鐘。停止反應(yīng)，加入10微升100mM的巰基乙醇、10微升20％SDS和10微升50％甘油衍生過量的mBBr。然后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，NTS和DTT加硫氧還蛋白對(duì)于卵清蛋白(80％變應(yīng)原)的還原非常有效。GSH或GSH/GR/NADPH顯示與對(duì)照相同水平的還原，因此是一種卵清蛋白的無效還原劑。
實(shí)施例36變應(yīng)原性研究中動(dòng)物的致敏本研究中所用的動(dòng)物是特異質(zhì)犬，出身于產(chǎn)生高IgE的西班牙獵犬的近親交配群體的不同對(duì)同窩出生幼仔。
一只由其兄弟受精的近交IgE反應(yīng)性母狗生下了一窩9只幼仔(4只雄性，5只雌性)。在出生1日，對(duì)于牛奶、大豆和稻研究，將9只幼仔分成兩組5只幼仔的組I在右側(cè)腋窩皮下(SQ)注射1微克實(shí)施例33中所述的商品大豆抽提物的0.2毫升明礬溶液；4只幼仔的組II在右側(cè)腋窩SQ注射1微克商品干燥牛奶抽提物(實(shí)施例33所述)的0.2毫升鹽水和0.2毫升明礬溶液。全部9只幼仔在左側(cè)腋窩SQ接受了1微克儲(chǔ)液1∶10w/v稻變應(yīng)原抽提物(目錄號(hào)3549ED，Miles，Inc.Elkhart，Indiana)的0.2毫升明礬。
在3、7和11周齡，用0.5毫升活的減毒犬熱病-肝炎疫苗(Pitman-Moore，Washington’s Crossing，PA)在肩部SQ接種全部幼仔。接種2日和9日后，給予幼仔在新生期接受過的相同食物抗原，組I的5只犬接受1微克大豆抽提物溶于2毫升明礬，組II的4只犬接受1微克牛奶溶于0.2毫升明礬，全部9只犬分別在右側(cè)和左側(cè)腋窩SQ接受1微克稻抽提物溶于0.2毫升明礬。
在RAST試驗(yàn)中使用了125I-標(biāo)記的家兔抗-犬IgE血清(Frick，O.L.等(1983)Am.J.Vet.Res.44440-445)。如在標(biāo)準(zhǔn)RAST方案中，使溴化氰活化的濾紙片與100微克大豆、牛奶或稻抗原反應(yīng)(Wide，L.等(1967)Lancet21105-1107)。用非特異質(zhì)雜種幼犬的新生犬臍帶血清的合并物作為陰性對(duì)照或基線cpm。
撫育幼犬6周，并斷奶供應(yīng)常規(guī)Puppy Chow(Ralston-Purina Company，St.Louis，MO)，它包括致敏蛋白質(zhì)、大豆粕、干乳清和稻殼；它們每日喂食一次，無限制供應(yīng)水，在University of California，Davis，Animal Resources Services，School of Veterinary Medicine的獸醫(yī)學(xué)看護(hù)和監(jiān)督下。6個(gè)月后，用常規(guī)Field& Farm Dog Chow喂養(yǎng)。
在3-4月齡之間，當(dāng)發(fā)現(xiàn)幼犬對(duì)具體的食物抗原產(chǎn)生IgE抗體時(shí)，對(duì)一窩全部9只幼犬在清晨給予雙盲的，240毫升大豆或牛奶嬰兒配方，豆腐、稻米粥或香草味的Vivonex蛋白質(zhì)水解物(Norwich-Eaton Co.，Norwich，CT)。攻擊前和該日每隔2小時(shí)測(cè)量肚臍水平的周長(zhǎng)。由獸醫(yī)專家密切觀察它們瘙癢或皮疹和嘔吐的臨床癥狀、糞便的頻率和特征，咳嗽或呼吸困難和鼻涕。監(jiān)測(cè)它們的這些反應(yīng)癥狀4日。7日后再次給予攻擊食物。
該窩的全部9只幼犬體重增加并正常發(fā)育，沒有醫(yī)學(xué)問題。它們無腹瀉或其它胃腸道癥狀，除非用已致敏的食物攻擊它們。也未發(fā)生皮膚或呼吸道異常。對(duì)于接種或免疫也無不利的反應(yīng)。
每?jī)芍苋§o脈血樣跟蹤針對(duì)這3種食物蛋白的犬IgE-RAST。
對(duì)應(yīng)的牛奶(當(dāng)在4個(gè)月加強(qiáng)攻擊時(shí)，p＜0.5)和大豆(前3個(gè)月p＜0.0005)免疫的動(dòng)物比對(duì)照產(chǎn)生了顯著更多的IgE-抗-食物抗體。IgE-抗-食物抗體的平均滴度在5-10周時(shí)升高，達(dá)到平臺(tái)，然后在20-30周齡再次急劇升高。當(dāng)分別在食物中加入了大豆和牛奶時(shí)，大豆和牛奶免疫的動(dòng)物中出現(xiàn)了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的腹瀉和腹部腫脹反應(yīng)。
以類似上述方法的方法培養(yǎng)了另一組8只對(duì)牛奶、大豆、小麥和牛肉過敏的犬。產(chǎn)生高IgE的西班牙獵犬的所述近交群中另一窩的4只同窩幼犬右側(cè)腋窩SQ注射1微克實(shí)施例33中所述的各儲(chǔ)藏牛奶、大豆、小麥和牛肉變應(yīng)原抽提物。同窩的4只幼犬作為對(duì)照。還對(duì)全部8只幼犬左側(cè)腋窩皮下注射了1微克稻抽提物的0.2毫升明礬。如上所述接種幼犬，每次接種后2和9日后給予它們新生期接受的相同量的相同食物抗原。如上，以相同的時(shí)間表喂給它們含有合適致敏性蛋白的食物(如牛奶、大豆、牛肉和小麥)。對(duì)原先對(duì)大豆和牛奶過敏的動(dòng)物，這些免疫接種的犬比對(duì)照產(chǎn)生顯著更多的抗-特異性食物IgE抗體(包括小麥和牛肉抗體)。當(dāng)用含有小麥、牛肉、大豆或牛奶的食物攻擊時(shí)，免疫的動(dòng)物中出現(xiàn)了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的腹瀉和腹部腫脹反應(yīng)。
實(shí)施例37用還原的硫氧還蛋白處理的食物變應(yīng)原中變應(yīng)原性降低的皮試確定在實(shí)施例36所述的合適致敏犬(如用牛奶稀釋液注射的牛奶致敏犬)的腹部皮膚上，透皮注射實(shí)施例33中所述的硫氧還蛋白處理的食物變應(yīng)原稀釋液的各100毫升稀釋液。變應(yīng)原稀釋液注射前，用4毫升0.5％Evan藍(lán)染料注射入犬前肢靜脈。顯示變態(tài)反應(yīng)的犬在變應(yīng)原注射區(qū)域出現(xiàn)藍(lán)色的丘疹。出現(xiàn)10分鐘后測(cè)量丘疹的大小(長(zhǎng)度和寬度)。用各變應(yīng)原制劑一定濃度范圍注射后觀察到的丘疹大小和稀釋終點(diǎn)作為變應(yīng)原性指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白處理對(duì)于大豆的1×105稀釋液產(chǎn)生50％保護(hù)，對(duì)于牛奶3×104稀釋液和對(duì)于小麥1×106稀釋液產(chǎn)生完全保護(hù)，對(duì)于牛肉1×105稀釋液產(chǎn)生至少一部分保護(hù)(分別見
圖1、2、3、4和5)。
實(shí)施例38用還原的硫氧還蛋白處理的食物變應(yīng)原的變應(yīng)原性的喂食試驗(yàn)確定喂食前一周，用前面實(shí)施例中所述的商品變應(yīng)原性抽提物，如實(shí)施例36用合適的食物變應(yīng)原透皮皮膚測(cè)試了以實(shí)施例36所述方法致敏的犬。根據(jù)這些結(jié)果，將動(dòng)物分成“對(duì)照”和“硫氧還蛋白處理的”組。各組由具有互補(bǔ)敏感性的代表構(gòu)成，即對(duì)于各組選擇了相等數(shù)目的強(qiáng)、中和弱反應(yīng)者。除非另外說明，各組由3只動(dòng)物(每次實(shí)驗(yàn)6只動(dòng)物)組成。對(duì)于喂食攻擊3日前和5日后，使犬維持Hill’s處方飲食犬d/d飲食(Hill’s Division of Colgate Palmolive Co.，Topeka，Kansas)。觀察這段時(shí)間內(nèi)犬的臨床癥狀，如干嘔和嘔吐。另外，監(jiān)測(cè)糞便并評(píng)分，作為對(duì)測(cè)試食物的變應(yīng)性反應(yīng)的指標(biāo)。在變應(yīng)原性飲食攻擊3日前和3日后計(jì)數(shù)犬糞便次數(shù)，并將其堅(jiān)松度用數(shù)字表示1＝堅(jiān)硬，2＝柔軟，3＝過稀。然后將糞便次數(shù)與堅(jiān)松度因子相乘，計(jì)算出糞便的評(píng)分。作為對(duì)測(cè)試的食物變態(tài)反應(yīng)的指標(biāo)，將變應(yīng)原性飲食攻擊后得到的每日平均糞便評(píng)分減去攻擊之前的計(jì)算出各組(對(duì)照或硫氧還蛋白處理的)每日平均最終凈糞便評(píng)分。每日較高的平均凈糞便評(píng)分代表了更強(qiáng)的變態(tài)性反應(yīng)。
下文給出了制備和施給該飲食的方法。除非另外說明，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。
大豆將商品大豆配方(添加了鐵的Isomil，Ross Laboratories，Columbus，Ohio)1.026公斤溶于3升水中。將溶液分成1.925升的兩批，一批用作對(duì)照，另一批用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)如下處理。預(yù)培育含有45微摩爾NADPH、564微克的NADP-硫氧還蛋白還原酶(NTR)和1.125毫克硫氧還蛋白(全部溶于30mMTris-HCl緩沖液，pH7.9中)的混合物5分鐘，然后加到1.925升配方之一(因此稱為“硫氧還蛋白-處理的”批)中加入硫氧還蛋白系統(tǒng)后，恒定攪拌，繼續(xù)培育1小時(shí)。在對(duì)照批中加入等量緩沖液。培育后，將600毫升配方喂給指定組的3只犬。喂給動(dòng)物的部分等于培育前25.0克大豆蛋白。
小麥將未漂白的面粉1.5公斤加到一加侖的Waring攪拌器中的3升水中加熱到37℃?；旌?分鐘后，將面粉懸液均分成兩批，一批用作對(duì)照，另一批用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)如下處理預(yù)培育含有45微摩爾NADPH、564微克(NTR)和1.125毫克硫氧還蛋白(全部溶于30mM Tris-HCl緩沖液，pH7.9中)的混合物5分鐘，然后加到一批中(因此稱為“硫氧還蛋白-處理的”批)。將等量的緩沖液加到對(duì)照批中。兩批制劑都頻繁攪拌，37℃培育1小時(shí)。從各制劑中取出600毫升，與一份犬(15-3/4盎司)d/d，無小麥、基于稻/羊肉的狗食混合，并喂給指定批的3只犬。該部分相當(dāng)于25.0克小麥蛋白。在用8只犬的實(shí)驗(yàn)中，面粉增加到2.0公斤，方法中使用量相應(yīng)增加。
牛奶類似的將已用水重建的干燥CARNATION制劑與NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)一起培育。如前，3只犬接受未處理的牛奶，3只犬接受處理過的牛奶。犬接受的最終部分等價(jià)于10克牛奶蛋白。
結(jié)果所用的NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)各組分的水平顯著高于實(shí)施例15中所述生面團(tuán)研究中的。在該喂食研究中，初步試驗(yàn)表明需要更高水平的這些化合物來還原變應(yīng)原性蛋白，如mBBr/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法體外測(cè)定的那樣。下文表明了該飼料試驗(yàn)中，相對(duì)于烘烤試驗(yàn)中所用的量，對(duì)于各犬每克蛋白所用的NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)各組分的量
*標(biāo)出的量是相對(duì)于上述烘烤試驗(yàn)中使用的量，其中在每克面粉蛋白中加入了3微克硫氧還蛋白、1.5微克NTR和0.3微摩爾NADPH。在烘烤試驗(yàn)中，用約200克面粉或大約20克面粉蛋白烘烤面包。對(duì)于這些飼料實(shí)驗(yàn)，將食品制備物與NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)的組分在室溫下(牛奶和大豆)或37℃(小麥)一起培育1小時(shí)。
根據(jù)“床邊癥狀”(嘔吐和干嘔)和“糞便評(píng)分”(見圖6)，發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白處理降低了犬對(duì)大豆和小麥配方的變態(tài)性反應(yīng)。用NTS處理也降低了牛奶配方的變應(yīng)原性。應(yīng)注意雖然所用的硫氧還蛋白和NTR來自大腸桿菌，也可用其它來源，如酵母的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白h和m。
實(shí)施例39測(cè)定硫氧還蛋白處理的牛奶蛋白和Raw Cow’s牛奶提高的可消化性和下降的變應(yīng)原性幾種蛋白質(zhì)-α-乳清蛋白、血清白蛋白、酪蛋白，特別是β-乳球蛋白(BLG)導(dǎo)致牛奶過敏。
該實(shí)施例顯示，硫氧還蛋白選擇性和特異性的還原牛奶蛋白質(zhì)和變應(yīng)原的二硫鍵。一旦被還原，這些變應(yīng)原中最活躍的(BLG)不僅顯示變應(yīng)原性降低，還顯示可消化性驚人的提高。在硫氧還蛋白還原后，其它牛奶二硫鍵蛋白對(duì)胃蛋白酶的敏感性也在某種程度上增加了。
材料和方法變應(yīng)原來源從University of California at Davis的實(shí)驗(yàn)性農(nóng)場(chǎng)獲得了未加工的牛奶。從Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO購(gòu)得了純?chǔ)?乳球蛋白A和B，以及這兩種形式的80％混合物。
動(dòng)物使同一窩實(shí)施例36-38中使用的近交高IgE-產(chǎn)生特異質(zhì)犬的犬致敏，并在School of Veterinary Medicine，University of California，Davis的AnimalResources Service中喂養(yǎng)。挑選出生時(shí)就致敏的對(duì)過敏有遺傳傾向的犬，它們具有15年歷史的食物和花粉超敏反應(yīng)性。
化學(xué)藥品和酶從Sigma，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN和Biorad Laboratories，Hercules，CA獲得了十二烷基磺酸鈉/聚丙烯酰胺(SDS/PAGE)試劑。DTT購(gòu)自Boehringer Mannheim，一溴二滿(mBBr)購(gòu)自Calbiochem，San Diego，CA。從過度表達(dá)該蛋白的大腸桿菌菌株純化了硫氧還蛋白和NTR。用對(duì)于菠菜NTR所用的相同方法純化了菠菜葉子的谷胱甘肽還原酶。豬胃粘膜的胃蛋白酶、NADPH和其它生物化學(xué)試劑購(gòu)自Sigma。
特異質(zhì)犬的食物致敏在第1日，用1微克各小麥、牛奶和牛肉抽提物(Miles，Inc.，Elkhart，Indiana，如實(shí)施例33所述)的0.2毫升明礬皮下注射兩窩特異質(zhì)犬，稱為CGB和GCb的新生幼犬。用大豆抽提物(Miles Inc.如實(shí)施例33所述)加上這些相同的變應(yīng)原注射第三窩，稱為CBB。幼犬的致敏、測(cè)試和養(yǎng)護(hù)方法基本上和實(shí)施例36中描述的相同。
皮試皮試3分鐘前，各犬通過頭靜脈接受4-5毫升過濾的0.5％Evans藍(lán)染料溶液(等價(jià)于每公斤體重0.2毫升0.5％Evans藍(lán)染料)，來增強(qiáng)皮膚IgE抗體的評(píng)估。在腹部皮膚上透皮注射100微升各樣品的系列稀釋液建立滴度。15-20分鐘后，通過測(cè)量藍(lán)色丘疹反應(yīng)的大小(最大長(zhǎng)度和寬度)，來測(cè)定過敏反應(yīng)。測(cè)試的各動(dòng)物包括一合適陰性對(duì)照(生理鹽水稀釋的緩沖液)。用硫氧還蛋白、NTR、NADPH和胃蛋白酶單獨(dú)重復(fù)測(cè)試始終是陰性。
蛋白質(zhì)試驗(yàn)用Bradford法，使用牛γ球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定了蛋白質(zhì)濃度。用計(jì)算的16800的摩爾消光系數(shù)通過其278納米處的吸光度測(cè)定了純BLG的濃度(Gill，S.C.等(1989)Anal.Biochem.182319-326)。
蛋白質(zhì)建模
Brookhaven National Laboratory的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫提供了一個(gè)由Brownlow等以1.8埃分辨率確定的BLG結(jié)構(gòu)模型。(Brownlow，S.等(1997)“牛β-乳球蛋白在1.8分辨率-仍為謎樣的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalcin)”Structure 5481-495)。Swiss-Model程序建立了一個(gè)具有單突變C160S(部分還原)和雙突變C160S-C160S(完全還原)的蛋白質(zhì)模型(Peitsch，M.C.(1996)，“ProMod和Swiss-模型自動(dòng)化比較性蛋白質(zhì)建模的基于國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)的工具”，Biochem.Soc.Trans.24274-279)。用RasMol程序v2.6顯現(xiàn)了BLG的三維模型。
蛋白質(zhì)還原在100微升體積中用(i)NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)，含有5微升25mMNADPH、8微升0.3mg/ml大腸桿菌硫氧還蛋白(即2.4微克總硫氧還蛋白)和7微升O.3mg/ml大腸桿菌NTR；或(ii)NADP/谷胱甘肽系統(tǒng)(NGS)，含有5微升25mMNADPH、10微升30mM還原的谷胱甘肽(GSH)和15微升0.1mg/ml谷胱甘肽還原酶進(jìn)行了蛋白質(zhì)二硫鍵的還原。反應(yīng)在含有10微克純靶蛋白或50微克未加工過的牛奶的生理緩沖鹽水溶液(PBS；即10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、2.7mM KCl和137mMNaCl，pH7.4)中進(jìn)行。4℃過夜或37℃和55℃45分鐘培育反應(yīng)混合物。為了完成還原，在含有5微升1OOmM DTT的PBS中培育樣品，并煮沸5分鐘。還原的蛋白在凝膠上通過mBBr標(biāo)記和凝膠電泳而顯現(xiàn)。掃描凝膠確定還原程度。
胃蛋白酶試驗(yàn)在上述條件下，在4℃(得到完全還原形式)或55℃(得到部分還原形式)將BLG640微克或牛奶1毫克蛋白質(zhì)(如約30微升)和或不和硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)一起培育。然后在Astwood，J.D.等(1996)，“食物變應(yīng)原對(duì)體外消化的穩(wěn)定性”，Nature Biotechnol.141269-1273所述的200微升模擬的胃液(SGF)中處理BLG320微克或牛奶500微克蛋白。SGF由0.32％胃蛋白酶(w/v)和30mM NaCl構(gòu)成，用HCl調(diào)節(jié)到pH1.2(Board of Trustees(編)1995，人工胃液，TS.，2053頁，于UnitedStates Pharmacopeia 23 The National Formulary 18，United StatesPharmacopeial convention，Inc.Rockville，MD)。37℃溫育反應(yīng)混合物，并在溫育0、0.25、1、2、4、8、15、30和60分鐘后加入O.375倍體積的160mM Na2CO3(約pH7)中止反應(yīng)。然后對(duì)該蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行SDS-PAGE(15％凝膠)，并用考馬斯藍(lán)如下染色。如指出的，用皮試分析測(cè)定消化的樣品的變應(yīng)原性。
喂食攻擊對(duì)于每只犬，在100毫升水中進(jìn)行80％純BLG(一種A和B形式的混合物)的還原。加入104毫克NADPH、1毫克大腸桿菌硫氧還蛋白和1毫克大腸桿菌NTR的水相混合物，處理每克BLG。反應(yīng)在125rpm的振蕩器中37℃進(jìn)行45分鐘。樣品4℃儲(chǔ)藏過夜。次日，將未處理(對(duì)照)或處理的BLG2.5克與一罐12盎司的P/D食物(Hills)混合，并喂給犬。未受攻擊的動(dòng)物接受沒有BLG的狗食，而對(duì)照動(dòng)物接受具有未處理BLG的狗食。最初喂給犬1/4罐未處理的食物，引起胃酸流出。15分鐘后，分3次，每隔15分鐘喂給犬已混合了2.5克未處理或硫氧還蛋白處理的BLG的1/3罐狗食。在這些間隔中監(jiān)測(cè)犬，并評(píng)估其GI反應(yīng)。然后在下5個(gè)小時(shí)內(nèi)觀察犬，并每隔1小時(shí)記錄其反應(yīng)。
數(shù)據(jù)分析對(duì)喂食引起的嘔吐的時(shí)間、嘔吐量和流體性指定數(shù)字，來評(píng)估上述食物攻擊的犬的消化反應(yīng)。流體性無嘔吐＝0，固態(tài)嘔吐物＝1，液態(tài)嘔吐物＝2，液體和血液或膽汁嘔吐物＝3。體積無嘔吐物＝0，小量嘔吐物＝1，大量嘔吐物＝2。計(jì)時(shí)延遲嘔吐＝1，立即嘔吐＝2。
蛋白質(zhì)的mBBr標(biāo)記和分析巰基可以其熒光mBBr衍生物而觀察到。在各蛋白質(zhì)樣品中加入10微升100mM溶液。培育20分鐘后，加入10微升100mM 2-巰基乙醇、10微升20％SDS和20微升含有80％(v/v)甘油的SDS/PAGE樣品緩沖液和0.005％溴酚藍(lán)停止反應(yīng)。然后用SDS/PAGE(10-20％丙烯酰胺梯度)如下分離蛋白質(zhì)。電泳后，將凝膠置于12％三氯乙酸中固定1小時(shí)，然后在40％(v/v)甲醇和10％(v/v)乙酸中浸泡過夜或更長(zhǎng)，換液幾次除去過量mBBr。然后將脫色凝膠置于365納米紫外光下，目測(cè)熒光條帶。用(i)Polaroid照片(正片/負(fù)片Landfilm，55型)通過黃色Wratten明膠濾光片8號(hào)，曝光時(shí)間45秒，f4.5或(ii)NucleoTech Corporation的Nucleovision系統(tǒng)拍攝照片。
SDS/PAGE按照Laemmli，U.K.(1970)“在噬菌體T4頭裝配期間結(jié)構(gòu)蛋白的切割”，Nature227680-685制備了凝膠(10-20％丙烯酰胺梯度，1.5毫米厚度或15％丙烯酰胺，0.75毫米厚度)。電泳后，用0.01％考馬斯亮藍(lán)R-250的40％甲醇和10％乙酸溶液染色凝膠1小時(shí)，然后用20％乙醇和10％乙酸溶液脫色過夜。在脫色后用(i)Polaroid照相(曝光時(shí)間1/15秒，f7)或(ii)NucleoTech Corporation的Nucleovision系統(tǒng)拍照。
序列分析用SDS-PAGE(10-20％丙烯酰胺梯度，1.5mm厚度或15％丙烯酰胺，0.75mm厚度)分離作為mBBr衍生物的不同形式的BLG(氧化物，部分或全部還原的，10微克)。用凝膠內(nèi)消化法獲得含有cys殘基的肽，它將確定結(jié)構(gòu)特征(Hwang，B.J.等(1996)“從聚丙烯酰胺凝膠洗脫出的蛋白質(zhì)的內(nèi)部序列分析”，J.Chromatogr.B.Biomed.Appl.686165-175)。用作起始材料的干燥凝膠置于水中，使膨脹，并除去賽璐玢層。然后從重建的凝膠中切割下合適的BLG條帶。將各蛋白質(zhì)條帶切成1-2毫米小塊。簡(jiǎn)單說，將凝膠塊在速度蒸發(fā)器中脫水，重新以0.1M pH9的Tris緩沖液和pH9.0的0.05％SDS(含有0.03-0.05微克Lys-C內(nèi)肽酶(Wako))水合，并在30℃溫育過夜。用水抽提凝膠2小時(shí)2次，用70％乙腈/0.1％三氟乙酸(TFA)抽提2小時(shí)2次，洗脫肽。干燥合并的抽提物，溶于最小體積6M的胍HCl-Tris，pH8.2中。然后用二硫蘇糖醇(DTT)還原抽提的肽，并用碘乙酰胺烷基化。反應(yīng)后，將混合物用水稀釋4-X，并通過離心除去還原的十二烷基磺酸胍沉淀。用胰蛋白酶在稀釋的反應(yīng)混合物中進(jìn)行溶液內(nèi)消化，以完全消化。用C18微孔柱(1mm×15cm，VYDAC)，使用Applied Biosystems 172HPLC系統(tǒng)純化了肽。在樣品注入后，用95％溶劑A(0.1％TFA溶于水)/5％溶劑B(70乙腈/0/075％TFA)洗滌該柱10分鐘，流速為80微升/分鐘。用5-70％溶劑B梯度以90分鐘洗脫得到肽。用ABI 477或470A測(cè)序儀和串聯(lián)HPLC鑒定乙內(nèi)酰苯硫脲(thenylthiohydratoin，PTH)氨基酸對(duì)純化的肽進(jìn)行測(cè)序。如下所示的分離了含有Cys160或Cys190的肽。完全氧化的蛋白質(zhì)的二硫鍵對(duì)應(yīng)于Cys106-Cys119和Cys60-Cys160。為了鑒定與部分或完全還原形式有關(guān)的二硫鍵，分離了對(duì)各形式獨(dú)特的胰蛋白酶肽。部分和完全還原的形式都顯示以下肽-Leu149-Ser-Phe-Asn-Pro-Thr-Gln-Leu-Glu-Glu-Gln-Cys160-His-Ile162。完全還原的蛋白質(zhì)還顯示了以下的肽-Tyr102-Leu-Leu-Phe-Cys106-Met-Glu-Asn-Ser-Ala-Glu-Pro-Glu-Gln-Ser-Leu-Ala-Cys119-Gln-Cys121-Leu-Val-。
結(jié)果硫氧還蛋白系統(tǒng)對(duì)牛奶蛋白質(zhì)的還原硫氧還蛋白對(duì)于牛奶中最多的二硫鍵蛋白，即BLG的還原是有效的。為此，在用含有NADPH、NTR和硫氧還蛋白的NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)處理后，監(jiān)測(cè)純BLG(A和B形式)的氧化還原狀態(tài)。如上所述，將樣品與NTS一起溫育，然后用一溴二滿(mBBr)/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法分析。在此，如前所述，用mBBr衍生并用SDS-PAGE分離的靶蛋白還原(-SH)形式，當(dāng)用紫外光觀察時(shí)呈現(xiàn)一條熒光條帶。發(fā)現(xiàn)如前面實(shí)施例中用含有分子內(nèi)二硫鍵的蛋白質(zhì)廣譜所看到的那樣，純BLG的A和B形式被硫氧還蛋白活躍的還原。當(dāng)用于牛奶時(shí)，硫氧還蛋白不僅還原BLG還還原幾種其它蛋白質(zhì)，包括α-乳清蛋白，如圖7凝膠所用的SDS/PAGE/mBBr標(biāo)記法所測(cè)定。對(duì)于該凝膠，在所有泳道中加入50微克未加工過的牛奶的PBS溶液。其它各泳道的變量是泳道1對(duì)照，4℃，無添加；泳道2，NTS，55℃；泳道3，NTS，4℃；泳道4，NGS，55℃；泳道5，NGS，4℃；泳道6，5mM DTT，100℃，5分鐘；泳道7與泳道6相同，除了用考馬斯藍(lán)染色。注意過量的NADPH、NTR和硫氧還蛋白將靶牛奶蛋白在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中維持于還原狀態(tài)中。在主要(24kDa)酪蛋白組分(α和β)前面泳動(dòng)的小條帶是κ-酪蛋白。
發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)還原有一種有趣而且有用的作用。當(dāng)如圖7所示在55℃處理(45分鐘)時(shí)，BLG被還原但它在凝膠中的遷移率僅輕微改變。相反，當(dāng)在4℃溫育(17小時(shí))時(shí)，大多數(shù)BLG的遷移率顯著下降，呈現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)形式(泳道3，圖7)。凝膠掃描對(duì)還原程度的評(píng)估揭示，BLG在55℃時(shí)被部分還原，在4℃時(shí)被完全還原。將BLG的已知結(jié)構(gòu)與部分和完全還原形式的胰蛋白酶水解肽的氨基酸序列比較，得到關(guān)于該還原性質(zhì)的進(jìn)一步信息。
已知BLG含有兩個(gè)二硫鍵，兩者都是分子內(nèi)(見圖8)一個(gè)在表面上可清楚的接觸，位于靠近C-末端(Cys66-Cys160)，而另一個(gè)靠近核心，位于兩個(gè)β-折疊之間(Cys160-Cys119或可能是Cys106-Cys121)。序列分析證實(shí)暴露的二硫鍵(Cys66-Cys160)在55℃被還原(部分還原形式)，這個(gè)二硫鍵和隱藏的二硫鍵(Cys160-Cys119或Cys106-Cys121)都在4℃被還原(完全還原形式)(見材料和方法)。改變pH也能實(shí)現(xiàn)BLG的不同還原。pH6.8時(shí)還原僅產(chǎn)生部分還原形式，而在pH8.0時(shí)觀察到部分和完全還原形式的混合物(都在37℃)(數(shù)據(jù)未顯示)。該結(jié)果證實(shí)了他人的發(fā)現(xiàn)，即顯示BLG在高于中性的pH值時(shí)是不穩(wěn)定的(Tanford，C.等(1959)“β-乳球蛋白在pH7.5時(shí)的轉(zhuǎn)化”Biochemistry 814032-4036)并在高于40℃的溫度上經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)換(Qi，X.L.等(1997)，“溫度對(duì)β-乳球蛋白在pH6.7時(shí)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用，用CD和IR光譜測(cè)定熔球假說的一種試驗(yàn)”Biochem.J.324341-346)。顯然，當(dāng)僅在不含緩沖液的未處理牛奶中加入NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)的組分時(shí)，可獲得如圖7所示的BLG的相同還原結(jié)果。另外，當(dāng)在空氣中儲(chǔ)藏在4℃時(shí)，該不含緩沖液的處理過的牛奶中的BLG在2天內(nèi)保持還原。
如圖7凝膠的泳道4和5中可見，被NADPH和谷胱甘肽還原酶維持在還原態(tài)的一硫醇谷胱甘肽也還原了BLG，并在某種程度上還原了其它牛奶蛋白，但效力比NTS低。其它二硫鍵還原劑，二硫蘇糖醇和硫辛酸也是有效的，但如前面實(shí)施例對(duì)于毒液神經(jīng)毒素所述的那樣僅當(dāng)與硫氧還蛋白聯(lián)合時(shí)才有效(數(shù)據(jù)未顯示)。
用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化牛奶蛋白如實(shí)施例19和29所示，含有分子內(nèi)二硫鍵的小蛋白質(zhì)(如胰蛋白酶抑制蛋白、毒液神經(jīng)毒素)的胰蛋白酶敏感性在被硫氧還蛋白還原后急劇提高。類似的，觀察到BLG符合該模式，即硫氧還蛋白還原的BLG對(duì)胰蛋白酶消化高度敏感，而氧化的BLG(即純的、未處理的)有抗性(見實(shí)施例34)。在該實(shí)施例中用純BLG和經(jīng)過人工胃液處理的牛奶(如Astwood，J.D.等，見上)獲得了相似結(jié)果。當(dāng)用SDS-PAGE分離并用考馬斯藍(lán)染色時(shí)，發(fā)現(xiàn)BLG被胃蛋白酶消化，但僅在被硫氧還蛋白還原后(見圖9)。圖9顯示了用微型SDS/PAGE和考馬斯藍(lán)染色測(cè)定的氧化的和還原的BLG的消化。所有均與SGF一起37℃培育。圖9中凝膠的其它變量是泳道1，BLG，SGF，0分鐘；泳道2，BLG，SGF，60分鐘；泳道3，55℃NTS還原的BLG，SGF，0分鐘；泳道4，55℃被NTS還原的BLG，SGF，60分鐘；泳道5，還原的BLG，4℃，SGF，0分鐘；泳道6，還原的BLG，55℃，SGF，60分鐘；泳道7，SGF；泳道8，BLG。如圖9所見，敏感性的差異是驚人的。
發(fā)現(xiàn)牛奶中氧化的BLG對(duì)消化至少能抵抗60分鐘，而硫氧還蛋白還原形式在60秒鐘內(nèi)被消化(見
圖10A-10C)。
圖10A、10B和10C描述了用微型SDS/PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色測(cè)定的，時(shí)間對(duì)硫氧還蛋白還原后用PBS緩沖的牛奶消化的作用。樣品2-10含有13.5微升人工胃液混合物，而樣品3-10含有50微克牛奶蛋白。培育0、0.25、1、2、4、8、15、30、60分鐘后通過中和停止消化，將等份加到
圖10A、10B和10C中凝膠的各合適泳道中。
圖10A凝膠的其它變量是緩沖牛奶對(duì)照；
圖10B凝膠是緩沖牛奶，NTS，55℃；
圖10C凝膠是緩沖牛奶，NTS，4℃。單個(gè)二硫鍵的還原是充分的。BLG的部分(55℃)和完全(4℃)形式顯示在胃蛋白酶敏感性上沒有差異(比較
圖10B和10C)。顯然，即使被硫氧還蛋白部分還原，谷胱甘肽處理的樣品對(duì)于人工胃液的消化是不敏感的(數(shù)據(jù)未顯示)。雖然硫氧還蛋白還原在某種程度上提高了α-乳清蛋白和κ-酪蛋白的敏感性，發(fā)現(xiàn)不論是純的還是在牛奶中的BLG是唯一的不經(jīng)硫氧還蛋白還原就不被消化的蛋白質(zhì)(見圖7、9和10A-10C)。
還原和消化的牛奶蛋白的變應(yīng)原狀態(tài)用犬模型皮膚試驗(yàn)比較牛奶主要蛋白質(zhì)(酪蛋白、α-乳清蛋白、BSA、BLG)的變應(yīng)原性揭示，BLG是牛奶的主要變應(yīng)原，負(fù)責(zé)產(chǎn)生80％丘疹的活性。另外，當(dāng)用硫氧還蛋白系統(tǒng)處理時(shí)，牛奶和BLG都顯示引起變態(tài)反應(yīng)的能力下降。因此，與測(cè)試變應(yīng)原性的前述實(shí)施例的結(jié)果相似，經(jīng)處理，牛奶的變應(yīng)原性下降了10-300倍，這取決于測(cè)試的犬的敏感性(見
圖11A和11B)。
圖11A和11B中的圖比較了兩只敏感性不同的犬對(duì)未處理牛奶變應(yīng)原皮膚測(cè)試反應(yīng)與硫氧還蛋白相關(guān)的變化。如
圖11A和11B中所示，透皮注射100微升牛奶的PBS溶液，通過所引起的丘疹面積(平方毫米)確定發(fā)生了I型超敏反應(yīng)。該溶液用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS，4℃)預(yù)處理或未處理(對(duì)照)。顯示了兩只犬的反應(yīng)，說明盡管敏感性不同，硫氧還蛋白處理在兩種情況下都改變了變應(yīng)原性(即輕微(
圖11B)和高度(11A)敏感動(dòng)物)。發(fā)現(xiàn)PBS/甘油對(duì)照和NTS對(duì)于各犬都是陰性的。另外，用顯示不同敏感性的許多犬進(jìn)行的試驗(yàn)揭示，純的或牛奶中的BLG的部分和完全還原形式的變應(yīng)原性中沒有一致性差異(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，該皮膚試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示硫氧還蛋白的還原改變了表位可接近性，從而降低了BLG和可能的其它牛奶蛋白的變應(yīng)原性。
純BLG顯示與牛奶相似的變態(tài)反應(yīng)(與
圖12A和12B中的氧化和還原的0時(shí)刻樣品比較)。在
圖12A和12B中，氧化的“0”分鐘和還原的“0”分鐘直方圖代表消化處理前的樣品，氧化60分鐘和還原60分鐘的直方圖代表用含胃蛋白酶的SGF處理后的樣品。透皮注射100微升用NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)(NTS)(還原的)預(yù)處理的或未處理(氧化的對(duì)照)的經(jīng)消化并中和的BLG(
圖12A)或牛奶(
圖12B)，通過所引起的皮膚丘疹面積(平方毫米)觀察到發(fā)生了I型超敏反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)對(duì)所有測(cè)試的犬中和的SGF對(duì)照均是陰性。另外，皮膚試驗(yàn)顯示純的BLG A和B形式在硫氧還蛋白對(duì)變應(yīng)原性的作用上無差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
用BLG和牛奶進(jìn)行的皮膚試驗(yàn)揭示，胃蛋白酶消化幾乎完全消除了這兩種制備物的變應(yīng)原性(見
圖12A和12B)。根據(jù)皮膚試驗(yàn)，當(dāng)消化與還原聯(lián)合時(shí)，變態(tài)反應(yīng)下降了300-1000倍。另外，消化樣品的變應(yīng)原性在高度和中度敏感的犬中下降到邊緣水平。
這些結(jié)果與硫氧還蛋白的還原(1)改變完整蛋白質(zhì)表位的可接近性，從而在大部分動(dòng)物中降低了其變應(yīng)原性，和(2)賦予穩(wěn)定的變應(yīng)原對(duì)胃蛋白酶消化的敏感性，如BLG，從而幾乎完全喪失其變應(yīng)原性的結(jié)論一致(見
圖13和14)。
最后，還發(fā)現(xiàn)當(dāng)被NTS系統(tǒng)還原時(shí)，α-乳清蛋白和BLG可被胰蛋白酶消化(見實(shí)施例34)。這些結(jié)果與本實(shí)施例用胃蛋白酶獲得的結(jié)果相結(jié)合，證實(shí)了硫氧還蛋白使BLG對(duì)蛋白酶敏感的能力。
特異質(zhì)犬的喂食試驗(yàn)導(dǎo)致嘔吐和腹瀉的胃腸道不適是伴隨攝取食物變應(yīng)原和食物蛋白不消化性的癥狀。另外，這些癥狀的嚴(yán)重性提供了變應(yīng)原強(qiáng)度的量度，它補(bǔ)充了皮膚試驗(yàn)。為了獲得胃腸道反應(yīng)的證據(jù)，給過敏性犬的食物添加BLG。如下文表VII列出的結(jié)果所示，攝取了含有2.5克還原BLG(2.5克BLG對(duì)應(yīng)于3/4升牛奶)的食物的狗顯示嘔吐程度顯著降低。重復(fù)喂食試驗(yàn)表明，平均約70％的胃反流消失。很明顯，在一組用處理過或未處理的BLG喂食的犬中觀察到該模式。在每罐喂給每只犬的食物中，將BLG從表VIII中使用的2.5克減少到1.25克，觀察到有關(guān)的胃腸道不適反應(yīng)呈類似的減輕(數(shù)據(jù)未顯示)。這些觀察補(bǔ)充了上文討論的皮膚試驗(yàn)結(jié)果，顯示粘膜淋巴組織對(duì)變應(yīng)原的識(shí)別因硫氧還蛋白處理而改變。
表XVIII用未處理或硫氧還蛋白處理的β-乳球蛋白喂食的犬的變態(tài)反應(yīng)
*引起嘔吐的質(zhì)量和流動(dòng)性的量度用硫氧還蛋白處理的或未處理的(對(duì)照)BLG2.5克，與一罐狗食混合測(cè)量上胃腸道指標(biāo)。在兩次獨(dú)立的喂食實(shí)驗(yàn)A和B后進(jìn)行指標(biāo)計(jì)算。上胃腸道指標(biāo)引用為無嘔吐物＝0、少量嘔吐物＝1、大量嘔吐物＝2、固態(tài)嘔吐物＝1、液態(tài)嘔吐物＝2、具有血液和膽汁的液態(tài)嘔吐物＝3，延遲的嘔吐＝1和立即嘔吐＝2。
討論在該實(shí)施例中，發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白可特異性還原BLG(一種主要牛奶變應(yīng)原)中的分子內(nèi)二硫鍵。根據(jù)情況而定，NADPH和NTR還原的硫氧還蛋白，不論用純的蛋白或牛奶分析，還原了BLG的一個(gè)或兩個(gè)二硫鍵。在結(jié)構(gòu)模型的分子水平上可見通過皮膚試驗(yàn)和喂食攻擊實(shí)驗(yàn)性揭示了表位分布的改變(Peitsch，M.C.(1996)見上)。當(dāng)用計(jì)算機(jī)模型通過定點(diǎn)誘變打斷BLG(Cys66-Cys160)的暴露二硫鍵時(shí)，125Thr-135Lys表位(Kaminogawa，S.等(1989)，“作為監(jiān)測(cè)牛β-乳球蛋白變性過程的探針的單克隆抗體”，Biochemica et Biophisica Acta 99850-56)不改變，它的位置附近發(fā)生改變，而該表位距兩個(gè)二硫鍵(8Lys-19Trp)有一定距離(見
圖13和14)。誘變埋藏的二硫鍵(Cys106-Cys119或可能是Cys106-Cys121)不會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步改變?cè)摫砦坏奈恢谩Ｓ萌薆LG表位制備的模型進(jìn)行了類似觀察(Ball，G.等(1994)“人IgE結(jié)合識(shí)別的牛β-乳球蛋白的主要連續(xù)性變應(yīng)原性表位”，Clinicaland Experimental Allergy 24758-764)。本結(jié)果提示，硫氧還蛋白的還原以兩種方法降低了靶蛋白變應(yīng)原的變應(yīng)原性。還原導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，限制了表位的可接近性并提高了可消化性。用這種方法，降低了變應(yīng)原的強(qiáng)度，另外還能更迅速的在胃腸道中被消除。
實(shí)施例40胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)還原的麥膠蛋白的消化調(diào)查了如實(shí)施例9和10所述的小麥面粉乙醇抽提物中麥膠蛋白組分的蛋白酶敏感性。如前面實(shí)施例10中所示，麥膠蛋白含有可被硫氧還蛋白特異性還原的分子內(nèi)二硫鍵。麥膠蛋白也是小麥中的主要食物變應(yīng)原。Buchanan，B.B.等，(1997)，“對(duì)小麥變態(tài)反應(yīng)的硫氧還蛋白相關(guān)的改變”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA945372-5377。硫氧還蛋白本身可被NADPH和NADP-硫氧還蛋白還原酶酶促還原，或被二硫蘇糖醇(DTT)化學(xué)還原。對(duì)于該例子，將分離的麥膠蛋白(1.04mg/ml)的等份(50微升)與或不與硫氧還蛋白(1.0微克)一起培育，在存在或不存在1mM DTT下，pH7.5的Tris-HCl緩沖液中還原1小時(shí)。在培育結(jié)束時(shí)，在各樣品中加入5微升Sigma的胰蛋白酶(1毫克/毫升)，使樣品30℃再消化1小時(shí)。用PMSF(苯甲基磺酰氟(2微升，100mM))終止各樣品的消化。與SDS(10微升10％)和甘油(15微升50％)混合后，用SDS-PAGE分析樣品。電泳后，用考馬斯藍(lán)染色15％凝膠，并用甲醇和乙酸脫色。蛋白質(zhì)條帶的分析證明，麥膠蛋白在氧化(未處理)狀態(tài)下對(duì)消化是穩(wěn)定的，但在硫氧還蛋白還原后則被降解成低分子量組分。當(dāng)處理麥膠蛋白等份，并用胃蛋白酶代替實(shí)施例39中的胰蛋白酶消化時(shí)，獲得相似結(jié)果。
該實(shí)施例和實(shí)施例34和39顯示，硫氧還蛋白還原變應(yīng)原的結(jié)果是對(duì)蛋白酶敏感性的驚人提高。因此，雖然麥膠蛋白和BLG的氧化形式對(duì)于胃蛋白酶有抗性，其還原形式則是高度敏感并可被輕易消化。小麥面粉中天然硫氧還蛋白的平均濃度是約0.01％(Johnson，T.C.等(1987)，“小麥種子硫氧還蛋白系統(tǒng)對(duì)嘌呤硫堇素的還原和在氧化還原控制中作為第二硫醇信使的可能功能”，Plant Physiol.85446-451)。這是每公斤面粉或面包100毫克-200毫克，每100克面粉約2毫克硫氧還蛋白。然而，面粉中天然存在的硫氧還蛋白上限可能是每克食物蛋白約2毫克。例如，含有更高濃度的已用硫氧還蛋白還原劑處理的硫氧還蛋白的面包將是變應(yīng)原性較低，而且更易消化的面包。用硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原劑處理的食物蛋白對(duì)胃蛋白酶敏感性提高(也通過BLG建模在分子水平上觀察到)，可能導(dǎo)致攝入的BLG在胃腸道中更迅速的被加工。如果延伸到全體動(dòng)物，預(yù)計(jì)用硫氧還蛋白系統(tǒng)處理牛奶、小麥和其它食物產(chǎn)品，將減弱變應(yīng)原性和不可消化性的長(zhǎng)期作用—顯著的水腫和腹瀉。
可通過在巴氏消毒法(即55℃45分鐘，或4℃至少10小時(shí))之前或之后用NTS處理牛奶，實(shí)現(xiàn)與牛奶有關(guān)的硫氧還蛋白技術(shù)的商業(yè)化。這些應(yīng)用可包括以下1.將液體形式的硫氧還蛋白系統(tǒng)加到未加工的牛奶或乳清中，并將還原與巴氏消毒法相聯(lián)合。
2.使未加工的或巴氏消毒牛奶通過結(jié)合有還原的硫氧還蛋白的柱?？稍诩优Ｄ糖坝肗ADPH和NTR還原硫氧還蛋白。也可能采用二硫蘇糖醇還原硫氧還蛋白，二硫蘇糖醇在加牛奶前可通過洗滌柱而除去。
3.在非氧化條件下儲(chǔ)藏NTS處理的牛奶，通過使用例如完全或真空容器來提高其有效期。
4.巴氏消毒后在牛奶中加入硫氧還蛋白和NTR，并在使用前加入固體形式的NADPH。
5.用硫氧還蛋白處理后，用酶(如胰蛋白酶)對(duì)牛奶進(jìn)行有限的蛋白酶水解消化。該產(chǎn)品可用于在對(duì)牛奶敏感的人中誘導(dǎo)耐受。
實(shí)施例41測(cè)定硫氧還蛋白處理的豚草花粉蛋白降低的變應(yīng)原性和提高的可消化性硫氧還蛋白系統(tǒng)還原花粉蛋白用Bradford試驗(yàn)，采用牛γ-球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品分析了購(gòu)自Bayer Inc.的大豚草變應(yīng)原抽提物(Wong，J.H.等(1995)“硫氧還蛋白和種子蛋白”，MethordsEnzymol 252228-240)。用1.25mM NADPH、1.7微克大腸桿菌NADP/硫氧還蛋白還原酶(NTR)和1.7微克大腸桿菌硫氧還蛋白(Trx)37℃在30mM生理緩沖鹽水(PBS，10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、2.7mM KCl和137mM NaCl，pH7.4)中(最終體積為100微升)培育45分鐘，還原了該蛋白質(zhì)100微克。用如上所述和Wong等(ibid.)所述的SDS-PAGE/一溴二滿法確定了還原程度。在紫外光下觀察凝膠。
皮膚試驗(yàn)。用變應(yīng)性劑量皮膚試驗(yàn)來測(cè)量I型超敏反應(yīng)的方法基本上與前述的(見實(shí)施例36、37和39)方法相同。簡(jiǎn)單說，在皮膚測(cè)試5分鐘前靜脈注射0.5％Evans藍(lán)染料(0.2毫升/公斤)。以半對(duì)數(shù)稀釋度在側(cè)腹皮膚上透皮注射0.1毫升等份的花粉變應(yīng)原抽提液。讓同一有經(jīng)驗(yàn)的不知情觀察者對(duì)每個(gè)藍(lán)色斑點(diǎn)的垂直直徑評(píng)分，盲法對(duì)皮膚測(cè)試讀數(shù)。對(duì)于各測(cè)試的動(dòng)物包括合適的陰性對(duì)照(用PBS稀釋)。
人工胃液對(duì)花粉蛋白的消化。使花粉蛋白650微克或純Amb t V100微克在100微升PBS緩沖液中，在37℃與或不與2.4微克Trx、4.2微克NTR和2.5mM NADPH的混合物一起培育。然后，在100微升如Astwood等所述的(Astwood，J.D.等(1996)“食物變應(yīng)原對(duì)體外消化的穩(wěn)定性”，Nature Biotechnology 141269-1273)人工胃液(SGF)中消化含有325微克花粉蛋白或50微克Amb t V的50微升各反應(yīng)混合物。SGF含有0.32％豬胃蛋白酶(w/v)和30mM NaCl，用HCl調(diào)節(jié)到pH1.2。37℃培育該消化混合物，在0、0.25、1、2、4、8、15或60分鐘用0.375體積的160mMNa2CO3停止，得到中性的pH。用SDS-PAGE。并用指定的皮膚試驗(yàn)分析蛋白質(zhì)。
Amb t V純化。通過改進(jìn)Roebber等1985的方法(Roebber，M.等(1985)“Amb.t.V(Ra5G)，一種大豚草花粉Ra5同源物的免疫化學(xué)和遺傳學(xué)研究”，J.Immunol.1343062-9)實(shí)現(xiàn)了純化。簡(jiǎn)單說，將100克未脫脂花粉(GreerLaboratories)懸浮在1升緩沖液[50mM Tris-HCl pH7.4，含1μM苯甲基磺酰氟(PMSF)和1mM EDTA-Na]中，室溫溫和攪拌30分鐘。然后將該混合物4C 3,840xg離心15分鐘。將收集的上清液組分濾過玻璃棉，然后濾過Whatman定量濾紙兩次。不再使用含有花粉顆粒的沉淀。通過用等體積的石油醚抽提，并11,300xg離心10分鐘除去過濾的上清液組分中大量的脂肪。石油醚步驟重復(fù)4次。通過Amicon YM-3膜濃縮得到的澄清溶液，并在Sephadex G-50F凝膠過濾柱(2.1×90cm)上分離，該柱用20mM Tris-HCl pH7.5(補(bǔ)充了200mM NaCl)平衡并洗脫。用15％SDS-PAGE分析含有5kDa蛋白質(zhì)的組分，合并這些組分并用YM-3膜濃縮。在濃縮蛋白中加入硫酸銨，使最終濃度為2.6M。然后將該蛋白混合物在1毫升HiTrap苯基瓊脂糖柱(Pharmacia)上級(jí)分，用200mM pH7.0的磷酸緩沖液平衡，并用50毫升含遞減梯度2.5-0M的硫酸銨的相同緩沖液洗脫。在大約0.8M的單峰中回收到純Amb t V。最后，以5mM磷酸鉀緩沖液pH7.0透析該純蛋白質(zhì)，并儲(chǔ)藏在-70℃進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。用摩爾消光系數(shù)5800定量蛋白質(zhì)濃度。
數(shù)據(jù)分析。用配對(duì)的單尾t-檢驗(yàn)測(cè)定了顯示與硫氧還蛋白相關(guān)的花粉變應(yīng)原緩解的皮膚試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。針對(duì)另一個(gè)假設(shè)，即處理導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)減弱，測(cè)試了零假設(shè)，其假定未處理的花粉蛋白引起的丘疹面積與硫氧還蛋白處理的引起的無差異。完成了各稀釋系列(0.07-219納克變應(yīng)原)的t檢驗(yàn)，所有敏感犬(df≈8)均在0.05顯著水平。
結(jié)果和討論花粉蛋白的還原。如
圖15所示，硫氧還蛋白活躍的還原了幾種蛋白質(zhì)，即5kDa的Amb t V，和12、14和35kDa的未鑒定蛋白質(zhì)。另外還原程度隨反應(yīng)溫度而變化。如
圖15所示，還原在37℃或更高溫度最有效。就Amb t V而言，結(jié)果表明多個(gè)二硫鍵(可能全部4個(gè))在37℃和55℃被還原，而在4℃還原的數(shù)目較少。平行的，還觀察到硫氧還蛋白的還原驚人的影響到所述的Amb t V的高熱穩(wěn)定性(Baer，H.等(1980)，“矮豚草花粉抽提物的熱穩(wěn)定性和皮膚反應(yīng)中各變應(yīng)原的重要性”，J.Allergy Clin.Immunol.66281-5)。在硫氧還蛋白還原后發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀(數(shù)據(jù)未顯示)。
硫氧還蛋白還原對(duì)變應(yīng)原性的減弱。如下面的表XIX所示，硫氧還蛋白還原有效減弱了皮試反應(yīng)。雖然比用牛奶發(fā)現(xiàn)的不明顯(見實(shí)施例39)，花粉粗抽提物的變應(yīng)原性與硫氧還蛋白相關(guān)的下降范圍在3-33倍之間。另外，根據(jù)t檢驗(yàn)分析，這種減弱是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
表XIX對(duì)硫氧還蛋白減弱對(duì)花粉變應(yīng)原的皮膚試驗(yàn)反應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。配對(duì)一尾t檢驗(yàn)意味著P值等于或小于0.05。
硫氧還蛋白還原對(duì)花粉蛋白對(duì)胃蛋白酶敏感性的作用。為了測(cè)定硫氧還蛋白的還原是否提高了花粉變應(yīng)原的可消化性，用SGF(Astwood，J.D.等(1996)“食物變應(yīng)原對(duì)體外消化的穩(wěn)定性”，Nature Biotechnology 141269-1273，12)處理純化的Amb t V蛋白的氧化和還原形式。首先，發(fā)現(xiàn)與β-乳球蛋白一樣，Amb t V僅在被硫氧還蛋白系統(tǒng)還原時(shí)才被消化。氧化的該蛋白能抵抗胃蛋白酶達(dá)60分鐘，與其在
圖16A中顯示的變應(yīng)原性質(zhì)一致(Astwood，J.D.(1996)，見上)。相反，如
圖16B所示，硫氧還蛋白還原的蛋白質(zhì)在2分鐘后幾乎完全消失。通過用8只狗，用粗花粉抽提物獲得的皮膚試驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證了對(duì)胃蛋白酶的這種敏感性。觀察到氧化的花粉抽提物引起的皮試反應(yīng)在這些狗的4只中消化后仍保留(代表的是稱為6CGB1的狗，見實(shí)施例39“特異質(zhì)犬的食物致敏”)，表明如
圖17A中所示，這些變應(yīng)原是胃蛋白酶抗性的。相反，當(dāng)制備物被硫氧還蛋白還原時(shí)，在這些犬中變態(tài)反應(yīng)顯著下降。這肯定了變應(yīng)原是二硫鍵蛋白，并與蛋白質(zhì)被消化的凝膠資料相一致。另4只狗(代表的是
圖17B中稱為5CBB3的狗)顯示當(dāng)氧化(未處理)的蛋白質(zhì)被SGF消化時(shí)，反應(yīng)顯著下降-即從一開始活性最高的變應(yīng)原就被消化。該發(fā)現(xiàn)表明第二組對(duì)二硫蛋白較不敏感。
圖18中的數(shù)據(jù)提供了證據(jù)，即未處理的和硫氧還蛋白處理的制備物的這種不同反應(yīng)在于具體動(dòng)物對(duì)二硫鍵蛋白變應(yīng)原的敏感性。如
圖17A和17B中純Amb tV所見，粗制備物中二硫蛋白(包括Amb t V)對(duì)胃蛋白酶具有強(qiáng)烈抗性，除非被NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)還原(
圖18A和18B)。另外，還原溫度是重要的；隨著還原溫度從4℃上升到37℃，到55℃，消化逐漸增加。沒有還原時(shí)，5-20kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)在與SGF溫育60分鐘后也不被消化。
上述結(jié)果與牛奶中主要變應(yīng)原β-乳球蛋白是二硫蛋白(del Val，G.等(1999)，“硫氧還蛋白處理提高了牛奶的可消化性并降低了變應(yīng)原性”，J.of Allergy Clin.Immunol.出版中)的結(jié)論相反，與豚草花粉含有復(fù)雜的變應(yīng)原混合物，含有或不含二硫鍵的蛋白的結(jié)論一致。
這些結(jié)果顯示NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)減弱了對(duì)花粉的變態(tài)反應(yīng)。還顯示可通過比較氧化的和硫氧還蛋白還原的樣品的胃蛋白酶敏感性來評(píng)估活性二硫蛋白對(duì)變應(yīng)原的復(fù)雜混合物的重要性。二硫鍵蛋白對(duì)變態(tài)反應(yīng)越重要，硫氧還蛋白對(duì)減弱該反應(yīng)就越有效。
實(shí)施例42硫氧還蛋白處理的豚草花粉變應(yīng)原在免疫治療中的用途吸入特定量的豚草花粉蛋白Amb t V的氣溶膠后，顯示打噴嚏和咳嗽(支氣管痙攣)的動(dòng)物是該研究的對(duì)象。氣溶膠中的Amb t V蛋白未用任何還原劑處理過。皮下注射遞增量的含有67微克/cc的Amb t V(已經(jīng)純化，并實(shí)施例41中所述與硫氧還蛋白、NADPH和NTR一起培育)的臨床溶液。這些皮下注射是為了確定對(duì)處理過的Amb t V發(fā)生局部變態(tài)反應(yīng)的最接近劑量或終點(diǎn)。觀察到在用10納克(ng)的0.15cc溶液時(shí)注射位點(diǎn)發(fā)生約5毫米的丘疹。確定10納克為終點(diǎn)，接著在3日后用比該終點(diǎn)小一個(gè)log的Amb t V量(在此是1納克)皮下注射動(dòng)物。該劑量對(duì)應(yīng)于下表列出的注射時(shí)間表的第一劑量。
表XX稀釋液IV(藍(lán)) 1∶10,000 稀釋液II(黃) 1∶100第一劑量-0.15cc 第11劑量-0.15cc第2劑量-0.30cc 第12劑量-0.25cc第3劑量-0.60cc 第13劑量-0.35cc第4劑量-1.00cc 第14劑量-0.50cc第15劑量-0.75cc稀釋液III(綠) 1∶1,000 第16劑量-1.00cc第5劑量-0.15cc第6劑量-0.25cc 稀釋液I(紅)濃度1∶10第7劑量-0.35cc 第17劑量-0.10cc+0.10cc鹽水第8劑量-0.50cc 第18劑量-0.15cc+0.15cc鹽水第9劑量-0.75cc 第19劑量-0.20cc+0.20cc鹽水第10劑量-1.00cc 第20劑量-0.25cc+0.25cc鹽水第21劑量-0.30cc+0.30cc鹽水因此，第一劑注射了0.15cc1∶10,000稀釋的Amb t V67微克/cc溶液。觀察對(duì)象的局部反應(yīng)。由于注射第一劑后未觀察到反應(yīng)，給動(dòng)物第二次注射0.30cc1∶10,000稀釋液或2納克。3日后，皮下施用第3劑0.60cc的1∶10,000稀釋液。然后按照注射時(shí)間表，每3日注射1次，直到動(dòng)物達(dá)到最大劑量耐受。大的局部皮膚反應(yīng)，即大于一個(gè)硬幣的丘疹和/或全身性癥狀如蕁麻疹(風(fēng)團(tuán))、打噴嚏、嘔吐或血壓下降表明該最大劑量。該動(dòng)物的最大劑量是第21劑量，但是對(duì)于另一只動(dòng)物可以是第11劑量、第15劑量、或第18劑量等。觀察到最大劑量后，降低1或2劑量，將該降低的劑量作為新的最大劑量。隨后每3周到4周用新的最大劑量皮下注射動(dòng)物。每隔3-4周接受新的最大劑量約6個(gè)月后，動(dòng)物吸入原先導(dǎo)致打噴嚏的相同量的Amb t V氣溶膠。作為該吸入的結(jié)果，觀察不到或觀察到有限的打噴嚏或咳嗽。動(dòng)物繼續(xù)規(guī)律性間隔接受新的最大劑量，并在再次吸入未還原的Amb t V時(shí)仍然沒有或基本沒有打噴嚏和任何其它變態(tài)反應(yīng)。
實(shí)施例43
硫氧還蛋白處理的花粉蛋白與未處理的花粉蛋白免疫治療有效性的比較在吸入特定量的未還原變應(yīng)原Amb t V后，顯示打噴嚏和其它變態(tài)反應(yīng)的一組同品種的10只動(dòng)物，是本研究的主題。為了確定變應(yīng)原性終點(diǎn)，將動(dòng)物分成兩組，每組5只。測(cè)試動(dòng)物抗體水平，然后用遞增量的未還原Amb t V注射組A，用遞增量的與硫氧還蛋白、NADPH和NTR保溫的Amb t V如實(shí)施例42中所述注射組B?；谌?0只動(dòng)物體重的mg/kg劑量是相同的，即使給予每只動(dòng)物的絕對(duì)劑量可能不同。確定了組中每只動(dòng)物的終點(diǎn)劑量。組A基于mg/kg體重的平均終點(diǎn)劑量低于組B的。然后按照實(shí)施例42中列出的方法和注射時(shí)間表注射動(dòng)物。測(cè)定了各組中每只動(dòng)物最大劑量。組B動(dòng)物的最大劑量比組A動(dòng)物的最大劑量一致更高，而且觀察到的局部或全身性癥狀較少。然后如實(shí)施例42中所述的方法，為動(dòng)物指定新的最大劑量，然后如實(shí)施例42，每隔3-4周用該新的最大劑量注射。這樣注射約6周后，組A動(dòng)物顯示在吸入特定量的非還原變應(yīng)原時(shí)，在某種程度上變態(tài)反應(yīng)下降，而組B的動(dòng)物顯示非常有限的變態(tài)反應(yīng)或不明顯。另外，組B的動(dòng)物能對(duì)高得多劑量的變應(yīng)原劑量耐受，在某些情況下達(dá)10-100倍。在處理過的動(dòng)物中測(cè)定抗體水平的試驗(yàn)顯示，免疫治療后，組B動(dòng)物的IgG抗體滴度更高，而IgE滴度隨時(shí)間下降。免疫治療后組A的IgG抗體滴度有點(diǎn)高，但比組B動(dòng)物的IgG滴度平均低得多。
這些結(jié)果顯示·豚草花粉的硫氧還蛋白還原減弱了變態(tài)反應(yīng)。
·硫氧還蛋白還原顯著提高了二硫花粉變應(yīng)原的可消化性。
·硫氧還蛋白(和可能的其它二硫還原劑，如硫辛酸)可用于降低花粉提取物的變應(yīng)原性并通過增強(qiáng)IgG產(chǎn)生而不是IgE抗體產(chǎn)生用于免疫治療花粉過敏病人，并改進(jìn)治療的安全性。
本發(fā)明的實(shí)施例可包括用眼藥水或鼻噴霧治療花粉過敏，包括-硫辛酸，-NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)-硫辛酸和NADP/硫氧還蛋白系統(tǒng)本發(fā)明通過用NADP/硫氧還蛋白或硫辛酸如上所述預(yù)處理二硫蛋白可用于治療和預(yù)防許多類型的由于二硫蛋白引起的過敏(如食物、花粉、塵螨)。
結(jié)論性評(píng)述從上面本發(fā)明的一般描述和說明用途的具體實(shí)施例中可見，本發(fā)明具有多種和廣泛的重要性。本發(fā)明基本上提供了新的生面團(tuán)和面團(tuán)混合物，以及產(chǎn)生新面團(tuán)和改進(jìn)面團(tuán)和烘烤食品質(zhì)量的新方法，以及滅活谷物產(chǎn)品中酶抑制蛋白的新方法。本發(fā)明還提供了改變動(dòng)物毒素的生物活性和滅活，消除或降低幾種變應(yīng)原，即花粉和食品(小麥、雞蛋、牛奶、乳清、大豆、堅(jiān)果和牛肉)的變應(yīng)原性的新方法。本發(fā)明還提供了一種提高花粉和食物變應(yīng)原，尤其是牛奶、乳清及其產(chǎn)物和小麥產(chǎn)品的蛋白酶水解和可消化性的方法。另外，本發(fā)明提供了一種新的蛋白，它是一種支鏈淀粉酶抑制蛋白，和一種其滅活的方法。
雖然已結(jié)合某些具體實(shí)施例描述了本發(fā)明，應(yīng)認(rèn)識(shí)到對(duì)于本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可以明白可作各種修改，但這些修改也在權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種低變應(yīng)原性的花粉蛋白，其特征在于，該花粉蛋白已用硫氧還蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸處理過。
2.如權(quán)利要求1所述的低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)是Amb t V。
3.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，每1克純蛋白質(zhì)中硫氧還蛋白的量是0.01-24毫克，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶是約0.01-48毫克，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸約1.0微摩爾-2,500微摩爾。
4.一種還原的花粉蛋白抽提物，其特征在于，所述抽提物已用硫氧還蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸處理過。
5.如權(quán)利要求4所述的花粉蛋白抽提物，其特征在于，所述抽提物是一種大豚草花粉蛋白抽提物。
6.如權(quán)利要求4所述的還原的花粉蛋白抽提物，其特征在于，每1克花粉蛋白中硫氧還蛋白量是約0.01-6.0毫克，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶是約0.01-8.0毫克，還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是約1.0-500微摩爾。
7.一種可吸收的花粉蛋白質(zhì)，其特征在于，所述花粉蛋白已用硫氧還蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸處理過。
8.如權(quán)利要求7所述的可吸收的花粉蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是Ambt V。
9.一種可吸收的花粉抽提物，其特征在于，所述抽提物已用硫氧還蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸處理過。
10.一種低變應(yīng)原性蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)是一種已用硫氧還蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸處理過的蛋白質(zhì)。
11.還原的花粉蛋白在免疫治療中降低或消除動(dòng)物的變態(tài)反應(yīng)的用途，所述動(dòng)物對(duì)未還原狀態(tài)的所述花粉蛋白過敏，其特征在于，所述還原的花粉蛋白質(zhì)已被有效量的硫氧還蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸所還原。
12.一種提高花粉蛋白質(zhì)可消化性的方法，其特征在于，該方法包括(a)用一定量的、能有效提高所述蛋白質(zhì)可消化性的硫氧還蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸處理所述花粉蛋白；和(b)將步驟(a)中處理過的蛋白質(zhì)施給動(dòng)物，從而提高所述蛋白質(zhì)的消化性，所述的可消化性是通過所述動(dòng)物與對(duì)照比較所顯示的癥狀后測(cè)得的。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，每1克蛋白中硫氧還蛋白的量是約0.01-6.0毫克，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶是約0.01-8.0毫克，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是約1.0-500微摩爾。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，每克蛋白中硫氧還蛋白的量是約0.1-4.0毫克，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶是約0.1-7.0毫克，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是約25-500微摩爾。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，每克蛋白中硫氧還蛋白的量至少是約0.01毫克，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶至少是約0.01毫克，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸至少是約1.0微摩爾。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述蛋白是花粉蛋白。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述花粉蛋白是Amb t V。
18.一種減少動(dòng)物對(duì)特定量的具有二硫鍵的特定變應(yīng)原性蛋白的變應(yīng)原性的方法，其特征在于，該方法包括(a)通過用硫氧還蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸處理所述蛋白，還原所述特定蛋白的二硫鍵；和(b)對(duì)所述過敏動(dòng)物在一段時(shí)間內(nèi)以一定間隔施用步驟(a)的蛋白質(zhì)的遞增的免疫治療劑量，所述蛋白質(zhì)的所述給藥可有效降低或消除所述動(dòng)物對(duì)所述特定量的所述特定變應(yīng)原蛋白質(zhì)的所述變態(tài)反應(yīng)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，每克蛋白質(zhì)中硫氧還蛋白的量是0.01-6.0毫克，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶是約0.01-8.0毫克，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是約1.0-500微摩爾。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，每克蛋白質(zhì)中硫氧還蛋白的量是0.1-4.0毫克，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶是約0.1-7.0毫克，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是約25-500微摩爾。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，每克蛋白質(zhì)中硫氧還蛋白的量至少是0.01毫克，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶至少是約0.01毫克，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸至少是約1.0微摩爾。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是花粉蛋白。
23.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是Amb t V。
24.一種測(cè)定特定變應(yīng)原蛋白中存在的二硫鍵的方法，其特征在于，該方法包括(a)將所述變應(yīng)原蛋白質(zhì)與一定量的能有效還原蛋白質(zhì)二硫鍵的硫氧還蛋白、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶一起培育，和(b)分析步驟(a)中所述培育的蛋白質(zhì)的二硫鍵還原。
25.一種減少含有二硫鍵的花粉蛋白變應(yīng)原性的方法，其特征在于，該方法包括(a)將所述花粉蛋白和一定量的硫氧還蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-硫氧還蛋白還原酶一起培育，來還原所述蛋白的二硫鍵，和(b)給予動(dòng)物步驟(a)中培育的蛋白質(zhì)，從而降低了所述蛋白質(zhì)的變應(yīng)原性，所述變應(yīng)原性是通過所述動(dòng)物與對(duì)照比較所顯示的過敏癥狀后測(cè)得的。
全文摘要
硫氧還蛋白(一種小型二巰基蛋白)是變應(yīng)原蛋白,特別是存在于花粉和動(dòng)物和植物來源的變應(yīng)原性蛋白質(zhì)的一種特異性還原劑。其所有靶向的蛋白質(zhì)含有二硫(S－S)鍵,它被硫氧還蛋白還原到巰基(SH)水平。其靶向的蛋白質(zhì)具有變應(yīng)原活性,而且在氧化(S－S)狀態(tài)較不易被消化,當(dāng)被還原(SH態(tài))時(shí),它們喪失其變應(yīng)原性,和/或變得更可消化。當(dāng)被NADPH通過NADP－硫氧還蛋白還原酶(生理?xiàng)l件)或通過硫辛酸化學(xué)還原劑激活(還原)時(shí),硫氧還蛋白實(shí)現(xiàn)這種還原作用。過敏的狗進(jìn)行的皮膚試驗(yàn)顯示,在注射前用還原的硫氧還蛋白處理花粉消除了或降低了花粉的變應(yīng)原性。研究顯示被硫氧還蛋白還原后,花粉蛋白的消化提高。已被硫氧還蛋白還原的花粉蛋白是有效和安全的免疫治療劑,可用于降低或消除動(dòng)物在接觸非還原花粉蛋白質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生的過敏反應(yīng)。
文檔編號(hào)A23J3/18GK1350547SQ00804968
公開日2002年5月22日 申請(qǐng)日期2000年1月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月27日
發(fā)明者B·B·布坎南, G·德瓦爾, R·M·洛薩諾, J·H·翁, B·C·伊, O·L·弗里克 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)